Summary
Изолированный препарат для легких кролика является золотым стандартом в исследованиях легких. Эта публикация направлена на описание методики, разработанной для изучения физиологических и патологических механизмов, участвующих в реактивности дыхательных путей, сохранении легких и доклинических исследованиях при трансплантации легких и отеке легких.
Abstract
Изолированная система перфузии легких широко используется в легочных исследованиях, способствуя выяснению внутренней работы легких, как микро- и макроскопически. Этот метод полезен при характеристике физиологии и патологии легких путем измерения метаболической активности и дыхательных функций, включая взаимодействия между циркулирующими веществами и эффекты вдыхаемых или перфузированных веществ, как при тестировании на наркотики. В то время как методы in vitro включают нарезку и культивирование тканей, изолированная система перфузии легких ex vivo позволяет работать с полным функциональным органом, что делает возможным изучение непрерывной физиологической функции при воссоздании вентиляции и перфузии. Однако следует отметить, что последствия отсутствия центральной иннервации и лимфодренажа еще предстоит полностью оценить. Этот протокол направлен на описание сборки изолированного аппарата легких с последующим хирургическим извлечением и канюляцией легких и сердца у экспериментальных лабораторных животных, а также на отображение метода перфузии и обработки сигналов данных. Средняя жизнеспособность изолированного легкого колеблется в пределах 5-8 ч; в этот период повышается проницаемость легочных капилляров, вызывая отек и травмирование легких. Функциональность сохраненной легочной ткани измеряется коэффициентом капиллярной фильтрации (Kfc), используемым для определения степени отека легких во времени.
Introduction
Броди и Диксон впервые описали систему перфузии легких ex-vivo в 1903 году 1. С тех пор он стал золотым стандартом для изучения физиологии, фармакологии, токсикологии и биохимии легких2,3. Метод предлагает последовательный и воспроизводимый способ оценки жизнеспособности трансплантации легких и определения эффекта воспалительных медиаторов, таких как гистамин, метаболиты арахидоновой кислоты и вещество P, среди прочих, а также их взаимодействия во время легочных явлений, таких как бронхоконстрикция, ателектаз и отек легких. Изолированная система легких была ключевым методом в раскрытии важной роли легких в устранении биогенных аминов из общего кровообращения4,5. Кроме того, система была использована для оценки биохимии легочного поверхностно-активного вещества6. За последние несколько десятилетий система перфузии легких ex-vivo стала идеальной платформой для исследований трансплантации легких7. В 2001 году команда во главе со Стигом Стином описала первое клиническое применение системы перфузии легких ex-vivo, используя ее для восстановления легких 19-летнего донора, который был первоначально отвергнут центрами трансплантации из-за его травм. Левое легкое собирали и перфузировали в течение 65 мин; после этого он был успешно пересажен 70-летнему мужчине с ХОБЛ8. Дальнейшие исследования по восстановлению легких с использованием перфузии ex-vivo привели к разработке метода Торонто для расширенной перфузии легких для оценки и лечения поврежденных донорских легких9,10. Клинически система перфузии легких ex-vivo показала, что является безопасной стратегией увеличения донорских пулов путем лечения и восстановления нестандартных донорских легких, не представляя существенной разницы в рисках или исходах по сравнению со стандартными критериями доноров10.
Основным преимуществом изолированной системы перфузии легких является то, что экспериментальные параметры могут быть оценены в полном функциональном органе, который сохраняет свою физиологическую функцию при искусственной лабораторной установке. Кроме того, он позволяет измерять и манипулировать легочной механической вентиляцией для анализа компонентов легочной физиологии, таких как сопротивление дыхательных путей, общее сосудистое сопротивление, газообмен и образование отеков, которые на сегодняшний день не могут быть измерены точно in vivo на лабораторных животных2. Примечательно, что состав раствора, с помощью которого перфузируется легкое, можно полностью контролировать, что позволяет добавлять вещества для оценки их воздействия в режиме реального времени и сбора проб из перфузии для дальнейшего изучения11. Исследователи, работающие с изолированной системой легких, должны иметь в виду, что механическая вентиляция вызывает распад легочной ткани, сокращая ее полезное время. Это прогрессирующее падение механических параметров может быть значительно замедлено гиперинфляцией легких время от времени во время эксперимента4. Тем не менее, подготовка обычно не может длиться более восьми часов. Другим соображением для системы перфузии легких ex-vivo является отсутствие центральной нервной регуляции и лимфодренажа. Последствия их отсутствия еще не полностью поняты и потенциально могут быть источником предвзятости в некоторых экспериментах.
Метод изолированной перфузионной системы легких может быть выполнен в модели кролика с высокой степенью консистенции и воспроизводимости. В этой работе описываются технические и хирургические процедуры для реализации метода изолированной перфузии легких ex-vivo , разработанного для модели кролика в Национальном институте респираторных заболеваний в Мехико, с намерением поделиться идеями и предоставить четкое руководство по ключевым шагам в применении этой экспериментальной модели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Изолированная перфузионная система в модели кролика широко используется в лаборатории бронхиальной гиперчувствительности в Национальном институте респираторных заболеваний. Протокол включает новозеландских кроликов с примерным весом 2,5-3 кг. Все животные содержались в стандартных условиях вивария и кормлении ad libitum в соответствии с официальными мексиканскими руководящими принципами для лабораторных животных (NOM 062-ZOO-1999) и в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных (8-е издание, 2011). Все процедуры для животных и методы ухода за животными, представленные в этом протоколе, были предварительно одобрены Комитетом по этике Национального института респираторных заболеваний.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка изолированной системы перфузии легких включает в себя преднамеренную смерть животного под наркозом и путем эвтаназии.
1. Оборудование и подготовка аппаратуры.
- Компоновка оборудования:
- Установите операционный стол с размером в соответствии с весом кролика.
- Установите крышку искусственной грудной клетки на стальную колонну со стеклянной камерой внизу и вентилятор с роликовым насосом по бокам.
- Убедитесь, что крышка легко наклонена к тому, чтобы канюля трахеи была на одной линии с трахеей, чтобы обеспечить более быстрое соединение.
- Искусственная грудная клетка:
ПРИМЕЧАНИЕ: Это неотъемлемая часть системы. Он состоит из стеклянной камеры с водяной рубашкой, герметичной специальной крышкой. Крышка работает как органодержатель с соединениями для канюляции трахеи и сосудов, встроенных в нее.- Настройте струю Вентури, управляемую сжатым воздухом, для создания отрицательного давления внутри искусственной грудной клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Модуль управления вентиляцией (VCM) позволяет отдельно регулировать давление вдоха и на конце выдоха, а также скорость дыхания и отношение продолжительности вдоха к общей продолжительности цикла.
- Настройте струю Вентури, управляемую сжатым воздухом, для создания отрицательного давления внутри искусственной грудной клетки.
- Аппарат:
- Убедитесь, что нормально работающий аппарат состоит из основной стальной колонны, установленной на опорной пластине, удерживающей искусственную грудную клетку, с пневмотахометром и датчиком веса, расположенными над ним и за катушкой предварительного нагрева с пузырьковой ловушкой.
- Подключите один преобразователь дифференциального давления к пневмотахометру, а другой к давлению в камере. Установите другую пару датчиков давления за грудной клеткой для измерения перфузии и венозного давления.
- Подключите переходный материал под кислородным оксигенатором с нивелиром и системой вентиляции рядом с аппаратом.
2. Хирургическое извлечение сердечно-легочного блока.
- Анестезия:
- Используйте комбинацию седативного средства (ксилазин) и барбитурата (пентобарбитала).
ПРИМЕЧАНИЕ: Различные обезболивающие коктейли могут быть использованы без влияния на результаты экспериментов. - Во-первых, успокоить здоровых новозеландских кроликов однократной внутримышечной инъекцией ксилазина гидрохлорида (3-5 мг/кг). Убедитесь, что кролики остаются спокойными и расслабленными, чтобы позволить дальнейшие манипуляции после нескольких минут инъекции.
- После седации используют маргинальные (боковые) ушные вены в качестве доступа для обезболивания кроликов внутривенной инъекцией пентобарбитала натрия (28 мг/кг).
- Используйте комбинацию седативного средства (ксилазин) и барбитурата (пентобарбитала).
- Контроль:
- Чтобы избежать недостаточной анестезии или чрезмерного угнетения сердечной и дыхательной функций, контролируйте следующие параметры. Чтобы оценить глубину анестезии, выполните тест на ущемление пальца ноги.
- Убедитесь, что слизистая оболочка розовая. Синие или серые оттенки указывают на гипоксию.
- Убедитесь, что частота сердечных сокращений составляет 120-135 ударов в минуту, и что температура тела не опускается ниже 36,5 ° C.
- Размещение животных:
- Побрейте туловище кролика и положите животное на операционный стол в лежачем положении. Поместите вентиляционную систему рядом со столом, за головой кролика, чтобы обеспечить быстрое соединение канюль после трахеотомии, чтобы избежать повреждения тиссуляра.
- Разрез и трахеотомия:
- Рассекните кожу вентральным срединным разрезом 3-5 см от диафрагмы до шеи.
- С помощью операционных ножниц разрезайте переднюю 2/3 трахеи между двумя хрящевыми кольцами, чтобы вставить канюлю трахеи через фиброзную оболочку трахеи.
- Вставьте 5 мм (наружный диаметр; OD) канюля трахеи через фиброзную оболочку трахеи и использовать 4-0 шелковый шов, чтобы аккуратно зафиксировать его.
- Поместите щипцы или пинцет под трахею, чтобы канюля не сгибалась против трахеи.
- Вентиляция под положительным давлением:
- Пока легкие остаются вне искусственной грудной клетки, используйте дыхательный насос небольшого вида для вентиляции положительного давления, чтобы избежать коллапса легких во время операции.
- Инициируйте вентиляцию через канюлю трахеи, подключенную к дыхательному насосу, быстро после трахеотомии и до открытия грудной клетки.
- Установите дыхательный объем на уровне 10 мл/кг.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от установки эксперимента и модели искусственной грудной клетки обеспечьте вентиляцию под положительным давлением либо с помощью того же вентиляционного насоса, который используется для обеспечения отрицательного давления, либо с помощью другого, что обеспечивает быстрое повторное канюляцию.
- Торакотомия и экссангинация:
- Чтобы получить доступ к грудной полости, используйте скальпель или ножницы, чтобы открыть стенку грудной клетки и выполнить медиальную стернотомию до верхней трети грудной клетки.
- Держите половинки грудной клетки открытыми двумя втягивающими устройствами. Несколько легочных лоскутов обычно окружают сердце.
- Локализуйте верхнюю и нижнюю полую вену и направляйте их нитями.
- Перед экссангинацией животного определите правый желудочек и введите 1000 UI/кг гепарина.
- Сразу после инъекции обжаривают верхнюю и нижнюю полую вену предварительно закольцованной нитью и выполняют экссангинацию.
- Урожай сердца и легких:
- Соберите сердечно-легочный блок аккуратно и быстро. Используйте прямое цифровое рассечение или пружинные ножницы, чтобы отделить соединительную ткань, чтобы удалить легкие из грудной клетки.
- Рассекайте сосудистую систему в этой области, а также пищевод.
- Прорежьте manubrium sterni, чтобы расширить медиальную стернотомию к канюле трахеи, освобождая трахею с обеих сторон от соединительной ткани.
- Теперь резекция трахеи над канюлей трахеи. Осторожно подтяните канюлю по краниокаудальной оси, так как дорсальная фиксация трахеи и легких резецируется.
- Каннуляция:
- Выньте изолированные легкие из грудной клетки и осторожно поместите их поверх стерильной марли на чашке Петри.
- Для предотвращения ателектаза проветривайте легкие с помощью вентиляции с положительным давлением с положительным давлением выдоха (PEEP), установленным на уровне 2 смH2O.
- Удалите желудочки, отрезав им сердце на уровне атриовентрикулярной бороздки.
- После вскрытия двух желудочков вводят канюлю легочной артерии OD 4,6 мм для кролика с корзиной через легочную артерию и вводят канюлю OD 5,9 мм левого предсердия для кролика с корзиной через митральный клапан в левое предсердие.
- Используйте шелковый шов 4-0 в легочной артерии и левом предсердии, чтобы зафиксировать канюли. Включите окружающие ткани в лигатуры легочной артерии и левого предсердия, чтобы избежать растяжения этих структур.
- Вводят 250 мл физиологического изотонического раствора через артериальные канюли, чтобы промыть оставшуюся кровь из сосудистого русла.
3. Перфузионная техника.
- Настройка:
- Осторожно поместите изолированные легкие в камеру легких.
- Прикрепите трахею к трансдуктору на крышке камеры.
- Подключите канюлированные сосуды к перфузионной системе.
- Закройте камеру и закрепите ее поворотным замком.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рециркуляционный перфузионный контур состоит из открытого венозного резервуара, перистальтического насоса, теплообменника и пузырьковой ловушки. - В этот момент прикрепите крышку камеры и переключите запорный кран, чтобы переключиться с вентиляции с положительным на отрицательное давление. Чтобы проверить вентиляцию легких при отрицательном давлении и герметичное закрытие камеры, осмотрите дыхательную экскурсию легкого и давление в камере на манометре.
- Перфузируйте легкие 200 мл искусственного перфузата без крови (бикарбонатный буфер Кребса-Рингера, содержащий 2,5% бычьего альбумина).
- Начните поток перфусата со скоростью 3 мл/мин/кг, затем медленно увеличьте расход в течение 5-минутного периода до 5 мл/мин/кг. Достигните расхода 8 мл/мин/кг в течение следующих 5 мин, а затем через еще 5 мин достигайте максимального потока 10 мл/мин/кг. Позаботьтесь о том, чтобы воздух не попадал в цепь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживать рН и температуру перфусата в физиологических диапазонах (рН 7,4-7,5; температура, 37 °C-38 °C). Чтобы отрегулировать pH, добавьте NaHCO3 (1N) или увеличьте поток углекислого газа. В качестве альтернативы, используйте HCl (0,1N) для подкисления.
- Параметры:
- Проверьте, установлены ли заданные параметры перфузии и вентиляции по мере необходимости.
- Проветривайте легкие увлажненным воздухом с частотой 30 уд/мин, приливным объемом 10 мл/кг и давлением в конце выдоха (Pe) 2 смH2O.
ПРИМЕЧАНИЕ: Легочное артериальное давление (0-20 мм рт.ст.) соответствует высоте уровня жидкости в оксигенаторе или резервуаре в сантиметрах над легочным стволом, в то время как легочное венозное давление соответствует высоте камеры равновесия давления над левым предсердием. Оба значения могут быть изменены. Отметим, что давление в левом предсердии также составляет 0-20 мм рт.ст.
- Достижение условий зоны 3:
- Используйте два катетера, соединенных с боковыми портами канюль, закрепленных в легочной артерии, левом предсердии, и датчиками давления для измерения артериального (Pa) и венозного (Pv) давления.
- Установите базовое давление на уровне легкого хилума (Zero-reference).
- Проводить эксперименты в условиях вентиляции зоны 3. Для этого подождите 10-15 мин, чтобы получить равновесие, характеризующееся изогравиметрическим состоянием.
- Убедитесь, что венозное давление выше, чем альвеолярное давление (Palv), а артериальное давление остается выше, чем оба (Pa > Pv > Palv) для возникновения условий зоны 3.
- Убедитесь, что вес легких остается постоянным, а артериальное и левое предсердное давления стабильны для достижения условий зоны 3 для открытия максимального количества легочных сосудов и поддержания содержания микрососудистого русла во время эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение Kfc как показателя отека легких не имеет различий между ручной и автоматической перфузионной системой.
- Электронное управление и обработка сигналов: Убедитесь, что дыхательный поток, изменения веса, микрососудистое давление, приливный объем, сосудистое сопротивление, среди прочего, зарегистрированы на нескольких центральных электронных устройствах, которые интегрируют сигналы, поступающие от преобразователей, и отображают их в системе оценки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изолированная система перфузии легких позволяет манипулировать органами для биопсии, сбора образцов из перфузии и сбора физиологических параметров в режиме реального времени. Изолированная система может быть использована для проверки многих гипотез, связанных с различными функциями и явлениями легких, от метаболической и ферментативной активности до периодов образования и сохранения отеков для трансплантации легких.
На рисунке 1 показана схема полностью собранной изолированной системы перфузии легких вместе с системой вентиляции и расчетным сбором данных. Перфузионный компонент системы гарантирует, что перфусат постоянно протекает через изолированные легкие. Легочная артерия каннулируется для обеспечения перфузии притока, в то время как отток перфузата обеспечивается канюляцией левого предсердия сердца. Перфусат пропускается с помощью роликового насоса таким образом, что перфусат проходит через теплообменник, затем через пузырьковую ловушку в легочную артерию и, наконец, в сосудистое русло легких. Вентиляционный компонент системы позволяет вентиляционной среде постоянно проходить мимо дистального конца пневмотахометра непосредственно через канюлю трахеи в легкие.
На фиг.2 показана концентрация МАО (фиг.2А) и 5-НТ (фиг.2В) в изолированном легком, сохраненном при 4°С через 24 ч. Уровни серотонина и моноаминоксидазы определяли по образцам внутрисосудистой жидкости, полученным в разное время и проанализированным методом ИФА. Концентрация 5-НТ достигала пика после 15 мин консервации, а затем уменьшалась в течение следующих 6 ч. После этого уровни перфузии показали нестатистически значимое увеличение до 24-го часа. Уровни МАО показали аналогичное поведение, достигнув пика после 15 минут сохранения, а затем снизившись в течение следующих шести часов до 24-го часа12. На рисунке 3 показаны скорости высвобождения 5-НТ и МАО, выраженные в процентах от начального значения, измеренные через 24 ч в изолированном препарате легких при 4 °C. В течение первого часа сохранения уровни 5-НТ поднялись выше, чем МАО, и снизились в течение 6 ч после повторного захвата эндотелиальными клетками и тромбоцитами, а также опосредованного МАО катаболизма12.
На рисунке 4 показана НЭП (оптическая плотность/мг белка/мин) и ферментативная активность АПФ (оптическая плотность/мг белка/мин) во времени в изолированном препарате легких. Активность НЭП (рисунок 4А) определяли спектрофотометрическим анализом с использованием N-Dansyl-D-Ala-Gly-pnitro-Phe-Gly в качестве субстрата NEP с последующим добавлением эналаприла для ингибирования АПФ. Активность АПФ (рисунок 4В) определяли спектрофотометрическим анализом с использованием эналаприла в качестве субстрата АПФ с последующим добавлением фосфорамидона для ингибирования НЭПа. Поскольку оба раствора содержали эналаприл, активность АПФ рассчитывали как разницу в флуоресценции между образцами с эналаприлом и без него13.
На рисунке 5 показано влияние легочной консервации на проницаемость капилляров (mKfc) через период 24 ч в изолированной перфузионной системе легких в модели кролика. Контрольная группа (n = 6), оцененная сразу после сбора урожая, имела mKfc 2,8 ± стандартную погрешность 0,8 (мл / мин / смH2O / г), напротив, перфузированное легкое страдало прогрессирующим увеличением mKfc, набрав 7,5 ± 1,4 (n = 6) через 6 ч, 10,8 ± 2,3 (n = 6) через 12 ч и достигло 16,3 ± 2,5 (n = 6) после 24 ч сохранения13.
На фиг.6 показано влияние различных добавок на проницаемость капилляров изолированной перфузионной системы легких в различных условиях. Внезапное повышение давления в 10 смH2O генерируется частичной обструкцией венозного оттока для измерения проницаемости капиллярного русла через капиллярный коэффициент фильтрации (Kfc). Чтобы измерить Kfc, отводная трубка, которая выходит из левого желудочка в резервуар Кребса, была частично зажата. Затем частичный зажим поддерживали в течение 3 минут, следя за тем, чтобы приращение давления достигало 10 смH2O. Зажим был отпущен, и нормальный поток продолжился. Этот маневр был зарегистрирован как увеличение артериального давления и увеличение веса легких. Этот последний параметр считается Kfc.
Рисунок 1: Схема изолированной перфузионной системы легких. Эта цифра была изменена с Hugo Sachs Elektronik (HSE), Harvard Apparatus14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Концентрация серотонина (5-HT) и моноаминоксидазы (MAO), участвующих в метаболизме легких и проницаемости сосудов. Концентрация (A) MAO и (B) 5-HT в изолированном легком сохраняется при 4°C через 24 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Скорость высвобождения серотонина (5-НТ) и моноаминоксидазы (МАО). Скорость высвобождения 5-НТ и МАО, выраженная в процентах от начального значения, измеренная через 24 ч в изолированном легочном препарате при 4 °C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Ферментативная активность нейтральной эндопептидазы (НЭП) и ангиотензинпревращающего фермента (АПФ). Ферментативная активность (A) NEP и (B) ACE через время в изолированном легком сохраняется при 4 °C до 24 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Влияние легочной консервации на проницаемость капилляров (mKfc). Данные показывают влияние легочной консервации на проницаемость капилляров (mKfc) через период 24 ч в изолированной перфузионной системе легких в модели кролика. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Влияние различных добавок на проницаемость капилляров. Влияние различных добавок на проницаемость капилляров изолированной перфузионной системы легких в различных условиях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта работа отображает общий взгляд на изолированную систему перфузии легких, необходимую технику в исследованиях физиологии легких. Изолированная система перфузии легких предлагает большую степень универсальности в ее использовании и позволяет оценить несколько параметров, имеющих значение при тестировании широкого спектра гипотез15. Изолированная система легких является инструментом с мировым присутствием, который в последнее десятилетие еще больше доказал свою актуальность для оценки конкретных органов, а также расширил свою полезность в качестве расширения современных технологий и новых методов лечения с участием мезенхимальных стволовых клеток16 и геномной инженерии CRISPR / Cas917, среди прочих. Текущие области исследований перфузии легких ex vivo широко охватывают противовоспалительные стратегии, управление и профилактику травм вентиляции, лечение против отторжения и эффективность борьбы с отеком легких15.
Правильная сборка аппарата необходима для обеспечения правильного сбора данных. Как показано на рисунке 1 , вся система состоит из влажной камеры с отрицательным давлением, прикрепленной к системе вентиляции, и перфузионной системы, которая имитирует дыхательную и циркуляторную функции легких соответственно. Обе системы подключены к системе сбора данных, которая позволяет добавлять измерительные устройства, которые могут быть адаптированы к потребностям любого протокола. Хирургический процесс сбора сердечно-легочной блокады должен выполняться быстро, предпочтительно опытным персоналом, чтобы избежать дополнительного повреждения тканей, чтобы сохранить легкое как можно более нетронутым, чтобы физиологическая функция могла продолжаться без дальнейшего вмешательства во время эксперимента. Система также позволяет в режиме реального времени собирать образцы перфузии, которые могут быть использованы для определения влияния определенных молекул на различные легочные функции (например, влияние гепарина на легочную сохранность).
Для достижения надлежащего распределения перфузионного потока между легочными сосудами, а именно капиллярами, должны быть обеспечены условия зоны 3. Условия зоны 1 определяются как область, где артериальное давление падает ниже альвеолярного давления, обычно приближаясь к атмосферному давлению. Когда это происходит, капилляры сплющиваются, что делает невозможным кровоток или перфузионный поток. При нормальных обстоятельствах зона 1 не может существовать, так как артериального давления достаточно, чтобы гарантировать распределение потока. Однако условия зоны 1 могут появиться, если артериальное давление падает, или альвеолярное давление увеличивается (как это происходит во время вентиляции с положительным давлением). Условия зоны 1 приводят к неперфузированному вентилируемому легкому, которое не способно выполнять газообмен. В условиях зоны 2 артериальное давление выше альвеолярного давления. Однако венозное давление остается ниже альвеолярного давления, что приводит к перфузионному потоку, определяемому разницей между артериальным и альвеолярным давлениями. Такое поведение можно смоделировать с помощью резистора Starling. Условия зоны 3 определяются разницей между артериальным и венозным давлением. Увеличение перфузионного потока в зоне 3 происходит из-за растяжения капилляров, обусловливая открытие максимального числа легочных сосудов.
Блок системы состоит из семи модулей: двух модулей аналогового усилителя преобразователя (TAM-A), оснащенных аналоговым светодиодным гистограммным сигналом для мониторинга динамических сигналов (артериальное давление, дыхательный поток, сила сжатия и т.д.), одного модуля усилителя цифрового преобразователя (TAM-D) с цифровым цифровым цифровым дисплеем, предназначенным для мониторинга медленно изменяющихся пульсирующих сигналов; сервоконтроллер для перфузионного модуля (SCP), который работает совместно с усилителями TAM-A и TAM-D для перфузионного контроля изолированных перфузий органов с помощью перистальтического насоса, скорость насоса может быть установлена в режиме постоянного давления или управляться вручную через SCP; модуль баланса отеков (EBM), который измеряет массу легких; модуль управления вентиляцией (VCM) для управления вентиляцией с положительным и отрицательным давлением и модуль счетчика таймера (TCM), который может быть настроен на запуск VCM для выполнения циклов глубокого вдоха.
Высокая глобальная распространенность легочных и респираторных заболеваний и ограничения современных терапевтических возможностей обусловливают повышенный спрос на трансплантацию легких, поскольку она остается золотым стандартом лечения для пациентов с терминальным заболеванием легких18. Система перфузии легких ex-vivo представляет собой отличную платформу для тестирования таргетной терапии как в фундаментальных, так и в клинических исследованиях. На клиническом уровне перфузионная система ex-vivo может быть использована для оценки ткани трансплантата вне организма, что позволяет тестировать изолированный орган перед трансплантацией, помогая собирать клинические данные для более точного прогноза эффективности трансплантации. Рациональное использование изолированной системы перфузии легких может помочь оптимизировать операцию по пересадке легких, сделав их более безопасной и более выборочной процедурой. Изолированная модель легких также полезна в фундаментальных исследованиях передовых методов диагностики и терапии, таких как инстилляция мезенхимальных стволовых клеток и другие иммуноопосредованные методы лечения; многие доклады показали потенциал метода перфузии ex-vivo в качестве платформы для дальнейших исследований по сохранению легких при разработке методов предотвращения травмы ишемии-реперфузии и отека легких, продлевая жизнеспособность органов15. Некоторые этапы устранения неполадок и ограничения, связанные с изолированной моделью легких, в основном связаны с коротким доступным временем этого метода для возможного возникновения отеков, вызванных ограничением лимфатического дренажа, а также системным эффектом метода. Определение капиллярного фильтрационного коэффициента (Kfc) является надежным критерием для измерения функциональности сохраненной легочной ткани и установления степени отека во времени. Не было обнаружено различий между ручным и автоматическим определениями Kfc19.
Поскольку использование изолированной системы перфузии легких популяризируется, а новые методы лечения меняют клинический ландшафт, метод перфузии ex-vivo становится выборочным выбором для улучшения результатов лечения пациентов при различных легочных патологиях, а также для увеличения пула потенциальных доноров легких без ущерба для безопасности реципиентов, обещая новую эру в легочной сохранности и трансплантации легких. Появление пандемии Covid-19 и увеличение распространенности ХОБЛ18,20 среди населения мира подчеркивает необходимость дальнейших фундаментальных исследований в области легочной физиологии, сохранения легких и трансплантации легких, а также доклинических исследований новых методов лечения с взглядами на трансляционную медицину. Кроме того, модель кролика ex-vivo является доступной и практической моделью для обучения жителей и студентов в области пульмонологии, особенно тех, кто занимается торакальной хирургией и ЭКМО. Любой лаборатории, участвующей в протоколах респираторных или тораколегочных исследований, рекомендуется рассматривать изолированную систему перфузии легких как часть своих ежедневных инструментов для своих экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить доктора философии Беттину Зоммер Сервантес за ее поддержку в написании этой рукописи и Китцию Елену Лару Сафонт за ее поддержку с иллюстрациями.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
References
- Dixon, W. E. Contributions to the physiology of the lungs: Part I. The bronchial muscles, their innervation, and the action of drugs upon them. The Journal of Physiology. 29 (2), 97-173 (1903).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Roman, M. A., Nair, S., Tsui, S., Dunning, J., Parmar, J. S. Ex vivo lung perfusion: a comprehensive review of the development and exploration of future trends. Transplantation. 96 (6), 509-518 (2013).
- Delaunois, A., Gustin, P., Ansay, M. Multiple muscarinic receptor subtypes mediating pulmonary oedema in the rabbit. Pulmonary Pharmacology. 7 (3), 185-193 (1994).
- Delaunois, A., Gustin, P., Vargas, M., Ansay, M. Protective effect of various antagonists of inflammatory mediators against paraoxon-induced pulmonary edema in the rabbit. Toxicology and Applied Pharmacology. 132 (2), 343-345 (1995).
- Barr, H. A., Nicholas, T. E., Power, J. H. Control of alveolar surfactant in rats at rest and during prolonged hyperpnoea: pharmacological evidence for two tissue pools of surfactant. British Journal of Pharmacology. 93 (3), 473-482 (1988).
- Machuca, T. N., Cypel, M.
- Steen, S., et al. First human transplantation of a nonacceptable donor lung after reconditioning ex vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (6), 2191-2194 (2007).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. New England Journal of Medicine. 364 (15), 1431-1440 (2011).
- Kao, C. C., Parulekar, A. D.
- Alquicira-Mireles, J. Participación de la serotonina en los cambios de permeabilidad vascular en la preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Biología thesis (2013).
- Arreola-Ramírez, J. L. Papel de la liberación de acetilcolina y sustancia P en el deterioro de la función pulmonar en un modelo experimental de preservación pulmonar en conejo. , Universidad Nacional Autónoma de México. Doctorado en Ciencias Biomédicas thesis (2009).
- Isolated lung perfusion systems for small to large animal models. Harvard Apparatus. Hugo Sachs Elektronik (HSE). , Available from: https://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Isolated%20Lung%20Perfusion%20Systems%20Brochure.pdf (2021).
- Jiao, G. Evolving trend of EVLP: Advancements and emerging pathways. SN Comprehensive Clinical Medicine. 1 (4), 287-303 (2019).
- Mordant, P., et al. Mesenchymal stem cell treatment is associated with decreased perfusate concentration of interleukin-8 during ex vivo perfusion of donor lungs after 18-hour preservation. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1245-1254 (2016).
- Cowan, P. J., Hawthorne, W. J., Nottle, M. B. Xenogeneic transplantation and tolerance in the era of CRISPR-Cas9. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (1), 5-11 (2019).
- Collaborators, G. C. R. D. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Bravo-Reyna, C. C., Torres-Villalobos, G., Aguilar-Blas, N., Frías-Guillén, J., Guerra-Mora, J. R. Comparative study of capillary filtration coefficient (Kfc) determination by a manual and automatic perfusion system. Step by step technique review. Physiological Research. 68 (6), 901-908 (2019).
- Pereira, M. R., et al. COVID-19 in solid organ transplant recipients: Initial report from the US epicenter. American Journal of Transplantation. 20 (7), 1800-1808 (2020).
