È stato stabilito un metodo per riattivare le cellule staminali neurali quiescenti negli espianti cerebrali di Drosophila in coltura. Utilizzando questo metodo, il ruolo dei segnali sistemici può essere disaccoppiato dai segnali intrinseci del tessuto nella regolazione della quiescenza, dell'ingresso e dell'uscita delle cellule staminali neurali.
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Articolo metodologico
Riattivazione delle cellule staminali neurali negli espianti cerebrali di Drosophila in coltura
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule staminali neurali (NSC) hanno la capacità di proliferare, differenziarsi, subire apoptosi e persino entrare e uscire dalla quiescenza. Molti di questi processi sono controllati dalla complessa interazione tra i programmi genetici intrinseci NSC con i fattori estrinseci NSC, locali e sistemici. Nell'organismo modello genetico, Drosophila melanogaster, le NSC, note come neuroblasti (NB), passano dalla quiescenza alla proliferazione durante la transizione embrionale a quella larvale. Durante questo periodo, le larve emergono dai loro gusci d'uovo e iniziano a gattonare, alla ricerca di nutrienti dietetici. In risposta all'alimentazione animale, il corpo grasso, un organo endocrino con capacità di accumulo lipidico, produce un segnale, che viene rilasciato sistemicamente nell'emolinfa circolante. In risposta al segnale derivato dal corpo grasso (FBDS), i peptidi insulino-simili a Drosophila (Dilps) vengono prodotti e rilasciati dai neuroni neurosecretori del cervello e dalla glia, portando all'attivazione a valle della segnalazione della crescita della PI3-chinasi nei NB e nella loro nicchia gliale e tracheale. Sebbene questo sia il modello attuale di come i NB passano dalla quiescenza alla proliferazione, la natura del segnale estrinseco FBDS rimane sfuggente. Per capire meglio come i segnali sistemici estrinseci NB regolano l'uscita dalla quiescenza, è stato sviluppato un metodo per coltivare i primi cervelli larvali in vitro prima dell'alimentazione animale. Con questo metodo, i fattori esogeni possono essere forniti ai terreni di coltura e NB uscita dalla quiescenza analizzata. Abbiamo scoperto che l'insulina esogena è sufficiente per riattivare i NB dalla quiescenza negli espianti di tutto il cervello. Poiché questo metodo è adatto per schermi su larga scala, miriamo a identificare ulteriori segnali estrinseci che regolano la quiescenza NB rispetto alle decisioni di proliferazione. Poiché i geni e i percorsi che regolano le decisioni di proliferazione NSC sono conservati evolutivamente, i risultati di questo test potrebbero fornire informazioni sul miglioramento delle terapie rigenerative nella clinica.
Introduzione
Le cellule staminali sono di grande interesse per il loro potenziale di utilizzo nella medicina rigenerativa 1,2. Molti animali, specialmente quelli longevi, mantengono le cellule staminali all'interno dei loro tessuti adulti. Queste cellule staminali residenti funzionano per mantenere l'omeostasi tissutale e sono utilizzate per la riparazione a seguito di lesioni fisiche o malattie 3,4. La maggior parte delle cellule staminali negli animali adulti sono quiescenti, uno stato relativamente dormiente caratterizzato dall'arresto del ciclo cellulare e dall....
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Protocollo
1. Raccolta delle larve di Drosophila
NOTA: Preparare il piatto di lievito, la pasta d'uva e il condominio Fly prima di iniziare:
- Pasta di lievito: In un piccolo contenitore, mescolare 5 g di lievito secco attivo con 10 ml di acqua per formare una pasta che abbia la consistenza del burro di arachidi. Coprire la pasta di lievito con pellicola trasparente e utilizzare un elastico per fissarlo saldamente al contenitore.
NOTA: la pasta di lievito fresco si espanderà nel suo contenitore e si staccherà dal coperchio a meno che non sia saldamente attaccata. La pasta di lievito durerà per diversi giorni a temp....
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Risultati
I cervelli selvatici dell'OregonR appena nati sono stati sezionati e coltivati per 24 ore nei media di Schneider integrati (SSM) con insulina. I tessuti sono stati fissati e macchiati secondo il protocollo. Sono stati utilizzati anticorpi primari generati contro Deadpan (Dpn) per rilevare NB e Scribble per etichettare le membrane cellulari. L'analogo della timidina 5-etinil-2′-deossiuridina (Edu) è stato aggiunto per rilevare l'ingresso nella fase S e la riattivazione NB. Abbiamo trovato NB Edu positivi e Dpn positivi di.......
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Discussione
Il metodo qui descritto per coltivare gli espianti cerebrali può essere eseguito nella maggior parte degli ambienti di laboratorio. Gli strumenti richiesti, così come la procedura e la raccolta dei dati, sono semplici e diretti. Con questo metodo, si può testare una varietà di ipotesi, comprese quelle relative alle cascate di segnalazione cellulare e ai fattori estrinseci che regolano la riattivazione e la proliferazione nb. Qui, utilizzando animali OregonR selvatici, abbiamo scoperto che l'insulina esogena era sufficien.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi in competizione.
Ringraziamenti
Riconosciamo il programma LSAMP Bridges to Doctorate for funding (CNK) e NIH / NIGMS (R01-GM120421 e R35-GM141886). Siamo grati al Dr. Conor Sipe per la Figura 1. Ringraziamo anche tutti i membri del laboratorio Siegrist per il loro continuo supporto e tutoraggio. Ringraziamo in particolare Chhavi Sood e Gary Teeters per l'attenta lettura del manoscritto e per aver fornito commenti.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 10 µ L Puntali per pipette | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 µ L Puntali per pipette | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 µ L Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16% paraformaldeide (10 x 10 mL) | Microscopia elettronica Scienze | 2912.60.0000 | Utilizzato per la fissazione di cervelli larvali |
| 20 &; L Pipetta | Gilson | P20 | |
| 200 & micro; L Puntali per pipette | Denville Sci | 1158U56 | |
| Piastre di coltura multipozzetto a 24 pozzetti | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| Piastre Petri da 35 mm | Fisher Scientific | 08-757-100A | Piastra per uva Ingredienti |
| 4 gradi Frigorifero C | Fisher Scientific | Fornisce una temperatura ideale per incubazioni di >24 ore in soluzione anticorpale | |
| 63x Obiettivo | Lecia | ||
| Lievito secco attivo | La maggior parte dei supermercati | ||
| Agarosio | Fisher Scientific | 214010 | Ingredienti del piatto d'uva |
| Click-iT EdU Kit di proliferazione cellulare per l'imaging, Alexa Fluor 647 colorante | Thermo Fisher Scientific | C10340 | per etichettare le cellule proliferanti |
| Microscopio confocale | Leica | SP8 | |
| Vetrini coprioggetti 22 mm x 22 mm x 1 mm , confezione da 10 da 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Due vetrini coprioggetti sono super incollati alle estremità del vetrino del microscopio. Questo crea uno spazio che consente ai cervelli di fluttuare in antidissolvenza durante l'immagine. |
| Vetrini coprioggetti, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | Il vetrino coprioggetti viene posizionato su due vetrini coprioggetti quadrati sul vetrino del microscopio, assicurando che il cervello nell'antidissolvenza non si muova durante l'imaging. |
| Microscopio da dissezione | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, bottiglia da 1 gallone | Fisher Scientific | 2701 | Utilizzato per lavare via le larve prima della tenuta di 24 ore nel terreno di coltura |
| Siero fetale bovino (10%) | Sigma | F4135-100ML | Integratore per terreni di coltura cellulare. |
| Pinze fini per la dissezione | Strumenti di scienze fini | 11295-20 | Forcepts utilizzati nelle dissezioni. Funzionano meglio se affilati. |
| Bottiglie per Incrocio | Genessee Scientific | 32-130 | Questa bottiglia viene utilizzata come contenitore che permette alle mosche di deporre le uova sul piatto d'uva. |
| Piatto di dissezione in vetro (3 pozzetti) | Questi non sono più disponibili | ||
| Glutatione | Sigma | G6013 | Fornisce protezione ossidativa durante la coltura cellulare. |
| Siero di capra | Sigma | G9023- 10ML | Agente bloccante |
| Piastre d'uva | Fatto in casa | Fatto in casa | Piastre di succo d'uva/agarosio per la raccolta di uova appena schiuse |
| Immagine J | Imagej.net/fiji/downloads | Download gratuito: https://fiji.sc | Piattaforma di imaging che viene utilizzata per contare le cellule e la riattivazione Edu |
| Incubatore | Thermo Fisher Scientific | Assicura che la temperatura, l'umidità e l'esposizione alla luce siano esattamente le stesse durante l'esperimento. | |
| Insulina | Sigma | I0516 | Variabile indipendente dell'esperimento |
| flusso laminare | Per l'aliquotazione di terreni di coltura | ||
| L-Glutammina | Sigma | G7513 | Fornisce supporto durante la coltura cellulare |
| Nunc Mini vassoi Microwell a 72 pozzetti | Fisher Scientific | 12-565-154 | Le fasi di immunocolorazione vengono eseguite in questo vassoio |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film utilizzato per sigillare le piastre al fine di prevenire l'evaporazione |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics utilizzato per prevenire la contaminazione batterica delle cellule durante la coltura. |
| Tampone fosfato, pH7.4 | Prodotto in casa | Prodotto in casa | Solvente utilizzato per lavare il cervello dopo le fasi di fissaggio e colorazione |
| Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Utilizzato per raccogliere le larve dal piatto d'uva |
| Acido propionico | Fisher Scientific | A-258 | Ingredienti del piatto d'uva |
| Coniglio 405 | Abcam | ab175653 | Anticorpi utilizzati per l'immunocolorazione |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Anticorpi utilizzati per l'immunocolorazione |
| Rb Scribble | Un regalo da Chris Doe | Anticorpi utilizzati per l'immunocolorazione | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Anticorpi utilizzati per l'immunocolorazione |
| Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contiene sostanze nutritive che aiutano le cellule a crescere e proliferare |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagente che fornisce protezione contro lo sbiadimento dei fluorofori |
| Acqua sterile | Autoclave Acqua Milli-Q prodotta in casa | Necessario per le soluzioni | |
| Saccarosio | Fisher | S2-12 | Ingredienti Vetrini |
| microscopio Superfrost | Scientific | 12-544-7 | |
| Supercolla | La maggior parte dei supermercati | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Ingredienti del piatto d'uva |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% succo d'uva d'uva | La maggior parte dei supermercati | Ingredienti del piatto d'uva |
Riferimenti
- Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
- Tabar, V., Studer, L. Plur....
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Ristampe e permessi
