Summary
חיידקים מפרישים שלפוחיות חוץ-תאיות בגודל ננומטר (EVs) הנושאות מולקולות ביולוגיות ביו-אקטיביות. מחקר EV מתמקד בהבנת הביוגנזה שלהם, תפקידם באינטראקציות ובמחלות בין מיקרובים למיקרובים ולמיקרובים מארחים, כמו גם ביישומים הטיפוליים הפוטנציאליים שלהם. זרימת עבודה לבידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים מחיידקים שונים מוצגת כדי להקל על סטנדרטיזציה של מחקר EV.
Abstract
מיני חיידקים מגוונים מפרישים ~20-300 ננומטר שלפוחית חוץ-תאית (EVs), המורכבת מליפידים, חלבונים, חומצות גרעין, גליקנים ומולקולות אחרות שמקורן בתאי ההורים. כלי רכב חשמליים מתפקדים כווקטורים לתקשורת תוך-מינית ובין מינים, תוך שהם תורמים גם לאינטראקציה בין חיידקים לאורגניזמים מארחים בהקשר של זיהום והתיישבות. בהתחשב בריבוי התפקודים המיוחסים לרכבים חשמליים בבריאות ובמחלות, יש עניין גובר בבידוד כלי רכב חשמליים למחקרי in vitro ו-in vivo . ההשערה הייתה כי הפרדת כלי רכב חשמליים על בסיס תכונות פיזיקליות, כלומר גודל, תקל על בידוד שלפוחיות מתרביות חיידקים מגוונות.
תהליך הבידוד מורכב מצנטריפוגה, סינון, אולטרה-סינון וכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC) לבידוד כלי רכב חשמליים מתרביות חיידקים. שלב סינון זרימה משיק מונע משאבה (TFF) שולב כדי לשפר את המדרגיות, ולאפשר בידוד של חומר מליטרים של תרבית תאים מתחילים. Escherichia coli שימשה כמערכת מודל המבטאת ננו-לוציפראז הקשור ל-EV ו-mCherry שאינו קשור ל-EV כחלבונים מדווחים. הננולוציפראז היה מכוון לרכבים החשמליים על ידי מיזוג ה-N-טרמינל שלו עם ציטוליזין A. שברים כרומטוגרפיים מוקדמים המכילים 20-100 ננומטר EVs עם ציטוליזין A - nanoLuc הקשורים היו שונים מן השברים המאוחרים יותר המכילים את החלבונים החופשיים. נוכחותו של ננולוציפראז הקשור ל- EV אושרה על ידי תיוג אימונוגולד ומיקרוסקופיית אלקטרונים. תהליך עבודה זה של בידוד EV ישים על מינים אחרים של חיידקים גראם-שליליים וגראם-חיוביים הקשורים למעי אנושיים. לסיכום, שילוב של צנטריפוגה, סינון, אולטרה-סינון/TFF ו-SEC מאפשר בידוד מדרגי של כלי רכב חשמליים ממיני חיידקים מגוונים. שימוש בתהליך בידוד סטנדרטי יאפשר מחקרים השוואתיים של כלי רכב חשמליים מיקרוביאליים בין מינים.
Introduction
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הן מבנים דמויי ליפוזום בגודל ננומטרי, המורכבים מליפידים, חלבונים, גליקנים וחומצות גרעין, המופרשים הן על ידי תאים פרוקריוטים והן על ידי תאים אאוקריוטים1. מאז המחקרים המוקדמים הממחישים את שחרורם של כלי רכב חשמליים מחיידקים גראם שליליים2, מספר הפונקציות הביולוגיות המיוחסות לרכבים חשמליים חיידקיים (בקוטר 20-300 ננומטר) גדל בהתמדה בעשורים האחרונים. תפקידיהם כוללים העברת עמידות לאנטיביוטיקה3, היווצרות ביופילם4, חישת מניין5 והעברת רעלנים6. יש גם עניין גובר בשימוש ברכבים חשמליים חיידקיים כטיפולים, במיוחד בחיסון7 ובטיפול בסרטן8.
למרות העניין הגובר בחקר כלי רכב חשמליים, עדיין קיימים אתגרים טכניים בנוגע לשיטות בידוד. באופן ספציפי, יש צורך בשיטות בידוד הניתנות לשחזור, מדרגיות ותואמות לאורגניזמים מגוונים המייצרים EV. כדי ליצור מערכת עקרונות אחידה לתכנון ודיווח על בידוד ושיטות מחקר של כלי רכב חשמליים, האגודה הבינלאומית לשלפוחיות חוץ-תאיות מפרסמת ומעדכנת את נייר העמדה של MISEV9. יתר על כן, קונסורציום EV-TRACK מספק פלטפורמה פתוחה לדיווח על מתודולוגיות מפורטות לבידוד EV המשמשות בכתבי יד שפורסמו כדי לשפר את השקיפות10.
בפרוטוקול זה הותאמו11,12 מתודולוגיות קודמות ששימשו לבידוד כלי רכב חשמליים מתרבית תאי יונקים, כדי לאפשר בידוד של כלי רכב חשמליים מתרבית תאי חיידקים. ביקשנו להשתמש בשיטות המאפשרות בידוד של כלי רכב חשמליים ממגוון מיקרובים, הניתנים להרחבה, ולאזן את הטוהר והתפוקה של EV (כפי שנדון בנייר העמדה של MISEV9). לאחר הסרת תאי חיידקים ופסולת על ידי צנטריפוגה וסינון, מדיום התרבית מרוכז על ידי אולטרה-סינון של מכשיר צנטריפוגלי (בנפח של עד ~100 מ"ל) או TFF מונע משאבה (לנפחים גדולים יותר). לאחר מכן, כלי רכב חשמליים מבודדים על ידי SEC באמצעות עמודות הממוטבות לטיהור כלי רכב חשמליים קטנים.
איור 1: סקירה סכמטית של זרימת עבודה של בידוד ר"ח חיידקי. קיצורים: EV = שלפוחית חוץ-תאית; TFF = סינון זרימה משיק; SEC = כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל; MWCO = חיתוך משקל מולקולרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
זן עכבר-קומנסאלי של Escherichia coli (כלומר, E. coli MP113) שימש כאורגניזם מודל ושונה כדי לבטא ננולוציפראז הקשור ל-EV על ידי היתוך לציטוליזין A, כפי שדווח בעבר14. השיטות המשמשות כאן יכולות לעבד לפחות עד כמה ליטרים של תרביות חיידקים ולהפריד ביעילות בין חלבונים הקשורים ל-EV לבין חלבונים שאינם קשורים ל-EV. לבסוף, שיטה זו יכולה לשמש גם עבור מינים אחרים של חיידקים גראם חיוביים וגרם שליליים. כל הנתונים הרלוונטיים של הניסויים המדווחים הוגשו למאגר הידע EV-TRACK (EV-TRACK ID: EV210211)10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: ודא שכל העבודה המערבת חיידקים ודנ"א רקומביננטי תואמת לשיטות עבודה מומלצות להכלת בטיחות ביולוגית המתאימה לרמת הסיכון הביולוגי של כל זן. העבודה צריכה להיעשות בהתאם לתקנות בטיחות ביולוגית מקומיות, לאומיות ובינלאומיות.
1. זני חיידקים ותנאי גידול
הערה: זני חיידקים ששימשו במחקר זה היו Escherichia coli MP113, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve ו-Bifidobacterium dentium.
- עבור E. coli , השתמש בלולאה סטרילית כדי לחסן מושבות בודדות לתוך 250 עד 1,000 מ"ל של מרק לוריא-ברטאני (LB) ודגרה אירובית באינקובטור רועד ב-300 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפני עיבוד התרבית. עבור זן E. coli MP1 רקומביננטי עם p114-mCherry-Clyluc (שיטה משלימה ותוספת איור S1), הוסיפו כלוראמפניקול לאגר LB ולציר בריכוז סופי של 17 מיקרוגרם/מ"ל.
- עבור A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve , ו - B. dentium, פסים על צלחות אגר של עירוי לב מוחי (BHI) ודגרה אנאירובית בתוך תא אנאירובי של ויניל. לחסן מושבות בודדות לתוך 100 מ"ל של מרק BHI מופחת מראש דגירה במשך 48 שעות אנאירובית.
2. בידוד EV
- הבהרת תווך תרבית חיידקים על ידי צנטריפוגה וסינון
- העבירו את תרביות תאי החיידקים שחוסנו בשלב 1 לניקוי בקבוקי צנטריפוגה מפוליפרופילן של 250 מ"ל או 500 מ"ל על ידי מזיגה. צנטריפוגה של הבקבוקים ברוטור בעל קיבולת גדולה וזווית קבועה ב-4 מעלות צלזיוס ו-5,000 × גרם למשך 15 דקות. מעבירים את הסופר-נאטנט לבקבוקי צנטריפוגה נקיים על ידי מזיגה זהירה, והצנטריפוגה שוב ב-10,000 × גרם למשך 15 דקות.
הערה: שימוש חוזר בבקבוקים לאחר ניקוי וטיהור המתאימים לבטיחות ביולוגית.- אם קיימים כדורים גדולים של תאי חיידקים לאחר הצנטריפוגה השנייה, חזור על הצנטריפוגה בבקבוק נקי כדי להסיר עוד יותר תאים.
- העבר את הסופרנטנט להתקן מסנן מונע ואקום פוליאתרסולפון בגודל 0.22 מיקרומטר בגודל המתאים על ידי מזיגה. סנן על ידי חיבור התקן הסינון לאספקת קיר ואקום. אם קצב הסינון יורד באופן משמעותי, פשוט העבר כל חומר לא מסונן למכשיר חדש. אחסנו את המדיום המסונן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, והמשיכו את הפרוטוקול למחרת אם תרצו.
הערה: הצנטריפוגות לעיל מאפשרות בדרך כלל עיבוד של ~פי 2 מהנפח המצוין של תרבית תאים דרך כל מכשיר. לדוגמה, מכשיר מסנן יחיד של 500 מ"ל יכול לסנן ~ 1,000 מ"ל של תרבות טרום צנטריפוגה. בדרך כלל לא נעשה שימוש חוזר במכשירים אלה. שימוש במסנני מזרק בשלב זה אינו מומלץ ללא אופטימיזציה, שכן הפסדים משמעותיים נרשמו עם המודלים שנבדקו. זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית. - בדוק את ההסרה המוחלטת של התאים בני הקיימא בשלב זה על ידי פיזור אליקוט של הסופרנטנט המסונן על צלחות אגר מתאימות וודא היעדר מושבות כלשהן לאחר הדגירה בתנאים אופטימליים לזן החיידקים. אם מזוהים חיידקים, בצע אופטימיזציה נוספת של ההליך לעיל על ידי ביצוע צנטריפוגות ו/או סינון נוספים.
- העבירו את תרביות תאי החיידקים שחוסנו בשלב 1 לניקוי בקבוקי צנטריפוגה מפוליפרופילן של 250 מ"ל או 500 מ"ל על ידי מזיגה. צנטריפוגה של הבקבוקים ברוטור בעל קיבולת גדולה וזווית קבועה ב-4 מעלות צלזיוס ו-5,000 × גרם למשך 15 דקות. מעבירים את הסופר-נאטנט לבקבוקי צנטריפוגה נקיים על ידי מזיגה זהירה, והצנטריפוגה שוב ב-10,000 × גרם למשך 15 דקות.
- ריכוז המדיום המסונן
- אם אתה עובד עם אמצעי אחסון באופן משמעותי >100 מ"ל, המשך לשלב 2.2.2. אם עובדים עם נפחים של ~ 100 מ"ל, טען 90 מ"ל של מדיום תרבות מסונן על המאגר של קיבולת בהתאמה 100 kDa משקל מולקולרי חותך (MWCO) מכשיר אולטרה סינון צנטריפוגלי באמצעות פיפטות סרולוגיות. איזון תמידי עם התקן סינון אולטרה תואם, וצנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד ב-4 מעלות צלזיוס ו-2,000 × גרם למרווחים של 15-30 דקות, עד שנפח המדיום במאגר העליון מרוכז ל-<0.5 מ"ל.
- טען את המאגר בכל מדיום תרבות מסונן שנותר. אם "מתמלאים", הסירו את הזרימה בתחתית המכשיר ואיזנו מחדש את כל המכשירים.
הערה: נצפה כי הנפח המרבי של מדיום תרבות מסונן שניתן לרכז באמצעות מכשירים אלה הוא פי 2 < מהנפח המומלץ. - אם צמיגות התווך המרוכז במאגר מוגברת באופן ניכר (חומר כהה וצמיג), יש לדלל עם תמיסת מלח עם אגירת פוספט (PBS) ולהתרכז מחדש על ידי צנטריפוגה כדי לדלל חלבונים שאינם EV הקטנים מה-MWCO של 100 kDa.
הערה: זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית. - מעבירים את המדיום המרוכז לצינור קשירה דל חלבון, מאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, וממשיכים את הפרוטוקול למחרת אם רוצים.
- טען את המאגר בכל מדיום תרבות מסונן שנותר. אם "מתמלאים", הסירו את הזרימה בתחתית המכשיר ואיזנו מחדש את כל המכשירים.
- אם אתה עובד עם אמצעי אחסון >100 מ"ל באופן משמעותי, בחר התקן TFF בגודל מתאים (100 kDa MWCO) כדי להתאים את עוצמת הקול לעיבוד.
הערה: התקני סינון לעיבוד 100 מ"ל עד >1,000 מ"ל זמינים מסחרית. זמינות מקומית, עלות ותאימות עם המשאבה והצינורות / החיבורים יכתיבו אילו דגמים מסוימים יהיו שימושיים ביותר. עד 2 ליטר של מדיום תרבית עובדו עם המכשיר המצוין בטבלת החומרים לפני הצורך לנקות את המסנן (ראה שלב 2.3 להלן עבור פרוטוקול הניקוי).- הרכיבו מעגל סינון עם צינורות #16 קשירה נמוכה/שטיפה נמוכה, צינור 1/8 אינץ' למתאמי Luer, התקן TFF ומשאבה פריסטלטית, כפי שמצוין באיור משלים S2.
הערה: בצע TFF בתוך ארון בטיחות ביולוגית כדי למזער את הסיכון לזיהום תכשיר EV עם חיידקים סביבתיים. - בטמפרטורת החדר, התחל להפיץ את המדיום המסונן והמותנה במהירות של כ-200 מ"ל/דקה (מינימום 100 מ"ל/דקה). קבע את הסל"ד המתאים לקצב הזרימה הרצוי על ידי שאיבת 200 מ"ל של PBS לתוך כלי מדורג. בעת מחזור מסונן, מדיום מותנה, לאסוף את המולקולות <100 kDa לחצות את קרום אולטרה סינון כמו פסולת בכלי נפרד.
הערה: הדוגמה שלהלן תהיה בהנחה של נפח התחלתי של 2 ליטר תרבות. - המשך להפיץ את המדיום המותנה עד נפחו הופחת ל ~ 100-200 מ"ל. עוברים לכלי שיט קטנים יותר לפי הצורך. יש לדלל פי 2 עם PBS, ולהמשיך להסתובב עם המשאבה, תוך ריכוז של 75-100 מ"ל. יש לדלל פי 2 עם PBS, ולהמשיך להסתובב עד לנפח סופי של 25 מ"ל. יש לדלל פי 2 עם PBS ולהמשיך להסתובב עד <10 מ"ל.
- הרם את צינורות ההזנה ממאגר הדגימה, והמשך לשאוב כדי לטהר את המסנן ולשחזר את כמות הדגימה המרבית.
הערה: זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית. - מעבירים את הדגימה המרוכזת לצינור חרוטי ומאחסנים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במידת הצורך. לחלופין, המשך עם הפרוטוקול.
- העבר את הדגימה המרוכזת להתקן אולטרה-סינון צנטריפוגלי בקיבולת של 15 מ"ל של 100 kDa MWCO. צנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד ב-4 מעלות צלזיוס ו-2,000 × גרם למרווחים של 15-30 דקות עד שנפח המדיום במאגר העליון התרכז ל-<2 מ"ל.
הערה: זוהי נקודת עצירה פוטנציאלית. - מעבירים את המדיום המרוכז לצינור קושר חלבון נמוך, ומאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, וממשיכים את הפרוטוקול למחרת אם רוצים.
- הרכיבו מעגל סינון עם צינורות #16 קשירה נמוכה/שטיפה נמוכה, צינור 1/8 אינץ' למתאמי Luer, התקן TFF ומשאבה פריסטלטית, כפי שמצוין באיור משלים S2.
- אם אתה עובד עם אמצעי אחסון באופן משמעותי >100 מ"ל, המשך לשלב 2.2.2. אם עובדים עם נפחים של ~ 100 מ"ל, טען 90 מ"ל של מדיום תרבות מסונן על המאגר של קיבולת בהתאמה 100 kDa משקל מולקולרי חותך (MWCO) מכשיר אולטרה סינון צנטריפוגלי באמצעות פיפטות סרולוגיות. איזון תמידי עם התקן סינון אולטרה תואם, וצנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד ב-4 מעלות צלזיוס ו-2,000 × גרם למרווחים של 15-30 דקות, עד שנפח המדיום במאגר העליון מרוכז ל-<0.5 מ"ל.
- ניקוי התקן TFF (אופציונלי)
הערה: קצב הסינון יורד כאשר התקן TFF מתחיל "לסתום" במהלך התהליך (סתימה). במידת הצורך, ניתן לנקות את מכשיר המסנן כדי להקל על סינון של דגימות נוספות באותה ריצת טיהור. למרות שתיאורטית הדבר אפשרי, מסנן TFF מנוקה לא שימש לריצת טיהור אחרת כדי למנוע זיהום צולב.- כדי לנקות, הסר את כל הצינורות והכובעים ממכשיר TFF ורוקן כל נוזל שיורי.
- השתמש במשאבה ובצינורות הפריסטלטיים כדי להציף את התאים הפנימיים והחיצוניים של התקן TFF (כלומר, דרך היציאות המקבילות והניצבות בדגם המפורט בטבלת החומרים) עם ~ 100 מ"ל של מים מזוקקים. הסר את כל הצינורות / מכסים ורוקן את התקן TFF.
- יש לכסות את היציאות החיצוניות (מאונכות, תסנין) ולהזרים 250 מ"ל של 20% אתנול במים מזוקקים במהירות של >200 מ"ל/דקה למשך 10 דקות דרך התא הפנימי. מנקזים, מציפים במים מזוקקים, ומסננים שוב כנ"ל.
- יש להזרים 250 מ"ל של תמיסת NaOH טרייה של 0.5 N למשך 30 דקות דרך התא הפנימי ולנקז שוב.
- חברו מחדש את כל הצינורות והפקקים לפתח, לשקע וליציאות הסינון, כמו באיור S2 המשלים, והפיצו שוב תמיסת NaOH 0.5 N עד שנפח של NaOH > 1 מ"ל/ס" מ 2 שטח הפנים של המסנן מחלחל דרך קרום המסנן ונאסף כתסנין/פסולת.
- יש לשטוף את מכשיר ה-TFF במים מזוקקים כנ"ל. השתמש במכשיר TFF באופן מיידי או הציף את המכשיר עם ~ 100 מ"ל של 20% אתנול ולאחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: אם מאוחסן באתנול, הקפד לנקז, לשטוף במים, לנקז ולהזרים 250 מ"ל של PBS דרך המכשיר עד שנפח של >1 מ"ל/ס"מ2 שטח הפנים של המסנן מחלחל דרך קרום המסנן ונאסף כתנין/פסולת כדי להסיר אתנול שיורי לפני עיבוד הדגימה.
- כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC)
הערה: SEC משמש להגברת הטוהר של כלי רכב חשמליים ולהסרת חלבון שאינו שלפוחית.- השתמש בעמודת SEC קטנה (נפח מיטה של 10 מ"ל) לבידוד של כלי רכב חשמליים מ-<100 מ"ל של חומר מוצא ובעמודה גדולה יותר (נפח מיטה של 47 מ"ל) לבידוד של כלי רכב חשמליים מ->100 מ"ל של חומר מוצא.
הערה: הדוגמה שלהלן תפרט אמצעי אחסון עבור העמודה הגדולה יותר, עם אמצעי אחסון עבור העמודה הקטנה יותר בסוגריים. - הביאו את עמודת ה-SEC ואת PBS לטמפרטורת החדר במשך מספר שעות. ייצוב עמודת ה- SEC במיקום אנכי באמצעות מעמד ומחזיק מעבדה סטנדרטיים. לחלופין, השתמש במעמדי עמודי כרומטוגרפיה מסחריים.
- לפני ההתחברות לעמודת ה- SEC, התייבש את מאגר הדגימה על ידי מתן אפשרות ל- 5 מ"ל של PBS לזרום דרך הפריט לתוך מיכל פסולת. פתח את מכסה הכניסה של עמודת ה- SEC, הוסף 2 מ"ל של PBS למאגר הדגימה, וחבר בזהירות את המאגר לעמודה כאשר ה- PBS מטפטף החוצה דרך ה- frit (לא ישים עבור עמודות SEC קטנות).
הערה: שלב קודם זה מונע מבועות אוויר להילכד בראש עמודת ה-SEC. אם האוויר נלכד, הסר את המאגר, הקש על העמודה כדי להוציא את בועת האוויר וחזור על הליך החיבור. עבור העמודה הקטנה יותר, פשוט בטל את המכסה של החלק העליון של עמודת ה- SEC, וצרף את ההופר לדוגמה. - הוסף 47 מ"ל (10 מ"ל) של PBS למאגר הדגימה ופתח את החלק התחתון של עמודת ה- SEC. אפשר לכל מאגר הדגימה שנטען לזרום דרך העמודה לצורך שיווי משקל. בטל את הזרימה.
- טען עד 2 מ"ל (0.5 מ"ל) של דגימה על מאגר הדגימה, השליך את הזרימה ואפשר לדגימה להיכנס לעמודה במלואה.
- הוסף מיד PBS למאגר הדגימה או להופר בנפח של 14.25 מ"ל פחות נפח הדגימה (3 מ"ל פחות נפח הדגימה, עבור העמודה הקטנה). אפשר לפתרון לזרום דרך העמודה ומחק סכום זה השווה לנפח הריק של העמודה.
הערה: עבור דגימה טיפוסית של 2 מ"ל, כמות ה-PBS שתתווסף למאגר הדגימה או להופר תהיה 12.25 מ"ל. - מקם מיקרו-צינורית בעלת קשירה נמוכה של 2 מ"ל ישירות מתחת לעמודת ה-SEC. הוסף מיד 2 מ"ל (0.5 מ"ל) של PBS למאגר הדגימה ואפשר לו להיכנס לעמודה. תייג את 2 המ"ל הראשונים (0.5 מ"ל) של זרימה דרך כשבר 1. המשך להוסיף 2 מ"ל (0.5 מ"ל) בכל פעם למאגר הדגימה כדי לאסוף כל שבר עוקב.
הערה: רוב כלי הרכב החשמליים החיידקיים מתרוממים ב-5 השברים הראשונים. במהלך האופטימיזציה, נאספו 12 השברים הראשונים. - אחסן את השברים ב- 4 °C לאחסון לטווח קצר (ימים) או -80 °C לאחסון לטווח ארוך.
- ניקוי ואחסון של עמודות ה- SEC לשימוש חוזר
הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בעמודות ה- SEC המתוארות בפרוטוקול זה עד 5 פעמים בהתאם ליצרן. אם קצב הזרימה של עמודות ה- SEC יורד לאחר <5 שימושים, היצרן ממליץ על צנטריפוגה של הדגימות המרוכזות ב- 10,000 x g למשך 10 דקות כדי לנקות את כל האגרגטים לפני ה- SEC. לאחר מכן טען את הסופר-נטנט של צנטריפוגה זו על עמודת ה- SEC לבידוד EV.- כדי לנקות ולאחסן עמודת SEC לאחר כל שימוש, הוסף 2 מ"ל (0.5 מ"ל) של 0.5 M NaOH ואפשר לה להיכנס לעמודה במלואה. הפעל 100 מ"ל (20 מ"ל) של 20% אתנול דרך העמודה ואחסן אותו ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש הבא. לפני השימוש הבא, משווים את האתנול לטמפרטורת החדר כנ"ל, והחליפו אותו במאגר PBS על ידי הפעלת 150 מ"ל (30 מ"ל) נוספים של PBS דרך העמודה.
- כדי לנקות ולהשתמש מחדש באופן מיידי בעמודת SEC לאחר כל שימוש, הוסף 2 מ"ל (0.5 מ"ל) של 0.5 M NaOH ואפשר לו להיכנס לעמודה לחלוטין. הפעל כ-150 מ"ל (30 מ"ל) של חיץ PBS כדי לשטוף את NaOH. כאשר ה- pH של eluate שווה ל- PBS (~7), דגימה חדשה עשויה להיטען.
- השתמש בעמודת SEC קטנה (נפח מיטה של 10 מ"ל) לבידוד של כלי רכב חשמליים מ-<100 מ"ל של חומר מוצא ובעמודה גדולה יותר (נפח מיטה של 47 מ"ל) לבידוד של כלי רכב חשמליים מ->100 מ"ל של חומר מוצא.
3. בקרת איכות הכנת EV
- בדיקת סטריליות
הערה: מכיוון שרכבים חשמליים אלה מגיעים מתרביות חיידקים, חיוני להבטיח סטריליות לפני השימוש במורד הזרם.- השג 100 μL (20 μL) של השברים שישמשו במבחנים וחסן 3 מ"ל של המדיום המשמש לגידול חיידקי המקור. תרבות בתנאים אופטימליים בהתאמה במשך 3 ימים לפחות ולשמור על עכירות. לחלופין, יש למרוח את דגימות השבר על צלחות אגר המכילות את המדיום המשמש לגידול החיידקים המייצרים ולחפש היווצרות מושבה.
הערה: אם מזוהה זיהום חיידקי, לא מומלץ להשתמש בתכשיר EV לניסויים. במקום זאת, חזור על הבידוד, תוך הקפדה על מזעור הסיכון לזיהום חיידקי על ידי (א) ביצוע צנטריפוגה/סינון מספקים של מדיום תרבית תאי חיידקים מותנה, (ב) שימוש בבקבוקים נקיים, צינורות, מסננים ועמודות כרומטוגרפיה, ו-(ג) שימוש בטכניקות אספטיות מתאימות.
- השג 100 μL (20 μL) של השברים שישמשו במבחנים וחסן 3 מ"ל של המדיום המשמש לגידול חיידקי המקור. תרבות בתנאים אופטימליים בהתאמה במשך 3 ימים לפחות ולשמור על עכירות. לחלופין, יש למרוח את דגימות השבר על צלחות אגר המכילות את המדיום המשמש לגידול החיידקים המייצרים ולחפש היווצרות מושבה.
- כימות חלבונים
הערה: נעשה שימוש בערכת כימות חלבונים מבוססת פלואורסצנציה בעלת רגישות גבוהה (ראה טבלת החומרים). הערכה עובדת עם פלואורמטר קנייני תואם באורכי גל עירור/פליטה של 485/590 ננומטר.- הביאו את כל הריאגנטים, התקנים והדגימות לטמפרטורת החדר.
- הכינו תערובת אב של ריאגנט חלבון ומאגר על ידי הוספת 1 μL של המגיב ל-199 μL של חיץ עבור כל דגימה ותקן לבדיקה. באמצעות צינורות PCR דקי דופן של 0.5 מ"ל, הוסף 10 μL סטנדרטיים + 190 μL של תערובת מאסטר לכל צינור סטנדרטי.
הערה: כדי להיות בטווח של הבדיקה, הכמות של כל שבר שיתווסף לכל צינור דגימה תלויה בתפוקת החלבון הצפויה של הטיהור. בדרך כלל, 5 μL של כל שבר + 195 μL של תערובת מאסטר שימשו. הנפח הסופי של מדגם + תערובת מאסטר חייב להיות 200 μL. - מערבבים את צינורות הבדיקה, ודוגרים לפחות 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
- מדוד את התקנים על הפלואורמטר הקנייני המתאים (ראה טבלת חומרים) על ידי בחירה באפשרות בדיקת חלבון באמצעות לחצני החצים ולחיצה על כפתור GO כדי לאשר. בצע את ההוראות שעל המסך, הכנס כל צינור סטנדרטי ולחץ על GO.
- הכנס את צינור הדגימה הניסויי; לחץ על GO כדי לקרוא; ושימו לב לתוצאה המוצגת, שהיא ריכוז החלבון בפועל בתערובת החיץ/דגימה של הבדיקה. כדי לקבל את ריכוז החלבון בדגימה, השתמש במקשי החצים כדי לבחור באפשרות חשב ריכוז דגימה , הקש GO והשתמש במקשי החצים כדי לבחור את נפח הדגימה שנוסף למאגר הבדיקה עבור הדגימה הנתונה . לחץ על GO ורשום את ריכוז החלבון בדגימה. חזור על שלב זה כדי לנתח כל דגימה.
- ספירת חלקיקים והתפלגות גודלם
הערה: חישת פולסים התנגדותית מיקרופלואידית (MRPS) שימשה לכימות ריכוז EV וחלוקת גודלו.- דללו את הדגימות ב-PBS בתוספת 1% Tween-20 שסונן דרך מסנן מזרק של 0.02 מיקרומטר לריכוז חלבון של כ-0.1 מיקרוגרם/מ"ל.
הערה: מטרת הדילול היא להגיע לריכוז חלקיקים צפוי בטווח של 1010 חלקיקים למ"ל בשברים המכילים EV. ייתכן שיהיה צורך לקבוע את הדילול האופטימלי באופן אמפירי. מעט כלי רכב חשמליים צפויים לשברים מאוחרים יותר (מעבר לשבר 6). לפיכך, ריכוז החלקיקים יהיה ככל הנראה <1010 חלקיקים למ "ל למרות ניתוח בדילולים נמוכים. - טען 3 μL מכל דגימה לתוך מחסנית microfluidics חד פעמית עם micropipette, הכנס את המחסנית למכשיר MRPS ולחץ על כפתור המתכת עם חישוק מואר כחול.
- לחץ על Go! על תוכנת הרכישה והמתן עד שהמדגם ינותח על ידי המכשיר. רכוש 1,000 עד 10,000 אירועים של חלקיקים כדי למזער את השגיאה הסטטיסטית הטכנית של הניתוח. בשלב זה, לחץ על עצור וסיים הפעלה כדי להשלים את הרכישה לדוגמה.
הערה: יחד עם קובצי הנתונים הגולמיים, המכשיר מפיק גיליון אלקטרוני מסכם המפרט את ריכוז החלקיקים בדגימה. תקן ערך זה בהתאם לדילול המדגם שבוצע. - באמצעות תוכנת ניתוח, טען את הנתונים הגולמיים וצור גרפים מותאמים אישית של התפלגות גודל.
- דללו את הדגימות ב-PBS בתוספת 1% Tween-20 שסונן דרך מסנן מזרק של 0.02 מיקרומטר לריכוז חלבון של כ-0.1 מיקרוגרם/מ"ל.
4. אחסון EV
- שברים בודדים או מאוגדים של Aliquot עד 25-50% מגודל השבר הבודד (בהתאם לגודל העמודה שבה נעשה שימוש) בצינורות קשירה נמוכים של חלבון ומאוחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי למנוע מחזורי הפשרה בהקפאה.
הערה: יישומים שונים עשויים לדרוש aliquots קטנים או גדולים יותר, בהתאם לכמות הצפויה שנוצלה בכל ניסוי. זה יצטרך להיקבע אמפירית. ניתן להשליך את השברים שאינם מכילים EV אם אינם ישימים למטרות המחקר.
5. מיקרוסקופיית אלקטרונים
- הכתמה שלילית
- הוסף 5 μL של דגימת EV לרשת הנחושת המצופה פחמן 400 רשת ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. שטפו את צד הדגימה עם 5 טיפות של 5 mM Tris buffer (pH 7.1) ולאחר מכן עם 5 טיפות של מים מזוקקים.
- צד דגימת כתם עם 5 טיפות של 2% אורניל אצטט. הסירו כל כמות נוספת של כתם בעזרת נייר סינון, ואפשרו לרשת להתייבש לחלוטין למשך מספר שעות או למשך הלילה. דמיינו את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים המופעל ב-80 קילו-וולט.
- תיוג אימונוגולד
- יש להחיל 10 μL של מתלי EV על רשת רשת formvar/carbon 400 ולדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לשטוף את הרשת PBS שלוש פעמים, ולאחר מכן להחיל 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות כדי לתקן את הדגימה. לשטוף את הרשתות חמש פעמים עם PBS.
- חסום את הרשת עם שלוש שטיפות של PBS המכילות אלבומין בסרום בקר (BSA) של 0.1%. לאחר מכן, יש למרוח 10 מיקרוגרם למ"ל של נוגדן ראשוני למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר (כאן, 1 מיקרוגרם/מ"ל של נוגדן נלוק). יש לשטוף שוב שלוש פעמים עם PBS המכיל 0.1% BSA.
- יש להוסיף לרשת 10 μL של נוגדן משני המסומן בזהב ולדגור במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את הרשתות שלוש פעמים עם PBS.
הערה: כאן, נעשה שימוש בנוגדן נגד עכברים מצומד עם ננו-חלקיקי זהב של 10 ננומטר לאחר דילול 1:10 במאגר חוסם. אם תיוג זהב מטשטש את ההדמיה של EV, ניתן להשתמש במקום זאת בנוגדנים משניים עם ננו-חלקיקי זהב קטנים יותר (למשל 5 ננומטר). - לאחר תיקון הרשת עם 10 μL של 2.5% glutaraldehyde במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף שלוש פעמים ב-PBS. בצע צביעה שלילית עם 2% אורניל אצטט (10 μL) למשך 15 דקות. הטמע את הדגימות ב-10 μL של 0.5% אורניל אצטט ותמיסת מתיל תאית 0.13% למשך 10 דקות.
- אפשרו לרשתות הדגימה להתייבש במשך הלילה בטמפרטורת החדר לפני ההדמיה במיקרוסקופ האלקטרונים.
- בתוכנת רכישת המיקרוסקופ, קבע את החשיפה באופן אמפירי כדי לקבל את האיכות האופטימלית של התמונה (לדוגמה, 0.80851 שניות בהגדרה מסוימת זו) והתאם אותה על-ידי הקלדת ערך זה בתיבת האפשרויות של זמן החשיפה . בחר באפשרות 80 kV ולחץ על התחל רכישה כדי ללכוד את התמונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להעריך אילו שברים כרומטוגרפיים של SEC הועשרו עבור כלי רכב חשמליים, עמודת ה-SEC הועמסה ב-2 מ"ל של מדיום תרבות מותנה E. coli MP1 שהתרכזה פי 1,000 על ידי TFF, ונאספו שברים רציפים. באמצעות MRPS, נמצא כי שברים 1-6 הכילו הכי הרבה כלי רכב חשמליים (איור 2A). השברים הבאים הכילו מעט מאוד כלי רכב חשמליים, שכללו במקום חלבונים נטולי EV (איור 2B). כלי רכב חשמליים היו בקוטר של <100 ננומטר (איור 2C). TEM אישר העשרה וגודל של EV, במיוחד בשברים 2-6 (איור 2D).
כדי להבטיח עוד יותר שהשיטות יוכלו להפריד בין כלי רכב חשמליים לחלבונים שאינם קשורים ל-EV, נוצר זן רקומביננטי של E. coli MP1 המבטא חלבון היתוך ציטוליזין A-ננולוציפראז ו-mCherry חופשי (לא מתמזג) (סכמטי באיור 3A). בעבר הודגם כי חלבוני היתוך מסוג ציטוליזין A קשורים ל-E. coli EVs14. כדי לעקוב אחר פלואורסצנציה mCherry, 100 μL aliquots מכל שבר כרומטוגרפיה הועברו לבארות של צלחת 96 באר. הפלואורסצנטיות שלהם נמדדה בקורא מיקרו-לוחות באמצעות 580 ננומטר ו-620 ננומטר כאורכי גל של קליטה ופליטה, בהתאמה.
באופן דומה, לצורך מדידת זוהר, 20 μL aliquot של כל שבר היה מעורבב עם נפח שווה של תמיסת הבדיקה לוציפראז בלוח 384 באר, דגירה במשך 15 דקות, ואור נראה luminescence נמדד. נצפה כי לשברים מועשרים ב-EV (שברים 2-7) הייתה פעילות ננו-לוציפראז גבוהה הדומה לזו של שברים מאוחרים יותר, אך רק אות פלואורסצנטי נמוך מאוד מ-mCherry שאינו קשור ל-EV (איור 3B). אות הרקע מכמות שווה של כלי רכב חשמליים בעלי בקרה שלילית (שבודד מזן חיידקי תואם ללא ביטוי ננו-לוציפראז) היה נמוך פי >1,000 בשברי EV. האות מהבקרה החיובית (כדורית תא חיידקי המבטאת ננולוציפראז) היה גבוה בערך פי 1,000 מזה של שברי EV (לא מוצג). זה האחרון היה מנורמל לנפח הראשוני של חומר תרבית תאים הניב את התאים המנותחים או EVs, בהתאמה. שיוך EV של ננולוציפראז אושר בשברים 2-5 על ידי תיוג אימונוגולד (איור 3C), תוך התבוננות בתיוג בתוך כלי הרכב החשמליים הקטנים בגודל ~20 ננומטר שבודדו.
לבסוף, כדי להעריך את תחולת פרוטוקול זה על מיני חיידקים אחרים, כלי רכב חשמליים בודדו מתרביות של ~ 100 מ"ל של החיידקים האנאירוביים המגוונים הבאים: A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve, ו - B. dentium שהוכנו במדיום תרבית BHI. כבקרה, כלי רכב חשמליים היו מבודדים מהמדיום הטרי של תרבות BHI. בעוד תפוקת EV השתנתה לפי מינים, שוב נצפה כי כרומטוגרפיה מוקדמת שברים 1-4 היו מועשרים עבור כלי רכב חשמליים (איור 4A). תווך ה-BHI המורכב הכיל גם חלקיקים בגודל EV, אם כי ב-<25% מתפוקת הרכב החשמלי הכוללת בתכשירים אלה (איור 4A, פסים שחורים). רכבים חשמליים של חיידקים אלה נמצאו גם הם בעיקר בגודל של <100 ננומטר (איור 4B).
איור 2: אלוטיון E. coli MP1 EV מייצג בשברים כרומטוגרפיים מוקדמים. (A) ספירת חלקיקים על ידי MRPS בשברים כרומטוגרפיים רציפים של 2 מ"ל. קלט ה-SEC היה 2 ליטר של תרבית-על של תרבית חיידקים מרוכזת ל-2 מ"ל. קו מוצק מייצג ממוצע; אזור מוצל מציין SEM. (B) ריכוז חלבון בכל שבר. (C) התפלגות הגודל של חלק 3 כלי רכב חשמליים הנמדדת על-ידי MRPS. קו מוצק מייצג ממוצע; שטח מוצלל מייצג 95% CI. שים לב שהמכשיר אינו יכול לכמת חלקיקים <50 ננומטר. (D) מיקרוגרפים אלקטרונים של שברים כרומטוגרפיים רציפים ומרוכזים ומדיום תרבית טרי (בקרה). כל התמונות צולמו באותו קנה מידה (100 ננומטר). תמונות TEM בשדה רחב מוצגות באיור משלים S3. קיצורים: EV = שלפוחית חוץ-תאית; MRPS = מיקרופלואידיקה חישת דופק התנגדותית; SEC = כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל; SEM = שגיאת תקן של הממוצע; CI = רווח בר-סמך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הפרדה של כלי רכב חשמליים מסוג E. coli MP1 מחלבונים נטולי EV על-ידי SEC. (A) סכמת של E. coli MP1 המבטאת mCherry רקומביננטי (אדום) בציטופלסמה וציטוליזין A-nanoLuciferase בציטופלסמה ובחלבון היתוך (יהלומים צהובים). (B) פעילות הביולומינסנציה של nanoLuciferase ופלואורסצנציה mCherry היו מנוטרות בשברי כרומטוגרפיה ברצף. קו מקווקו אנכי מייצג את הגבול של שברים מועשרים ב-EV בהתבסס על ניתוחים באיור 2. (C) שברי EV (F2-5) תויגו כאימונוגולד לאחר צביעה בנוגדן אנטי-ננו-לוציפראז. ראשי חץ בצבע תכלת מצביעים על שילוב נוגדנים משניים מצומדים בזהב עם כלי רכב חשמליים קטנים. לרכבי בקרה חשמליים מסוג E. coli MP1 היה כתם זניח ולא ספציפי. שתי התמונות צולמו באותו קנה מידה (100 ננומטר). תמונות TEM בשדה רחב מוצגות באיור משלים S4. קיצורים: EV = שלפוחית חוץ-תאית; SEC = כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל; F = שבר; TEM = מיקרוסקופיית אלקטרונים הולכה; ClyA-nLuc = ציטוליזין A-ננולוציפראז חלבון היתוך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: בידוד של כלי רכב חשמליים ממיני חיידקים מגוונים. המינים המצוינים גודלו במשך 48 שעות במדיום BHI בתנאים אנאירוביים. כלי רכב חשמליים בודדו על-ידי סינון אולטרה-סינון + SEC. (A) ריכוז EV ב-4 שברי ה-SEC הראשונים, שנמדדו על-ידי MRPS. ממוצע ± SEM. פסים שחורים מייצגים חלקיקים שזוהו באצווה של מדיום BHI טרי (בקרה). (B) התפלגות הגודל של כלי רכב חשמליים בשבר 2. קיצורים: EV = שלפוחית חוץ-תאית; MRPS = מיקרופלואידיקה חישת דופק התנגדותית; SEC = כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל; BHI = עירוי לב במוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים S1: פלסמיד p114-mCherry-Clyluc. (A) מפה של פלסמיד p114-mCherry-Clyluc. (B) רצף של אזור J23114-mCherry-clyA-nluc. ויולט, מקדם J23114; ורוד, גן mCherry ; גריי, גן clyA ; ירוק, רצף לינקר; גן כתום, nLuc . אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S2: סכמת סינון זרימה משיקה (TFF). הצינורות עם צינורות barb היה מחובר למכשיר TFF, כפי שמוצג. צינורות זרימת הזנה מתחילים שקועים בכלי התרבות המסוננים והמותנים, ממשיכים דרך המשאבה הפריסטלטית ומתחברים ליציאת הכניסה של התקן TFF. זרימת ההחזרה מתחילה ביציאת השקע של התקן TFF ומסתיימת מעל פני השטח של מדיום התרבות המסונן והמותנה. לחלופין, ניתן להשתמש במהדק לחץ אחורי (למשל, אום בורג + בורג או מהדק נייר פשוט) כדי להגביר את קצב הסינון. כאשר המשאבה מפיצה את המדיום המותנה, לחץ מפותח בתוך התקן TFF מוביל לסינון אולטרה והסרה של רכיבים <100 kDa דרך צינורות זרימת הסינון/פסולת, אותם ניתן לאסוף בכלי נפרד לסילוק (מגנטה). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S3: מיקרוגרפים של אלקטרונים להולכה רחבה. תמונות TEM של שברי כרומטוגרפיה רציפים ומרוכזים ומדיום תרבית טרי (בקרה) מוצגות באיור 2D. התמונות מראות כי הבועיות החוץ-תאיות E. coli MP1 חמקמקות בשברים כרומטוגרפיים מוקדמים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור משלים S4: תמונות TEM בשדה רחב עבור איור 3C. שברי EV (F2-5) סומנו כאימונוגולד לאחר צביעה בנוגדן אנטי-ננו-לוציפראז. ראשי חץ בצבע תכלת מצביעים על שילוב נוגדנים משניים מצומדים בזהב עם כלי רכב חשמליים קטנים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
שיטה משלימה: לזן רקומביננטי E. coli MP1 עם p114-mCherryClyluc. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול לעיל מתוארת שיטה הניתנת להרחבה ומבודדת באופן אמין כלי רכב חשמליים מחיידקים גראם-שליליים/חיוביים ואירוביים/אנאירוביים שונים. יש לו כמה נקודות עצירה פוטנציאליות לאורך ההליך, אם כי עדיף להימנע מלקחת יותר מ 48 שעות כדי לבודד כלי רכב חשמליים ממדיה תרבית חיידקים מותנה.
ראשית, הוא מורכב מגידול חיידקים כדי ליצור מדיום תרבית חיידקים מותנה. נמצא כי הגדלת זמן התרבית ל-48 שעות לפחות ושימוש במדיום הגידול האופטימלי מסייעים למקסם את תפוקת הרכב החשמלי. סביר להניח שכל מין חיידק יצטרך לעבור אופטימיזציה ביחס לשני הפרמטרים הללו. נפח תרבית החיידקים חשוב גם כדי להבטיח מספיק כלי רכב חשמליים מבודדים עבור היישום הרצוי. עבור מחקרים במבחנה , כלי הרכב החשמליים מבודדים בדרך כלל ממינימום של 100 מ"ל, בעוד שבמחקרי in vivo , כלי רכב חשמליים מבודדים בדרך כלל מ->1 ליטר של מדיום תרבית. שוב, מאפייני ייצור הרכב החשמלי של כל זן חיידקי וכמות ה-EV הנדרשת לבדיקות במורד הזרם יכתיבו את נפח התרבית ההתחלתי המינימלי.
ברגע שאמצעי התרבית המותנה זמין, יש להסיר תאים ופסולת גדולה שאינה EV. נמצא כי צנטריפוגה היא שלב קריטי בתהליך זה. כפי שצוין בפרוטוקול לעיל, בוצעו שתי צנטריפוגות כוח G מוגברות. מדי פעם מבוצעת צנטריפוגה נוספת של 10,000 × גרם אם צוין כי הכדור של הספין השני אינו קומפקטי. לאחר מכן, סינון סטרילי של supernatant זה מבוצע באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. צנטריפוגה לא מספקת מובילה לסתימה ולביצועים ירודים של שלב סינון זה. צוין כי המשך סינון הסופר-נטנט לאחר האטה משמעותית בקצב הסינון עלול להוביל לתקלה במסנן ולזיהום תכשיר הרכב החשמלי עם החיידק ההורי. הפתרון לסתימה מתמשכת של המסנן הוא צנטריפוגה מחדש ו/או סינון מחדש של הסופר-נטנט, תוך הבטחת סטריליות. שלבי הצנטריפוגה והסינון המונעים על ידי ואקום שתוארו נבדקו עבור עד 4 ליטר של תרבית חיידקים. הרחבה נוספת של בידוד EV עשויה לדרוש שינויים. לדוגמה, ניתן להחליף את שני השלבים הללו בסינון רציף המונע על ידי משאבה באמצעות התקני מסנן תואמים עם הקטנת גודל הנקבוביות, עד 0.22 מיקרומטר. עם זאת, זה נשאר להיבדק.
בפרוטוקול הנוכחי מתוארות שתי וריאציות, בהתאם לנפח ההתחלתי של תרבית החיידקים. עבור נפחים <100 מ"ל, השתמש במכשירי אולטרה-סינון צנטריפוגליים כדי לרכז את מדיית התרבות. ה-MWCO הוא קריטי בשלבים אלה. עבור כלי רכב חשמליים של יונקים, >300 kDa MWCO שימשו בעבר11,12. עם זאת, התוצאה הייתה תפוקה נמוכה מאוד של כלי רכב חשמליים מחיידקים, ככל הנראה בגלל התפלגות הגודל הקטנה יותר. לכן, מומלץ להשתמש 100 kDa MWCO. ניתן להשתמש גם ב-MWCO קטן יותר, אך הוא קשור לזמני צנטריפוגה ארוכים יותר ופחות הסרה של מזהמים קטנים במשקל מולקולרי, מה שמגדיל את צמיגות הדגימה. זה גם מועיל שיש גדלים שונים של התקני סינון אולטרה ב 100 kDa MWCO כדי לעזור לרכז נפחים התחלתיים שונים של דגימה לאורך הפרוטוקול.
לחלופין, עבור גודל מדגם משמעותי >100 מ"ל, השתמש TFF מונע משאבה כדי לרכז את הדגימה; שוב, שימוש ב- MWCO של 100 kDa הוא קריטי. שיטה זו מאפשרת עיבוד כמויות גדולות של מדיום תרבות באופן חצי אוטומטי. חשוב להשיג התקן TFF בגודל מתאים לנפח התרבות ההתחלתי. המכשיר המשמש מדורג בעיבוד עד 200 מ"ל של חומר על ידי היצרן. ניתן היה לעבד עד כ-2 ליטר. עם זאת, נצפתה ירידה חדה בקצב הסינון כאשר מנסים לעבד נפחים גדולים יותר, מה שמחייב לעצור את התהליך ולנקות את המכשיר לפני עיבוד נוסף. לפיכך, המאפיינים של כל תרבית חיידקים וכמות חומר המוצא יכתיבו את הגודל הנדרש של מכשיר TFF. יתר על כן, מהירות המשאבה הניתנת להשגה היא פרמטר חשוב נוסף עבור TFF. בשיעורים נמוכים של ~ 100 מ"ל לדקה, היה צורך להגדיל את הלחץ האחורי במכשיר TFF באמצעות מהדק, כפי שצוין באיור משלים S2, כדי להקל על הסינון, מה שמגדיל את קצב ההסתבכות של המסנן. נעשה שימוש חוזר בצינורות עד פעמיים לאחר טיהור מתאים ואוטוקלאבינג.
לאחר ריכוז הדגימה, ניתן לטעון אותה על עמודת SEC כדי לבודד את כלי הרכב החשמליים. נעשה שימוש בעמודים מסחריים המותאמים לבידוד EV קטן. עבור דוגמאות התחלתיות קטנות, השתמש בעמודות עם נפח טעינה של 0.5 מ"ל, והשתמש בעמודות עם נפח טעינה של 2 מ"ל לקבלת דגימות התחלתיות גדולות יותר של עד 2 ליטר. סביר להניח שעיבוד תרבויות התחלתיות >2 L ידרוש עמודות גדולות יותר. יצרנים של עמודות ממוטבות EV מציעים כיום עמודות SEC המסוגלות לקבל >100 מ"ל של חומר מרוכז.
שיטות שונות משמשות לאפיון כלי הרכב החשמליים המבודדים, שרובם זמינים באופן נרחב. הנורמליזציה התבססה על ריכוז החלבון ברוב המבחנים מכיוון שהדבר אינו מושפע מחוסר היכולת של שיטות כימות אחרות (כלומר, כימות חלקיקים על ידי טכנולוגיות כגון MRPS) לזהות כלי רכב חשמליים קטנים מאוד <50 ננומטר. MRPS וטכנולוגיות אחרות לכימות ננו-חלקיקים עדיין שימושיות בכימות היחסי של כלי רכב חשמליים בין השברים השונים.
היבט קריטי אחד של כימות MRPS הוא רמת הדילול. כאשר מדולל כראוי, התדירות של כלי רכב חשמליים שזוהו צריכה להמשיך לעלות עד קצה גבול הגילוי ברוב המקרים, מכיוון שהמכשיר אינו יכול לכמת חלקיקים <50 ננומטר. דילול לא מספיק יוביל לרעש מכשירים גבוה, אשר ייצור עקומה בצורת פעמון מלאכותי עם שיא >65 ננומטר (בעת שימוש במחסנית C-300 microfluidics המומלצת). במהלך ניתוח נתוני התפלגות תדר הגודל, עדיין נצפה לעתים שיא ארטפקטי בין 50 ננומטר (הגבול המוחלט של גילוי המכשיר) ל-60 ננומטר, למרות דילול הולם. הסיבה לכך היא ככל הנראה נוכחותם של מספר משמעותי של כלי רכב חשמליים חיידקיים קטנים מאוד (כפי שניתן לראות ב-TEM, איור 2D) שנמצאים מתחת לגבול של זיהוי מדויק על-ידי MRPS ושוב מובילים לרעש מכשירים. במקרה זה, אל תכלול נקודות נתונים קטנות יותר מה"שיא" שנצפה, שהופך לגבול התחתון דה פקטו של כמות המדגם הנתון.
כפי שמתואר בפרוטוקול זה, כימות השפע של EV, ריכוז החלבון הכולל ושפע החלבונים שאינם EV בשברים הכרומטוגרפיים המלוטשים יכולים לסייע למשתמשים להחליט באילו שברים להשתמש עבור בדיקות במורד הזרם. לדוגמה, כלי רכב חשמליים קטנים זוהו בשברים 7-8 מאוגדים (איור 2D); עם זאת, השפע שלהם היה נמוך מזה שבשברים שקדמו להם, בעוד שריכוז החלבון הכולל (איור 2B) היה גבוה יותר. זה עשוי להצביע על כך ששברים 7-8 מכילים כמויות גבוהות יותר של חלבונים שאינם קשורים ל-EV, ולכן ייתכן שאינם רצויים עבור יישומים מסוימים במורד הזרם.
לסיכום, פרוטוקול בידוד EV רב-תכליתי המסתמך על חומרים זמינים מסחרית מתואר כאן. המשמעות של מתודולוגיה זו בהשוואה לשיטות מבוססות אולטרה-צנטריפוגציה הנמצאות בשימוש נרחב היא שהיא כוללת שלבים הניתנים לשחזור בקלות על ידי משתמשים שונים והיא ניתנת להרחבה. זה חשוב במיוחד כדי להקל על יצירת חומר מספיק למחקרי in vivo . הוא שימש לבידוד כלי רכב חשמליים מתרבויות של 100 מ"ל עד 2 ליטר. בהתחשב במגוון הרחב של התקני TFF זמינים, ייתכן כי פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לטיהור בקנה מידה גדול יותר עם שינוי כלשהו. פרוטוקול הבידוד המתואר מבוסס בעיקר על התכונות הפיזיקליות של כלי רכב חשמליים, כלומר גודלם, והוא ככל הנראה ישים למיני חיידקים מעבר לאלה שתוארו במחקר זה.
מגבלה אחת של הפרוטוקול המתואר היא שהוא מעדיף בידוד של כלי רכב חשמליים קטנים, במיוחד <100 ננומטר, כפי שניתן לראות בתוצאות המייצגות. דוחות קודמים מתארים גם נוכחות של כלי רכב חשמליים חיידקיים גדולים יותר15,16. בידוד של כלי רכב חשמליים חיידקיים גדולים יותר עשוי לדרוש שינויים בפרוטוקול לעיל, לדוגמה, על ידי שימוש בעמודות SEC הממוטבות עבור כלי רכב חשמליים גדולים יותר. עמודות SEC כאלה זמינות גם מסחרית. יתר על כן, פרוטוקולים אחרים יכולים ככל הנראה להשיג טוהר EV גבוה יותר (לדוגמה, אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות או בידוד חיסוני). עם זאת, שיטות אלה חסרות את התפוקה והמדרגיות של השיטות המתוארות במחקר זה. שינוי פרוטוקול זה עם שלבי טיהור נוספים בעתיד עשוי להגדיל עוד יותר את התשואה ואת טוהר ההכנות, אשר עשוי להיות חשוב עבור יישומים ניסיוניים וטיפוליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
המחקר שתואר לעיל נתמך על ידי מענק ההכשרה NIH TL1 TR002549-03. אנו מודים לד"ר ג'ון טילטון וזכארי טרוייר (אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב) על שהקלו על הגישה למכשיר ניתוח גודל החלקיקים; לו בראון (ספקטרדין) לסיוע טכני בניתוח נתוני התפלגות גודל החלקיקים; ד"ר דיוויד פוטנאם מאוניברסיטת קורנל על אספקת פלסמיד pClyA-GFP14; וד"ר מארק גוליאן מאוניברסיטת פנסילבניה על שסיפק לנו את ה- E. coli MP113.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes | Thermo Scientific | 3430 | it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit |
| 16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron microscopy sciences | 15700 | |
| 250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1495 | |
| 500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles | ThermoFisher | 010-1493 | |
| 65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter | Beckman Coulter | 392077 | Allows Vivacell to fit in rotor |
| Akkermansia mucinophila | ATCC | BAA-835 | |
| Amicon-15 (100 kDa MWCO) | MilliporeSigma | UFC910024 | |
| Avanti J-20 XPI centrifuge | Beckman Coulter | No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model. | |
| Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 | ATCC | 29148 | |
| Bifidobacterium breve | NCIMB | B8807 | |
| Bifidobacterium dentium | ATCC | 27678 | |
| Brain Heart infusion (BHI) broth | Himedia | M2101 | After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains. |
| C-300 microfluidics cartridge | Spectradyne | ||
| Chloramphenicol | MP Biomedicals | ICN19032105 | |
| Electron microscope | FEI company | Tecnai G2 SpiritBT | |
| Escherichia coli HST08 (Steller competent cells) | Takara | 636763 | |
| Escherichia coli MP1 | Dr. Mark Goulian (gift) | commensal bacteria derived from mouse gut | |
| Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter | ThermoFisher | 010-0151-05 | used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture |
| Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor | ThermoFisher | F12-6x500-LEX | fits 6 x 500 mL bottles |
| Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper | Electron microscopy sciences | FCF-400-CU | |
| Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution) | Electron microscopy sciences | 16100 | |
| Hematin | ChemCruz | 207729B | Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as 1.2 mg/mL |
| Infinite M Nano+ Microplate reader | Tecan | This equibment was used to measure the mCherry fluorescence | |
| In-Fusion HD Cloning Plus | Takara | 638909 | For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors |
| JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Lauria Bertani (LB) broth, Miller | Difco | 244620 | |
| L-Cysteine Hydrochloride | J.T. Baker | 2071-05 | It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer - special | HV-30800-08 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK | cole-parmer - special | HV-30800-24 | connection adapters for filtration tubing circuit |
| Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm | Masterflex | HV-07555-00 | |
| Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor | Masterflex | EW-07514-10 | |
| Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft | Cole Palmer | EW-06435-16 | low-binding/low-leaching tubing |
| Menadione (Vitamin K3) | MP | 102259 | Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL |
| MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK | Repligen | D04-E100-05-N | TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant |
| Nano-Glo Luciferase Assay System | Promega | N1110 | This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein |
| NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808 | R&D Systems | MAB10026 | |
| nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument | Spectradyne | ||
| nCS1 Viewer | Spectradyne | Analysis software for particle size distribution | |
| OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer | NEB | M0482 | DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking |
| Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes | Eppendorf | 30108450 | |
| Q5 High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0492 | DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning |
| qEV original, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 0.5 mL | |
| qEV rack | Izon | for use with the qEV-original SEC columns | |
| qEV-2, 35 nm | Izon | maximal loading volume of 2 mL | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher | Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238) | |
| Qubit protein assay kit | ThermoFisher | Q33211 | Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C. |
| Sorvall Lynx 4000 centrifuge | ThermoFisher | 75006580 | |
| SpectraMax i3x Microplate reader | Molecular Devices | This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence | |
| Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL) | MilliporeSigma | S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE |
One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size. |
| Uranyl acetate | Electron microscopy sciences | 22400 | |
| Vinyl anaerobic chamber | Coy Lab | ||
| Vivacell 100, 100,000 MWCO PES | Sartorius | VC1042 | |
| Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron) | MilliporeSigma | WHA68093002 | to filter MRPS diluent |
References
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Chatterjee, S. N., Das, J. Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae. Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).
- Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).
- Yonezawa, H., et al. Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation. BMC Microbiology. 9, 197 (2009).
- Mashburn, L. M., Whiteley, M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).
- Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
- Petousis-Harris, H., et al. Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study. Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).
- Kim, O. Y., et al. Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response. Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Consortium, E. -T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Watson, D. C., et al. Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles. Biomaterials. 105, 195-205 (2016).
- Watson, D. C., et al. Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).
- Lasaro, M., et al. Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts. Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).
- Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).
- Beveridge, T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).
- Reimer, S. L., et al. Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content. Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).
