Name: Preparazione di doppi strati lipidici supportati da perline per studiare la produzione di particolato delle sinapsi immunitarie delle cellule T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Scopri come preparare doppi strati lipidici supportati da perline per studiare la produzione di particolato delle sinapsi immunitarie delle cellule T. Questo metodo ottimizza la citometria a flusso multicolore per analisi accurate.

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Siamo grati ai nostri membri del laboratorio e alla comunità del Kennedy Institute of Rheumatology per le discussioni scientifiche costruttive, in particolare il nostro responsabile della struttura di citometria a flusso Jonathan Webber. Questo lavoro è stato finanziato dalla Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, dall'ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) e dal Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (tutti e tre a MLD). PFCD è stato sostenuto da EMBO Long-Term Fellowship (ALTF 1420-2015, in collaborazione con la Commissione Europea (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) e Marie Sklodowska-Curie Actions) e una Oxford-Bristol Myers Squibb Fellowship.

<ol><li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li>
<li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li>
<li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528(2019).</li>
<li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li>
<li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li>
<li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li>
<li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+%28Th%29+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate%3A+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li>
<li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li>
<li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li>
<li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 18 Unit 18.13 (2007).</li>
<li>Abcam. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+compensation+for+flow+cytometry%3A+visualization+artifacts%2C+limitations%2C+and+caveats%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li>
<li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367(2020).</li>
<li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li>
<li>Céspedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654(2017).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+autofluorescence+after+compensation%3A+Be+panglossian%2C+fret+not%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li>
<li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+controls%2C+instrument+setup%2C+and+the+determination+of+positivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li>
<li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li>
<li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.

I BSLB sono strumenti versatili per studiare la produzione di particolato delle cellule T stimolate con membrane APC modello. La flessibilità del metodo consente la ricostituzione di composizioni di membrana complesse e riduzioniste per studiare gli effetti dei ligandi e dei loro segnali sulla secrezione di tSV e particelle di attacco supramolecolare e dei loro componenti. Abbiamo testato questa tecnologia su varie cellule T, tra cui TH, CTL, Tregs e CART15 preattivati. Questo protocollo funziona ...

La sinapsi immunologica (IS) è una struttura molecolare cardine formata all'interfaccia di cellule impegnate nel contatto fisico che facilita lo scambio regolato di informazioni juxtracrine. Diversi IS sono stati descritti in letteratura e un numero crescente di prove suggerisce che questi hub molecolari sono una caratteristica conservata delle reti cellulari. Varie cellule immunitarie, tra cui cellule B, cellule natural killer, cellule dendritiche, macrofagi e cellule T, si scambiano informazioni attraverso l'assemblaggio di contatti di breve durata1. Studi multiomici stanno facendo progredire la comprensione di nuovi sottoinsiemi di leucociti e cellule stromali che guidano reti cellulari patogene ed esprimono proteine di superficie con funzioni sconosciute. Come APC sintetici, i BSLB consentono lo studio diretto del ruolo funzionale delle singole proteine nell'integrazione dei segnali attivanti, vale a dire antigeni e costimolazione/corepressione, da parte delle cellule T e il conseguente rilascio di particelle effettrici denominate segnale quattro.
Questo documento descrive i protocolli e i punti tecnici critici da considerare durante l'utilizzo dei BSLB per imitare la composizione superficiale degli APC modello. I protocolli per la misurazione quantitativa dei recettori immunitari e di altre proteine di superficie sulle APC sono presentati insieme al protocollo per la ricostituzione di APC sintetici contenenti queste quantità misurate. Quindi, i passaggi necessari per la coculturazione delle cellule T e BSLB vengono presentati insieme al protocollo per la misurazione quantitativa del trasferimento di particelle trans-sinaptiche utilizzando la citometria a flusso. Più sorprendentemente, i BSLB facilitano lo studio di una popolazione di TSV derivati dalla membrana plasmatica chiamati ectosomi sinaptici (SE). Le SE arricchite con recettore dell'antigene delle cellule T (TCR+) vengono eliminate in risposta all'attivazione del TCR2 e catturate in modo efficiente dai BSLB3, rappresentando un'eccellente lettura per valutare le proprietà agonistiche degli antigeni e la composizione della membrana modellata. Gli esosomi CD63+ e le particelle di attacco supramolecolare (SMAP) vengono anche rilasciati dalle cellule T stimolate e catturati dai BSLB. Possono essere utilizzati come letture aggiuntive dell'attivazione e della conseguente secrezione di granuli esocitici e litici da parte delle cellule T. La mobilizzazione delle vescicole esocitiche al polo interagente della cellula T facilita anche il rilascio direzionale di citochine, come IL-2, IFN-γ e IL-10 in risposta all'attivazione4,5,6,7,8. Sebbene le citochine rilasciate dalle cellule T possano essere rilevate anche sui BSLB, uno studio più dedicato è attualmente in fase di sviluppo per convalidare l'analisi quantitativa del rilascio di citochine nella sinapsi immunologica.
Per interrogarsi su come specifiche composizioni di membrana influenzano l'output sinaptico delle cellule T è necessario definire la densità fisiologica della componente della membrana bersaglio. Le quantificazioni basate sulla citometria a flusso delle proteine di superficie cellulare sono un passo essenziale in questo protocollo e richiedono: 1) l'uso di anticorpi con un numero noto di fluorocromi per anticorpo (F / P) e 2) perline di riferimento che forniscono un riferimento standard per l'interpolazione di molecole di fluorocromo da intensità medie di fluorescenza misurate (MFI).
Questi standard di riferimento sono costituiti da cinque popolazioni di perline, ciascuna contenente un numero crescente di fluorocromi solubili equivalenti (MESF), che coprono la gamma dinamica di rilevamento arbitrario della fluorescenza. Queste popolazioni standard producono picchi di fluorescenza discreti, facilitando la conversione di unità di fluorescenza arbitrarie in MESF mediante semplice regressione lineare. I MESF risultanti vengono quindi utilizzati insieme ai valori degli anticorpi F / P per calcolare il numero medio di molecole legate per cellula (o BSLB nelle fasi successive). L'applicazione di aree di superficie cellulare stimate al numero medio di molecole rilevate consente quindi il calcolo delle densità fisiologiche come molecole/μm2. Questo protocollo di quantificazione può anche essere adattato alla misurazione delle densità proteiche sulle cellule T e alla ricostituzione biochimica delle composizioni di membrana che mediano la formazione di sinapsi omotipiche delle cellule T (cioè le sinapsi T-T9). Se necessario, la valenza del legame anticorpale può essere ulteriormente stimata utilizzando bersagli ricombinanti etichettati con un numero noto di fluorocromi per molecola. Quindi, la valenza legante gli anticorpi può essere calcolata per la stessa popolazione BSLB confrontando contemporaneamente il numero di proteine fluorescenti legate e gli anticorpi di quantificazione (utilizzando due diversi fluorocromi di quantificazione e standard MESF).
La ricostituzione delle membrane APC richiede l'assemblaggio di doppi strati lipidici supportati (SLB) su perle di silice1. Gli stock di liposomi contenenti diverse specie di fosfolipidi possono essere sfruttati per formare una matrice lipidico-bistrato versatile, consentendo l'ancoraggio di proteine ricombinanti con una diversa chimica di legame (la preparazione dei liposomi è dettagliata in 10). Una volta definita la densità fisiologica (o densità) del ligando pertinente "sulle cellule", lo stesso protocollo di citometria a flusso viene adattato per stimare la concentrazione di proteina ricombinante necessaria per rivestire i BSLB con la densità fisiologica target. Due diversi sistemi di ancoraggio possono essere utilizzati in combinazione o separatamente.
In primo luogo, SLB contenente un ultimo 12,5 mol% di fosfolipidi contenenti Ni2+ è sufficiente a fornire circa 10.000 siti di legame His-tag per micron quadrato10 e funziona bene per decorare BSLB con la maggior parte delle proteine disponibili in commercio le cui densità fisiologiche non superano questa capacità di carico massima. Il secondo sistema di carico sfrutta i fosfolipidi contenenti biotina (come mol%) per caricare i biotinilati anti-CD3e Fab (o monomeri HLA / MHC) tramite ponti di streptavidina. La combinazione di questi due metodi di decorazione BSLB consente quindi la personalizzazione flessibile dei BSLB come APC sintetici. Per composizioni superficiali APC altamente complesse, il mol% di fosfolipidi e proteine può essere aumentato per caricare tutte le proteine richieste dalla domanda in questione. Una volta definite le concentrazioni di lavoro delle proteine e il mol% dei fosfolipidi biotinilati, i BSLB possono essere assemblati per interrogare l'output sinaptico delle cellule T con citometria a flusso multiparametrica.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-[(acido N-(5-ammino-1-carbossipentil)iminodiacetico)succinil] (sale di nichel)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404C-25mg</td><td>18:1 DGS-NTA(Ni) in cloroformio</td></tr><tr><td> PIPETMAN L Multicanale P8x200L, 20-200 &; L</td><td>Gilson</td><td>FA10011</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C-25mg</td><td>&nbsp; 18:1 (&Delta; 9-Cis) PC (DOPC) in cloroformio</td></tr><tr><td>1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina (DOPE) ATTO 390</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td><td>DOPE ATTO 390</td></tr><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolammina (DOPE) ATTO 488</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 488-165</td><td>DOPE ATTO 488</td></tr><tr><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) ATTO 565</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 565-165</td><td>DOPE ATTO 565</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(cap biotinyl) (sale sodico)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870273C-25mg</td><td>18:1 Biotinyl Cap PE in cloroformio</td></tr><tr><td>200 &; L punte gialle 10 x 96 punte, Stack</td><td>Starlab</td><td>S1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>5 mL di provette in polistirene a fondo tondo</td><td>Falcon&reg;</td><td></td><td></td>352052</tr><tr><td>5,00 &plusmn; 0,05 &micro; m perle di silice non funzionalizzate</td><td>Bangs Laboratories Inc.</td><td></td><td></td>SS05003</tr><tr><td>Piastra di cultura cellulare a 96 pozzetti con fondo a U con coperchio, trattamento con coltura tissutale, apirogena.</td><td>Costar&reg;</td><td>3799</td><td>Per colorazione FCM e co-coltura di BSLB e cellule.</td></tr><tr><td>Piastra di cultura cellulare a 96 pozzetti, fondo a V con coperchio, coltura tissutale trattata, apirogena.</td><td>Costar&reg;</td><td>3894</td><td>Per la colorazione FCM di cellule o perline in sospensione.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 NHS Estere (Succinimidil Estere)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen&commercio;</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Estere (Succinimidil Estere)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen&commercio;</td><td>A37573 e A20006</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R Centrifuga</td><td>Beckman Coltro</td><td></td><td>Per la normale colorazione in provetta di campioni biologici per FCM</td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Qualsiasi marca</td><td></td><td>Per proteggere le cellule e i BSLB dalla luce</td></tr><tr><td>anti-umana CD154 (CD40L), clone 24-31</td><td>BioLegend</td><td>310815 e 310818</td><td>coniugati Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647, rispettivamente.</td></tr><tr><td>anti-umano CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, clone J252D4</td><td>BioLegend</td><td>356934</td><td>Per l'analisi quantitativa della FCM delle cellule tonsillari come mostrato in Fig. 1E</td></tr><tr><td>anti-umano CD19 Brilliant Violet 421, clone HIB19</td><td>BioLegend</td><td>302234</td><td>Per l'analisi quantitativa della FCM delle cellule tonsillari come mostrato in Fig. 1E</td></tr><tr><td>anti-umano CD2, clone RPA-2.10</td><td>BioLegend</td><td>300202</td><td>Etichettato in casa con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr> <tr><td>anti-umano CD2, clone TS1/8</td><td>BioLegend</td><td>309218</td><td>coniugato Brilliant Violet 421.</td></tr><tr><td>CD252 anti-umano (OX40L), clone 11C3.1</td><td>BioLegend</td><td></td><td>Alexa Fluor 647 coniugato</td></tr><tr><td>anti-CD28 umano, clone CD28.2</td><td>eBioscience</td><td>16-0289-85</td><td>Marcato internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr><tr><td>CD317 anti-umano (BST2, PDCA-1), clone 26F8</td><td>ThermoFisher Scientific, coniugato invitrogen</td><td>53-3179-42</td><td>Alexa Fluor 488, abbiamo scoperto che questo clone è più pulito del clone RS38E.</td></tr><tr><td>CD38 anti-umano, clone HB-7</td><td>BioLegend</td><td>356624</td><td>Alexa Fluor 700 coniugato</td></tr><tr><td>anti-umano CD38, clone HIT2</td><td>BioLegend</td><td>303514</td><td>Alexa Fluor 647 coniugato</td></tr><tr><td>anti-umano CD39, clone A1</td><td>BioLegend</td><td></td><td>Marcato in casa con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr><tr><td>anti-umano CD4 Brilliant Violet 650, clone OKT4</td><td>BioLegend</td><td>317436</td><td>Per l'analisi quantitativa della FCM delle cellule tonsillari, come mostrato in Fig. 1E</td></tr><tr><td>, CD4 anti-umano, clone A161A1</td><td>BioLegend</td><td>357414 e 357421</td><td>coniugati PerCP/Cyanine5.5 e Alexa Fluor 647, rispettivamente</td></tr><tr><td>CD4 anti-umano, clone OKT4</td><td>BioLegend</td><td>317414 e coniugati 317422</td><td>PE/Cy7 e Alexa Fluor 647, rispettivamente</td></tr><tr><td>CD40 anti-umano, clone 5C3</td><td>BioLegend</td><td>334304</td><td>Etichettato internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr><tr><td>anti-umano CD40, clone G28.5</td><td>BioLegend</td><td></td><td>Marcato internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr><tr><td>anti-umano CD45, clone HI30</td><td>BioLegend</td><td>304056 e 368516</td><td>Alexa Fluor 647 e APC/Cy7 coniugati</td></tr><tr><td>anti-umano CD47, clone CC2C6</td><td>BioLegend</td><td>323118</td><td>coniugato</td></tr> <tr><td>Alexa Fluor 647CD54 anti-umano (ICAM-1), clone HCD54</td><td>BioLegend</td><td>322702</td><td>Marcato in casa con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr><tr><td>anti-umano CD63 (LAMP-3), clone H5C6</td><td>BioLegend</td><td>353020 e coniugati 353015</td><td>PerCP/Cyanine5.5 e Alexa Fluor 647, rispettivamente</td></tr><tr><td>CD73 anti-umano, clone AD2</td><td>BioLegend</td><td>344002</td><td>Marcato in house con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr><tr><td>CD80 anti-umano, clone 2D10</td><td>BioLegend</td><td>305216</td><td>Alexa Fluor 647 coniugato</td></tr><tr><td>anti-umano CD81, clone 5A6</td><td>BioLegend</td><td>349512 e 349502</td><td>PE/Cy7 coniugato e marcati in house con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester), rispettivamente.</td></tr><tr><td>CD82 anti-umano, clone ASL-24</td><td>BioLegend</td><td>342108</td><td>Alexa Fluor 647 coniugato</td></tr><tr><td>anti-umano CD86, clone IT2.2</td><td>BioLegend</td><td>305416</td><td>Alexa Fluor 647 coniugato</td></tr><tr><td>anti-umano CD8a, clone HIT8a</td><td>BioLegend</td><td>300920</td><td>Alexa Fluor 700 coniugato</td></tr><tr><td>anti-umano CD8a, clone SK1</td><td>BioLegend</td><td>344724</td><td>Alexa Fluor 700 coniugato</td></tr><tr><td>anti-umano HLA-A/ B/C/E, clone w6/32</td><td>BioLegend</td><td>311414 e 311402</td><td>Alexa Fluor 647 coniugato ed etichettato in casa con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr> <tr><td>anti-HLA-DR umano, clone L243</td><td>BioLegend</td><td>307656 e coniugati 307622</td><td>Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647, rispettivamente.</td></tr><tr><td>anti-umano ICAM-1, clone HCD54</td><td>BioLegend</td><td>322702</td><td>Marcato in casa con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr><tr><td>anti-umano ICOS, clone C398.4A</td><td>BioLegend</td><td>313516</td><td>Criceto armeno IgG</td></tr><tr><td>anti-umano ICOSL, clone MIH12</td><td>BioLegend</td><td>329611</td><td>Alexa Fluor 647 coniugato</td></tr><tr><td>anti-umano ICOSL, clone MIH12</td><td>eBioscience</td><td>16-5889-82</td><td>Etichettato internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr><tr><td>anti-umano LFA-1, clone TS1/22</td><td>BioLegend</td><td>Prodotto internamente</td><td>Etichettato internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr><tr><td>anti-umano OX40, clone Ber-ACT35 (ACT35)</td><td>BioLegend</td><td>350018</td><td>Alexa Fluor 647 coniugato</td></tr><tr><td>anti-umano PD-1, clone EH12.2H7</td><td>BioLegend</td><td>135230 e 329902</td><td>Alexa Fluor 647 coniugato ed etichettato internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr><tr><td>anti-umano PD-L1, clone 29E.2A3</td><td>BioLegend</td><td>329702</td><td>Marcato internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr><tr><td>anti-umano PD-L2, clone 24F.10C12</td><td>BioLegend</td><td>329611</td><td>Alexa Fluor 647 coniugato</td></tr><tr><td>anti-umano PD-L2, clone MIH18</td><td>BioLegend</td><td>345502</td><td>Etichettato internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr> <tr><td>anti-umano TCRab, clone IP26</td><td>BioLegend</td><td>306712 e</td><td>coniugati 306714 Alexa Fluor 488 e Alexa Fluor 647, rispettivamente.</td></tr><tr><td>antti-umano CD156c (ADAM10), clone SHM14</td><td>BioLegend</td><td>352702</td><td></td></tr><tr><td>anttico-umano CD317 (BST2, Tetherin), clone RS38E</td><td>BioLegend</td><td>348404</td><td>Alexa Fluor 647 coniugato</td></tr><tr><td>criceto armeno IgG Alexa Fluor 647 Controllo dell'isotipo, clone HTK888</td><td>BioLegend</td><td>400902</td><td>Etichettato in casa con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester</td></tr><tr><td>)BD Citometro Configurazione e perline di tracciamento</td><td>Becton Dickinson & Società (BD)</td><td>641319</td><td>Performance track degli strumenti prima dell'FCM quantitativo</td></tr><tr><td>BD FACSDiva</td><td>Becton Dickinson & Azienda (BD)</td><td>23-14523-00</td><td>Software di acquisizione</td></tr><tr><td>Bovino Seum Albumina</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, Cloruro di calcio</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>anidro, BioReagente, adatto per colture cellulari di insetti, adatto per colture cellulari vegetali, &ge; 96,0%</td></tr><tr><td>Caseina da latte bovino, adatta come substrato per protein chinasi (dopo defosforilazione), polvere purificata</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>C5890</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>11132D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>ThermoFisher Scientific, Invitrogen & trade;</td><td>12321D</td><td>Per la rimozione di Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 in volumi inferiori a 2 mL</td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-15</td><td>ThermoFisher Scientific, Invitrogen&trade;</td><td>12301D</td><td>Per la rimozione di Dynabeads&trade; T-attivatore umano CD3/CD28 in volumi inferiori a 15 mL</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino qualificato, One Shot</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>A3160801</td><td>Necessita di inattivazione del calore per 30 minuti a 56 oC</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Cytiva, GE Healthcare</td><td>GE17-1440-02</td><td>Soluzione sterile di polisaccaride e diatrizoato di sodio per l'isolamento dei linfociti</td></tr><tr><td>Colorante di vitalità fissabile eFluor 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-14</td><td>Per l'esclusione di cellule morte durante le analisi</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Becton Dickinson & Azienda (BD)</td><td>Versione 10.7.1</td><td>Software di analisi</td></tr><tr><td>Grant Bio MPS-1 Agitatore multipiastra</td><td>Keison Prodotti</td><td>MPS-1</td><td>Per la miscelazione di cellule durante le colorazioni o BSLB durante lo staning o il caricamento di proteine (in alternativa all'agitazione orbitale)</td></tr><tr><td>Soluzione tampone HEPES (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, acido N-(2-idrossietil)piperazina-N&prime;-(2-etansolfonico), acido 4-(2-idrossietil)piperazina-1-etansolfonico.</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>Per la preparazione di tampone HBS/HAS o HBS/BSA. Certificato BioPerformance, &ge; 99,5% (titolazione), adatto per colture cellulari</td></tr><tr><td>HERACell 150i CO2 incubatore, 150 L, acciaio inossidabile elettrolucidato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51026282</td><td>Per la coltura e l'espansione di cellule T CD4+ e CD8+ purificate.</td></tr><tr><td>Miscelatore Hula&reg; Miscelatore di campioni</td><td>ThermoFisher Scientific, Life Technologies</td><td>15920D</td><td>Miscelatore da laboratorio verticale ad angolo variabile utilizzato per la miscelazione di BSLB e master mix lipidici, soluzioni bloccanti, master mix proteici e colorazioni di anticorpi su piccola scala.</td></tr><tr><td>Albumina sierica umana, soluzione acquosa al 30%</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>12667-M</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blocco del recettore Fc TruStain FcX umano</td><td>BioLegend</td><td>422302</td> Soluzione di <td>blocco del recettore Fc per il blocco dei recettori Fc da campioni biologicamente rilevanti</td></tr><tr><td>Contatore e analizzatore di cellule CASY Innovatis TT</td><td>Biovendis Products GmbH</td><td></td><td>Per il conteggio delle celle e la determinazione delle dimensioni e del volume delle celle in base all'esclusione della corrente elettrica.</td></tr><tr><td>KCl, Cloruro di potassio</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>Polvere, BioReagente, adatto per colture cellulari</td></tr><tr><td>L-Glutammina 200 mM (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2, Cloruro di magessio</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td>BioReagent, adatto per colture cellulari, adatto per colture cellulari di insetti</td></tr><tr><td>Inserto per microprovette per 24 x 1,5/2,0 mL tubi</td><td>Keison Products</td><td>P-2-24</td><td>Inserto per microprovette Grant Bio MPS-1 Multi Plate Shaker</td></tr><tr><td>Mini Incubator</td><td>Labnet International&nbsp;</td><td>I5110A-230V</td><td>Per l'incubazione (co-coltura) di BSLB e cellule in assenza di CO2</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Controllo degli anticorpi policlonali IgG di topo</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>PP54</td><td>Utilizzato come controllo positivo per la misurazione degli anticorpi legati agli standard</td></tr> <tr><td>delle perle di cattura IgG di topoIgG1 di topo, k Isotype, clone MOPC-21</td><td>BioLegend</td><td>400129, 400112, 400130, 400144, 400128 e 400170</td><td>Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC/Cyanine7 e Brilliant Violet 785&nbsp; coniugati, rispettivamente.</td></tr><tr><td>IgG1 di topo, isotipo k, clone X40</td><td>Becton Dickinson & Company (BD), Orizzonte</td><td>562438</td><td>coniugato Brilliant Violet 421.</td></tr><tr><td>IgG1 di topo, &kappa; Controllo dell'isotipo, clone P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>14-4714-82</td><td>Marcato internamente con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr><tr><td>IgG2a di topo, Isotipo k, clone MOPC-173</td><td>BioLegend</td><td>400240</td><td>Alexa Fluor 647 coniugato</td></tr><tr><td>IgG2b di topo, Isotipo k, clone MPC-11</td><td>BioLegend</td><td>400330 e 400355</td><td>coniugati Alexa Fluor 647 e Brilliant Violet 785, rispettivamente</td></tr><tr><td>Multiwell 6 pozzetti Coltura tissutale trattata con plasma gassoso sottovuoto</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>Per la coltura e l'espansione di cellule T CD4+ e CD8+.</td></tr><tr><td>Na2HPO4, fosfato disodico</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, cloruro di sodio</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>BioReagent, adatto per colture cellulari, adatto per colture cellulari di insetti, adatto per colture cellulari vegetali, &ge; 99%</td></tr><tr><td>NiSO4, solfato di nichel(II)</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>656895</td><td>Per saturare i siti NTA; aggiunto durante il processo di blocco</td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina [+]10.000 unità Penicillina; [+] 10.000 &micro; g/mL di streptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato pH 7,4, sterile</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>10010</td><td>No Ca2+ o Mg2+ aggiunto</td></tr><tr><td>Polietersulfone (PES) Unità filtro</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>&nbsp; UY-06730-43</td><td>La membrana PES idrofila con basso legame proteico facilita il filtraggio di soluzioni ad alto contenuto proteico</td></tr><tr><td>PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar</td><td>BOC Ltd.</td><td>11-Y</td><td>Per la protezione delle scorte lipidiche immagazzinate a +4 &ordm;C.</td></tr><tr><td>Streptavidina purificata</td><td>BioLegend</td><td>280302</td><td></td></tr><tr><td>Quantum Alexa Fluor 488 perline MESF</td><td>Bangs Laboratories Inc.</td><td>488</td><td>Perle di riferimento per l'interpolazione di molecole Alexa Fluor 488 legate alle cellule e/o BSLB</td></tr><tr><td>Quantum Alexa Fluor 647 MESF beads</td><td>Bangs Laboratories Inc.</td><td>647</td><td>Beads di riferimento per l'interpolazione di molecole Alexa Fluor 647 legate alle cellule e/o BSLB</td></tr><tr><td>Rat anti-mouse IgG Kappa Light Chain, clone OX-20</td><td>ThermoFisher Scientific, invitrogen</td><td>SA1-25258</td><td>Marcato in casa con Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02-1MG</td><td></td></tr><tr><td>RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutammina</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta Cocktail di arricchimento di cellule B umane</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15064</td><td>Isolamento di cellule B per misurare la densità delle proteine in popolazioni cellulari purificate</td></tr><tr><td>Rosetta Cocktail di arricchimento di cellule T CD4+ umane STEMCELL</td><td>Technologies</td><td>15022C.1</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta Cocktail di arricchimento di cellule T umane CD4+CD127low</td><td>STEMCELL Tecnologie</td><td>15361</td><td>Pre-arricchimento di cellule T CD4+ CD127Low per l'isolamento a valle di Treg mediante FACS.</td></tr><tr><td>Cocktail di arricchimento di cellule T CD8+ umane a rosetta</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>15063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1x); [-] Rosso fenolo</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>11835-063</td><td>Per l'incubazione (co-coltura) di BSLB e cellule in assenza di CO2. I terreni privi di rosso fenolo riducono l'autofluorescenza delle cellule nelle misure di citometria a flusso e microscopia.</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrifuga per germogli</td><td>FisherScientific, Heathrow Scientific LLC</td><td>120301</td><td>Microcentrifuga da banco utilizzata per lavare perle di silice e BSLB in provette Eppendorf da 1,5 mL.</td></tr><tr><td>Provette sterili in polistirene da 5 mL con tappo Falcon</td><td></td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads Perline di compensazione</td><td>ThermoFisher Scientific, invitrogen</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Colonne di desalinizzazione 7K MWCO</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen&trade;</td><td>Codice 89882</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di doppi strati lipidici supportati da perline per studiare la produzione di particolato delle sinapsi immunitarie delle cellule t

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Le cellule che presentano l'antigene (APC) presentano tre segnali attivanti alle cellule T impegnate nel contatto fisico: 1) antigene, 2) costimolazione/corepressione e 3) citochine solubili. Le cellule T rilasciano due tipi di particelle effettrici in risposta all'attivazione: vescicole trans-sinaptiche (tSV) e particelle di attacco supramolecolare, che trasferiscono rispettivamente messaggeri intercellulari e mediano la citotossicità. Queste entità vengono rapidamente interiorizzate da APC impegnate in contatto fisico con le cellule T, rendendo la loro caratterizzazione scoraggiante. Questo documento presenta il protocollo per fabbricare e utilizzare i BSLB lipidici supportati da perline come mimetici delle cellule che presentano l'antigene (APC) per catturare e analizzare queste particelle trans-sinaptiche. Vengono inoltre descritti i protocolli per le misurazioni assolute delle densità proteiche sulle superfici cellulari, la ricostituzione dei BSLB con tali livelli fisiologici e la procedura di citometria a flusso per il monitoraggio del rilascio di particelle sinaptiche da parte delle cellule T. Questo protocollo può essere adattato per studiare gli effetti di singole proteine, miscele di ligandi complessi, determinanti di virulenza patogena e farmaci sulla produzione effettrice delle cellule T, comprese le cellule T helper, i linfociti T citotossici, le cellule T regolatorie e le cellule T che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CART).

FCM per la quantificazione assoluta delle proteine sulla superficie cellulare La ricostituzione di BSLB che presentano densità fisiologiche di ligandi richiede la stima delle densità proteiche totali sul sottoinsieme cellulare modellato. Per ricostituire i BSLB, includere qualsiasi ligando rilevante che si prevede svolga un ruolo nell'asse di segnalazione di interesse insieme alle proteine che supportano l'adesione e l'interazione funzionale tra BSLB e cellule, come ICAM-1 e molecole costimulatorie, a...

Qui presentiamo il protocollo per la ricostituzione graduale di cellule sintetiche che presentano antigene utilizzando Bead-Supported Lipid Bilayers e il loro uso per interrogare l'output sinaptico dalle cellule T attivate.

Preparazione di doppi strati lipidici supportati da perline per studiare la produzione di particolato delle sinapsi immunitarie delle cellule T

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

Lo studio della produzione della sinapsi immunitaria è stato limitato principalmente a metodi microscopici. I BSLB hanno ampliato il nostro repertorio di strumenti che possono essere utilizzati per studiare l'output delle sinapsi immunitarie delle cellule T, tra cui citometria a flusso, microscopia, proteomica e tecnologie di sequenziamento dell'RNA. Come tale, i BSLB possono essere utilizzati in un'ampia varietà di domande di immunologia e nell'identificazione della composizione e della regolazione biochimica dell'output delle cellule T.Ciò include, ad esempio, lo studio dei recettori dell'antigene chimerico, i farmaci che inibiscono specifiche vie di segnalazione o l'ablazione genetica dei geni di interesse. Uno degli aspetti più critici di questo protocollo è l'ottimizzazione delle calibrazioni proteiche e del pannello di citometria a flusso multicolore necessario per tracciare la particella trans-sinaptica di interesse. Ciò richiede l'iterazione sistematica delle concentrazioni proteiche, delle concentrazioni di anticorpi e delle impostazioni dello strumento.Iniziare diluendo un microlitro di soluzione di perline con 1.000 microlitri di PBS. Conta le perline usando una camera emocitometrica e calcola la loro concentrazione per millilitro. Quindi, calcolare il volume di perline di silice necessarie per 500.000 BSLB finali per punto di titolazione.Trasferire il volume richiesto di perline di silice in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri. Lavare le perle di silice tre volte con un millilitro di PBS sterile e centrifugare le perline. Preparare tre volumi di mix principale di liposomi contenenti un ultimo 12,5 per cento di talpa di fosfolipidi contenenti nichel.Utilizzare il mix master di liposomi per risospese le perle di silice lavate. Quindi, mescolare delicatamente pipettando su e giù metà del volume totale. Utilizzando una tecnica sterile, aggiungere argon o azoto gassoso al tubo per spostare l'aria e proteggere i lipidi dall'ossidazione durante la miscelazione.Aggiungere argon alle scorte lipidiche 0,4 millimolari. Conservare il brodo e manipolare utilizzando una tecnica sterile. Spostare i BSLB sul mixer verticale e mescolare per 30 minuti a temperatura ambiente utilizzando la miscelazione orbitale a 10 RPM.Quindi, ruotare le perline centrifugando per 15 secondi a temperatura ambiente su una minicentrifuga da banco. Bloccare i BSLB formati aggiungendo un millilitro di BSA al 5% contenente 100 micromolari di solfato di nichel per saturare i siti NTA sui BSLB. Lavare tre volte utilizzando il tampone HBS-HSA per rimuovere la soluzione di blocco in eccesso.Prendi una nuova piastra a 96 pozzetti con fondo a U o A V e prepara due diluizioni seriali delle proteine. Sospendere i BSLB preparati in un volume tale che 100 microlitri di buffer HBS-HSA contengano 500.000 BSLB. Quindi, prendi un'altra piastra a 96 pozzetti con fondo a U o V e trasferisci 100 microlitri della sospensione BSLB ai pozzetti in modo tale che ogni pozzo riceva 500.000 BSBL.Far girare la seconda piastra a temperatura ambiente per due minuti a 300x G.Scartare il surnatante e trasferire volumi di 100 microlitri dalla piastra di titolazione proteica alla piastra contenente i BSLB sedimentati. Mescolare delicatamente, evitando la generazione di bolle in eccesso durante il pipettaggio. Utilizzare un foglio di alluminio per proteggerlo dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti a 1.000 RPM.Quindi, lavare la piastra tre volte aggiungendo il tampone HBS-HSA alla piastra e ruotarla a temperatura ambiente per due minuti a 300x G.Contare le celle dopo il lavaggio. Quindi, diluirli a una concentrazione finale di 2,5 milioni per millilitro utilizzando il mezzo di saggio di trasferimento sinaptico. Una volta che i BSLB sono caricati con la miscela proteica, lavare i BSLB due volte con tampone HBS-HSA per rimuovere le proteine non legate in eccesso.Sospendere 500.000 BSLB per pozzetto in 200 microlitri di buffer HBS-HSA. Trasferire 100 microlitri di BSLB per pozzetto a una nuova piastra a 96 pozzetti con fondo a U per creare un duplicato, in modo tale che la quantità finale di BSLB per pozzo sia 250.000. Abbassare i BSLB a 300x G per due minuti a temperatura ambiente.Scartare il surnatante e quindi risospescere i BSLB usando 100 microlitri di sospensione di cellule T. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di bolle. Incubare le co-colture per 90 minuti a 37 gradi Celsius.Proteggere le cellule dalla luce e raffreddare le co-colture incubandole prima a temperatura ambiente per un minimo di 15 minuti. Centrifugare le co-colture a temperatura ambiente per cinque minuti a 500x G.Scartare il surnatante e risospese le co-colture in calcio e magnesio 2%BSA PBS senza ioni a temperatura ambiente per il blocco. Mettere le cellule sul ghiaccio per 45 minuti e proteggerle dalla luce.Preparare la miscela principale di anticorpi utilizzando il 2% BSA filtrato a 0,22 micrometri e PBS ghiacciato come tampone di colorazione. Questo mix principale fornirà un blocco extra. Abbassare le co-colture a 500x G per cinque minuti e quattro gradi Celsius.Scartare i supernatanti e quindi utilizzare una pipetta multicanale per risospescere le cellule nella miscela principale di colorazione contenente concentrazioni di anticorpi ottimizzate. Includere cellule marcate con isotipo e BSLB, BSLB fluorescenti e non fluorescenti e cellule e BSLB colorati da soli. Mescolare delicatamente pipettando su e giù metà del volume.Incubare per 30 minuti sul ghiaccio e proteggerli dalla luce. Lavare le cellule e i BSLB due volte usando il 2% BSA PBS ghiacciato. Girali verso il basso a 500x G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, controllare la co-coltura sedimentata sul fondo dei pozzi. Quindi, risospendere le co-colture lavate in 100 microlitri di PBS e acquisire immediatamente. Attivare la scala di registro per la luce diffusa lateralmente e il parametro del tempo di volo per le luci sparse laterali e in avanti.Acquisire gli standard MESF, assicurando che sia le popolazioni dim-set che le popolazioni più brillanti rientrino nella gamma lineare dello strumento. Quindi, acquisire campioni di compensazione, calcolare la compensazione e applicare la matrice di compensazione all'esperimento. Acquisire e salvare un minimo di 20.000 standard MESF totali per ciascun canale di quantificazione.Evitare l'uso di liquido guaina FACS o simile alle perle MESF risospese, poiché contengono sali e alcoli che distruggeranno i fluorocromi, portando a picchi di fluorescenza più ampi e ad un elevato errore. Per l'acquisizione utilizzando campionatori ad alta produttività, impostare l'acquisizione dello strumento su Standard, impostare l'acquisizione del campione su 80 microlitri. Portata del campione tra due e tre microlitri al secondo, volume di miscelazione del campione a 50 microlitri, miscelazione del campione di 150 microlitri al secondo e miscelazione per pozzo tra tre e cinque.Acquisire un minimo di 10.000 BSLB singoli per campione. Infine, esporta i file FCS. Un esempio di misurazioni quantitative della citometria a flusso di ICAM-1 sulla superficie delle cellule B tonsillari e delle cellule T helper è mostrato qui.Le immagini rappresentative descrivono la strategia di gating per l'analisi di singole cellule CXCR5 B e cellule T follicolari-helper isolate da tonsille palatine umane. Questa strategia di gating sequenziale identifica i singoli eventi live all'interno della finestra di acquisizione continua. I doppietti, l'espressione della superficie cellulare di ICAM-1 rispetto ai controlli FMO e i controlli FMO etichettati con isotipi rilevanti delle popolazioni, sono mostrati qui.La gating e la misurazione delle IFM di diverse popolazioni MESF standard negli istogrammi sovrapposti delle popolazioni MESF sono mostrate qui. I valori rappresentano le IFM per ciascuna delle cinque popolazioni MESF. La regressione lineare del MESF su cMFI per le popolazioni MESF è presentata qui.La pendenza estrae MESF legato alle cellule dai dati FCM di ICAM-1 sulla superficie delle cellule B tonsillari in TFH. La conversione in densità molecolari assolute segue queste semplici operazioni matematiche. Le immagini rappresentative mostrano l'analisi citometrica a flusso di BSLB ricostituiti con densità aumentate di istidine monomeriche ricombinanti ICAM-1 12.Le analisi di regressione della concentrazione di riferimento ICAM-1 rispetto alla densità misurata sono mostrate qui. La pendenza viene utilizzata per calcolare le concentrazioni target di proteine per raggiungere la densità delle cellule. I diagrammi di flusso mostrano i passaggi critici per la co-coltura di cellule T con BSLB, ricostituendo membrane modello nella successiva misurazione del trasferimento di particelle con citometria a flusso.La strategia di gating per identificare singoli BSLB e celle all'interno della finestra di acquisizione continua è mostrata qui. Uno degli aspetti più importanti di questo protocollo è che, per mantenere la riproducibilità dei risultati, ogni volta che si cambiano le scorte proteiche o lipidiche, è necessario eseguire nuove analisi di calibrazione. Per scoprire nuove molecole efficaci secrete da diversi sottoinsiemi di cellule T, i BSLB possono essere ulteriormente isolati mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza sottoposte ad analisi trascrittomico e proteomica.I nostri colleghi dell'Università di Oxford hanno utilizzato questa tecnologia per studiare e dimostrare nuove interazioni recettore-ligando e anche per studiare gli effetti delle ablazioni genetiche sulla produzione della sinapsi immunitaria delle cellule T.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Supportati doppi strati planari sono strumenti potenti che possono essere utilizzati per modellare le interazioni molecolari in una sinapsi immunologica. Qui vi mostriamo i metodi per l'ancoraggio delle proteine ​​di adesione cellulare conosciuto per modulare la formazione di sinapsi il foglio superiore della bilyer lipidi e visualizzare formazione di sinapsi usando la microscopia TIRF.

Supportato bilayers Planar per la formazione degli Studi di sinapsi immunologica e Kinapse

Questo video descrive la tecnica di studio dell'assemblaggio della proteina septina su microsfere rivestite con doppi strati lipidici. Questa tecnica aiuta a comprendere gli assemblaggi di proteine dipendenti dalla curvatura su superfici curve.

Saggio del doppio strato lipidico supportato sferico: una tecnica per osservare l'assemblaggio della septina su microsfere

Questo video mostra una tecnica per visualizzare la formazione della sinapsi immunologica nelle cellule natural killer (NK) su un doppio strato lipidico supportato (SLB). L'SLB viene prima marcato con un ligando del recettore attivante delle cellule NK marcato con fluoroforo, seguito dall'incubazione con cellule NK. Successivamente, le cellule vengono colorate per l'actina polimerizzata e i granuli litici perforin-positivi. Questo approccio consente la visualizzazione della formazione delle...

Imaging a super-risoluzione della formazione di sinapsi immunologiche delle cellule NK su un doppio strato lipidico supportato

Questo video dimostra una tecnica in vitro per studiare la formazione di sinapsi immunitarie tra le cellule T umane primarie e i doppi strati lipidici supportati (SLB). Le proteine della superficie delle cellule T interagiscono con i rispettivi ligandi immobilizzati su SLB per formare una sinapsi immunitaria, seguita dal movimento dei granuli litici verso la sinapsi, che viene visualizzato utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Una tecnica in vitro per studiare l'interazione delle cellule T con i doppi strati lipidici planari supportati

Questo video illustra la ricostituzione di cellule sintetiche presentanti l'antigene attraverso i doppi strati lipidici supportati da perline e la loro applicazione nella valutazione dell'output sinaptico generato dalle cellule T attivate.

Utilizzo di doppi strati lipidici supportati da perline per studiare l'output sinaptico dalle cellule T

Bistrati lipidici supportati e particelle di membrana naturali sono sistemi convenienti che può approssimare le proprietà delle membrane cellulari e di essere incorporati in una varietà di strategie analitiche. Qui mostriamo un metodo per preparare microarray composto da supportati doppio strato lipidico rivestite SiO 2 perline, vescicole di fosfolipidi di membrana o particelle naturali.

Formazione di microarray di membrana con un metodo di assemblaggio con sede a seccatoio

Descriviamo qui una combinazione della tecnica del doppio strato lipidico supportato da vetro per formare sinapsi immunologiche con la tecnica di imaging a super-risoluzione della microscopia STED (Stimulated Emission Depletion). L'obiettivo di questo protocollo è fornire agli utenti le istruzioni necessarie per eseguire con successo queste due tecniche.

Super-Resolution Imaging di cellule Natural Killer immunologica Sinapsi su un vetro supportato Planar doppio strato lipidico

L'immunità adattativa è controllata da 'sinapsi immunologiche' dinamiche formate tra le cellule T e le cellule presentanti l'antigene. Questo protocollo descrive i metodi per studiare le cellule endoteliali sia come APC fisiologiche poco studiate sia come un nuovo tipo di "modello di APC cellulare planare".

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Presentiamo un protocollo per funzionalizzare vetro con macchie proteiche nanometriche circondato da un doppio strato lipidico fluido. Questi substrati sono compatibili con la microscopia ottica avanzata e si prevede di utilizzare come piattaforma per gli studi di adesione cellulare e migrazione.

Array Ligand Nano-cluster in un doppio strato lipidico supportati

Il protocollo descrive una tecnica per studiare la capacità delle cellule T umane policlonali primarie per formare sinaptiche interfacce utilizzando lipidici planare. Usiamo questa tecnica per dimostrare la capacità di formazione di sinapsi differenziale delle cellule T umane primarie derivata da linfonodi e nel sangue periferico.

Valutazione dell'interfaccia sinaptica primaria umana delle cellule di T dal sangue periferico e tessuto linfoide

Questo protocollo descrive la formazione di vescicole unilipidiche e multilipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. Questi modelli in vitro possono essere adattati per incorporare una varietà di tipi di lipidi e possono essere utilizzati per studiare varie interazioni molecolari e macromolecole.

Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

Scopri come preparare doppi strati lipidici supportati da perline per studiare la produzione di particolato delle sinapsi immunitarie delle cellule T. Questo metodo ottimizza la citometria a flusso multicolore per analisi accurate.

Preparazione di doppi strati lipidici supportati da perline per studiare la produzione di particolato delle sinapsi immunitarie delle cellule T (Video) | JoVE Journal

Preparazione di doppi strati lipidici supportati da perline per studiare la produzione di particolato delle sinapsi immunitarie delle cellule T

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