Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Published: October 13, 2021 doi: 10.3791/63155
Automatic Translation
1,2,3, 1, 1,4, 5, 1, 1,3, 1,3,4
1Department of Cardiovascular & Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2University Hospitals Cleveland Medical Center, 3Case Western Reserve University, 4Center for Microbiome & Human Health, Cleveland Clinic, 5Electron Microscopy Core, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic

Summary

Bacteriën scheiden nanometergrote extracellulaire blaasjes (EV's) af die bioactieve biologische moleculen dragen. EV-onderzoek richt zich op het begrijpen van hun biogenese, rol in microbe-microbe en gastheer-microbe interacties en ziekte, evenals hun potentiële therapeutische toepassingen. Een workflow voor schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriën wordt gepresenteerd om standaardisatie van EV-onderzoek te vergemakkelijken.

Abstract

Diverse bacteriesoorten scheiden ~ 20-300 nm extracellulaire blaasjes (EV's) af, bestaande uit lipiden, eiwitten, nucleïnezuren, glycanen en andere moleculen afgeleid van de ouderlijke cellen. EV's functioneren als intra- en inter-species communicatievectoren en dragen tegelijkertijd bij aan de interactie tussen bacteriën en gastheerorganismen in de context van infectie en kolonisatie. Gezien de veelheid aan functies die aan EV's worden toegeschreven in gezondheid en ziekte, is er een groeiende interesse in het isoleren van EV's voor in vitro en in vivo studies. Er werd verondersteld dat de scheiding van EV's op basis van fysieke eigenschappen, namelijk grootte, de isolatie van blaasjes uit verschillende bacterieculturen zou vergemakkelijken.

De isolatieworkflow bestaat uit centrifugatie, filtratie, ultrafiltratie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) voor de isolatie van EV's uit bacterieculturen. Een pompgestuurde tangentiële flowfiltratie (TFF) stap werd opgenomen om de schaalbaarheid te verbeteren, waardoor materiaal uit liters startcelcultuur kon worden geïsoleerd. Escherichia coli werd gebruikt als een modelsysteem dat EV-geassocieerde nanoluciferase en niet-EV-geassocieerde mCherry tot expressie brengt als reportereiwitten. De nanoluciferase was gericht op de EV's door zijn N-terminus te fuseren met cytolysine A. Vroege chromatografiefracties met 20-100 nm EV's met geassocieerd cytolysine A - nanoLuc verschilden van de latere fracties die de vrije eiwitten bevatten. De aanwezigheid van EV-geassocieerd nanoluciferase werd bevestigd door immunogold labeling en transmissie-elektronenmicroscopie. Deze EV-isolatieworkflow is van toepassing op andere menselijke darmgerelateerde gramnegatieve en grampositieve bacteriesoorten. Kortom, de combinatie van centrifugatie, filtratie, ultrafiltratie / TFF en SEC maakt schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriesoorten mogelijk. Het gebruik van een gestandaardiseerde isolatieworkflow zal vergelijkende studies van microbiële EV's tussen soorten vergemakkelijken.

Introduction

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn nanometergrote, liposoomachtige structuren die bestaan uit lipiden, eiwitten, glycanen en nucleïnezuren, uitgescheiden door zowel prokaryote als eukaryote cellen1. Sinds de vroege studies die de afgifte van EV's van gramnegatieve bacteriën2 visualiseren, is het aantal biologische functies dat wordt toegeschreven aan bacteriële EV's (20-300 nm in diameter) de afgelopen decennia voortdurend gegroeid. Hun functies omvatten het overbrengen van antibioticaresistentie3, biofilmvorming4, quorumdetectie5 en toxineafgifte6. Er is ook een groeiende belangstelling voor het gebruik van bacteriële EV's als therapieën, vooral in vaccinologie7 en kankertherapie8.

Ondanks de groeiende belangstelling voor EV-onderzoek, zijn er nog steeds technische uitdagingen met betrekking tot isolatiemethoden. In het bijzonder is er behoefte aan isolatiemethoden die reproduceerbaar, schaalbaar en compatibel zijn met diverse EV-producerende organismen. Om een uniforme reeks principes te creëren voor het plannen en rapporteren van EV-isolatie en onderzoeksmethoden, publiceert en actualiseert de International Society for Extracellular Vesicles de MISEV-position paper9. Bovendien biedt het EV-TRACK-consortium een open platform voor het rapporteren van gedetailleerde methodologieën voor EV-isolatie die worden gebruikt in gepubliceerde manuscripten om de transparantie te vergroten10.

In dit protocol werden eerdere methodologieën die werden gebruikt voor de isolatie van EV's uit zoogdiercelkweekaangepast 11,12 om de isolatie van EV's uit bacteriële celkweek mogelijk te maken. We hebben geprobeerd methoden te gebruiken die EV-isolatie van een verscheidenheid aan microben mogelijk maken, die schaalbaar kunnen zijn en de zuiverheid en opbrengst van EV's in evenwicht brengen (zoals besproken in de MISEV-position paper9). Na het verwijderen van bacteriële cellen en puin door centrifugering en filtratie, wordt het kweekmedium geconcentreerd door ultrafiltratie van centrifugaalapparaten (voor een volume tot ~ 100 ml) of pompaangedreven TFF (voor grotere volumes). EV's worden vervolgens geïsoleerd door SEC met behulp van kolommen die zijn geoptimaliseerd voor de zuivering van kleine EV's.

Figure 1
Figuur 1: Bacterial EV isolatie workflow schematisch overzicht. Afkortingen: EV = extracellulair blaasje; TFF = tangentiële stromingsfiltratie; SEC = grootte-uitsluitingschromatografie; MWCO = afsnijding van het molecuulgewicht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een muis-commensale stam van Escherichia coli (d.w.z. E. coli MP113) werd gebruikt als een modelorganisme en gemodificeerd om EV-geassocieerd nanoluciferase tot expressie te brengen door fusie tot cytolysine A, zoals eerder gemeld14. De methoden die hier worden gebruikt, kunnen ten minste enkele liters bacterieculturen verwerken en EV-geassocieerde van niet-EV-geassocieerde eiwitten effectief scheiden. Ten slotte kan deze methode ook worden gebruikt voor andere grampositieve en gramnegatieve bacteriesoorten. Alle relevante gegevens van de gerapporteerde experimenten werden ingediend bij de EV-TRACK-kennisbank (EV-TRACK ID: EV210211)10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: Zorg ervoor dat al het werk met bacteriën en recombinant DNA de beste praktijken voor bioveiligheidsinsluiting volgt die geschikt zijn voor het bioveiligheidsrisiconiveau van elke stam. Het werk moet worden gedaan in overeenstemming met lokale, nationale en internationale bioveiligheidsvoorschriften.

1. Bacteriestammen en kweekomstandigheden

OPMERKING: Bacteriestammen die in deze studie werden gebruikt, waren Escherichia coli MP1 13, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve en Bifidobacterium dentium.

  1. Gebruik voor E. coli een steriele lus om afzonderlijke kolonies in te enten in 250 tot 1.000 ml Luria-Bertani (LB) bouillon en incubeer aeroob in een schuddende incubator bij 300 tpm en 37 °C gedurende 48 uur voordat u de cultuur verwerkt. Voor recombinante E. coli MP1-stam met p114-mCherry-Clyluc (aanvullende methode en aanvullende figuur S1), voegt u chlooramfenicol toe aan de LB-agar en bouillon in een eindconcentratie van 17 μg / ml.
  2. Voor A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve en B. dentium, streak op Brain heart infusion (BHI) agarplaten en incubeer anaëroob in een vinyl anaerobe kamer. Ent enkele kolonies in 100 ml vooraf gereduceerde BHI-bouillon en incubeer gedurende 48 uur anaeroob.

2. EV-isolatie

  1. Verhelderen van bacteriekweekmedium door centrifugatie en filtratie
    1. Breng de bacteriële celculturen die in stap 1 zijn ingeënt over om 250 ml of 500 ml polypropyleencentrifugeflessen te reinigen door te gieten. Centrifugeer de flessen in een rotor met grote capaciteit met vaste hoek bij 4 °C en 5.000 × g gedurende 15 minuten. Breng het supernatant over in schone centrifugeflessen door voorzichtig te gieten en centrifugeer opnieuw op 10.000 × g gedurende 15 minuten.
      OPMERKING: Hergebruik de flessen na bioveiligheidsgeschikte reiniging en decontaminatie.
      1. Als er na de tweede centrifugatie grote pellets bacteriële cellen aanwezig zijn, herhaal dan de centrifugatie in een schone fles om cellen verder te verwijderen.
    2. Breng het supernatant over naar een 0,22 μm polyethersulfon vacuümaangedreven filterapparaat van de juiste grootte door te gieten. Filter door het filtratieapparaat aan te sluiten op een vacuümwandtoevoer. Als de filtratiesnelheid aanzienlijk daalt, verplaatst u eenvoudig al het ongefilterde materiaal naar een nieuw apparaat. Bewaar het gefilterde medium een nacht bij 4 °C en zet het protocol indien gewenst de volgende dag voort.
      OPMERKING: De bovenstaande centrifugaties maken meestal verwerking van ~ 2x het aangegeven volume celkweek door elk apparaat mogelijk. Een enkel filterapparaat van 500 ml kan bijvoorbeeld ~ 1.000 ml voorgecentrifugeerde cultuur filteren. Deze apparaten worden meestal niet hergebruikt. Het gebruik van spuitfilters bij deze stap wordt niet aanbevolen zonder optimalisatie, omdat aanzienlijke verliezen werden opgemerkt met de geteste modellen. Dit is een potentieel pleisterpunt.
    3. Controleer op de volledige verwijdering van de levensvatbare cellen op dit punt door een aliquot van het gefilterde supernatant op geschikte agarplaten te verspreiden en zorg ervoor dat er na incubatie geen kolonies zijn onder optimale omstandigheden voor de bacteriestam. Als bacteriën worden gedetecteerd, optimaliseer dan de bovenstaande procedure verder door extra centrifugaties en / of filtraties uit te voeren.
  2. Concentratie van het gefilterde medium
    1. Als u werkt met volumes die aanzienlijk > 100 ml, gaat u verder met stap 2.2.2. Als u werkt met volumes van ~ 100 ml, laadt u 90 ml gefilterd kweekmedium op het reservoir van een respectievelijk capaciteit 100 kDa moleculair gewichtsafsnijdingsapparaat (MWCO) centrifugaal ultrafiltratieapparaat met behulp van serologische pipetten. Balanceer altijd met een bijpassend ultrafiltratieapparaat en centrifugeer in zwenkbakrotor bij 4 °C en 2.000 × g gedurende intervallen van 15-30 minuten, totdat het volume van het medium in het bovenste reservoir is geconcentreerd tot <0,5 ml.
      1. Vul het reservoir aan met eventueel achtergebleven gefilterd kweekmedium. Als u 'bijlaadt', verwijdert u de doorstroom in de onderkant van het apparaat en balanceert u alle apparaten opnieuw.
        OPMERKING: Er werd waargenomen dat het maximale volume van gefilterd kweekmedium dat met deze apparaten kan worden geconcentreerd, <2 keer het aanbevolen volume is.
      2. Als de viscositeit van het geconcentreerde medium in het reservoir zichtbaar is verhoogd (donker, viskeus materiaal), verdun dan met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en herconcentrateer door centrifugatie om niet-EV-eiwitten kleiner dan de MWCO van 100 kDa te verdunnen.
        OPMERKING: Dit is een potentieel stoppunt.
      3. Breng het geconcentreerde medium over in een eiwitarme buis, bewaar het een nacht bij 4 °C en zet het protocol indien gewenst de volgende dag voort.
    2. Als u met volumes werkt die aanzienlijk > 100 ml, selecteert u een TFF-apparaat van de juiste grootte (100 kDa MWCO) om het te verwerken volume te verwerken.
      OPMERKING: Filtratie-apparaten voor het verwerken van 100 ml tot > 1.000 ml zijn in de handel verkrijgbaar. Lokale beschikbaarheid, kosten en compatibiliteit met de pomp en slangen / verbindingen zullen bepalen welke specifieke modellen het nuttigst zullen zijn. Tot 2 L kweekmedium werd verwerkt met het apparaat dat is aangegeven in de tabel met materialen voordat het filter moest worden gereinigd (zie stap 2.3 hieronder voor het reinigingsprotocol).
      1. Monteer een filtratiecircuit met # 16 laag-bindende / lage uitlogingsbuizen, 1/8 inch slang-weerhaak naar Luer-adapters, het TFF-apparaat en een peristaltische pomp, zoals aangegeven in aanvullende figuur S2.
        OPMERKING: Voer TFF uit in een bioveiligheidskast om het risico op besmetting van het EV-preparaat met omgevingsbacteriën te minimaliseren.
      2. Begin bij kamertemperatuur met het circuleren van het gefilterde, geconditioneerde medium op ongeveer 200 ml / min (minimaal 100 ml / min). Bepaal het juiste toerental dat overeenkomt met het gewenste debiet door 200 ml PBS in een gegradueerd vat te pompen. Verzamel bij het circuleren van gefilterd, geconditioneerd medium de moleculen < 100 kDa die het ultrafiltratiemembraan passeren als afval in een apart vat.
        OPMERKING: Het onderstaande voorbeeld gaat uit van een beginvolume van 2 L cultuur.
      3. Blijf het geconditioneerde medium circuleren totdat het volume is verminderd tot ~ 100-200 ml. Ga indien nodig over op kleinere schepen. Verdun 2-voudig met PBS en blijf circuleren met de pomp, geconcentreerd tot 75-100 ml. Verdun 2-voudig met PBS en blijf circuleren tot een eindvolume van 25 ml. Verdun 2-voudig met PBS en blijf circuleren tot <10 ml.
      4. Til de voedingsslang uit het monsterreservoir en blijf pompen om het filter te zuiveren en de maximale hoeveelheid monster terug te winnen.
        OPMERKING: Dit is een potentieel stoppunt.
      5. Breng het geconcentreerde monster over in een conische buis en bewaar indien gewenst een nacht bij 4 °C. U kunt ook doorgaan met het protocol.
      6. Verplaats het geconcentreerde monster naar een 15 ml capaciteit 100 kDa MWCO centrifugaal ultrafiltratie-apparaat. Centrifugeer in een zwenkbakrotor bij 4 °C en 2.000 × g gedurende intervallen van 15-30 minuten totdat het volume van het medium in het bovenste reservoir is geconcentreerd tot <2 ml.
        OPMERKING: Dit is een potentieel stoppunt.
      7. Breng het geconcentreerde medium over in een eiwitarme buis en bewaar het bij 4 °C 's nachts, waarbij het protocol de volgende dag indien gewenst wordt voortgezet.
  3. Het TFF-apparaat reinigen (optioneel)
    OPMERKING: De filtratiesnelheid neemt af naarmate het TFF-apparaat tijdens het proces begint te "verstoppen" (vervuiling). Indien nodig kan het filterapparaat worden gereinigd om de filtratie van extra monsters in dezelfde zuiveringsrun te vergemakkelijken. Hoewel theoretisch mogelijk, is een gereinigd TFF-filter niet gebruikt voor een andere zuiveringsrun om kruisbesmetting te voorkomen.
    1. Om schoon te maken, verwijdert u alle slangen en doppen van het TFF-apparaat en voert u eventuele resterende vloeistof af.
    2. Gebruik de peristaltische pomp en slang om zowel de binnen- als buitencompartimenten van het TFF-apparaat (d.w.z. via de parallelle en loodrechte poorten in het model in de materiaaltabel) te overspoelen met ~ 100 ml gedestilleerd water. Verwijder alle slangen/doppen en laat het TFF-apparaat leeglopen.
    3. Sluit de buitenste (loodrechte filtraat) poorten af en laat 250 ml 20% ethanol in gedestilleerd water circuleren op >200 ml/min gedurende 10 minuten door het binnenste compartiment. Draineren, overstromen met gedestilleerd water, en opnieuw aftappen zoals hierboven.
    4. Laat 250 ml 0,5 N verse NaOH-oplossing gedurende 30 minuten door het binnencompartiment circuleren en laat opnieuw uitlekken.
    5. Sluit alle slangen en doppen opnieuw aan op de inlaat-, uitlaat- en filtraatpoorten, zoals in aanvullende figuur S2, en laat 0,5 N NaOH-oplossing opnieuw circuleren totdat een volume NaOH->filteroppervlak van 1 ml / cm 2 door het filtermembraan dringt en wordt verzameld als filtraat / afval.
    6. Spoel het TFF-apparaat af met gedestilleerd water zoals hierboven beschreven. Gebruik het TFF-apparaat onmiddellijk of overspoel het apparaat met ~ 100 ml 20% ethanol en bewaar het 's nachts bij 4 °C.
      OPMERKING: Als het in ethanol wordt bewaard, moet u 250 ml PBS door het apparaat afvoeren, spoelen met water, aftappen en door het apparaat laten circuleren totdat een volume van >1 ml / cm2 filteroppervlak door het filtermembraan dringt en wordt verzameld als filtraat / afval om resterende ethanol te verwijderen voorafgaand aan monsterverwerking.
  4. Grootte-uitsluitingschromatografie (SEC)
    OPMERKING: SEC wordt gebruikt om de zuiverheid van EV's te verhogen en niet-vesiculaire eiwitten te verwijderen.
    1. Gebruik een kleine SEC-kolom (bedvolume van 10 ml) voor de isolatie van EV's van < 100 ml uitgangsmateriaal en een grotere kolom (bedvolume van 47 ml) voor de isolatie van EV's van >100 ml uitgangsmateriaal.
      OPMERKING: In het onderstaande voorbeeld worden volumes voor de grotere kolom weergegeven, met volumes voor de kleinere kolom tussen haakjes.
    2. Breng de SEC-kolom en PBS gedurende enkele uren op kamertemperatuur. Stabiliseer de SEC-kolom in een verticale positie met behulp van een standaard laboratoriumstandaard en houder. U kunt ook commerciële chromatografiekolomstandaards gebruiken.
    3. Voordat u verbinding maakt met de SEC-kolom, hydrateert u het monsterreservoir door 5 ml PBS door de frit en in een afvalcontainer te laten stromen. Schroef de inlaatdop van de SEC-kolom los, voeg 2 ml PBS toe aan het monsterreservoir en sluit het reservoir voorzichtig aan op de kolom terwijl de PBS door de frit naar buiten druipt (niet van toepassing op kleine SEC-kolommen).
      OPMERKING: Deze vorige stap voorkomt dat luchtbellen vast komen te zitten aan de bovenkant van de SEC-kolom. Als er lucht vastzit, verwijdert u het reservoir, tikt u op de kolom om de luchtbel eruit te halen en herhaalt u de verbindingsprocedure. Voor de kleinere kolom maakt u eenvoudig de bovenkant van de SEC-kolom los en bevestigt u de monstertrechter.
    4. Voeg 47 ml (10 ml) PBS toe aan het monsterreservoir en maak de bodem van de SEC-kolom los. Laat alle geladen monsterbuffer door de kolom stromen voor equilibratie. Gooi de doorstroom weg.
    5. Laad maximaal 2 ml (0,5 ml) monster op het monsterreservoir, gooi de doorstroom weg en laat het monster volledig in de kolom komen.
    6. Voeg onmiddellijk PBS toe aan het monsterreservoir of de trechter met een volume van 14,25 ml minus het monstervolume (3 ml minus het monstervolume, voor de kleine kolom). Laat de oplossing door de kolom stromen en gooi deze hoeveelheid weg die gelijk is aan het volume van de kolomleegstand.
      OPMERKING: Voor een typisch monster van 2 ml is de hoeveelheid PBS die aan het monsterreservoir of de trechter moet worden toegevoegd 12,25 ml.
    7. Plaats een 2 ml laagbindende microbuis direct onder de SEC-kolom. Voeg onmiddellijk 2 ml (0,5 ml) PBS toe aan het monsterreservoir en laat het in de kolom komen. Label deze eerste 2 ml (0,5 ml) doorstroom als fractie 1. Blijf 2 ml (0,5 ml) per keer toevoegen aan het monsterreservoir om elke volgende fractie te verzamelen.
      OPMERKING: De meeste bacteriële EV's elueren in de eerste 5 fracties. Tijdens de optimalisatie werden de eerste 12 fracties verzameld.
    8. Bewaar de fracties bij 4 °C voor kortdurende opslag (dagen) of -80 °C voor langdurige opslag.
    9. Reiniging en opslag van de herbruikbare SEC-kolommen
      OPMERKING: De SEC-kolommen die in dit protocol worden beschreven, kunnen volgens de fabrikant tot 5 keer opnieuw worden gebruikt. Als het debiet van de SEC-kolommen afneemt na gebruik <5, raadt de fabrikant aan de geconcentreerde monsters gedurende 10 minuten op 10.000 x g te centrifugeren om eventuele aggregaten vóór SEC te verwijderen. Laad vervolgens het supernatant van deze centrifugatie op de SEC-kolom voor EV-isolatie.
      1. Om de SEC-kolom na elk gebruik schoon te maken en op te slaan, voegt u 2 ml (0,5 ml) van 0,5 M NaOH toe en laat u deze volledig in de kolom komen. Laat 100 ml (20 ml) 20% ethanol door de kolom lopen en bewaar het bij 4 °C tot het volgende gebruik. Voor het volgende gebruik, breng de ethanol in evenwicht tot kamertemperatuur zoals hierboven, en wissel het uit met PBS-buffer door nog eens 150 ml (30 ml) PBS door de kolom te laten lopen.
      2. Om de SEC-kolom na elk gebruik schoon te maken en onmiddellijk opnieuw te gebruiken, voegt u 2 ml (0,5 ml) 0,5 M NaOH toe en laat u deze volledig in de kolom komen. Voer ongeveer 150 ml (30 ml) PBS-buffer uit om NaOH weg te spoelen. Wanneer de pH van eluaat gelijk is aan PBS (~7), kan een nieuw monster worden geladen.

3. Kwaliteitscontrole van ev-voorbereiding

  1. Steriliteitstesten
    OPMERKING: Aangezien deze EV's afkomstig zijn uit bacterieculturen, is het van cruciaal belang om steriliteit te garanderen voordat ze stroomafwaarts worden gebruikt.
    1. Verkrijg 100 μL (20 μL) van de fracties die in assays moeten worden gebruikt en ent 3 ml van het medium dat wordt gebruikt om de bronbacteriën te laten groeien. Kweek onder de respectieve optimale omstandigheden gedurende ten minste 3 dagen en observeer op troebelheid. U kunt ook de fractiemonsters aanbrengen op agarplaten die het medium bevatten dat wordt gebruikt om de producerende bacteriën te laten groeien en op zoek gaan naar kolonievorming.
      OPMERKING: Als bacteriële besmetting wordt gedetecteerd, wordt het niet aanbevolen om het EV-preparaat te gebruiken voor experimenten. Herhaal in plaats daarvan de isolatie en zorg ervoor dat het risico op bacteriële besmetting wordt geminimaliseerd door (a) voldoende centrifugatie / filtratie van geconditioneerd bacteriecelkweekmedium uit te voeren, (b) schone flessen, slangen, filters en chromatografiekolommen te gebruiken en (c) geschikte aseptische technieken te gebruiken.
  2. Eiwitkwantificering
    OPMERKING: Er werd een zeer gevoelige, op fluorescentie gebaseerde eiwitkwantificeringskit gebruikt (zie de tabel met materialen). De kit werkt met een bijpassende gepatenteerde fluorimeter bij excitatie/ emissiegolflengten van 485/590 nm.
    1. Breng alle reagentia, standaarden en monsters op kamertemperatuur.
    2. Bereid een hoofdmengsel van eiwitreagens en buffer door 1 μL van het reagens toe te voegen aan 199 μL buffer voor elk monster en de standaard die moet worden getest. Gebruik dunwandige 0,5 ml PCR-buizen en voeg 10 μL standaard + 190 μL mastermix toe aan elke standaardbuis.
      OPMERKING: Om binnen het bereik van de test te zijn, hangt de hoeveelheid van elke fractie die aan elke monsterbuis moet worden toegevoegd af van de verwachte eiwitopbrengst van de zuivering. Doorgaans werd 5 μL van elke fractie + 195 μL mastermix gebruikt. Het uiteindelijke volume monster + mastermix moet 200 μL zijn.
    3. Vortex de testbuizen en incubeer gedurende ten minste 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
    4. Meet de normen op de juiste gepatenteerde fluorimeter (zie de tabel met materialen) door de optie Eiwittest te selecteren met behulp van de pijlknoppen en op de GO-knop te drukken om te bevestigen. Volg de instructies op het scherm, plaats elke standaardbuis en druk op GO.
    5. Plaats de experimentele monsterbuis; druk op GO om te lezen; en noteer het weergegeven resultaat, namelijk de werkelijke eiwitconcentratie in het assaybuffer/monstermengsel. Als u de eiwitconcentratie in het monster wilt verkrijgen, gebruikt u de pijltoetsen om de optie Monsterconcentratie berekenen te selecteren, drukt u op GO en gebruikt u de pijltoetsen om het monstervolume te selecteren dat aan de testbuffer voor het gegeven monster is toegevoegd. Druk op GO en noteer de eiwitconcentratie van het monster. Herhaal deze stap voor elk te analyseren monster.
  3. Deeltjes tellen en grootteverdeling
    OPMERKING: Microfluidics resistive pulse sensing (MRPS) werd gebruikt om de EV-concentratie en grootteverdeling te kwantificeren.
    1. Verdun de monsters in PBS aangevuld met 1% Tween-20 dat is gefilterd door een spuitfilter van 0,02 μm tot een eiwitconcentratie van ongeveer 0,1 μg / ml.
      OPMERKING: Het doel van verdunning is het bereiken van een verwachte deeltjesconcentratie in het bereik van 1010 deeltjes/ml in EV-bevattende fracties. De optimale verdunning moet mogelijk empirisch worden bepaald. Er worden weinig EV's verwacht voor latere fracties (voorbij Fractie 6). De deeltjesconcentratie zal dus waarschijnlijk < 1010 deeltjes / ml zijn, ondanks analyse bij lage verdunningen.
    2. Laad 3 μL van elk monster met een micropipette in de wegwerpmicrofluïdicacartridge, plaats de cartridge in het MRPS-instrument en druk op de metalen knop met een blauw verlichte rand.
    3. Klik op Go! op de acquisitiesoftware en wacht tot het monster door het instrument is geanalyseerd. Verkrijg 1.000 tot 10.000 deeltjesgebeurtenissen om de technische statistische analysefout te minimaliseren. Klik op dit punt op Stoppen en Uitvoeren beëindigen om de voorbeeldacquisitie te voltooien.
      OPMERKING: Samen met de onbewerkte gegevensbestanden voert het instrument een samenvattende spreadsheet uit met de deeltjesconcentratie in het monster. Corrigeer deze waarde volgens de gemaakte monsterverdunning.
    4. Gebruik analysesoftware om de onbewerkte gegevens te laden en aangepaste grafieken van grootteverdeling te genereren.

4. EV-opslag

  1. Aliquot individuele of gepoolde fracties tot 25-50% van de individuele fractiegrootte (afhankelijk van de grootte van de gebruikte kolom) in eiwitarme buizen en bewaar bij -80 °C om vries-dooicycli te voorkomen.
    OPMERKING: Verschillende toepassingen kunnen kleinere of grotere aliquots vereisen, afhankelijk van de verwachte hoeveelheid die in elk experiment wordt gebruikt. Dit zal empirisch moeten worden bepaald. De niet-EV-bevattende fracties kunnen worden weggegooid als ze niet van toepassing zijn op de onderzoeksdoelstellingen.

5. Transmissie-elektronenmicroscopie

  1. Negatieve kleuring
    1. Voeg 5 μL van het EV-monster toe aan het met koolstof gecoate koperen 400 mesh-rooster en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Was de monsterzijde met 5 druppels Tris-buffer van 5 mM (pH 7,1) en vervolgens met 5 druppels gedestilleerd water.
    2. Kleur de zijkant van het monster met 5 druppels 2% uranylacetaat. Dep elke extra hoeveelheid vlek weg met filterpapier en laat het rooster enkele uren of een nacht volledig drogen. Visualiseer de monsters met een elektronenmicroscoop op 80 kV.
  2. Immunogold etikettering
    1. Breng 10 μL van de EV-suspensie aan op een formvar/koolstof 400 mesh-rooster en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was het rooster drie keer in PBS en breng vervolgens 4% paraformaldehyde aan gedurende 10 minuten om het monster te fixeren. Was de roosters vijf keer met PBS.
    2. Blokkeer het rooster met drie wasbeurten PBS met 0,1% runderserumalbumine (BSA). Breng vervolgens 10 μL van een primair antilichaam gedurende 40 minuten aan bij kamertemperatuur (hier 1 μg / ml nluc-antilichaam). Was drie keer opnieuw met PBS met 0,1% BSA.
    3. Voeg 10 μL secundair goudgelabeld antilichaam toe aan het rooster en incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur. Was de roosters drie keer met PBS.
      OPMERKING: Hier werd een geiten-antimuisantilichaam geconjugeerd met 10 nm gouden nanodeeltjes gebruikt na verdunning 1:10 in blokkerende buffer. Als gouden etikettering EV-visualisatie verdoezelt, kunnen in plaats daarvan secundaire antilichamen met kleinere gouden nanodeeltjes (bijv. 5 nm) worden gebruikt.
    4. Bevestig het rooster na 10 μL 2,5% glutaaraldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was drie keer in PBS. Voer negatieve kleuring uit met 2% uranylacetaat (10 μL) gedurende 15 minuten. Integreer de monsters in 10 μL van 0,5% uranylacetaat en 0,13% methylcellulose-oplossing gedurende 10 minuten.
    5. Laat de monsterroosters een nacht bij kamertemperatuur drogen voordat ze op de elektronenmicroscoop worden afgebeeld.
    6. Bepaal op de microscoop acquisitiesoftware de belichting empirisch om de optimale kwaliteit van het beeld te verkrijgen (bijv. 0,80851 s in deze specifieke opstelling) en pas deze aan door deze waarde in het optievak belichtingstijd te typen. Selecteer de optie 80 kV en klik op Acquisitie starten om de afbeelding vast te leggen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om te beoordelen welke SEC-chromatografiefracties werden verrijkt voor EV's, werd de SEC-kolom geladen met 2 ml E. coli MP1-geconditioneerd kweekmedium dat 1.000 keer door TFF was geconcentreerd en werden sequentiële fracties verzameld. Met behulp van MRPS bleek dat fracties 1-6 de meeste EV's bevatten (figuur 2A). Latere fracties bevatten zeer weinig EV's, bestaande uit in plaats van EV-vrije eiwitten (figuur 2B). EV's hadden voornamelijk een diameter van < 100 nm (figuur 2C). TEM bevestigde EV-verrijking en grootte, met name in fracties 2-6 (figuur 2D).

Om er verder voor te zorgen dat de methoden ev's konden scheiden van niet-EV-geassocieerde eiwitten, werd een recombinante stam van E. coli MP1 gegenereerd die een cytolysine A-nanoluciferase fusie-eiwit tot expressie bracht en vrij (niet-gefuseerd) mCherry (schematiseerd in figuur 3A). Cytolysine A-fusie-eiwitten bleken eerder te associëren met E. coli EV's14. Om de fluorescentie van mCherry te monitoren, werden 100 μL aliquots van elke chromatografiefractie overgebracht naar de putten van een 96-well plaat. Hun fluorescentie werd gemeten in een microplaatlezer met respectievelijk 580 nm en 620 nm als absorptie- en emissiegolflengten.

Evenzo werd voor luminescentiemeting een aliquot van 20 μL van elke fractie gemengd met een gelijk volume van de Luciferase-testoplossing in een 384-well plaat, geïncubeerd gedurende 15 minuten, en werd zichtbare lichtluminescentie gemeten. Er werd waargenomen dat EV-verrijkte fracties (Fracties 2-7) een hoge nanoluciferase-activiteit hadden die vergelijkbaar was met die van latere fracties, maar slechts een zeer laag fluorescerend signaal van niet-EV-geassocieerde mCherry (figuur 3B). Het achtergrondsignaal van een gelijke hoeveelheid negatieve controle-EV's (geïsoleerd uit een gematchte bacteriestam zonder nanoluciferase-expressie) was > 1.000 keer lager in EV-fracties. Het signaal van de positieve controle (een nanoluciferase-tot expressie brengende bacteriële celpellet) was ongeveer 1.000 keer hoger dan dat van de EV-fracties (niet weergegeven). Dit laatste werd genormaliseerd tot het initiële volume van celkweekmateriaal dat respectievelijk de geanalyseerde cellen of EV's opleverde. De EV-associatie van nanoluciferase werd bevestigd in fracties 2-5 door immunogold-etikettering (figuur 3C), waarbij de etikettering binnen de kleine geïsoleerde EV's van ~ 20 nm werd waargenomen.

Ten slotte, om de toepasbaarheid van dit protocol op andere bacteriesoorten te beoordelen, werden EV's geïsoleerd uit ~ 100 ml culturen van de volgende diverse anaerobe bacteriën: A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve en B. dentium bereid in BHI-kweekmedium. Als controle werden EV's geïsoleerd van het verse BHI-kweekmedium. Hoewel de EV-opbrengst per soort varieerde, werd opnieuw waargenomen dat vroege chromatografiefracties 1-4 werden verrijkt voor EV's (figuur 4A). Het complexe BHI-medium bevatte ook deeltjes van EV-formaat, zij het op <25% van de totale EV-opbrengst in deze preparaten (figuur 4A, zwarte balken). EV's van deze bacteriën bleken ook voornamelijk <100 nm groot te zijn (figuur 4B).

Figure 2
Figuur 2: Representatieve E. coli MP1 EV-elutie in vroege chromatografiefracties. (A) Deeltjestelling door MRPS in sequentiële chromatografiefracties van 2 ml. SEC-input was 2 L bacteriecultuur supernatant geconcentreerd tot 2 ml. Ononderbroken lijn staat voor gemiddelde; gearceerd gebied geeft SEM aan. (B) Eiwitconcentratie in elke fractie. (C) Grootteverdeling van fractie 3 EV's gemeten met MRPS. Ononderbroken lijn staat voor gemiddelde; gearceerd gebied vertegenwoordigt 95% CI. Merk op dat het instrument deeltjes <50 nm niet kan kwantificeren. (D) Transmissie-elektronenmicrografieën van sequentiële, gepoolde chromatografiefracties en vers kweekmedium (controle). Alle foto's zijn gemaakt met dezelfde schaal (100 nm). Wide-field TEM-afbeeldingen worden weergegeven in aanvullende figuur S3. Afkortingen: EV = extracellulair blaasje; MRPS = microfluïdica resistieve pulsdetectie; SEC = grootte-uitsluitingschromatografie; SEM = standaardfout van het gemiddelde; CI = betrouwbaarheidsinterval. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Scheiding van E. coli MP1 EV's van EV-vrije eiwitten door SEC. (A) Schematische weergave van E. coli MP1 die recombinant mCherry (rood) tot expressie brengt in het cytoplasma en periplasma-smokkelend cytolysine A-nanoLuciferase fusie-eiwit (gele diamanten). (B) nanoLuciferase bioluminescentie activiteit en mCherry fluorescentie werden gemonitord in sequentieel geëlueerde chromatografie fracties. Verticale stippellijn vertegenwoordigt de limiet van EV-verrijkte fracties op basis van analyses in figuur 2. (C) EV-fracties (F2-5) werden immunogoud gelabeld na kleuring met anti-nanoLuciferase-antilichaam. Cyaan pijlpunten wijzen op goud-geconjugeerde secundaire antilichamen die colocaliseren met kleine EV's. Controle-EV's van wildtype E. coli MP1 hadden verwaarloosbare niet-specifieke kleuring. Beide opnames zijn gemaakt met dezelfde schaal (100 nm). Tem-afbeeldingen met een breed veld worden weergegeven in aanvullende figuur S4. Afkortingen: EV = extracellulair blaasje; SEC = grootte-uitsluitingschromatografie; F = fractie; TEM = transmissie-elektronenmicroscopie; ClyA-nLuc = cytolysine A-nanoLuciferase fusie-eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Isolatie van EV's van diverse bacteriesoorten. Aangegeven soorten werden gedurende 48 uur gekweekt in BHI-medium onder anaërobe omstandigheden. EV's werden geïsoleerd door ultrafiltratie + SEC. (A) EV-concentratie in de eerste 4 SEC-fracties, gemeten met MRPS. Gemiddelde ± SEM. Zwarte staven vertegenwoordigen deeltjes gedetecteerd in een partij vers BHI-medium (controle). (B) Grootteverdeling van EV's in fractie 2. Afkortingen: EV = extracellulair blaasje; MRPS = microfluïdica resistieve pulsdetectie; SEC = grootte-uitsluitingschromatografie; BHI = hersenhartinfusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: p114-mCherry-Clyluc plasmide. (A) Kaart van p114-mCherry-Clyluc plasmide. (B) Volgorde van het J23114-mCherry-clyA-nluc gebied. Violet, J23114 Promotor; Roze, mCherry gen; Grijs, clyA gen; Groen, Linker volgorde; Oranje, nLuc gen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: TFF-instellingsschema (Tangential Flow Filtration). De buis met weerhaakslangen was aangesloten op het TFF-apparaat, zoals getoond. De toevoerstroombuizen beginnen ondergedompeld te worden in het gefilterde, geconditioneerde kweekmediumvat, gaan door de peristaltische pomp en maken verbinding met de inlaatpoort van het TFF-apparaat. De retourstroom begint bij de uitlaatpoort van het TFF-apparaat en eindigt boven het oppervlak van het gefilterde, geconditioneerde kweekmedium. Optioneel kan een tegendrukklem (bijv. Een schroefmoer + bout of eenvoudige papierklem) worden gebruikt om de filtratiesnelheid te verhogen. Terwijl de pomp het geconditioneerde medium circuleert, leidt de ontwikkelde druk in het TFF-apparaat tot ultrafiltratie en verwijdering van componenten < 100 kDa door de filtraat / afvalstroombuizen, die kunnen worden verzameld in een apart vat voor verwijdering (magenta). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S3: Widefield transmissie elektronenmicrografieën. TEM-beelden van sequentiële, gepoolde chromatografiefracties en vers kweekmedium (controle) weergegeven in figuur 2D. De beelden laten zien dat de E. coli MP1 extracellulaire blaasjes elueren in vroege chromatografiefracties. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S4: Widefield TEM-afbeeldingen voor figuur 3C. De EV-fracties (F2-5) werden immunogoud-gelabeld na kleuring met anti-nano-Luciferase-antilichaam. Cyaan pijlpunten wijzen op goud-geconjugeerde secundaire antilichamen die colocaliseren met kleine EV's. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende methode: Voor recombinante E. coli MP1-stam met p114-mCherryClyluc. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In het bovenstaande protocol wordt een methode beschreven die schaalbaar is en ev's betrouwbaar isoleert van verschillende gramnegatieve / positieve en aerobe / anaërobe bacteriën. Het heeft verschillende potentiële stoppunten tijdens de procedure, hoewel het beter is om te voorkomen dat het langer dan 48 uur duurt om EV's te isoleren van geconditioneerde bacteriële kweekmedia.

Ten eerste bestaat het uit het kweken van bacteriën om geconditioneerd bacteriekweekmedium te genereren. Het bleek dat het verhogen van de kweektijd tot ten minste 48 uur en het gebruik van het optimale groeimedium helpt om de EV-opbrengst te maximaliseren. Het is waarschijnlijk dat elke bacteriesoort moet worden geoptimaliseerd met betrekking tot deze twee parameters. Het volume van de bacteriecultuur is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat voldoende EV's worden geïsoleerd voor de gewenste toepassing. Voor in vitro studies worden de EV's meestal geïsoleerd uit minimaal 100 ml, terwijl voor in vivo studies EV's meestal worden geïsoleerd uit >1 L kweekmedium. Nogmaals, de EV-productiekenmerken van elke bacteriestam en de vereiste EV-hoeveelheid voor downstream-assays zullen het minimale startcultuurvolume dicteren.

Zodra geconditioneerd kweekmedium beschikbaar is, moeten cellen en groot niet-EV-vuil worden verwijderd. Centrifugatie bleek een cruciale stap in dit proces. Zoals opgemerkt in het bovenstaande protocol, werden twee toenemende g-kracht centrifugaties uitgevoerd. Af en toe wordt een extra 10.000 × g centrifugatie uitgevoerd als werd opgemerkt dat de pellet van de tweede spin niet compact is. Vervolgens wordt steriele filtratie van dit supernatant uitgevoerd door een filter van 0,22 μm. Onvoldoende centrifugatie leidt tot verstopping en slechte prestaties van deze filtratiestap. Er werd opgemerkt dat het blijven filteren van het supernatant nadat de filtratiesnelheid aanzienlijk is vertraagd, kan leiden tot filterstoringen en besmetting van het EV-preparaat met de ouderlijke bacteriën. De oplossing voor aanhoudende verstopping van het filter is om het supernatant opnieuw te centrifugeren en/of opnieuw te filteren, waardoor steriliteit wordt gegarandeerd. De beschreven centrifugatie- en vacuümgestuurde filtratiestappen werden getest op maximaal 4 L bacteriekweek. Verdere opschaling van EV-isolatie kan aanpassingen vereisen. Beide stappen kunnen bijvoorbeeld mogelijk worden vervangen door sequentiële pompgestuurde filtratie met behulp van compatibele filterapparaten met afnemende poriegrootte, tot 0,22 μm. Dit moet echter nog worden getest.

In het huidige protocol worden twee variaties beschreven, afhankelijk van het beginvolume van de bacteriecultuur. Gebruik voor volumes < 100 ml centrifugale ultrafiltratieapparaten om de kweekmedia te concentreren. De MWCO is van cruciaal belang in deze stappen. Voor ev's voor zoogdieren werden eerder >300 kDa MWCO gebruikt 11,12. Dit resulteerde echter in zeer slechte EV-opbrengsten van bacteriën, vermoedelijk vanwege de kleinere distributie. Daarom wordt aanbevolen om 100 kDa MWCO te gebruiken. Een kleinere MWCO kan ook worden gebruikt, maar wordt geassocieerd met langere centrifugatietijden en minder verwijdering van verontreinigingen met een klein molecuulgewicht, waardoor de viscositeit van het monster toeneemt. Het is ook handig om verschillende maten ultrafiltratie-apparaten op 100 kDa MWCO te hebben om verschillende startvolumes van monsters in het hele protocol te concentreren.

Als alternatief kunt u voor monstergrootten die aanzienlijk >100 ml gebruiken, pompaangedreven TFF gebruiken om het monster te concentreren; nogmaals, het gebruik van een 100 kDa MWCO is van cruciaal belang. Deze methode maakt het mogelijk om grote hoeveelheden kweekmedium op een semi-geautomatiseerde manier te verwerken. Het is belangrijk om een TFF-apparaat van de juiste grootte te verkrijgen voor het startcultuurvolume. Het gebruikte apparaat is geschikt voor het verwerken van maximaal 200 ml materiaal door de fabrikant. Het was mogelijk om tot ongeveer 2 L te verwerken. Er werd echter een ernstige daling van de filtratiesnelheid waargenomen bij het verwerken van grotere volumes, waardoor het proces moest worden gestopt en het apparaat moest worden gereinigd voordat het verder werd verwerkt. De kenmerken van elke bacteriecultuur en de hoeveelheid uitgangsmateriaal bepalen dus de vereiste grootte van het TFF-apparaat. Bovendien is het haalbare pomptoerental een andere belangrijke parameter voor TFF. Bij lage snelheden van ~ 100 ml / min was het noodzakelijk om de tegendruk in het TFF-apparaat te verhogen met behulp van een klem, zoals aangegeven in aanvullende figuur S2, om filtratie te vergemakkelijken, waardoor de vervuilingssnelheid van het filter toeneemt. De buis werd tot 2 keer hergebruikt na passende decontaminatie en autoclavering.

Zodra het monster is geconcentreerd, kan het vervolgens op een SEC-kolom worden geladen om de EV's te isoleren. Commerciële kolommen geoptimaliseerd voor kleine EV-isolatie werden gebruikt. Gebruik voor kleine startmonsters kolommen met een laadvolume van 0,5 ml en gebruik de kolommen met een laadvolume van 2 ml voor grotere startmonsters tot 2 l. Het is waarschijnlijk dat de verwerking van startculturen >2 L grotere kolommen vereist. Fabrikanten van EV-geoptimaliseerde kolommen bieden momenteel SEC-kolommen die > 100 ml geconcentreerd materiaal kunnen accepteren.

Verschillende methoden worden gebruikt om de geïsoleerde EV's te karakteriseren, waarvan de meeste op grote schaal beschikbaar zijn. Normalisatie was gebaseerd op de eiwitconcentratie voor de meeste testen omdat dit niet wordt beïnvloed door het onvermogen van andere kwantificeringsmethoden (namelijk deeltjeskwantificering door technologieën zoals MRPS) om zeer kleine EV's <50 nm te detecteren. MRPS en andere nanodeeltjeskwantificeringstechnologieën blijven nuttig bij de relatieve kwantificering van EV's tussen de verschillende fracties.

Een cruciaal aspect van MRPS-kwantificering is het verdunningsniveau. Wanneer de frequentie van gedetecteerde EV's op de juiste manier wordt verdund, moet deze in de meeste gevallen blijven stijgen tot de detectiegrens, aangezien het instrument deeltjes < 50 nm niet kan kwantificeren. Onvoldoende verdunning zal leiden tot een hoge instrumentruis, die een artefactuele klokvormige curve zal genereren met een piek >65 nm (bij gebruik van de aanbevolen C-300 microfluïdica-cartridge). Tijdens de analyse van de groottefrequentieverdelingsgegevens wordt soms nog steeds een artefactuele piek tussen 50 nm (de absolute detectiegrens van het instrument) en 60 nm waargenomen, ondanks adequate verdunning. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de aanwezigheid van aanzienlijke aantallen zeer kleine bacteriële EV's (zoals gevisualiseerd in TEM, figuur 2D) die onder de limiet van nauwkeurige detectie door MRPS liggen en opnieuw leiden tot instrumentruis. Sluit in dit geval gegevenspunten uit die kleiner zijn dan de waargenomen "piek", die de de facto ondergrens van kwantificering van het gegeven monster wordt.

Zoals beschreven in dit protocol, kan de kwantificering van EV-abundantie, totale eiwitconcentratie en overvloed aan niet-EV-eiwitten in de geëlueerde chromatografiefracties gebruikers helpen beslissen welke fracties ze moeten gebruiken voor downstream-assays. Kleine EV's werden bijvoorbeeld gedetecteerd in gepoolde fracties 7-8 (figuur 2D); hun abundantie was echter lager dan die in de onmiddellijk voorafgaande fracties, terwijl de totale eiwitconcentratie (figuur 2B) hoger was. Dit kan erop wijzen dat fracties 7-8 grotere hoeveelheden niet-EV-geassocieerde eiwitten bevatten en dus mogelijk niet wenselijk zijn voor bepaalde downstream-toepassingen.

Samenvattend wordt hier een veelzijdig EV-isolatieprotocol beschreven dat afhankelijk is van in de handel verkrijgbare materialen. Het belang van deze methodologie in vergelijking met veelgebruikte op ultracentrifugatie gebaseerde methoden is dat het stappen omvat die gemakkelijk door verschillende gebruikers kunnen worden gereproduceerd en zeer schaalbaar is. Dit is vooral belangrijk om het genereren van voldoende materiaal voor in vivo studies te vergemakkelijken. Het werd gebruikt om EV's te isoleren van culturen van 100 ml tot 2 l. Gezien het brede scala aan beschikbare TFF-apparaten, is het mogelijk dat dit protocol met enige aanpassing kan worden aangepast aan grootschalige zuiveringen. Het beschreven isolatieprotocol is voornamelijk gebaseerd op de fysieke eigenschappen van EV's, namelijk hun grootte, en is waarschijnlijk van toepassing op bacteriesoorten die verder gaan dan die welke in deze studie worden beschreven.

Een beperking van het beschreven protocol is dat het de isolatie van kleine EV's bevordert, met name <100 nm, zoals te zien is in de representatieve resultaten. Eerdere rapporten beschrijven ook de aanwezigheid van grotere bacteriële EV's15,16. Isolatie van grotere bacteriële EV's kan wijzigingen van het bovenstaande protocol vereisen, bijvoorbeeld door SEC-kolommen te gebruiken die zijn geoptimaliseerd voor grotere EV's. Dergelijke SEC-kolommen zijn ook in de handel verkrijgbaar. Bovendien kunnen andere protocollen waarschijnlijk een hogere EV-zuiverheid bereiken (bijvoorbeeld ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt of immuno-isolatie). Deze methoden missen echter de doorvoer en schaalbaarheid van de methoden die in dit onderzoek worden beschreven. Wijziging van dit protocol met aanvullende zuiveringsstappen in de toekomst kan de opbrengst en zuiverheid van preparaten verder verhogen, wat belangrijk kan zijn voor experimentele en therapeutische toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Acknowledgments

Het hierboven beschreven onderzoek werd ondersteund door NIH TL1 TR002549-03 trainingsbeurs. We bedanken Drs. John C. Tilton en Zachary Troyer (Case Western Reserve University) voor het vergemakkelijken van de toegang tot het deeltjesgrootte-analyse-instrument; Lew Brown (Spectradyne) voor technische assistentie bij de analyse van de deeltjesgrootteverdelingsgegevens; Dr. David Putnam aan de Cornell University voor het verstrekken van pClyA-GFPplasmide 14; en Dr. Mark Goulian aan de Universiteit van Pennsylvania voor het verstrekken van de E. coli MP113.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes Thermo Scientific 3430 it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution Electron microscopy sciences 15700
250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles ThermoFisher 010-1495
500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles ThermoFisher 010-1493
65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter Beckman Coulter 392077 Allows Vivacell to fit in rotor
Akkermansia mucinophila ATCC BAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO) MilliporeSigma UFC910024
Avanti J-20 XPI centrifuge Beckman Coulter No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482 ATCC 29148
Bifidobacterium breve NCIMB B8807
Bifidobacterium dentium ATCC 27678
Brain Heart infusion (BHI) broth Himedia M2101 After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.
C-300 microfluidics cartridge Spectradyne
Chloramphenicol MP Biomedicals ICN19032105
Electron microscope FEI company Tecnai G2 SpiritBT
Escherichia coli HST08 (Steller competent cells) Takara 636763
Escherichia coli MP1 Dr. Mark Goulian (gift) commensal bacteria derived from mouse gut
Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter ThermoFisher 010-0151-05 used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture
Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor ThermoFisher F12-6x500-LEX fits 6 x 500 mL bottles
Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper Electron microscopy sciences FCF-400-CU
Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution) Electron microscopy sciences 16100
Hematin ChemCruz 207729B Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as  1.2 mg/mL
Infinite M Nano+ Microplate reader Tecan This equibment was used to measure the mCherry fluorescence
In-Fusion  HD Cloning Plus Takara 638909 For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors
JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor Beckman Coulter 368690
Lauria Bertani (LB) broth, Miller Difco 244620
L-Cysteine Hydrochloride J.T. Baker 2071-05 It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK cole-parmer - special HV-30800-08 connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK cole-parmer - special HV-30800-24 connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm Masterflex HV-07555-00
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor Masterflex EW-07514-10
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft Cole Palmer EW-06435-16 low-binding/low-leaching tubing
Menadione (Vitamin K3) MP 102259 Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL
MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK Repligen D04-E100-05-N TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant
Nano-Glo Luciferase Assay System Promega N1110 This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein
NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808 R&D Systems MAB10026
nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument Spectradyne
nCS1 Viewer Spectradyne Analysis software for particle size distribution
OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer NEB M0482 DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking
Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes Eppendorf 30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix NEB M0492 DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning
qEV original, 35 nm Izon maximal loading volume of 0.5 mL
qEV rack Izon for use with the qEV-original SEC columns
qEV-2, 35 nm Izon maximal loading volume of 2 mL
Qubit fluorometer ThermoFisher Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)
Qubit protein assay kit ThermoFisher Q33211 Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C.
Sorvall Lynx 4000 centrifuge ThermoFisher 75006580
SpectraMax i3x Microplate reader Molecular Devices This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence
Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL) MilliporeSigma S2GPU01RE
S2GPU02RE
S2GPU05RE		 One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.
Uranyl acetate Electron microscopy sciences 22400
Vinyl anaerobic chamber Coy Lab
Vivacell 100, 100,000 MWCO PES Sartorius VC1042
Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron) MilliporeSigma WHA68093002 to filter MRPS diluent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).
  2. Chatterjee, S. N., Das, J. Electron microscopic observations on the excretion of cell-wall material by Vibrio cholerae. Journal of General Microbiology. 49 (1), 1-11 (1967).
  3. Ciofu, O., Beveridge, T. J., Kadurugamuwa, J., Walther-Rasmussen, J., Hoiby, N. Chromosomal beta-lactamase is packaged into membrane vesicles and secreted from Pseudomonas aeruginosa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 45 (1), 9-13 (2000).
  4. Yonezawa, H., et al. Outer membrane vesicles of Helicobacter pylori TK1402 are involved in biofilm formation. BMC Microbiology. 9, 197 (2009).
  5. Mashburn, L. M., Whiteley, M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).
  6. Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
  7. Petousis-Harris, H., et al. Effectiveness of a group B outer membrane vesicle meningococcal vaccine against gonorrhoea in New Zealand: a retrospective case-control study. Lancet. 390 (10102), 1603-1610 (2017).
  8. Kim, O. Y., et al. Bacterial outer membrane vesicles suppress tumor by interferon-gamma-mediated antitumor response. Nature Communications. 8 (1), 626 (2017).
  9. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  10. Consortium, E. -T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
  11. Watson, D. C., et al. Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles. Biomaterials. 105, 195-205 (2016).
  12. Watson, D. C., et al. Scalable, cGMP-compatible purification of extracellular vesicles carrying bioactive human heterodimeric IL-15/lactadherin complexes. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1442088 (2018).
  13. Lasaro, M., et al. Escherichia coli isolate for studying colonization of the mouse intestine and its application to two-component signaling knockouts. Journal of Bacteriology. 196 (9), 1723-1732 (2014).
  14. Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. Journal of Molecular Biology. 380 (1), 51-66 (2008).
  15. Beveridge, T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. Journal of Bacteriology. 181 (16), 4725-4733 (1999).
  16. Reimer, S. L., et al. Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content. Frontiers in Microbiology. 12, 628801 (2021).

Tags

Biologie Nummer 176
Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van <em>Escherichia coli</em> en andere bacteriën
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Watson, D. C., Johnson, S., Santos,… More

Watson, D. C., Johnson, S., Santos, A., Yin, M., Bayik, D., Lathia, J. D., Dwidar, M. Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria. J. Vis. Exp. (176), e63155, doi:10.3791/63155 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter