Summary
Общей целью данной процедуры является описание метода самостоятельного введения препаратов, которые можно использовать в мышиных моделях кормления и ожирения.
Abstract
Доклинические исследования на мышах часто полагаются на инвазивные протоколы, такие как инъекции или пероральный прием, для доставки лекарств. Эти стрессовые пути введения оказывают значительное влияние на важные метаболические параметры, включая потребление пищи и массу тела. Хотя привлекательным вариантом обойти это является соединение препарата в пище грызунов или растворение его в воде, эти подходы также имеют ограничения, поскольку на них влияет стабильность препарата при комнатной температуре в течение длительных периодов времени, растворимость препарата в воде и то, что дозирование сильно зависит от времени приема пищи или воды. Постоянная доступность препарата также ограничивает трансляционную значимость того, как лекарства вводятся пациентам. Чтобы преодолеть эти ограничения, лекарства можно смешивать с очень вкусной пищей, такой как арахисовое масло, что позволяет мышам самостоятельно вводить соединения. Мыши надежно и воспроизводимо потребляют гранулы препарата / арахисового масла в короткие сроки. Такой подход облегчает подход к доставке с минимальным стрессом по сравнению с инъекцией или рваной инъекцией. Этот протокол демонстрирует подход препарата, акклиматизации животных к доставке плацебо и доставки лекарств. Последствия этого подхода обсуждаются в исследованиях, связанных со сроками введения препарата и циркадным ритмом.
Introduction
Целью этого метода является доставка лекарств мышам с помощью неинвазивной, минимально стрессовой процедуры. Доклинические исследования на мышах часто полагаются на стрессовые, инвазивные пути введения лекарств, которые могут оказывать значительное влияние на метаболические параметры. Например, повторяющаяся ежедневная пероральная естя может значительно снизить потребление калорий и увеличение веса у мышей1. Кроме того, оральный уход может быть технически сложным и может вызвать травмы. В качестве альтернативы мыши могут самостоятельно вводить соединения, которые смешиваются в их пище или растворяются в их питьевой воде 2. Однако этот подход имеет серьезное ограничение, которое заключается в том, что он зависит от естественного циркадного времени приема пищи или воды. Кроме того, стабильность или растворимость препарата в воде может быть серьезной проблемой при хронической доставке таким образом. Чтобы преодолеть эти ограничения, препараты можно смешивать с очень вкусными продуктами, такими как тесто для печенья 3,желе 4,5 или арахисовое масло 6, чтобы стимулировать самостоятельное введение у мышей в определенное время. Преимущество такого подхода в том, что он облегчает доставку лекарств с минимальным стрессом по сравнению с инъекцией или ежедневным приемом1. Эта процедура может быть адаптирована для доставки широкого спектра лекарств мышам. Этот протокол демонстрирует процесс приготовления препарата, обучения с последующей доставкой препарата в очень вкусной пище. В качестве примера этот метод используется для введения антипсихотического препарата рисперидона самке мышей C57BL/6J. Хорошо известно, что рисперидон обладает мощным гиперфагическим эффектом и эффектом увеличения веса у пациентов 7, что хорошо смоделировано у грызунов 6,8. Эта система введения облегчает высокопереходную модель, которая может быть использована для изучения широкого спектра лекарств и их влияния на пути, регулирующие потребление пищи и массу тела 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Калифорнийском университете в Сан-Диего.
1. Изготовление препарата -гранулы арахисового масла
- Рассчитайте количество препарата, необходимое для изготовления нужной дозы препарата в грануле арахисового масла и накипью до размера партии, необходимой для эксперимента. Важно отметить, что гранулы могут храниться при -80 °C, в зависимости от стабильности препарата.
- Избавить препарат таблетками с помощью ступки и пестиков.
- Взвесьте рассчитанное количество арахисового масла, поместив его в весовую лодку на смолистых весах.
- Положите арахисовое масло на кипитель с теплой водой до тех пор, пока не растает.
- Добавьте необходимое количество измельченного препарата в растопленный арахис и тщательно перемешайте.
- Дайте смеси лекарственного и арахисового масла остыть, чтобы ее можно было легко поместить в резиновые формы.
- Поместите смесь арахисового масла в форму. Тот, который используется здесь, представляет собой резиновую форму для гранул кортикостерона и создает примерно ~ 100 мг гранул арахисового масла. Корректировка соотношения препарата к арахисовому маслу может быть необходима для обеспечения вкусовых качества.
- Повторите эти шаги только с арахисовым маслом, чтобы сделать гранулы плацебо.
- Заморозьте форму при -20 °C или -80 °C (в зависимости от стабильности препарата), чтобы арахисовое масло затвердело до использования.
2. Настройка мыши
- Поохоть мышей в стандартных клетках для мышей. Линия с высокоабсорбирующими бумажными подстилками и обогащением, включая бумажные полотенца и купол корпуса. Это бумажное постельное белье облегчает точные измерения потребления пищи, позволяя количественно оценивать пролитую пищу из фекалий и постельных принадлежностей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Получено одобрение ENsure IACUC для мышей с поощрочным размещением. - Обеспечьте ad libitum пищу и воду и позвольте мышам акклиматизироваться к жилью в течение примерно 3 дней.
3. Обучение самостоятельному дозирование лекарственного арахисового масла
- Спланируйте и выберите оптимальное время суток для введения препарата.
- Постить мышей в течение 24 часов и убедиться, что одобрение IACUC было получено на выбранную продолжительность голодания.
- Выньте форму из морозильной камеры, дайте резиновой форме размягчиться, чтобы гранулы можно было легко выдавить из формы. Все тренировки могут быть завершены с использованием плацебо контрольных гранул.
- Поместите гранулу арахисового масла плацебо-контроля на стенку клетки примерно в 1,5 дюймах от основания. В первый день мыши может потребоваться около 1 часа, чтобы съесть гранулу арахисового масла из-за новизны.
- После тренировки обеспечьте ad libitum доступ к пище и воде.
- На следующий день поместите гранулу арахисового масла на стенку клетки в том же месте для дальнейшего обучения на непостимых мышах.
- Повторяйте тренировку на мышах, которых кормили, в течение примерно 3 дней. Время, необходимое для употребления арахисового масла, составит менее 30 минут к третьему дню тренировки.
4. Эксперимент
- Рандомизируйте мышей в группы лечения на основе массы тела, чтобы группы имели одинаковую среднюю массу тела до лечения.
- Планируйте вводить таблетки арахисового масла (лечение или плацебо) мышам в то же время, когда они были обучены получать гранулы арахисового масла.
- Взвесьте пищу и мышь и запишите значения.
- Убедитесь, что таблетки арахисового масла (лечение или плацебо) помещены в то же место в клетке, которое установлено во время тренировки.
- Продолжайте процедуру дозирования ежедневно в течение всего эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В примере, представленном здесь, арахисовое масло использовалось для доставки рисперидона мышам ежедневно в течение 14 дней.
Это исследование показывает, что хроническая доставка рисперидона с помощью этого метода способствует высоко воспроизводимому увеличению потребления пищи и массы тела по сравнению с контролем(Рисунок 1a,b). Кроме того, этот метод доставки приводит к очень последовательным данным по сравнению с альтернативными, более стрессовыми подходами к доставке, такими как внутрибрюшинные инъекции(рисунок 1c,d).
Рисунок 1. Влияние методов доставки лекарств на прием пищи и увеличение веса у мышей. Самок мышей C57BL/6J ежедневно в 8 утра в течение 14 дней лечили рисперидоном (3 мг/кг) в грануле арахисового масла или контрольной грануле плацебо. Мыши, получавших рисперидон в арахисовом масле, имели значительно более высокое ежедневное потребление пищи(a)и набрали значительно больший вес(b)по сравнению с контрольным лечением. Кроме того, внутрибрюшинная доставка рисперидона (3 мг/кг) не оказала такого сильного влияния на потребление пищи(c)или увеличение веса(d)по сравнению с самостоятельной доставкой арахисового масла. Данные выражены как среднее ± SEM и были проанализированы студентом t-тестом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При проведении данного протокола важно соблюдать точность измерений потребления пищи и массы тела и сроки введения препарата на протяжении всего исследования. Хотя этот метод самостоятельного введения требует значительной фазы обучения, это особенно важно для приучения мышей к новизне арахисового масла и обеспечения того, чтобы мыши потребляли препарат в указанное время. После создания он также предлагает большую экспериментальную гибкость и может быть модифицирован и адаптирован для доставки лекарств несколько раз в день в различных дозах. Этот метод работает лучше всего, когда мыши потребляют нормальный чау-чау в качестве основного источника питания. Когда мышей кормят очень вкусными диетами с высоким содержанием жира и сахара, это может сделать фазу обучения более сложной, поскольку некоторые мыши менее мотивированы потреблять арахисовое масло в этих условиях и может быть ограничением этой техники.
По сравнению с существующими методами, такими как инъекции или пероральный прием, этот метод самостоятельной доставки лекарств вызывает минимальный стресс и приводит к надежным и последовательным данным, связанным с воздействием лекарств на метаболические фенотипы, включая потребление пищи и массу тела. Будущие применения этого метода включают исследования сроков доставки лекарств при приеме пищи и увеличении веса в контексте циркадных ритмов и метаболического здоровья10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Национального института здравоохранения R01DK117872, присужденным OO, и стипендией Фонда Ларри Л. Хиллблома, присужденной RCZ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57B6/J mice | Jackson Labs, Sacramento, CA, USA | 664 | |
| corticosterone pellet mold | Ted Pella Inc, Redding, CA, USA | 106A | |
| Mouse igloo | VWR, Visalia, CA, USA | 89067-850 | cage enrichment |
| peanut butter | Jif Peanut Butter, Orrville, OH, USA | Creamy peanut butter | |
| pestle and mortar | VWR, Visalia, CA, USA | 470148-960 | |
| risperidone | Patriot Pharmaceuticals, Horsham, PA, USA | 50458-593-50 | |
| rodent chow | LabDiet, St. Louis, MO, USA | 5001 | |
| weigh boat | VWR, Visalia, CA, USA | 10803-148 | |
| weighing scale | Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland | MS104TS | |
| Wypall paper X60 | Kimberly-Clark, Corinth, MS, USA | 34865-05 | absorbent paper bedding |
References
- de Meijer, V. E., Le, H. D., Meisel, J. A., Puder, M. Repetitive orogastric gavage affects the phenotype of diet-induced obese mice. Physiology and Behavior. 100 (4), 387-393 (2010).
- Perez-Gomez, A., et al. A phenotypic Caenorhabditis elegans screen identifies a selective suppressor of antipsychotic-induced hyperphagia. Nature Communications. 9 (1), 5272 (2018).
- Corbett, A., McGowin, A., Sieber, S., Flannery, T., Sibbitt, B. A method for reliable voluntary oral administration of a fixed dosage (mg/kg) of chronic daily medication to rats. Laboratory Animal. 46 (4), 318-324 (2012).
- Teixeira-Santos, L., Albino-Teixeira, A., Pinho, D. An alternative method for oral drug administration by voluntary intake in male and female mice. Laboratory Animal. 55 (1), 76-80 (2021).
- Zhang, L. Method for voluntary oral administration of drugs in mice. STAR Protocols. 2 (1), 100330 (2021).
- Cope, M. B., et al. Risperidone alters food intake, core body temperature, and locomotor activity in mice. Physiology and Behaviour. 96 (3), 457-463 (2009).
- Barton, B. B., Segger, F., Fischer, K., Obermeier, M., Musil, R. Update on weight-gain caused by antipsychotics: a systematic review and meta-analysis. Expert Opinion in Drug Safety. 19 (3), 295-314 (2020).
- Cope, M. B., et al. Antipsychotic drug-induced weight gain: development of an animal model. International Journal of Obesity. 29 (6), 607-614 (2005).
- Domecq, J. P., et al. Clinical review: Drugs commonly associated with weight change: a systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (2), 363-370 (2015).
- Wei, H., et al. Dopamine D2 receptor signaling modulates pancreatic beta cell circadian rhythms. Psychoneuroendocrinology. 113, 104551 (2020).
