Preparazione di doppi strati lipidici supportati da perline per studiare la produzione di particolato delle sinapsi immunitarie delle cellule T

Lo studio della produzione della sinapsi immunitaria è stato limitato principalmente a metodi microscopici. I BSLB hanno ampliato il nostro repertorio di strumenti che possono essere utilizzati per studiare l'output delle sinapsi immunitarie delle cellule T, tra cui citometria a flusso, microscopia, proteomica e tecnologie di sequenziamento dell'RNA. Come tale, i BSLB possono essere utilizzati in un'ampia varietà di domande di immunologia e nell'identificazione della composizione e della regolazione biochimica dell'output delle cellule T.

Ciò include, ad esempio, lo studio dei recettori dell'antigene chimerico, i farmaci che inibiscono specifiche vie di segnalazione o l'ablazione genetica dei geni di interesse. Uno degli aspetti più critici di questo protocollo è l'ottimizzazione delle calibrazioni proteiche e del pannello di citometria a flusso multicolore necessario per tracciare la particella trans-sinaptica di interesse. Ciò richiede l'iterazione sistematica delle concentrazioni proteiche, delle concentrazioni di anticorpi e delle impostazioni dello strumento.

Iniziare diluendo un microlitro di soluzione di perline con 1.000 microlitri di PBS. Conta le perline usando una camera emocitometrica e calcola la loro concentrazione per millilitro. Quindi, calcolare il volume di perline di silice necessarie per 500.000 BSLB finali per punto di titolazione.

Trasferire il volume richiesto di perline di silice in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri. Lavare le perle di silice tre volte con un millilitro di PBS sterile e centrifugare le perline. Preparare tre volumi di mix principale di liposomi contenenti un ultimo 12,5 per cento di talpa di fosfolipidi contenenti nichel.

Utilizzare il mix master di liposomi per risospese le perle di silice lavate. Quindi, mescolare delicatamente pipettando su e giù metà del volume totale. Utilizzando una tecnica sterile, aggiungere argon o azoto gassoso al tubo per spostare l'aria e proteggere i lipidi dall'ossidazione durante la miscelazione.

Aggiungere argon alle scorte lipidiche 0,4 millimolari. Conservare il brodo e manipolare utilizzando una tecnica sterile. Spostare i BSLB sul mixer verticale e mescolare per 30 minuti a temperatura ambiente utilizzando la miscelazione orbitale a 10 RPM.

Quindi, ruotare le perline centrifugando per 15 secondi a temperatura ambiente su una minicentrifuga da banco. Bloccare i BSLB formati aggiungendo un millilitro di BSA al 5% contenente 100 micromolari di solfato di nichel per saturare i siti NTA sui BSLB. Lavare tre volte utilizzando il tampone HBS-HSA per rimuovere la soluzione di blocco in eccesso.

Prendi una nuova piastra a 96 pozzetti con fondo a U o A V e prepara due diluizioni seriali delle proteine. Sospendere i BSLB preparati in un volume tale che 100 microlitri di buffer HBS-HSA contengano 500.000 BSLB. Quindi, prendi un'altra piastra a 96 pozzetti con fondo a U o V e trasferisci 100 microlitri della sospensione BSLB ai pozzetti in modo tale che ogni pozzo riceva 500.000 BSBL.

Far girare la seconda piastra a temperatura ambiente per due minuti a 300x G.Scartare il surnatante e trasferire volumi di 100 microlitri dalla piastra di titolazione proteica alla piastra contenente i BSLB sedimentati. Mescolare delicatamente, evitando la generazione di bolle in eccesso durante il pipettaggio. Utilizzare un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti a 1.000 RPM.

Quindi, lavare la piastra tre volte aggiungendo il tampone HBS-HSA alla piastra e ruotarla a temperatura ambiente per due minuti a 300x G.Contare le celle dopo il lavaggio. Quindi, diluirli a una concentrazione finale di 2,5 milioni per millilitro utilizzando il mezzo di saggio di trasferimento sinaptico. Una volta che i BSLB sono caricati con la miscela proteica, lavare i BSLB due volte con tampone HBS-HSA per rimuovere le proteine non legate in eccesso.

Sospendere 500.000 BSLB per pozzetto in 200 microlitri di buffer HBS-HSA. Trasferire 100 microlitri di BSLB per pozzetto a una nuova piastra a 96 pozzetti con fondo a U per creare un duplicato, in modo tale che la quantità finale di BSLB per pozzo sia 250.000. Abbassare i BSLB a 300x G per due minuti a temperatura ambiente.

Scartare il surnatante e quindi risospescere i BSLB usando 100 microlitri di sospensione di cellule T. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di bolle. Incubare le co-colture per 90 minuti a 37 gradi Celsius.

Proteggere le cellule dalla luce e raffreddare le co-colture incubandole prima a temperatura ambiente per un minimo di 15 minuti. Centrifugare le co-colture a temperatura ambiente per cinque minuti a 500x G.Scartare il surnatante e risospese le co-colture in calcio e magnesio 2%BSA PBS senza ioni a temperatura ambiente per il blocco. Mettere le cellule sul ghiaccio per 45 minuti e proteggerle dalla luce.

Preparare la miscela principale di anticorpi utilizzando il 2% BSA filtrato a 0,22 micrometri e PBS ghiacciato come tampone di colorazione. Questo mix principale fornirà un blocco extra. Abbassare le co-colture a 500x G per cinque minuti e quattro gradi Celsius.

Scartare i supernatanti e quindi utilizzare una pipetta multicanale per risospescere le cellule nella miscela principale di colorazione contenente concentrazioni di anticorpi ottimizzate. Includere cellule marcate con isotipo e BSLB, BSLB fluorescenti e non fluorescenti e cellule e BSLB colorati da soli. Mescolare delicatamente pipettando su e giù metà del volume.

Incubare per 30 minuti sul ghiaccio e proteggerli dalla luce. Lavare le cellule e i BSLB due volte usando il 2% BSA PBS ghiacciato. Girali verso il basso a 500x G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, controllare la co-coltura sedimentata sul fondo dei pozzi. Quindi, risospendere le co-colture lavate in 100 microlitri di PBS e acquisire immediatamente. Attivare la scala di registro per la luce diffusa lateralmente e il parametro del tempo di volo per le luci sparse laterali e in avanti.

Acquisire gli standard MESF, assicurando che sia le popolazioni dim-set che le popolazioni più brillanti rientrino nella gamma lineare dello strumento. Quindi, acquisire campioni di compensazione, calcolare la compensazione e applicare la matrice di compensazione all'esperimento. Acquisire e salvare un minimo di 20.000 standard MESF totali per ciascun canale di quantificazione.

Evitare l'uso di liquido guaina FACS o simile alle perle MESF risospese, poiché contengono sali e alcoli che distruggeranno i fluorocromi, portando a picchi di fluorescenza più ampi e ad un elevato errore. Per l'acquisizione utilizzando campionatori ad alta produttività, impostare l'acquisizione dello strumento su Standard, impostare l'acquisizione del campione su 80 microlitri. Portata del campione tra due e tre microlitri al secondo, volume di miscelazione del campione a 50 microlitri, miscelazione del campione di 150 microlitri al secondo e miscelazione per pozzo tra tre e cinque.

Acquisire un minimo di 10.000 BSLB singoli per campione. Infine, esporta i file FCS. Un esempio di misurazioni quantitative della citometria a flusso di ICAM-1 sulla superficie delle cellule B tonsillari e delle cellule T helper è mostrato qui.

Le immagini rappresentative descrivono la strategia di gating per l'analisi di singole cellule CXCR5 B e cellule T follicolari-helper isolate da tonsille palatine umane. Questa strategia di gating sequenziale identifica i singoli eventi live all'interno della finestra di acquisizione continua. I doppietti, l'espressione della superficie cellulare di ICAM-1 rispetto ai controlli FMO e i controlli FMO etichettati con isotipi rilevanti delle popolazioni, sono mostrati qui.

La gating e la misurazione delle IFM di diverse popolazioni MESF standard negli istogrammi sovrapposti delle popolazioni MESF sono mostrate qui. I valori rappresentano le IFM per ciascuna delle cinque popolazioni MESF. La regressione lineare del MESF su cMFI per le popolazioni MESF è presentata qui.

La pendenza estrae MESF legato alle cellule dai dati FCM di ICAM-1 sulla superficie delle cellule B tonsillari in TFH. La conversione in densità molecolari assolute segue queste semplici operazioni matematiche. Le immagini rappresentative mostrano l'analisi citometrica a flusso di BSLB ricostituiti con densità aumentate di istidine monomeriche ricombinanti ICAM-1 12.

Le analisi di regressione della concentrazione di riferimento ICAM-1 rispetto alla densità misurata sono mostrate qui. La pendenza viene utilizzata per calcolare le concentrazioni target di proteine per raggiungere la densità delle cellule. I diagrammi di flusso mostrano i passaggi critici per la co-coltura di cellule T con BSLB, ricostituendo membrane modello nella successiva misurazione del trasferimento di particelle con citometria a flusso.

La strategia di gating per identificare singoli BSLB e celle all'interno della finestra di acquisizione continua è mostrata qui. Uno degli aspetti più importanti di questo protocollo è che, per mantenere la riproducibilità dei risultati, ogni volta che si cambiano le scorte proteiche o lipidiche, è necessario eseguire nuove analisi di calibrazione. Per scoprire nuove molecole efficaci secrete da diversi sottoinsiemi di cellule T, i BSLB possono essere ulteriormente isolati mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza sottoposte ad analisi trascrittomico e proteomica.

I nostri colleghi dell'Università di Oxford hanno utilizzato questa tecnologia per studiare e dimostrare nuove interazioni recettore-ligando e anche per studiare gli effetti delle ablazioni genetiche sulla produzione della sinapsi immunitaria delle cellule T.