Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Verbeterde olieterugwinning met behulp van een combinatie van biosurfactanten

Published: June 3, 2022 doi: 10.3791/63207
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemical Engineering and Biotechnology, Indian Institute of Technology Delhi, 2Indian Oil Corporation, Research and Development Faridabad

Summary

We illustreren de methoden die betrokken zijn bij het screenen en identificeren van de biosurfactant producerende microben. Methoden voor chromatografische karakterisering en chemische identificatie van de biosurfactanten, het bepalen van de industriële toepasbaarheid van de biosurfactant bij het verbeteren van de resterende olieterugwinning worden ook gepresenteerd.

Abstract

Biosurfactanten zijn oppervlakteactieve verbindingen die in staat zijn om de oppervlaktespanning tussen twee fasen van verschillende polariteiten te verminderen. Biosurfactanten zijn in opkomst als veelbelovende alternatieven voor chemische oppervlakteactieve stoffen vanwege minder toxiciteit, hoge biologische afbreekbaarheid, milieucompatibiliteit en tolerantie voor extreme omgevingsomstandigheden. Hier illustreren we de methoden die worden gebruikt voor het screenen van microben die biosurfactanten kunnen produceren. De biosurfactant producerende microben werden geïdentificeerd met behulp van drop collapse, olie verspreiden en emulsie index assays. De productie van biosurfactanten werd gevalideerd door de vermindering van de oppervlaktespanning van de media als gevolg van de groei van de microbiële elementen te bepalen. We beschrijven ook de methoden die betrokken zijn bij de karakterisering en identificatie van biosurfactanten. Dunnelaagchromatografie van de geëxtraheerde biosurfactant gevolgd door differentiële kleuring van de platen werd uitgevoerd om de aard van de biosurfactant te bepalen. LCMS, 1H NMR en FT-IR werden gebruikt om de biosurfactant chemisch te identificeren. We illustreren verder de methoden om de toepassing van de combinatie van geproduceerde biosurfactanten te evalueren voor het verbeteren van de restolieterugwinning in een gesimuleerde zandpakketkolom.

Introduction

Biosurfactanten zijn de amfipathische oppervlakte-actieve moleculen geproduceerd door micro-organismen die het vermogen hebben om het oppervlak en de interfaciale spanning tussen twee fasen1 te verminderen. Een typische biosurfactant bevat een hydrofiel deel dat meestal bestaat uit een suikergroep of een peptideketen of hydrofiel aminozuur en een hydrofoob deel dat bestaat uit een verzadigde of onverzadigde vetzuurketen2. Vanwege hun amfipathische aard assembleren biosurfactanten zich op het grensvlak tussen de twee fasen en verminderen ze de interfaciale spanning aan de grens, wat de verspreiding van de ene fase in de anderevergemakkelijkt 1,3. Verschillende soorten biosurfactanten die tot nu toe zijn gemeld, zijn glycolipiden waarin koolhydraten zijn gekoppeld aan alifatische of hydroxy-alifatische zuren met een lange keten via esterbindingen (bijv. rhamnolipiden, trehalolipiden en sophorolipiden), lipopeptiden waarin lipiden zijn bevestigd aan polypeptideketens (bijv. Oppervlakteactine en lichenysine) en polymere biosurfactanten die meestal zijn samengesteld uit polysaccharide-eiwitcomplexen (bijv. emulsan, liposan, alasan en lipomannan)4. Andere soorten biosurfactanten die door de micro-organismen worden geproduceerd, zijn vetzuren, fosfolipiden, neutrale lipiden en deeltjesbiosurfactanten5. De meest bestudeerde klasse van biosurfactanten is glycolipiden en onder hen zijn de meeste studies gerapporteerd over rhamnolipiden6. Rhamnolipiden bevatten een of twee moleculen rhamnose (die het hydrofiele deel vormen) gekoppeld aan een of twee moleculen lange keten vetzuren (meestal hydroxy-decaanzuur). Rhamnolipiden zijn primaire glycolipiden die als eerste zijn gemeld uit Pseudomonas aeruginosa7.

Biosurfactants krijgen steeds meer aandacht in vergelijking met hun chemische tegenhangers vanwege verschillende unieke en onderscheidende eigenschappen die ze bieden8. Deze omvatten een hogere specificiteit, lagere toxiciteit, grotere diversiteit, bereidingsgemak, hogere biologische afbreekbaarheid, beter schuimen, milieuvriendelijkheid en activiteit onder extreme omstandigheden9. Structurele diversiteit van de biosurfactanten (figuur S1) is een ander voordeel dat hen een voorsprong geeft op de chemische tegenhangers10. Ze zijn over het algemeen effectiever en efficiënter bij lagere concentraties omdat hun kritische micelconcentratie (CMC) meestal meerdere malen lager is dan chemische oppervlakteactieve stoffen11. Er is gemeld dat ze zeer thermostabiel zijn (tot 100 °C) en hogere pH (tot 9) en hoge zoutconcentraties (tot 50 g/L)12 kunnen verdragen, waardoor verschillende voordelen worden geboden in industriële processen, die blootstelling aan extreme omstandigheden vereisen13. Biologische afbreekbaarheid en lagere toxiciteit maken ze geschikt voor milieutoepassingen zoals bioremediatie. Vanwege de voordelen die ze bieden, hebben ze meer aandacht gekregen in verschillende industrieën zoals de voedings-, landbouw-, wasmiddel-, cosmetische en aardolie-industrie11. Biosurfactanten hebben ook veel aandacht gekregen bij oliesanering voor het verwijderen van aardolieverontreinigingen en giftige verontreinigende stoffen14.

Hier rapporteren we de productie, karakterisering en toepassing van biosurfactanten geproduceerd door Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 en Paenibacillus sp. IITD108. De stappen die betrokken zijn bij screening, karakterisering en toepassing van een combinatie van biosurfactanten voor verbeterde olieterugwinning worden beschreven in figuur 1.

Figure 1
Figuur 1: Een methode voor verbeterde olieterugwinning met behulp van een combinatie van biosurfactanten. De stapsgewijze werkstroom wordt weergegeven. De werkzaamheden zijn in vier stappen uitgevoerd. Eerst werden de microbiële stammen gekweekt en gescreend op de productie van biosurfactant door verschillende assays, waaronder drop collapse assay, oil spreading assay, emulsion index assay en surface tension measurement. Vervolgens werden de biosurfactanten geëxtraheerd uit de celvrije bouillon en hun aard werd geïdentificeerd met behulp van dunne laagchromatografie en ze werden verder geïdentificeerd met behulp van LCMS, NMR en FT-IR. In de volgende stap werden de geëxtraheerde biosurfactanten gemengd en werd het potentieel van het resulterende mengsel voor verbeterde olieterugwinning bepaald met behulp van de zandpakketkolomtechniek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Screening van deze microbiële stammen om biosurfactanten te produceren werd gedaan door druppelinstorting, oliespreiding, emulsie-indextest en bepaling van vermindering van de oppervlaktespanning van het celvrije medium als gevolg van de groei van de microben. De biosurfactanten werden geëxtraheerd, gekarakteriseerd en chemisch geïdentificeerd door LCMS, 1H NMR en FT-IR. Ten slotte werd een mengsel van biosurfactanten geproduceerd door deze microben bereid en werd gebruikt om de resterende olie terug te winnen in een gesimuleerde zandpakketkolom.

De huidige studie illustreert alleen de methoden die betrokken zijn bij screening, identificatie, structurele karakterisering en toepassing van de biosurfactantcombinatie op het verbeteren van restolieterugwinning. Het biedt geen gedetailleerde functionele karakterisering van de biosurfactanten geproduceerd door de microbiële stammen15,16. Verschillende experimenten zoals kritische micelbepaling, thermogravimetrische analyse, bevochtigbaarheid van het oppervlak en biologische afbreekbaarheid worden uitgevoerd voor gedetailleerde functionele karakterisering van elke biosurfactant. Maar aangezien dit artikel een methodepaper is, ligt de focus op screening, identificatie, structurele karakterisering en toepassing van de biosurfactantencombinatie op het verbeteren van restolieterugwinning; deze experimenten zijn niet meegenomen in deze studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Groei van microbiële stammen

  1. Weeg 2 g Luria Bouillonpoeder af en voeg toe aan 50 ml gedestilleerd water in een erlenmeyer van 250 ml. Meng de inhoud totdat het poeder volledig is opgelost en vul het volume aan tot 100 ml met gedestilleerd water.
  2. Bereid op dezelfde manier nog twee kolven van 100 ml Luria Bouillon en plaats wattenstaafjes op de hals van de kolven.
  3. Bedek de katoenen pluggen met aluminiumfolie en autoclaaf de kolven gedurende 15 minuten bij 121 °C en 15 psi om de media te steriliseren.
  4. Laat na het autoclaveren de media afkoelen tot kamertemperatuur.
  5. Kies voor de bereiding van de primaire kweek van een stam een enkele kolonie uit een LA-plaat met behulp van een inentingslus en ent in een reageerbuis met 5 ml steriele Luria-bouillon.
  6. Incubeer de reageerbuis 's nachts bij 30 °C bij 180 tpm.
  7. Ent de kolven met 100 ml geautoclaveerde Luria-bouillon door 1 ml 's nachts gekweekte zaadculturen toe te voegen aan de kolven in de laminaire luchtstroomkast.
  8. Incubeer de kolven in een roterende incubator bij 30 °C en 180 rpm gedurende 7 dagen.
  9. Oogst na het voltooien van de incubatietijd de kolven en breng de kweekbouillon over naar de centrifugebuizen. Centrifugeer de cultuur bij 4.500 x g gedurende 20 minuten in een koelcentrifuge bij 4 °C.
  10. Giet voorzichtig het celvrije supernatant in een vers bekerglas en gebruik het bij screeningstests voor de productie van biosurfactanten.

2. Screeningstests voor de productie van biosurfactanten

OPMERKING: In de volgende secties werd commerciële oppervlakteactieve stof (Saponine) gebruikt als een positieve controle, terwijl water en niet-geïinoculeerde media werden gebruikt als een negatieve controle.

  1. Samenvouwtest voor druppels
    1. Neem een schone glasplaat en bedek het oppervlak van de dia met 200 μL olie.
    2. Voeg 20 μL van het celvrije supernatant toe aan het midden van de olie en laat het 2-3 min ongestoord.
      OPMERKING: Als de druppel instort, scoor dan het bovennatuurlijke positief voor de aanwezigheid van biosurfactant.
  2. Olieverspreidingstest
    1. Neem 20 ml dubbel gedestilleerd water in een petriplaat (diameter 75 mm) en voeg 200 μL ruwe olie toe aan het wateroppervlak.
    2. Voeg 20 μL celvrij supernatant toe aan het midden van de olie en laat het 1 min ongestoord.
      OPMERKING: Als een clearingzone wordt gevormd als gevolg van olieverplaatsing, scoor dan het supernatant positief voor de aanwezigheid van de biosurfactant.
  3. Emulsie-indextest (E24-assay )
    1. Voeg elk 4 ml benzine en celvrij supernatant toe aan een reageerbuis van schoon glas.
    2. Vortex het mengsel krachtig gedurende 3 minuten en laat het de volgende 24 uur ongestoord.
    3. Bepaal na 24 uur de E24-index als percentage van de hoogte van de geëmulgeerde laag (cm) ten opzichte van de hoogte van de gehele vloeistofkolom (cm).
      Equation 1
      OPMERKING: Als een emulsie (olie in water of water in olie) na 24 uur wordt waargenomen, bevat het supernatant waarschijnlijk de biosurfactant.
  4. Oppervlaktespanningsmeting
    OPMERKING: De oppervlaktespanning werd gemeten met behulp van de Du Noüy-ringmethode17. Het instrument dat in dit experiment wordt gebruikt (zie Tabel met materialen) is erg gevoelig, dus zorg voor een goede reiniging van het glazen vat en de sonde.
    1. Schakel het systeem in en dubbelklik op de bijbehorende software om het te openen.
    2. Reinig het glazen vat met de vloeistof waarvan de oppervlaktespanning moet worden bepaald.
    3. Voeg de vloeistof (40 ml) toe aan het vat en monteer het vat op de vathouder.
    4. Ontgrendel de sondehouder en monteer de sonde erop. Vergrendel nu de sondehouder door op de vergrendelknop op de handmatige controller te drukken.
    5. Stel met behulp van de handmatige controller de hoogte van het platform zo in dat de sonde ongeveer 2-3 mm van het oppervlak van de vloeistof verwijderd is.
    6. Gebruik nu de software om de oppervlaktespanning te meten. Klik op Bestand in het linkerbovenpaneel van het scherm. Klik op Werkruimte openen. Er verschijnt een pop-upvenster.
    7. Scroll naar beneden en dubbelklik op het pictogram K100: Surface and Interfacial Tension .
    8. Klik nu op het pictogram Bestand in de linkerbovenhoek van het scherm. Klik op Nieuwe database. Voer de naam in voor het opslaan van de gegevens en klik op OK.
    9. Klik nogmaals op Bestand > Nieuwe meting > SFT > Ring. Voer de naam voor de meting in. Zorg ervoor dat de configuratiesjabloon SFT-ring weergeeft.
    10. Vul de details in het venster Metingsconfiguratie in door de sonde en het vat te selecteren dat voor de meting wordt gebruikt. Vul ook de details van de vloeistof- en de gasfase in.
      OPMERKING: De vloeibare fase is water, terwijl de gasfase lucht is. De dichtheid van de vloeibare fase is de dichtheid van het celvrije supernatant. Dit kan worden bepaald door het gewicht van 50 ml van de vloeistof te nemen en de dichtheid te berekenen als Kg / m3.
    11. Klik nu op het tabblad Procedure en vul de volgende gegevens in: Detectiesnelheid: 6 mm/min, Detectiegevoeligheid: 0,005 g, Zoeksnelheid: 6 mm/min, Zoekgevoeligheid: 0,005 g, Meetsnelheid: 3 mm/min, Meetgevoeligheid: 0,001 g, Onderdompelingsdiepte: 3 mm, Retourafstand: 10%, correctie: Harkins & Jordan, max waarden: 5. Klik op OK.
    12. Selecteer in het pop-upvenster de database om gegevens op te slaan en klik op OK.
      OPMERKING: Men kan hier een nieuwe database maken of nieuwe metingen toevoegen aan de bestaande gegevens.
    13. Klik nu op de knop Afspelen in het midden bovenaan het scherm. Het systeem begint met het uitvoeren van het script. Nadat het systeem is gestabiliseerd, detecteert het het oppervlak. Dompel de sonde onder in de vloeistof, beweeg de sonde heen en weer en detecteer de spanning in de gevormde lamellen.
    14. Om de resultaten te verkrijgen, klikt u op het pictogram Meting links in het midden van het scherm. Klik op Gegevens en noteer de bepaalde oppervlaktespanning.
    15. Na voltooiing van de meting verlaagt u de hoogte van het platform en ontgrendelt en ontkoppelt u de sonde en het vat van het instrument.
      OPMERKING: Om de afname van de oppervlaktespanning als gevolg van biosurfactantproductie te bepalen, moet niet-geinoculeerde LB als controle worden gebruikt.

3. Biosurfactant extractie

  1. Stel de pH van het celvrije supernatant in op 2 met behulp van 2 N HCl. Bewaar het mengsel 's nachts bij 4 °C.
  2. Voeg een gelijk volume chloroform-methanolmengsel (2:1) toe aan het supernatant en meng krachtig gedurende 20 minuten.
  3. Laat het mengsel ongestoord totdat de fasescheiding plaatsvindt.
  4. Verwijder de bovenste fase met water en methanol en laat de onderste fase met de biosurfactant verdampen in een zuurkast.
  5. Na verdamping van de organische fase, herisosolveer de honingkleurige ruwe biosurfactant in 3 ml chloroform en gebruik dit mengsel voor verdere identificatie en karakterisering van de biosurfactant.

4. Emulsiestabiliteitsstudies

  1. Emulsiestabiliteit bij verschillende temperaturen
    1. Neem 5 ml celvrije supernatanten in verschillende reageerbuizen.
    2. Voeg 5 ml benzine toe aan elke reageerbuis en meng krachtig door gedurende 3 minuten te vortexen.
    3. Incubeer de reageerbuizen een nacht in verschillende waterbaden bij verschillende temperaturen (30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C en 70 °C).
    4. Schat na 24 uur de emulsie-indices zoals eerder vermeld.
  2. Emulsiestabiliteit bij verschillende pH-waarden
    1. Neem 5 ml van het celvrije supernatant in schone reageerbuizen.
    2. Pas de pH van celvrije supernatanten (2, 4, 6, 8 en 10) aan met 1 N HCl en 1 N NaOH.
    3. Voeg een gelijke hoeveelheid benzine toe aan de reageerbuizen en meng krachtig door gedurende 3 minuten te vortexen.
    4. Laat de reageerbuizen gedurende 24 uur ongestoord bij kamertemperatuur.
    5. Schat de emulsie-index zoals eerder vermeld.
  3. Emulsiestabiliteit bij verschillende zoutconcentraties
    1. Neem 5 ml van het celvrije supernatant in schone reageerbuizen.
    2. Voeg verschillende hoeveelheden zout (NaCl) toe aan de supernatanten (0 g/L, 5 g/L, 10 g/L, 20 g/L, 60 g/L en 80 g/L).
    3. Los de zouten in de celvrije supernatanten op door gedurende 3 minuten te vortexen.
    4. Voeg een gelijke hoeveelheid benzine toe aan de reageerbuizen en meng krachtig door gedurende 3 minuten te vortexen.
    5. Laat de reageerbuizen gedurende 24 uur ongestoord bij kamertemperatuur.
    6. Schat de emulsie-index na 24 uur.

5. Bepalen van de aard van de biosurfactant

  1. TLC van de geëxtraheerde biosurfactant
    1. Spot 20 μL van de biosurfactanten op TLC-platen. Spot 2 μL in één keer.
    2. Spot de biosurfactanten op drie verschillende TLC-platen.
    3. Bereid een mengsel van 100 ml van het eluent dat chloroform:methanol (2:1) bevat en voeg het eluent toe aan de TLC-kamer. Sluit het deksel van de kamer en laat het 20 minuten verzadigen.
    4. Plaats na het drogen van de platen de TLC-platen in de kamer die verzadigd is met een chloroform methanolmengsel en laat de TLC lopen.
    5. Nadat de eluent de bovenkant van de TLC-plaat (1 cm van de bovenkant) heeft bereikt, haalt u de platen eruit en laat u deze aan de lucht drogen.
  2. Kleuring voor lipidendetectie
    1. Neem een schone TLC-kamer en voeg wat (5-10) korrels jodium toe aan de verse kamer en verzadig de kamer gedurende 5 tot 10 minuten.
    2. Plaats de TLC-plaat in de kamer en let op de ontwikkeling van de gele vlekken. Als de vlekken verschijnen, scoor dan de biosurfactant positief voor de aanwezigheid van de lipidecomponent.
  3. Kleuring voor detectie van peptiden of aminozuren
    1. Bereid een ninhydrineoplossing door 0,4 g ninhydrine op te lossen in 20 ml butanol. Voeg 0,6 ml 100% ijsazijn toe aan het mengsel.
    2. Spuit de TLC-plaat in met ninhydrine-oplossing en laat deze 2 min aan de lucht drogen. Verwarm de plaat op 110 °C en observeer de ontwikkeling van de kleur.
      OPMERKING: Als de blauwe vlekken verschijnen, scoor dan de biosurfactant positief voor de aanwezigheid van een peptideketen of aminozuur.
  4. Kleuring voor koolhydraatdetectie
    1. Bereid een oplossing van p-anisaldehyde door 2 ml p-anisaldehyde toe te voegen aan 48 ml ijsazijn met 1 ml H2SO4. Voeg 0,6 ml azijnzuur toe aan het mengsel.
    2. Spuit het mengsel gelijkmatig op een TLC-plaat en laat het 2 min aan de lucht drogen.
    3. Incubeer de plaat bij 110 °C en monitor de ontwikkeling van vlekken.
      OPMERKING: Als de groene of bruine vlekken verschijnen, scoor dan de biosurfactant positief voor de aanwezigheid van koolhydraten.

6. Chemische identificatie van de biosurfactant

  1. LCMS van de biosurfactant
    1. Los 25 mg van de geëxtraheerde biosurfactant op in 1 ml chloroform.
    2. Voer LCMS uit (in een vergrendelingssproeiconfiguratie met een referentiescanfrequentie van 10 s) met behulp van een C18-kolom.
    3. Gebruik chloroform:methanol (1:1) als mobiele fase en injecteer 2 μL van het monster in de kolom met een stroomsnelheid van 0,1 ml/min.
    4. Stel de experimentele parameters in op: polariteit: ES-positief, capillaire spanning: 3 kV, brontemperatuur: 80 °C, desolvatietemperatuur: 300 °C, desolvatiegasdebiet: 7.000 L / h en opvanggasdebiet: 0,40 ml / min.
    5. Scan het bereik van 100 tot 1.200 Da gedurende een detectietijd van 20 minuten en onderzoek de ionen in positieve ES-modus.
    6. Analyseer de m/z-waarden met behulp van massaspectrometrie quantitively software.
    7. Log voor analyse in op de software.
    8. Klik op Batch Search en voer de lijst met verkregen massa's in. Onderzoek de resultaten in een positieve laadmodus en gebruik M + H en M + Na als de adducten. Handhaaf de nauwkeurigheid tot 10 PPM en vink Displaystructuur aan.
    9. Klik op Zoeken en selecteer in de lijst met verbindingen degene met het laagste PPM-niveau.
  2. 1 H NMR van de biosurfactant
    OPMERKING: 1H NMR van de biosurfactant werd uitgevoerd met behulp van een 400 MHz NMR-spectrometer (zie Materiaaltabel).
    1. Los 5 mg van de biosurfactant op in 1 ml gedeutereerd chloroform (CdCl3).
    2. Breng het mengsel over in een NMR-buis. Sluit de buis goed af en steek de buis in de sleutel. Pas de hoogte van de buis aan met behulp van de verstelbuis.
    3. Plaats de buis samen met de sleutel in de NMR-machine en volg de onderstaande stappen om een NMR-spectrum te krijgen.
    4. Om het type monsterbuis te selecteren: sx N, waarbij N de positie is waar de buis is geplaatst (bijvoorbeeld sx 13, als de buis op de13e positie is geplaatst) in de bijbehorende software.
    5. Typ edc en druk op Enter om een nieuwe map te maken waarin gegevens kunnen worden opgeslagen.
    6. Er verschijnt een pop-up. Selecteer het oplosmiddel door in de lijst op CdCl 3 te klikken en voer de naam van het monster in.
    7. Om het protocol te starten, typt u "getprosol"; om het oplosmiddel te vergrendelen, typt u "lock cdcl3".
    8. Typ "topshim" om het monster te shim en typ ten slotte "rga;zgefp" voor het verkrijgen van de gegevens. Hiermee wordt het protocol gestart.
    9. Nadat de spectra zijn verkregen, typt u "apk;abs n" en drukt u op enter voor fase- en basislijncorrectie.
    10. Als u primaire pieken wilt selecteren, typt u "pp" en drukt u op Enter. Als u alleen intense pieken wilt selecteren, voert u "mi" in en typt u de intensiteit waarboven de pieken moeten worden geselecteerd. De standaardwaarde is 0,2.
    11. Om de pieken te integreren, klikt u op Integreren en plaatst u de cursor aan de linkerkant van de piek die moet worden geïntegreerd en terwijl u de cursor ingedrukt houdt, klikt u en sleept u de cursor rond de piek.
    12. Sla de gegevens op door in de linkerbovenhoek op Bestand te klikken en klik vervolgens op Opslaan.
    13. Het monster kan uit de machine worden verwijderd door "sx ej" te typen.
    14. Analyseer de pieken en bepaal de omgeving van de H-atomen.
  3. FourierTransformatie Infrarood Spectroscopie van de biosurfactant
    OPMERKING: FT-IR van geëxtraheerde biosurfactant werd uitgevoerd met behulp van een in de handel verkrijgbare spectrofotometer in ATR-modus (zie Materiaaltabel).
    1. Schakel de spectrofotometer in en controleer de purge, het droogmiddel en de detector.
    2. Om een spectrum te verzamelen, verzamelt u eerst het achtergrondspectrum zonder dat er een monster op zijn plaats is.
    3. Neem de geëxtraheerde biosurfactant en droog deze volledig. Plaats de gedroogde biosurfactant direct over het diamantkristal, oefen druk uit en druk op het ATR-aanraakpunt.
    4. Selecteer in de software het aantal scans (voer 30 in) en scan het spectrum van 400 cm-1 tot 4.000 cm-1.
    5. Klik op OK om het monsterspectrum toe te voegen aan het spectrale venster.
    6. Klik op Bestanden > Opslaan > Opslaan als en voer de bestandsnaam in gevolgd door extensie .spa en klik op OK.

7. Biosurfactant toepassing (verbeterde oliewinning)

OPMERKING: In dit experiment werd dubbel gedestilleerd water gebruikt als een negatieve controle en 10% SDS, 10% Tween 80 en 10% commercieel saponine werden gebruikt als positieve controles.

  1. Neem het glas en sluit de onderste uitlaat af met glaswol en glasparels.
  2. Verpak de kolom met zandgrond op zo'n manier dat er aan de bovenkant van de grond wat vloeistof kan worden toegevoegd en de doorstroming aan de onderkant kan worden opgevangen. Monteer de kolom op de houder en voeg wat glasparels toe aan de grond.
  3. Overspoel de kolom met 50 ml pekeloplossing en verzamel de doorstroming om het porievolume te bepalen.
    porievolume = volume pekel toegevoegd aan de bovenkant - volume van de doorstroming verzameld.
  4. Verwijder de pekel uit de kolom door ruwe olie er doorheen te laten gaan nadat u deze vanaf de bovenkant van de kolom hebt toegevoegd. Verzamel het volume van de pekel en olie die uit de kolom komt om het initiële olieverzadigingsvolume te bepalen. Het volume van de pekel die uit de kolom vrijkomt, is het initiële olieverzadigingsvolume of de originele olie op zijn plaats.
  5. Laat de zuil 24 uur ongestoord.
  6. Na 24 uur overstroomt u de kolom met 10 porievolumes pekel en verzamelt u de olie die uit de kolom komt om de secundaire oliewinning te schatten. De olie die na secundaire oliewinning in de kolom achterblijft, komt overeen met de restolie.
  7. Bereid een mengsel van biosurfactanten door gelijke volumes van de geëxtraheerde biosurfactant (geëxtraheerd na stap 3.5) toe te voegen aan het glazen bekerglas. Voeg de biosurfactanten toe aan de bovenkant van de kolom en incubeer de kolom gedurende 24 uur.
  8. Meet na 24 uur de hoeveelheid olie en water om extra of verbeterde olieterugwinning te bepalen. Het volume van de olie die vrijkomt uit de kolom komt overeen met de teruggewonnen restolie.
  9. Schat verbeterde oliewinning met de volgende vergelijking:
    Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Drie bacteriestammen (Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 en Paenibacillus sp. IITD108) werden gescreend op de productie van biosurfactanten door verschillende assays, waaronder drop collapse assay, oil displacement assay, emulsion index assay en surface tension reduction. Celvrije supernatanten van alle drie de bacteriestammen en een oplossing van chemische oppervlakteactieve stof resulteerden in een druppelinstorting en werden daarom positief gescoord voor de aanwezigheid van de biosurfactanten (figuur 4a). Aan de andere kant stortte de druppel water niet in en werd daarom negatief gescoord voor de aanwezigheid van de biosurfactant. Commerciële oppervlakteactieve stof en de celvrije supernatanten van de drie bacterieculturen waren ook succesvol in het verdringen van de olielaag in de oliestrooitest en werden daarom positief gescoord voor de aanwezigheid van biosurfactant (figuur 4b). Water daarentegen kon geen olie verdringen en werd daarom negatief gescoord. In emulsie-indextests werd een stabiele emulsie waargenomen in reageerbuizen die commerciële oppervlakteactieve stoffen en de supernatanten van de drie microbiële stammen bevatten. Er werd echter geen emulsie waargenomen in de reageerbuis met niet-geïmponiseerd kweekmedium (figuur 4c). Dit suggereerde opnieuw dat Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 en Paenibacillus sp. IITD108 biosurfactanten produceren. Bevestiging van biosurfeitenproductie werd verkregen door de oppervlaktespanning van de celvrije bouillon te meten en te vergelijken met de niet-geïmpculeerde controle. De biosurfactanten van Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 en Paenibacillus sp. IITD108 bleken de oppervlaktespanning van het medium te verminderen van respectievelijk 58,89 mN/m tot 45,41 mN/m, 45,82 mN/m en 28,43 mN/m (figuur 5).

IFT-metingen werden uitgevoerd met behulp van de ringtrekmethode. De biosurfactanten van alle drie de stammen waren in staat om de interfaciale spanningen tussen verschillende waterige en organische fasen aanzienlijk te verminderen (tabel S1). De oppervlaktespanning en de interfaciale spanningsmetingen bevestigen dat alle drie de stammen biosurfactanten produceren.

Oplosmiddelextractie van biosurfactanten uit de celvrije culturen van Rhodococcus sp. IITD102, Lysinibacillus sp. IITD104 en Paenibacillus sp. IITD108 resulteerde in biosurfactante concentraties van respectievelijk 820 mg/L, 560 mg/L en 480 mg/L.

Zoals waargenomen in figuur 4C, was de emulsie gevormd door de biosurfactant water in oliemicro-emulsie. Emulsiestabiliteitstests toonden aan dat de biosurfactanten een goede stabiliteit vertoonden onder diverse omgevingsomstandigheden (figuur 6). De geproduceerde emulsies waren zeer stabiel bij verschillende temperaturen (figuur 6a), pH-waarden (figuur 6b) en zoutconcentraties (figuur 6c) getest.

Thin Layer Chromatography werd uitgevoerd om de aard van de biosurfactanten te bepalen. Het beitsen van de platen met jodiumdamp resulteerde in de ontwikkeling van gele vlekken in alle biosurfactanten en de controle (Biosurfactant van Bacillus sp. IITD 106 (Figuur 7a). Dit gaf aan dat de biosurfactanten een lipidengroep bevatten. Er werden geen blauw gekleurde vlekken verkregen in een van de TLC-platen bij het kleuren met ninhydrine (figuur 7b). Hieruit bleek dat de biosurfactanten geen peptidegroep bevatten. Blauwe en groene vlekken werden waargenomen in alle TLC-platen, wanneer gekleurd met anisaldehydevlek (figuur 7c). Hieruit bleek dat de biosurfactanten een koolhydraatgroep bevatten. Uit de resultaten van TLC werd geconcludeerd dat alle biosurfactanten glycolipiden waren.

Chemische identificatie van de biosurfactanten met behulp van LCMS onthulde dat de Rhodococcus sp. IITD102 en Lysinibacillus sp. IITD104 hetzelfde type biosurfactant produceren, dat werd geïdentificeerd als Di-rhamnopyranosic hydroxydecanoic acid met een massa van 480,25 Da. De structuur van biosurfactant werd ondersteund door 1H NMR- en FT-IR-gegevens (figuur 8).

In het 1H NMR-spectrum vertegenwoordigden de chemische verschuivingen verkregen bij 7,2 de protonen van carbongroepen. Chemische verschuivingen die overeenkomen met protonen van methylgroep werden verkregen in het bereik van 1-2 ppm. Verschuivingen die overeenkomen met protonen die aan alkylgroepen zijn bevestigd, werden verkregen bij 2,3 ppm. FT-IR spectra van de biosurfactanten geëxtraheerd uit Rhodococcus sp. IITD102 en Lysinibacillus sp. IITD104 toonden de aanwezigheid van sterke pieken bij golf nummer 3.290 cm-1, wat de aanwezigheid van de OH functionele groep bevestigt. Een kleine piek bij golfgetal 2.951 cm-1 komt overeen met CH-stretching. Een sterke piek op 1.620 cm-1 vertegenwoordigde de aanwezigheid van carbongroep in de biosurfactanten. Andere pieken die werden verkregen bij respectievelijk 1.530, 1.410, 1.200 en 1.060 bevestigden de aanwezigheid van respectievelijk alkyl-, CH3-, C-O-C- en C-CH3-functionele groepen. Zowel NMR- als FT-IR-gegevens ondersteunden de structuur van de biosurfactant bepaald uit LCMS-studies. LCMS van ruwe biosurfactant van Paenibacillus sp. IITD108 (figuur 9) toonde aan dat het een rhamnolipide produceert met drie lipideketens die de bulk hydrofobe kern van de biosurfactant vormen. De biosurfactant werd geïdentificeerd als 2decanoyl)-αL rhamnopyranosyl-3-hydroxydecanoic acid met een massa van 802 Da. De resultaten van LCMS werden ondersteund door 1H NMR en FT-IR data.

De opzet voor verbeterde oliewinning is weergegeven in figuur 2.

Figure 2
Figuur 2: Experimentele opzet voor verbeterde oliewinning met behulp van de zandpakkolomtechniek. De met aarde volgepropte kolom was op de houder gemonteerd. De onderste uitlaat was afgesloten met glaswol en glasparels. Na secundaire terugwinning werd de resterende olie in de kolom onderworpen aan verbeterde olieterugwinning door toevoeging van het biosurfactantmengsel eraan. De buis die aan de onderkant van de kolom werd geplaatst, werd gebruikt om de geëlueerde fractie te verzamelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In het gesimuleerde verbeterde olieterugwinningsexperiment werd van de 50 ml pekel die aan de bovenkant van de kolom werd toegevoegd, 12 ml verzameld in de doorstroming en daarom werd het porievolume geschat op 38 ml. Toen olie door de kolom werd geperst, kwam er 33 ml pekel uit de kolom vrij. Dit vertegenwoordigde het initiële olieverzadigingsvolume. Secundaire terugwinning met behulp van 10 porievolumes pekel resulteerde in de elutie van 10 ml olie. De resterende olie in de kolom was 23 ml. Water dat het mengsel van biosurfactanten bevatte, kon 13 ml olie uit de kolom terugwinnen (figuur 3).

Figure 3
Figuur 3: Gesimuleerde verbeterde olieterugwinning met behulp van een zandpakkolom. Het initiële olieverzadigingsvolume van zowel de controle- als de testkolom was ongeveer 33 ml. Tijdens secundaire olieterugwinning werd ongeveer 10 ml van de olie teruggewonnen uit zowel de controle- als de testkolommen. De verschillen in de herstelprofielen van de test en de controlekolommen werden alleen waargenomen tijdens de terugwinning van de resterende olie in de kolom. Het biosurfactieve mengsel resulteerde in verdere terugwinning van 13 ml van de resterende olie die overbleef uit de testkolom, terwijl in de controlekolom slechts 1,03 ml olie werd teruggewonnen in deze stap. Dit toont aan dat het biosurfactantmengsel een groot potentieel heeft om de terugwinning van restolie uit de reservoirs te verbeteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Dit betekende een verbeterde oliewinning. Daarom was water dat het mengsel van biosurfactanten bevatte in staat om 56,52% van de resterende olie uit de kolom terug te winnen (tabel 1). Aan de andere kant waren oplossingen van 10% SDS, 10% Tween 80 en 10% saponine in staat om 85%, 68% en 73% restolie uit de kolom te herstellen.

Parameters Overstromingen beheersen Gecombineerde biosurfactante overstromingen 10 % VIB 10 % Tween 10 % saponine
PV (ml) 37 38 38 35 37
OOIP / IOSV (ml) 33 33 33 29 33
POS (%) 89.91 86.84 86.84 82.85 89.18
SV (ml) 330 330 330 330 330
SOR (ml) 9.77 10 11.5 9.2 10
ROC (ml) 23.23 23 21.5 18.8 23
ROS (%) 70.39 69.69 65.15 64.82 69.69
Rv (ml) 60 60 60 60 60
ROR (ml) 1.03 13 18.5 12.8 16.8
AOR (%) 4.43 56.5 85 68.08 73.04

waarbij PV = porievolume bepaald na initiële kolomverzadiging met pekel, OOIP = oorspronkelijke olie op zijn plaats, IOSV = initieel olieverzadigingsvolume, POS = Percentage olieverzadiging, Sv = volume pekel toegevoegd voor secundaire terugwinning, SOR = secundaire olie teruggewonnen na pekeloverstroming, ROC = resterende olie in kolom na secundaire terugwinning, ROS = resterende olieverzadiging, ROR = Restolie teruggewonnen na biosurfactante overstromingen; AOR = extra teruggewonnen olie

Tabel 1: Gesimuleerde verbeterde olieterugwinning in een zandpakkolom.

Figure 4
Figuur 4: Screeningstests voor biosurfactantproductie (a) Drop collapse assay: De druppel water stortte niet in nadat het aan het met olie bedekte oppervlak was toegevoegd, terwijl de chemische oppervlakteactieve stof en celvrije supernatanten van de drie bacteriestammen resulteerden in de druppelinstorting. b) Olieverplaatsingstest: De waterdruppel resulteerde niet in verplaatsing van de olie, terwijl de chemische oppervlakteactieve stof en celvrije supernatanten van de drie bacteriestammen de olielagen verdrongen (c) Emulsie-indextest: De celvrije supernatanten en de commerciële oppervlakteactieve stofoplossing resulteerden allemaal in de vorming van een stabiele emulsie-index. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Oppervlaktespanningsreductie door biosurfactantproductie. Bepaling van vermindering van de oppervlaktespanning van het medium als gevolg van microbiële groei bevestigde de biosurfactante productie door de microbiële leden. Door de groei van Rhodococcus sp. IITD 102 en Lysinibacillus sp. IITD 104 daalde de oppervlaktespanning van het medium van 59 mN/m naar 45 mN/m. Door de groei van Paenibacillus sp. IITD 108 is de oppervlaktespanning van het medium verlaagd van 59 mN/m naar 28 mN/m. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Emulsiestabiliteit bij verschillende (a) temperaturen, (b) pH-waarden en (c) zoutconcentraties. Alle emulsies die worden gegenereerd met behulp van de supernatanten van de drie microbiële stammen en het mengsel van commerciële oppervlakteactieve stoffen vertonen een grote stabiliteit onder verschillende omgevingsomstandigheden. Binnen de geteste temperatuur-, pH- en zoutconcentraties waren de vastgestelde emulsie-indices vergelijkbaar en werd er geen grote vermindering van EI waargenomen bij hogere waarden van de verschillende factoren die impliceren dat biosurfactant onder extreme omgevingsomstandigheden kan worden gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: TLC-karakterisering van biosurfactanten (a) Platen gekleurd met jodiumdamp: Verschillende vlekken ontwikkeld op de TLC-plaat laten zien dat de geëxtraheerde biosurfactanten een mengsel zijn van verschillende verbindingen die een lipidengroep bevatten. De vlekken gemarkeerd met blauwe pijl vertegenwoordigen de biosurfactanten, die positief zijn gekleurd voor de aanwezigheid van lipidegroep. De andere vlekken vertegenwoordigen de rest van de verbindingen die aanwezig zijn in het mengsel van de ruwe biosurfactant. b) Met ninhydrine bevlekte platen: er verschenen geen paarse vlekken wanneer de platen met ninhydrine werden gekleurd. Dit vertegenwoordigde de afwezigheid van aminozuren in het biosurfactantmengsel en (c) Platen gekleurd met anisaldehyde: Lichtgroene en gele vlekken verschenen op de TLC-plaat en deze vertegenwoordigen de verbindingen die suikers bevatten. De vlekken gemarkeerd met zwarte pijlen vertegenwoordigen de biosurfactanten die positief zijn gekleurd voor de aanwezigheid van het koolhydraatgedeelte. De vlekken die zowel met jodium als met anisaldehyde zijn gekleurd, vertegenwoordigen verbindingen die zowel lipide- als koolhydraatmoieties bevatten en mogelijk een glycolipide biosurfactant kunnen zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Chemische karakterisering van de biosurfactant geëxtraheerd uit Rhodococcus sp. IITD 102 en Lysinibacillus sp. IITD 104. a) de FT-IR-spectra vertegenwoordigt van de biosurfactanten geëxtraheerd uit Rhodococcus sp. IITD 102 en Lysinibacillus sp. IITD 104, (b) de H1 NMR-spectra van de biosurfactanten geëxtraheerd uit Rhodococcus sp. IITD 102 en Lysinibacillus sp. IITD 104, en (c) toont de structuur van de ruwe biosurfactanten geëxtraheerd uit Rhodococcus sp. IITD 102 en Lysinibacillus sp. IITD 104. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: Chemische karakterisering van de biosurfactant geëxtraheerd uit Paenibacillus sp. IITD 108. (a) vertegenwoordigt de FT-IR spectra van de biosurfactanten geëxtraheerd uit Paenibacillus sp. IITD 108, (b) vertegenwoordigt de 1H NMR spectra van de biosurfactanten geëxtraheerd uit Paenibacillus sp. IITD 108, en (c) toont de structuur van de ruwe biosurfactanten geëxtraheerd uit Paenibacillus sp. IITD 108. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur S1: Structuur van verschillende soorten biosurfactanten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Tabel S1: Effect van biosurfactanten op de interfaciale spanning (IFT) tussen water en koolwaterstoffen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biosurfactanten zijn een van de meest veelzijdige groep biologisch actieve componenten die aantrekkelijke alternatieven worden voor chemische oppervlakteactieve stoffen. Ze hebben een breed scala aan toepassingen in tal van industrieën, zoals wasmiddelen, verven, cosmetica, voedsel, farmaceutica, landbouw, aardolie en waterbehandeling vanwege hun betere bevochtigbaarheid, lagere CMC, gediversifieerde structuur en milieuvriendelijkheid18. Dit heeft geleid tot een toegenomen interesse in het ontdekken van meer microbiële stammen die in staat zijn tot biosurfactant productie. Hier illustreren we de methoden voor screening, identificatie en toepassing van een mengsel van biosurfactanten geproduceerd door Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 en Paenibacillus sp. IITD 108, voor verbeterde olieterugwinning. De productie van biosurfactanten werd gescreend door drop collapse, oliespreiding, emulsie-indextest en bevestigd door de vermindering van de oppervlaktespanning van het medium als gevolg van microbiële groei te meten. Verschillende rapporten over de productie van glycolipide biosurfactanten (rhamnolipiden en trehalolipiden) van Rhodococcus zijn beschikbaar in literatuur 19,20,21,22,23,24. Najafi et al. hebben de productie en optimalisatie van een lipopeptide biosurfactant van Paenibacillus sp. alvei ARN6325 gerapporteerd. Bezza et al. hebben melding gemaakt van biologische afbraak van pyreen door een lipopeptide biosurfactant geproduceerd door Paenibacillus dendritiformis CN526. Biosurfactant productie (Lipopeptiden en glycolipiden) is ook gemeld door andere stammen van Paenibacillus 27,28,29,30,31. Van verschillende soorten Lysinibacillus is gemeld dat ze biosurfactantenproduceren 32,33,34. Van Lysinibacillus sphaericus is gemeld dat het rhamnolipid produceert dat in staat is tot oplosbaarheid van hydrofobe pesticiden35.

Een van de voordelen die biosurfactanten bieden ten opzichte van hun chemische tegenhangers is hun stabiliteit onder extreme omgevingsomstandigheden. De biosurfactanten geproduceerd door Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 en Paenibacillus sp. IITD 108 werden getest op hun stabiliteit onder verschillende temperatuur-, pH- en zoutconcentraties en bleken stabiel te zijn onder extreme waarden van deze parameters. Eerder rapporteerden Habib et al. een lipopeptide geproduceerd door koolwaterstofafbrekende Rhodococcus sp. dat stabiliteit vertoonde over verschillende temperatuurbereiken, pH-waarden en zoutconcentraties36. Van een toename van de concentratie van anorganische zouten is gemeld dat het de stabiliteit van de emulsieverhoogt 37. De neiging van de colloïden om te agglomereren of te scheiden is een functie van de aantrekkelijke (Van der Walls krachten) en afstotende krachten (elektrostatische krachten) die betrokken zijn bij deeltjesinteractie38. De zoutkristallen bij het oplossen in water vestigen hun eigen elektrische ladingen en de vrijgekomen ionen adsorberen aan de emulsiedruppels. Bij het verhogen van de zoutconcentratie neemt de uitzetting en afstoting van de tweede laag af. Ook, hoe hoger de ladingsdichtheid van een ion, hoe lager de lengte van de elektrische laag. Divalente kationen zoals Na2+ resulteren dus in de vorming van stabielere emulsies in vergelijking met monovalente kationen39.

Een ander voordeel dat biosurfactanten hebben ten opzichte van chemische oppervlakteactieve stoffen is dat ze biologisch afbreekbaar zijn40. Zeng et al. hebben de afbraakcapaciteiten van synthetische oppervlakteactieve stof Triton X 100, lineaire alkylbenzeensulfonaten (LAS) en rhamnolipide vergeleken en vastgesteld dat de rhamnolipide biosurfactant volledig was afgebroken, terwijl LAS en Triton X 100 slechts gedeeltelijk werden afgebroken41. Liu et al. melden ook dat in tegenstelling tot synthetische oppervlakteactieve stoffen CTAB, Triton X 100 en SDS, rhamnolipid geen toxiciteit vertoont en gemakkelijk kan worden afgebroken door B. subtilis en andere compostmicro-organismen42.

De biosurfactanten geproduceerd door alle drie microbiële stammen bleken glycolipiden te zijn. Rhodococcus is eerder gemeld glycolipide te produceren door verschillende onderzoeksgroepen 20,21,23. Soortgelijke rapporten over glycolipide biosurfactant productie door Lysinibacillus en Paenibacillus zijn ook beschikbaar in de literatuur 31,32,35,43,44. Chemische identificatie van de biosurfactanten onthulde dat ze rhamnolipiden waren. Rhamnolipiden zijn de klasse van glycolipide biosurfactanten die een of twee rhamnose-eenheden bevatten die verbonden zijn met een lipidenketen45. Ze zijn het meest bestudeerde type biosurfactanten. Van verschillende microbiële stammen is gemeld dat ze rhamnolipidenproduceren 7,46,47,48,49. Van Rhamnolipiden is gemeld dat ze een hoog potentieel vertonen voor het verbeteren van de terugwinning van resterende olie 50,51,52,53. In onze studie ontdekten we dat het mengsel van biosurfactanten geproduceerd door Rhodococcus sp. IITD 102, Lysinibacillus sp. IITD 104 en Paenibacillus sp. IITD 108 met succes ongeveer 56,52% van de resterende olie terugwon in een gesimuleerde zandpakkolomtest. Hieruit bleek dat het mengsel van biosurfactanten kan worden gebruikt voor de terugwinning van restolie uit de grondreservoirs. In een vergelijkbare zandpakkettest hebben Sun et al. gemeld dat biosurfactant succesvol was in het terugwinnen van 50% van de resterende olie54. Van biosurfactanten die celvrije bouillon van Bacillus subtilis bevatten, is ook gemeld dat ze effectief zijn bij het terugwinnen van 33% van de resterende olie55. Restolieterugwinning van 27% en 26%-36% is ook gemeld door Darvishi et al. en Wahabi et al.56,57.

Economische evaluatie van biosurfactanten voor de terugwinning van restolie uit reservoirs toont aan dat het gebruik van biosurfactanten in EOR economisch gezien een haalbare optie is. Moutinho et al. meldden dat de typische kosten van een commerciële biosurfactant (rhamnolipiden) ongeveer 59,6 USD per kg58 bedragen. In een andere studie is ook gemeld dat de biosurfactantconcentratie van 28 mg / L biosurfactant de resterende olieterugwinning verbeterde en leidde tot de productie van 52,5 m3 extra olie59. De studies toonden aan dat een biosurfeitenconcentratie van 10 mg / L voldoende was om de olieterugwinning te mobiliseren. Volgens de gerapporteerde gegevens is de hoeveelheid biosurfactant die nodig is om 52,5 m3 extra olie te produceren ongeveer 0,525 kg. De totale productiekosten van 52,5 m3 olie bedragen ongeveer US$ 21463 waarvan slechts US$ 30 de productiekosten van de biosurfactant zijn. Uit de gegevens blijkt dat de procentuele kosten van de biosurfactant in de olieproductie per vat slechts 0,0000139% bedragen.

Onze resultaten suggereren dat de combinatie van de biosurfactanten efficiënt kan worden gebruikt om restolie uit de reservoirs terug te winnen. Voor zover wij weten, is dit het eerste rapport over het verbeteren van de terugwinning van de resterende olie uit het reservoir met behulp van een mengsel van biosurfactanten geproduceerd door verschillende microbiële stammen. Hoewel onze studie duidelijk de methoden beschrijft die betrokken zijn bij screening, structurele karakterisering en toepassing van biosurfactanten in verbeterde oliewinning, biedt de studie geen gedetailleerde functionele karakterisering van de biosurfactanten, die hun efficiëntie in verschillende toepassingen beïnvloeden. De kritische micelconcentratie, die de maat is voor de efficiëntie van een oppervlakteactieve stof bij het vormen van de micellen en de beperkende concentratie van de oppervlakteactieve stof specificeert voor het zinvolle gebruik ervan, is in dit onderzoek niet bepaald60. Evenzo is de thermische stabiliteit van de biosurfactant, die de toepasbaarheid ervan onder reservoiromstandigheden voor EOR bepaalt, ook niet beschreven61. Biosurfactanten in sommige toepassingen worden ook gebruikt als antibiofilmmiddelen. Hun oppervlaktebevochtigbaarheid speelt een belangrijke rol bij het bepalen van hun antibiofilmkarakter. Bij de huidige werkzaamheden zijn ook geen onderzoek naar de bevochtigbaarheid van het oppervlak uitgevoerd62. Andere functionele kenmerken die belangrijk zijn bij verschillende toepassingen van biosurfactanten, waaronder hun biologische afbreekbaarheid en de antimicrobiële aard, zijn ook niet bepaald in deze studie63,64. Daarom hebben we ons gericht op de structurele karakterisering van biosurfactanten. Afhankelijk van de doeltoepassing kan functionele karakterisering zoals stabiliteit, biologische afbreekbaarheid en antimicrobiële activiteit worden uitgevoerd.

In de drop collapse assay en oil spreading assay, om de zichtbaarheid te vergroten, is het beter om een olie te gebruiken die enige kleur heeft. In de olieverspreidingstest moet de emulsie na 24 uur worden waargenomen. Lichte schuimen, indien gevormd, desintegreren in 24 uur. Tensiometers zijn zeer gevoelige instrumenten, daarom moeten tijdens oppervlaktespanningsmetingen het vat en de sonde vóór elke meting goed worden gereinigd om fouten als gevolg van overdrachten van laatste metingen te voorkomen. Extractie van biosurfactant omvat de toevoeging van chloroform methanolmengsel aan het celvrije supernatant. De stap moet worden uitgevoerd in een zuurkast of de kolf moet onmiddellijk na overdracht van het extractiemengsel worden bedekt met aluminiumfolie. Tijdens secundair herstel in een EOR-experiment moet pekeloplossing in overmaat worden toegevoegd totdat er geen olie meer uit de kolom komt.

De methode bespreekt de reikwijdte van het mengsel van biosurfactanten bij de terugwinning van restolie uit de kolommen. Het proces is afhankelijk van vele factoren. Het groeistadium van de microben waarin de eerste culturen worden geoogst. Van sommige biosurfactanten is gemeld dat ze in de logfase worden geproduceerd, terwijl van andere is gemeld dat ze in de stationaire fase worden geproduceerd. De culturen moeten dienovereenkomstig worden geoogst in het specifieke stadium waarin de productie van biosuractieve stoffen zijn maximum heeft bereikt. Biosurfactant screening assays zijn minder gevoelig, daarom moeten alle assays worden uitgevoerd voordat een conclusie wordt getrokken over het biosurfactant producerende vermogen van een bepaalde stam. Zuivering van de biosurfactant moet worden uitgevoerd vóór chemische karakterisering van de biosurfactant als de concentratie van biosurfactant laag is in de ruwe biosurfactant. Verbeterde oliewinningsexperimenten zijn sterk afhankelijk van het type grond dat wordt gebruikt voor het verpakken van de kolom. De grond moet volledig droog zijn en moet worden gezeefd om grotere korrels en andere vaste verontreinigingen te verwijderen. Een mengsel van zandgrond en droge tuingrond (in gelijke verhouding) verdient de voorkeur voor het verpakken van de kolom. De kolomuitlaat moet goed worden afgedicht met glaswol en glasparels om lekkage van grond uit de kolom in de loop van het experiment te voorkomen.

De beschreven methode is nuttig voor het bepalen van de betekenis van de geproduceerde biosurfactanten en hun mengsels voor de terugwinning van extra olie in een gesimuleerd zandpakketkolomexperiment. Verschillende biosurfactanten hebben verschillende specifieke kenmerken omdat ze verschillende functionele groepenbevatten 65. Een combinatie van biosurfactanten zal oplosbaarheid van diverse koolwaterstoffen mogelijk maken en zal daardoor de resterende oliewinning uit de reservoirs verhogen. De beschreven methode zal helpen bij het bepalen van het potentieel van biosurfactantmengsels in veldtoepassingen zoals verbeterde oliewinning uit oliebronnen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Acknowledgments

De auteurs willen het Department of Biotechnology, Government of India, bedanken voor de financiële steun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml pipette Eppendorf, Germany G54412G
1H NMR Bruker Avance AV-III type spectrometer,USA
20 ul pipette Thermo scientific, USA H69820
Autoclave JAISBO, India Ser no 5923 Jain Scientific
Blue flame burner Rocker scientific, Taiwan dragon 200
Butanol GLR inovations, India GLR09.022930
C18 column Agilent Technologies, USA 770995-902
Centrifuge Eppendorf, Germany 5810R
Chloroform Merck, India 1.94506.2521
Chloroform-d SRL, India 57034
Falcon tubes Tarsons, India 546041 Radiation sterilized polypropylene
FT-IR Thermo Fisher Scientific, USA  Nicolet iS50
Fume hood Khera, India 47408 Customied
glacial acetic acid Merck, India 1.93002
Glass beads Merck, India 104014
Glass slides Polar industrial Corporation, USA Blue Star 75 mm * 25 mm
Glass wool Merk, India 104086
Hydrochloric acid Merck, India 1003170510
Incubator Thermo Scientific, USA MaxQ600 Shaking incubator
Incubator Khera, India Sunbim
Iodine resublimed Merck, India 231-442-4  resublimed Granules
K12 –Kruss tensiometer Kruss Scientific, Germany K100
Laminar air flow cabnet Thermo Scientific, China 1300 Series A2
LCMS Agilent Technologies, USA 1260 Infinity II
Luria Broth HIMEDIA, India M575-500G Powder
Methanol Merck, India 107018
Ninhydrin Titan Biotech Limited, India 1608
p- anisaldehyde Sigma, USA 204-602-6
Petri plate Tarsons, India 460090-90 MM Radiation sterilized polypropylene
Saponin Merck, India 232-462-6
Sodium chloride Merck, India 231-598-3
Test tubes Borosil, India 9800U06 Glass tubes
TLC plates Merck, India 1055540007
Vortex GeNei, India 2006114318
Water Bath Julabo, India SW21C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Desai, J. D., Banat, I. M. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 61 (1), 47-64 (1997).
  2. Banat, I. M. Biosurfactants production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation: a review. Bioresource Technology. 51 (1), 1-12 (1995).
  3. Singh, A., Van Hamme, J. D., Ward, O. P. Surfactants in microbiology and biotechnology: Part 2. Application aspects. Biotechnology Advances. 25 (1), 99-121 (2007).
  4. Shah, N., Nikam, R., Gaikwad, S., Sapre, V., Kaur, J. Biosurfactant: types, detection methods, importance and applications. Indian Journal of Microbiology Research. 3 (1), 5-10 (2016).
  5. McClements, D. J., Gumus, C. E. Natural emulsifiers-Biosurfactants, phospholipids, biopolymers, and colloidal particles: Molecular and physicochemical basis of functional performance. Advances in Colloid and Interface Science. 234, 3-26 (2016).
  6. Nguyen, T. T., Youssef, N. H., McInerney, M. J., Sabatini, D. A. Rhamnolipid biosurfactant mixtures for environmental remediation. Water Research. 42 (6-7), 1735-1743 (2008).
  7. Maier, R. M., Soberon-Chavez, G. Pseudomonas aeruginosa rhamnolipids: biosynthesis and potential applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 54 (5), 625-633 (2000).
  8. Banat, I. M., Makkar, R. S., Cameotra, S. S. Potential commercial applications of microbial surfactants. Applied Microbiology and Biotechnology. 53 (5), 495-508 (2000).
  9. Mulugeta, K., Kamaraj, M., Tafesse, M., Aravind, J. A review on production, properties, and applications of microbial surfactants as a promising biomolecule for environmental applications. Strategies and Tools for Pollutant Mitigation: Avenues to a Cleaner Environment. , 3-28 (2021).
  10. Sharma, J., Sundar, D., Srivastava, P. Biosurfactants: Potential agents for controlling cellular communication, motility, and antagonism. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 727070 (2021).
  11. Vijayakumar, S., Saravanan, V. Biosurfactants-types, sources and applications. Research Journal of Microbiology. 10 (5), 181-192 (2015).
  12. Curiel-Maciel, N. F., et al. Characterization of enterobacter cloacae BAGM01 producing a thermostable and alkaline-tolerant rhamnolipid biosurfactant from the Gulf of Mexico. Marine Biotechnology. 23 (1), 106-126 (2021).
  13. Nikolova, C., Gutierrez, T. Biosurfactants and their applications in the oil and gas industry: current state of knowledge and future perspectives. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, (2021).
  14. Rastogi, S., Tiwari, S., Ratna, S., Kumar, R. Utilization of agro-industrial waste for biosurfactant production under submerged fermentation and its synergistic application in biosorption of Pb2. Bioresource Technology Reports. 15, 100706 (2021).
  15. Zargar, A. N., Lymperatou, A., Skiadas, I., Kumar, M., Srivastava, P. Structural and functional characterization of a novel biosurfactant from Bacillus sp. IITD106. Journal of Hazardous Materials. 423, Pt B 127201 (2022).
  16. Adnan, M., et al. Functional and structural characterization of pediococcus pentosaceus-derived biosurfactant and its biomedical potential against bacterial adhesion, quorum sensing, and biofilm formation. Antibiotics. 10 (11), 1371 (2021).
  17. Du Nouy, P. L. A new apparatus for measuring surface tension. The Journal of General Physiology. 1 (5), 521-524 (1919).
  18. Akbari, S., Abdurahman, N. H., Yunus, R. M., Fayaz, F., Alara, O. R. Biosurfactants-a new frontier for social and environmental safety: a mini review. Biotechnology Research and Innovation. 2 (1), 81-90 (2018).
  19. Bicca, F. C., Fleck, L. C., Ayub, M. A. Z. Production of biosurfactant by hydrocarbon degrading Rhodococcus ruber and Rhodococcus erythropolis. Revista de Microbiologia. 30 (3), 231-236 (1999).
  20. Kuyukina, M. S., et al. Recovery of Rhodococcus biosurfactants using methyl tertiary-butyl ether extraction. Journal of Microbiological Methods. 46 (2), 149-156 (2001).
  21. Philp, J., et al. Alkanotrophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer. Applied Microbiology and Biotechnology. 59 (2), 318-324 (2002).
  22. Mutalik, S. R., Vaidya, B. K., Joshi, R. M., Desai, K. M., Nene, S. N. Use of response surface optimization for the production of biosurfactant from Rhodococcus spp. MTCC 2574. Bioresource Technology. 99 (16), 7875-7880 (2008).
  23. Shavandi, M., Mohebali, G., Haddadi, A., Shakarami, H., Nuhi, A. Emulsification potential of a newly isolated biosurfactant-producing bacterium, Rhodococcus sp. strain TA6. Colloids and Surfaces B, Biointerfaces. 82 (2), 477-482 (2011).
  24. White, D., Hird, L., Ali, S. Production and characterization of a trehalolipid biosurfactant produced by the novel marine bacterium Rhodococcus sp., strain PML026. Journal of Applied Microbiology. 115 (3), 744-755 (2013).
  25. Najafi, A., et al. Interactive optimization of biosurfactant production by Paenibacillus alvei ARN63 isolated from an Iranian oil well. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 82 (1), 33-39 (2011).
  26. Bezza, F. A., Chirwa, E. M. N. Pyrene biodegradation enhancement potential of lipopeptide biosurfactant produced by Paenibacillus dendritiformis CN5 strain. Journal of Hazardous Materials. 321, 218-227 (2017).
  27. Jimoh, A. A., Lin, J. Biotechnological applications of Paenibacillus sp. D9 lipopeptide biosurfactant produced in low-cost substrates. Applied Biochemistry and Biotechnology. 191 (3), 921-941 (2020).
  28. Liang, T. -W., et al. Exopolysaccharides and antimicrobial biosurfactants produced by Paenibacillus macerans TKU029. Applied Biochemistry and Biotechnology. 172 (2), 933-950 (2014).
  29. Mesbaiah, F. Z., et al. Preliminary characterization of biosurfactant produced by a PAH-degrading Paenibacillus sp. under thermophilic conditions. Environmental Science and Pollution Research. 23 (14), 14221-14230 (2016).
  30. Quinn, G. A., Maloy, A. P., McClean, S., Carney, B., Slater, J. W. Lipopeptide biosurfactants from Paenibacillus polymyxa inhibit single and mixed species biofilms. Biofouling. 28 (10), 1151-1166 (2012).
  31. Gudiña, E. J., et al. Novel bioemulsifier produced by a Paenibacillus strain isolated from crude oil. Microbial Cell Factories. 14 (1), 1-11 (2015).
  32. Pradhan, A. K., Pradhan, N., Sukla, L. B., Panda, P. K., Mishra, B. K. Inhibition of pathogenic bacterial biofilm by biosurfactant produced by Lysinibacillus fusiformis S9. Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (2), 139-149 (2014).
  33. Manchola, L., Dussán, J. Lysinibacillus sphaericus and Geobacillus sp biodegradation of petroleum hydrocarbons and biosurfactant production. Remediation Journal. 25 (1), 85-100 (2014).
  34. Bhardwaj, G., Cameotra, S. S., Chopra, H. K. Biosurfactant from Lysinibacillus chungkukjangi from rice bran oil sludge and potential applications. Journal of Surfactants and Detergents. 19 (5), 957-965 (2016).
  35. Gaur, V. K., et al. Rhamnolipid from a Lysinibacillus sphaericus strain IITR51 and its potential application for dissolution of hydrophobic pesticides. Bioresource Technology. 272, 19-25 (2019).
  36. Habib, S., et al. Production of lipopeptide biosurfactant by a hydrocarbon-degrading Antarctic Rhodococcus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6138 (2020).
  37. Shao, P., Ma, H., Zhu, J., Qiu, Q. Impact of ionic strength on physicochemical stability of o/w emulsions stabilized by Ulva fasciata polysaccharide. Food Hydrocolloids. 69, 202-209 (2017).
  38. Trefalt, G., Borkovec, M. Overview of DLVO theory. , Available from: https://archive-ouverte.unige.ch/unige:148595 (2014).
  39. Kazemzadeh, Y., Ismail, I., Rezvani, H., Sharifi, M., Riazi, M. Experimental investigation of stability of water in oil emulsions at reservoir conditions: Effect of ion type, ion concentration, and system pressure. Fuel. 243, 15-27 (2019).
  40. Chong, H., Li, Q. Microbial production of rhamnolipids: opportunities, challenges and strategies. Microbial Cell Factories. 16 (1), 1-12 (2017).
  41. Zeng, G., et al. Co-degradation with glucose of four surfactants, CTAB, Triton X-100, SDS and Rhamnolipid, in liquid culture media and compost matrix. Biodegradation. 18 (3), 303-310 (2007).
  42. Liu, G., et al. Advances in applications of rhamnolipids biosurfactant in environmental remediation: a review. Biotechnology and Bioengineering. 115 (4), 796-814 (2018).
  43. John, W. C., Ogbonna, I. O., Gberikon, G. M., Iheukwumere, C. C. Evaluation of biosurfactant production potential of Lysinibacillus fusiformis MK559526 isolated from automobile-mechanic-workshop soil. Brazilian Journal of Microbiology. 52 (2), 663-674 (2021).
  44. Naing, K. W., et al. Isolation and characterization of an antimicrobial lipopeptide produced by Paenibacillus ehimensis MA2012. Journal of Basic Microbiology. 55 (7), 857-868 (2015).
  45. Wittgens, A., et al. Novel insights into biosynthesis and uptake of rhamnolipids and their precursors. Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (7), 2865-2878 (2017).
  46. Rahman, K., Rahman, T. J., McClean, S., Marchant, R., Banat, I. M. Rhamnolipid biosurfactant production by strains of Pseudomonas aeruginosa using low-cost raw materials. Biotechnology Progress. 18 (6), 1277-1281 (2002).
  47. Bahia, F. M., et al. Rhamnolipids production from sucrose by engineered Saccharomyces cerevisiae. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
  48. Kim, C. H., et al. Desorption and solubilization of anthracene by a rhamnolipid biosurfactant from Rhodococcus fascians. Water Environment Research. 91 (8), 739-747 (2019).
  49. Nalini, S., Parthasarathi, R. Optimization of rhamnolipid biosurfactant production from Serratia rubidaea SNAU02 under solid-state fermentation and its biocontrol efficacy against Fusarium wilt of eggplant. Annals of Agrarian Science. 16 (2), 108-115 (2018).
  50. Wang, Q., et al. Engineering bacteria for production of rhamnolipid as an agent for enhanced oil recovery. Biotechnology and Bioengineering. 98 (4), 842-853 (2007).
  51. Câmara, J., Sousa, M., Neto, E. B., Oliveira, M. Application of rhamnolipid biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa in microbial-enhanced oil recovery (MEOR). Journal of Petroleum Exploration and Production Technology. 9 (3), 2333-2341 (2019).
  52. Amani, H., Mehrnia, M. R., Sarrafzadeh, M. H., Haghighi, M., Soudi, M. R. Scale up and application of biosurfactant from Bacillus subtilis in enhanced oil recovery. Applied Biochemistry and Biotechnology. 162 (2), 510-523 (2010).
  53. Gudiña, E. J., et al. Bioconversion of agro-industrial by-products in rhamnolipids toward applications in enhanced oil recovery and bioremediation. Bioresource Technology. 177, 87-93 (2015).
  54. Sun, G., Hu, J., Wang, Z., Li, X., Wang, W. Dynamic investigation of microbial activity in microbial enhanced oil recovery (MEOR). Petroleum Science and Technology. 36 (16), 1265-1271 (2018).
  55. Jha, S. S., Joshi, S. J., SJ, G. Lipopeptide production by Bacillus subtilis R1 and its possible applications. Brazilian Journal of Microbiology. 47 (4), 955-964 (2016).
  56. Darvishi, P., Ayatollahi, S., Mowla, D., Niazi, A. Biosurfactant production under extreme environmental conditions by an efficient microbial consortium, ERCPPI-2. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 84 (2), 292-300 (2011).
  57. Al-Wahaibi, Y., et al. Biosurfactant production by Bacillus subtilis B30 and its application in enhancing oil recovery. Colloids and Surfaces. B, Biointerfaces. 114, 324-333 (2014).
  58. Moutinho, L. F., Moura, F. R., Silvestre, R. C., Romão-Dumaresq, A. S. Microbial biosurfactants: A broad analysis of properties, applications, biosynthesis, and techno-economical assessment of rhamnolipid production. Biotechnology Progress. 37 (2), 3093 (2021).
  59. Youssef, N., Simpson, D. R., McInerney, M. J., Duncan, K. E. In-situ lipopeptide biosurfactant production by Bacillus strains correlates with improved oil recovery in two oil wells approaching their economic limit of production. International Biodeterioration & Biodegradation. 81, 127-132 (2013).
  60. Ruckenstein, E., Nagarajan, R. Critical micelle concentration and the transition point for micellar size distribution. The Journal of Physical Chemistry. 85 (20), 3010-3014 (1981).
  61. de Araujo, L. L., et al. Microbial enhanced oil recovery using a biosurfactant produced by Bacillus safensis isolated from mangrove microbiota-Part I biosurfactant characterization and oil displacement test. Journal of Petroleum Science and Engineering. 180, 950-957 (2019).
  62. Banat, I. M., De Rienzo, M. A. D., Quinn, G. A. Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (24), 9915-9929 (2014).
  63. Klosowska-Chomiczewska, I., Medrzycka, K., Karpenko, E. Biosurfactants-biodegradability, toxicity, efficiency in comparison with synthetic surfactants. Research and Application of New Technologies in Wastewater Treatment and Municipal Solid Waste Disposal in Ukraine, Sweden, and Poland. 17, 141-149 (2013).
  64. Fernandes, P. A. V., et al. Antimicrobial activity of surfactants produced by Bacillus subtilis R14 against multidrug-resistant bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 38 (4), 704-709 (2007).
  65. Santos, D. K. F., Rufino, R. D., Luna, J. M., Santos, V. A., Sarubbo, L. A. Biosurfactants: multifunctional biomolecules of the 21st century. International Journal of Molecular Sciences. 17 (3), 401 (2016).

Tags

Milieuwetenschappen nummer 184
Verbeterde olieterugwinning met behulp van een combinatie van biosurfactanten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nissar Zargar, A., Patil, N., Kumar, … More

Nissar Zargar, A., Patil, N., Kumar, M., Srivastava, P. Enhanced Oil Recovery using a Combination of Biosurfactants. J. Vis. Exp. (184), e63207, doi:10.3791/63207 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter