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Biology

विवो निषेध, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके शुक्राणुकोशिकाओं में काइन्सिन -7 सीईएनपी-ई का कार्यात्मक मूल्यांकन

Published: December 28, 2021 doi: 10.3791/63271
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3,4, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital, Affiliated Hospital of Fujian Medical University

Summary

यह लेख पेट की सर्जरी और GSK923295 के वृषण इंजेक्शन के माध्यम से सीईएनपी-ई के इनविवो निषेध की रिपोर्ट करता है, जो पुरुष मियोटिक विभाजन के लिए एक मूल्यवान मॉडल है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस, फ्लो साइटोमेट्री और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी परख का उपयोग करते हुए, हम दिखाते हैं कि सीईएनपी-ई निषेध के परिणामस्वरूप माउस शुक्राणुकोशिकाओं में गुणसूत्र गलत संरेखण और जीनोम अस्थिरता होती है।

Abstract

यूकेरियोट्स में, यौन प्रजनन में जीनोम स्थिरता और आनुवंशिक विविधता के लिए अर्धसूत्रीविभाजन आवश्यक है। वृषण में शुक्राणुकोशिकाओं के प्रयोगात्मक विश्लेषण पुरुष मियोटिक विभाजन में स्पिंडल असेंबली और क्रोमोसोम अलगाव की जांच के लिए महत्वपूर्ण हैं। माउस शुक्राणुकोशिका अर्धसूत्रीविभाजन के यंत्रवत अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल है, हालांकि, शुक्राणुकोशिकाओं के विश्लेषण के लिए प्रभावी तरीकों की कमी है। इस लेख में, माउस शुक्राणुकोशिकाओं में काइन्सिन -7 सीईएनपी-ई के इनविवो निषेध के लिए एक व्यावहारिक और कुशल विधि बताई गई है। 3 सप्ताह के चूहों में पेट की सर्जरी के माध्यम से GSK923295 एक विशिष्ट अवरोधक के वृषण इंजेक्शन के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया प्रस्तुत की गई है। इसके अलावा, यहां वर्णित ऊतक संग्रह और निर्धारण, हेमटोक्सिलिन-ईओसिन धुंधला, इम्यूनोफ्लोरेसेंस, फ्लो साइटोमेट्री और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला है। यहां हम पेट की सर्जरी और वृषण इंजेक्शन के माध्यम से एक इनविवो निषेध मॉडल प्रस्तुत करते हैं, जो पुरुष अर्धसूत्रीविभाजन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक हो सकती है। हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि सीईएनपी-ई निषेध के परिणामस्वरूप अर्धसूत्रीविभाजन I के दौरान प्राथमिक शुक्राणुकोशिकाओं में गुणसूत्र गलत संरेखण और मेटाफ़ेज़ गिरफ्तारी होती है। हमारी इन विवो निषेध विधि अर्धसूत्रीविभाजन के यंत्रवत अध्ययन की सुविधा प्रदान करेगी, पुरुष रोगाणु लाइनों के आनुवंशिक संशोधनों के लिए एक उपयोगी विधि के रूप में काम करेगी, और भविष्य के नैदानिक अनुप्रयोगों पर प्रकाश डालेगी।

Introduction

अर्धसूत्रीविभाजन यूकेरियोटिक जीवों में सबसे महत्वपूर्ण, अत्यधिक कठोर, विकासवादी संरक्षित घटनाओं में से एक है, और गैमेटोजेनेसिस, यौन प्रजनन, जीनोम अखंडता और आनुवंशिक विविधता 1,2,3 के लिए आवश्यक है। स्तनधारियों में, रोगाणु कोशिकाएं डीएनए प्रतिकृति के एक दौर के बाद दो क्रमिक कोशिका विभाजन, अर्धसूत्रीविभाजन I और II से गुजरती हैं। माइटोसिस में बहन क्रोमैटिड के विपरीत, डुप्लिकेट होमोलोगस क्रोमोसोम अर्धसूत्रीविभाजन I 4,5 के दौरान दो बेटी कोशिकाओं में जुड़ते हैं और अलग होते हैं। अर्धसूत्रीविभाजन II में, बहन क्रोमैटिड डीएनए प्रतिकृतिके बिना अगुणित युग्मक बनाने के लिए अलग और अलग हो जाते हैं। स्पिंडल असेंबली दोष और क्रोमोसोम मिससेग्रीगेशन सहित दो मियोटिक डिवीजनों में से किसी एक में गलतियों के परिणामस्वरूप युग्मकों, बाँझपन या एन्यूप्लोइडी सिंड्रोम 7,8,9 का नुकसान हो सकता है।

संचित अध्ययनों से पता चला है कि किन्सिन परिवार मोटर्स क्रोमोसोम संरेखण और अलगाव, स्पिंडल असेंबली, साइटोकिनेसिस और माइटोटिक और मियोटिककोशिकाओं दोनों में कोशिका चक्र प्रगति के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। काइन्सिन -7 सीईएनपी-ई (सेंट्रोमियर प्रोटीन ई) क्रोमोसोम कांग्रेस, क्रोमोसोम परिवहन और संरेखण के लिए आवश्यक एक प्लस-एंड-निर्देशित किनेटोकोर मोटर है, और माइटोसिस 13,14,15,16,17,18 में स्पिंडल असेंबली चेकपॉइंट का विनियमन है। अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान, विशिष्ट अवरोधक द्वारा सीईएनपी-ई अवरोध GSK923295 कोशिका चक्र गिरफ्तारी, गुणसूत्र गलत संरेखण, स्पिंडल विघटन और शुक्राणुजनककोशिकाओं में जीनोम अस्थिरता की ओर जाता है। विभाजित शुक्राणुकोशिकाओं के सेंट्रोमियर पर सीईएनपी-ई के स्थानीयकरण पैटर्न और गतिशीलता से संकेत मिलता है कि सीईएनपी-ई अर्धसूत्रीविभाजन I20,21 के दौरान सेंट्रोमियर की अनुक्रमिक असेंबली के लिए किनेटोकोर प्रोटीन के साथ बातचीत करता है। अंडाणुओं में, क्रोमोसोम संरेखण और अर्धसूत्रीविभाजन I13,22,23 के पूरा होने के लिए सीईएनपी-ई की आवश्यकता होती है। सीईएनपी-ई के एंटीबॉडी या मोर्फोलिनो इंजेक्शन के परिणामस्वरूप गलत संरेखित गुणसूत्र, असामान्य किनेटोकोर अभिविन्यास और अर्धसूत्रीविभाजन होता है जो माउस और ड्रोसोफिला अंडाणुओं दोनों में होता है। माइटोसिस में सीईएनपी-ई की आवश्यक भूमिकाओं की तुलना में, अर्धसूत्रीविभाजन में सीईएनपी-ई के कार्य और तंत्र काफी हद तक अज्ञात रहते हैं। क्रोमोसोम कांग्रेस में सीईएनपी-ई के विस्तृत तंत्र और पुरुष मियोटिक कोशिकाओं में जीनोम स्थिरता को स्पष्ट किया जाना बाकी है।

शुक्राणुजनन एक जटिल और लंबे समय तक चलने वाली शरीर विज्ञान प्रक्रिया है, जिसमें अनुक्रमिक शुक्राणुजनन प्रसार, अर्धसूत्रीविभाजन और शुक्राणुजनन शामिल हैं। इसलिए, स्तनधारियों और अन्य प्रजातियों24,25 में विट्रो में पूरी प्रक्रिया को पुन: पेश करना असाधारण रूप से मुश्किल है। विट्रो में पचीटेन चरण के बाद शुक्राणुकोशिकाओं के भेदभाव को प्रेरित करना असंभव है। पुरुष मियोटिक डिवीजनों पर अध्ययन आम तौर पर प्रारंभिक मियोटिक प्रोफ़ेज़25,26 के प्रयोगात्मक विश्लेषण तक सीमित रहे हैं। कई तकनीकी प्रयासों के बावजूद, जिसमें शुक्राणुकोशिकाओं की अल्पकालिक संस्कृति27,28 और अंग संस्कृति विधियां25 शामिल हैं, पुरुष मियोटिक विभाजन का अध्ययन करने के लिए कुछ प्रभावी तरीके हैं। इसके अलावा, आवश्यक जीन ों के आनुवंशिक विलोपन के परिणामस्वरूप आमतौर पर विकासात्मक गिरफ्तारी और भ्रूण घातकता होती है। उदाहरण के लिए, सीईएनपी-ई की कमी वाले माउस भ्रूण प्रत्यारोपण में विफल रहते हैं और पिछले आरोपण29 को विकसित नहीं कर सकते हैं, जो अर्धसूत्रीविभाजन में सीईएनपी-ई के यांत्रिक अध्ययन में एक बाधा है। एक साथ लिया गया, पुरुष मियोटिक विभाजन का अध्ययन करने के लिए एक व्यावहारिक और व्यवहार्य प्रणाली स्थापित करना अर्धसूत्रीविभाजन के अनुसंधान क्षेत्र को बहुत बढ़ावा दे सकता है।

छोटे सेल-पारगम्य अवरोधक कोशिका विभाजन और विकास प्रक्रियाओं में काइन्सिन मोटर्स का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। एलोस्टेरिक अवरोधक, GSK923295, विशेष रूप से सीईएनपी-ई मोटर डोमेन को बांधता है, एडीपी (एडेनोसिन डाइफॉस्फेट) की रिहाई को अवरुद्ध करता है, और अंत में सीईएनपी-ई और सूक्ष्मनलिकाएं30 के बीच बातचीत को स्थिर करता है। इस अध्ययन में, पेट की सर्जरी और GSK923295 के वृषण इंजेक्शन के माध्यम से एक इनविवो निषेध माउस मॉडल प्रस्तुत किया जाता है। सीईएनपी-ई निषेध के परिणामस्वरूप प्राथमिक शुक्राणुकोशिकाओं के मेटाफ़ेज़ I में क्रोमोसोम गलत संरेखण होता है। इसके अलावा, सीईएनपी-ई निषेध शुक्राणुकोशिकाओं की मियोटिक गिरफ्तारी और शुक्राणुजनन के विघटन की ओर जाता है। शुक्राणुकोशिकाओं के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला का वर्णन किया गया है और शुक्राणुकोशिकाओं में मियोटिक स्पिंडल सूक्ष्मनलिकाएं, समरूप गुणसूत्र और उपकोशिकीय जीवों का निरीक्षण करने के लिए लागू किया जा सकता है। हमारी विवो निषेध विधि मियोटिक विभाजन और शुक्राणुजनन के अध्ययन के लिए एक प्रभावी तरीका है।

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Protocol

फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी (प्रोटोकॉल नंबर SYXK 2016-0007) में पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा सभी पशु प्रयोगों की समीक्षा और अनुमोदन किया गया था। सभी माउस प्रयोग ों को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच प्रकाशन संख्या 8023, संशोधित 1978) के प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के प्रासंगिक दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था।

1. GSK923295-मध्यस्थता सीईएनपी-ई निषेध माउस मॉडल का निर्माण

  1. 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें। 2 घंटे के लिए पराबैंगनी-सी (यूवीसी) के साथ सर्जिकल अल्ट्रा-क्लीन वर्कबेंच को विकिरणित करें। प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले 3 सप्ताह के पुरुष आईसीआर (इंस्टीट्यूट ऑफ कैंसर रिसर्च) चूहों का वजन करें और आवश्यक एनेस्थेटिक की खुराक की गणना करें।
  2. इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से केटामाइन (100 मिलीग्राम / किग्रा) और ज़ाइलेज़िन (10 मिलीग्राम / किग्रा) के संयोजन को प्रशासित करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें। माउस कॉर्नियल रिफ्लेक्स, नोसिसेप्टिव रिफ्लेक्स, श्वसन, साथ ही मांसपेशियों की टोन के संयोजन के माध्यम से चूहों के संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें। पुष्टि करें कि चूहों को गहराई से एनेस्थेटाइज किया गया है।
    नोट: सर्जरी के दौरान थर्मल समर्थन प्रदान करने के लिए जानवर को हीटिंग पैड पर रखें।
  3. माउस अंगों को बांधें और उन्हें मोम ट्रे पर ठीक करें। संज्ञाहरण के दौरान सूखापन को रोकने के लिए माउस आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम की एक बूंद रखें। एक प्रयोगात्मक पशु रेजर का उपयोग करके माउस के पेट के बालों को निचले पेट से अंडकोश तक शेव करें। एक बाँझ ड्रेप के साथ सर्जिकल क्षेत्र को सुरक्षित करें।
  4. बीटाडीन स्क्रब के साथ उदर पेट को कीटाणुरहित करें और इसके बाद तीन बार 75% इथेनॉल लें। एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके पेट की गुहा खोलें और <5 मिमी उद्घाटन करें।
  5. बाँझ सर्जिकल क्लैंप के साथ त्वचा को दबाएं और बाँझ चिमटी का उपयोग करके वृषण का पता लगाने के लिए बाँझ विच्छेदन बल के साथ एपिडीडिमल वसा पैड को खींचें। एक स्टीरियोस्कोप के नीचे बाँझ बल के साथ वृषण को ठीक करें, और धीरे-धीरे 10 μM की अंतिम एकाग्रता पर 10 μM की अंतिम एकाग्रता पर 10 μL GSK923295 को सेमिनिफेरस नलिकाओं में इंजेक्टकरें। नियंत्रण समूह के निर्माण के लिए, 1% डीएमएसओ (डाइमिथाइल सल्फोक्साइड)/पीबीएस (फॉस्फेट बफर खारा) समाधान के 10 μL इंजेक्ट करें।
    नोट: GSK923295 घोल को -80 डिग्री सेल्सियस पर 10 एमएम की एकाग्रता पर स्टोर करें। 10 μM घोल तैयार करने के लिए 10 mM GSK923295 100 μL PBS घोल में 0.1 μL घोल GSK923295 घोलें।
  6. धीरे-धीरे वृषण को बाँझ शल्य चिकित्सा बल के साथ पेट की गुहा में वापस धकेलें। 0.1 मिमी के व्यास के साथ सीवन लाइन का उपयोग करके पेरिटोनियम और त्वचा को दो से चार टांके के साथ अलग-अलग सिकोड़ें।
  7. पेट की सर्जरी के बाद एक स्थायी मार्कर के साथ जानवर की पीठ पर 3 x 3 मिमी की जगह लेबल करें, माउस को वापस फीडिंग पिंजरे में रखें और पर्याप्त भोजन और पानी के साथ एक स्वच्छ और रोगज़नक़ मुक्त वातावरण सुनिश्चित करें।
  8. फ़िल्टर की गई हवा, निष्फल भोजन और पानी के माध्यम से पर्यावरण को बाँझ अवस्था में रखें। जानवर की देखभाल तब तक करें जब तक कि वह उरोस्थि की पुनरावृत्ति को बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले। पोस्ट-ऑपरेटिव एनाल्जेसिया के लिए, 3 दिनों के लिए हर 12 घंटे में बुप्रेनोर्फिन (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) की एक खुराक दें। सुनिश्चित करें कि माउस पूरी तरह से ठीक होने तक अन्य जानवरों की कंपनी में वापस नहीं आता है।
    नोट: चूहों को पोस्टऑपरेटिव देखभाल दी जाती है, और आवश्यक होने पर पोस्टऑपरेटिव दर्द को कम करने के लिए 0.5% लिडोकेन का उपयोग करके घाव को स्थानीय संज्ञाहरण उचित रूप से दिया जाता है।

2. हेमटोक्सिलिन-ईओसिन (एचई) धुंधला और हिस्टोपैथोलॉजी।

  1. पेट की सर्जरी के चार दिन बाद, सीओ2 कक्ष में 2 एल / मिनट की प्रवाह दर पर सीओ2 के साथ चूहों को इच्छामृत्यु दें। इच्छामृत्यु की पुष्टि विधि के रूप में गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से मृत्यु की पुष्टि करें। अंडकोश को खोलने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करें और बल के साथ वृषण को हटा दें। इंजेक्शन GSK923295 4 दिन बाद माउस वृषण एकत्र करें और उन्हें 12 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 10% फॉर्मलाडेहाइड समाधान के 30 मिलीलीटर में ठीक करें।
  2. ग्रेडिएंट निर्जलीकरण के लिए, क्रमिक रूप से 1 घंटे के लिए 70% इथेनॉल के 40 मिलीलीटर में, 1 घंटे के लिए 85% इथेनॉल के 40 मिलीलीटर में, 1 घंटे के लिए 95% इथेनॉल के 40 मिलीलीटर में और 1 घंटे के लिए 100% इथेनॉल के 40 मिलीलीटर में नमूना को इनक्यूबेट करें।
  3. 40 मिनट के लिए 40 मिलीलीटर जाइलीन में नमूने को इनक्यूबेट करें, और फिर 65 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 40 एमएल पैराफिन में। एम्बेडिंग बॉक्स के नीचे ऊतकों को रखें। पिघला हुआ पैराफिन एम्बेडिंग बॉक्स में जोड़ें। 6 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्ण ठोसकरण के लिए ऊतकों को ठंडा करें।
  4. अल्ट्रामाइक्रोटोम के धारक पर नमूने ठीक करें, नमूने और चाकू की सतह के बीच के कोण को 5-10 ° पर रखें, और स्लाइस मोटाई को 5 μm तक समायोजित करें। एक अल्ट्रामाइक्रोटोम का उपयोग करके 5 μm मोटे खंड तैयार करें, स्लाइड को 40 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में फैलाएं, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए स्लाइड ड्रायर में अनुभागों को सुखाएं।
  5. स्लाइड्स को 40 मिनट के लिए 200 मिलीलीटर जाइलीन में, 6 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के 200 मिलीलीटर में, 2 मिनट के लिए 95% इथेनॉल के 200 मिलीलीटर में, 2 मिनट के लिए 90% इथेनॉल के 200 मिलीलीटर में, 2 मिनट के लिए 80% इथेनॉल के 200 मिलीलीटर में, और 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के 200 मिलीलीटर में, क्रमशः।
  6. स्लाइड्स को आसुत जल में 5 मिनट के लिए कुल्ला करें और उन्हें कमरे के तापमान पर 6 मिनट के लिए मेयर के हेमटोक्सीलिन घोल के साथ दाग दें।
    नोट: मेयर का हेमटोक्सीलिन समाधान: 0.011 मोल / एल हेमटोक्सिलिन, 6.7% निर्जल इथेनॉल, 0.646 मोल / एल एल्यूमीनियम पोटेशियम सल्फेट, और 0.003 मोल / एल सोडियम आयोडेट।
  7. स्लाइड को बहते पानी में 5 मिनट के लिए कुल्ला करें और 2 मिनट के लिए आसुत पानी के साथ इनक्यूबेट करें।
  8. स्लाइड्स को 3 सेकंड के लिए 1% इथेनॉल हाइड्रोक्लोराइड में इनक्यूबेट करें, और फिर उन्हें 2 मिनट के लिए बहते पानी में धो लें।
  9. नमूने को 15 सेकंड के लिए 1% ईओसिन के साथ दाग दें, और फिर उन्हें 5 सेकंड के लिए 95% इथेनॉल के साथ, 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के साथ और 40 मिनट के लिए जाइलीन में इनक्यूबेट करें।
  10. 15 μL न्यूट्रल गम और 24 x 50 मिमी कवरस्लिप का उपयोग करके स्लाइड को सील करें।

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए माउस वृषण के 5 μm मोटे पैराफिन वर्गों को इकट्ठा करें। स्लाइड्स को 40 मिनट के लिए जाइलीन में, 6 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में, 2 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में, 2 मिनट के लिए 90% इथेनॉल में, 2 मिनट के लिए 80% इथेनॉल में और 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में इनक्यूबेट करें। 5 मिनट के लिए आसुत पानी में स्लाइड को कुल्ला करें, और 5 मिनट के लिए 0.01 एम पीबीएस के साथ स्लाइड को धो लें।
  2. स्लाइड को एंटीजन पुनर्प्राप्ति समाधान (0.01 एम साइट्रेट बफर) में रखें और एंटीजन पुनर्प्राप्ति के लिए 4 मिनट के लिए प्रेशर कुकर का उपयोग करके उच्च दबाव में उबालें। स्लाइड्स को स्वाभाविक रूप से कमरे के तापमान पर ठंडा करें। आसुत जल से 5 मिनट के लिए दो बार और पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए कुल्ला करें।
    नोट: 0.01 एम साइट्रेट बफर (पीएच 6.0): 2.1 mmol / L साइट्रिक एसिड, 11.6 mmol / L ट्राइसोडियम साइट्रेट डाइहाइड्रेट।
  3. 10 मिनट के लिए 0.25% ट्राइटनएक्स -100 / पीबीएस के 500 μL में स्लाइड ्स को इंजेक्ट करके कोशिकाओं को परमेबिलाइज करें। स्लाइड को पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
  4. एंटीजन ब्लॉकिंग के लिए, 1 घंटे के लिए 3% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए)/पीबीएसटी (पीबीएस में 0.1% ट्वीन -20) के 300 μL के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए 3% बीएसए / पीबीएसटी में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें। ऊतकों को सूखने से बचाने के लिए स्लाइड को एक ह्यूमिडिफायर बॉक्स में रखें। स्लाइड्स को 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्वाभाविक रूप से गर्म करें।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी को छोड़ दें, और फिर स्लाइड को पीबीएसटी में 5 मिनट के लिए तीन बार कुल्ला करें। 3% बीएसए / पीबीएसटी में द्वितीयक एंटीबॉडी को पतला करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ नमूनों को इनक्यूबेट करें। पांच मिनट के लिए पीबीएसटी में नमूने धो लें।
  6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिडोल (डीएपीआई) के 50 μL के साथ नाभिक को दाग दें। कवरस्लिप को एंटी-फेड माउंटिंग माध्यम से माउंट करें, और कवरस्लिप को नेल पॉलिश के साथ सील करें।
  7. एनए 40x / 0.75 उद्देश्य से लैस फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करके स्लाइड में फ्लोरोसेंट संकेतों का निरीक्षण और रिकॉर्ड करें।

4. फ्लो साइटोमेट्री

  1. 6 सेमी पेट्री व्यंजनों में माउस वृषण एकत्र करें और सर्जिकल कैंची का उपयोग करके वृषण को 1 मिमी3 टुकड़ों में काट लें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1% कोलेजनेस के 1 एमएल का उपयोग करके वृषण को पचाएं, और फिर शुक्राणुजनक कोशिकाओं को अवक्षेपित करने के लिए 5 मिनट के लिए 1,000 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए (एथिलीन डायमाइन टेट्राएसेटिक एसिड) समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और फिर 5 मिनट के लिए 1,000 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और फिर अवक्षेपित कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे से अधिक समय तक 70% ठंडे इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ इनक्यूबेट करें।
  5. 5 मिनट के लिए 1,000 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें, और फिर सेल तलछट एकत्र करें। शुक्राणुजनक कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 500 μL प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) धुंधला समाधान (50 μg / mL PI, 100 μg / mL RNase A और 0.2% ट्राइटन एक्स -100 पीबीएस में) के साथ दाग दें।
    नोट: सेल एकत्रीकरण से बचने के लिए हर 5 मिनट में सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को धीरे से हिलाएं।
  6. सेल मलबे से छुटकारा पाने के लिए 300 जाल स्क्रीन का उपयोग करके नमूने फ़िल्टर करें; कोशिकाओं को एक प्रवाह ट्यूब में इकट्ठा करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. फ्लो साइटोमीटर का उपयोग करके 488 एनएम के उत्तेजना तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्ति संकेतों और प्रकाश प्रकीर्णन का पता लगाएं। Modfit MFLT32 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डीएनए सामग्री और प्रकाश प्रकीर्णन का विश्लेषण करें।

5. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. तेज स्केलपेल का उपयोग करके वृषण को 1 मिमी 3 टुकड़ों में काटें, और अल्ट्रास्ट्रक्चर के परिवर्तनों से बचने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए 0.1 एम पीबीएस (पीएच 7.2) में3 % ग्लूटार्ल्डिहाइड -1.5% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान के साथ नमूनों को जल्दी से इनक्यूबेट करें। नमूने को 0.1 एम पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
    नोट: स्केलपेल और कैंची तेज होनी चाहिए, और कृत्रिम निचोड़ने और खींचने से बचने की कोशिश करें। नमूने का प्रसंस्करण निर्धारण द्रव में किया जाना चाहिए।
  2. 1.5 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1% ऑस्मिक एसिड-1.5% पोटेशियम फेरोसाइनाइड समाधान में नमूने ठीक करें। फिल्टर पेपर के साथ पानी को सुखाएं और नमूने को 0.1 एम पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए तीन बार कुल्ला करें।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 50% इथेनॉल के 40 मिलीलीटर में नमूनों को निर्जलित करें। नमूने को 70% इथेनॉल संतृप्त यूरेनियम एसीटेट डाई के 40 मिलीलीटर में 12 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 90% इथेनॉल के 40 मिलीलीटर में, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 90% इथेनॉल के 40 मिलीलीटर में, और कमरे के तापमान पर तीन बार 10 मिनट के लिए 40 मिलीलीटर में निर्जल एसीटोन में इनक्यूबेट करें।
  4. 1.5 घंटे के लिए निर्जल एसीटोन-एपॉक्सी राल 618 एम्बेडिंग एजेंटों (वी / वी = 1: 1) मिश्रण में नमूनों को इनक्यूबेट करें, और फिर 3 घंटे के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर एपॉक्सी राल 618 एम्बेडिंग एजेंटों में नमूने एम्बेड करें।
  5. राल पोलीमराइजेशन के लिए, एपॉक्सी राल 618 एम्बेडिंग एजेंटों में नमूनों को 12 घंटे के लिए 35 डिग्री सेल्सियस पर, 12 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर और फिर 24 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. नमूने और ग्लास चाकू स्थापित करें, और फिर नमूने और चाकू के बीच की दूरी को समायोजित करें। अल्ट्रा-थिन माइक्रोटोम का उपयोग करके 90 एनएम मोटी अल्ट्रा-थिन सेक्शन तैयार करें। नमूनों को एक स्थिर गति से स्लाइस करें, और फिर स्लाइड को निकल जाल पर रखें। स्लाइड को कमरे के तापमान पर पेट्री डिश में रखें।
  7. स्लाइड को 10 मिनट के लिए 2% यूरिनिल एसीटेट के साथ दाग दें, और फिर 10 मिनट के लिए 2% लीड साइट्रेट के साथ नमूने को दाग दें। आसुत जल के साथ स्लाइड को धो लें। कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए स्लाइड ्स को सुखाएं।
  8. स्लाइडों का निरीक्षण करें और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 70-100 केवी पर इलेक्ट्रॉन छवियों को रिकॉर्ड करें।

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Representative Results

हमने पेट की सर्जरी और GSK92329519 के वृषण इंजेक्शन के माध्यम से माउस वृषण के एक इनविवो सीईएनपी-ई निषेध मॉडल का सफलतापूर्वक निर्माण किया है। इस विधि के प्रमुख तकनीकी चरणों को चित्र 1 में दिखाया गया था। 4 दिनों के लिए GSK923295 के वृषण इंजेक्शन के बाद, आगे के विश्लेषण के लिए वृषण काटा गया था। नियंत्रण समूह में, सेमिनिफेरस नलिकाओं में शुक्राणुजनन तरंग नियमित और व्यवस्थित थी (चित्रा 2 ए)। हालांकि, GSK923295 समूह में, शुक्राणुजनन तरंग को सेमिनिफेरस नलिकाओं में बदल दिया गया था, और सीईएनपी-ई निषेध (चित्रा 2 बी-डी) के बाद मेटाफ़ेज़ गिरफ्तार प्राथमिक शुक्राणुकोशिकाओं में काफी वृद्धि हुई थी। महत्वपूर्ण रूप से, सीईएनपी-ई निषेध (चित्रा 2 बी-डी) के बाद भूमध्यरेखीय प्लेट पर कई समरूप गुणसूत्र संरेखित नहीं थे। इसके अलावा, सीईएनपी-ई निषेध ने सेमिनिफेरस नलिकाओं (चित्रा 2 ई, एफ, जी) में मेटाफ़ेज़ आई शुक्राणुकोशिकाओं की वृद्धि को भी जन्म दिया। एक साथ लिया गया, सीईएनपी-ई निषेध के परिणामस्वरूप अर्धसूत्रीविभाजन I के दौरान प्राथमिक शुक्राणुकोशिकाओं में गुणसूत्र गलत संरेखण होता है, जो बताता है कि सीईएनपी-ई क्रोमोसोम कांग्रेस और अर्धसूत्रीविभाजन में शुक्राणुकोशिकाओं के संरेखण के लिए जिम्मेदार है।

इन परिणामों को और अधिक मान्य करने के लिए, हमने सेमिनिफेरस नलिकाओं में शुक्राणुजन्य कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का प्रदर्शन किया। हमने पाया कि नियंत्रण समूह में दिखाई गई नियमित शुक्राणुजनन लहर स्पष्ट रूप से बदल गई थी और GSK923295 समूह में अनियमित हो गई थी (चित्रा 3)। शुक्राणुकोशिकाओं को विभाजित करने के मियोटिक स्पिंडल को एंटी-α-ट्यूबुलिन एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया था, और शुक्राणुकोशिकाओं में सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स के अनुप्रस्थ फिलामेंट को एंटी-सिनैप्टोनेमल कॉम्प्लेक्स प्रोटीन 3 (एसवाईसीपी 3) एंटीबॉडी (चित्रा 3 ए) के साथ लेबल किया गया था। सीईएनपी-ई निषेध (चित्रा 3 बी) के बाद प्रति सेमिनिफेरस नलिका में एसवाईसीपी 3 सकारात्मक कोशिकाओं में कमी आई है। इस बीच, सीईएनपी-ई निषेध (चित्रा 3 सी) के बाद प्रति मेटाफ़ेज़ सेल एसवाईसीपी 3 डॉट्स बाधित नहीं हुए थे। इसके अलावा, प्रति सेल एसवाईसीपी 3 स्ट्रेच भी GSK92395 समूहों (चित्रा 3 डी) में प्रभावित नहीं हुए थे। आश्चर्यजनक रूप से, हमने पाया कि सीईएनपी-ई निषेध (चित्रा 3 ई, एफ) के बाद मेटाफ़ेज़ 1 शुक्राणुकोशिकाओं में स्पिंडल ध्रुवों की दूरी बढ़ गई थी। इन इम्यूनोफ्लोरोसेंट परिणामों से पता चलता है कि क्रोमोसोम मिसलिग्नमेंट और शुक्राणुजनन की प्रक्रियाओं के लिए सीईएनपी-ई की आवश्यकता होती है, और द्विध्रुवी स्पिंडल के रखरखाव और मियोटिक स्पिंडल के संगठन के लिए अपरिहार्य है।

माउस वृषण में सेल आबादी की जांच करने के लिए, हमने वृषण को पचाया और पीआई धुंधला और फ्लो साइटोमेट्री परख (चित्रा 4) का प्रदर्शन किया। महत्वपूर्ण तकनीकी प्रक्रियाओं को चित्रा 4 ए-सी में दिखाया गया था। शुक्राणुजन्य कोशिकाओं में कई कोशिका आबादी होती है, जिसमें शुक्राणुजन, प्राथमिक शुक्राणुकोशिकाएं, द्वितीयक शुक्राणुकोशिकाएं, शुक्राणु और शुक्राणु शामिल हैं। इन शुक्राणुजनक कोशिकाओं की डीएनए सामग्री चित्रा 4 ए में दिखाया गया था। हमने प्रदर्शित किया कि सीईएनपी-ई निषेध के परिणामस्वरूप नियंत्रण समूह में अगुणित कोशिकाओं की कमी 42.95 ± 1.09% से GSK923295 समूह में 38.26 ± 1.86% हो गई (चित्रा 4 बी-डी)। सीईएनपी-ई निषेध (चित्रा 4 ई, एफ) के बाद द्विगुणित कोशिकाओं और एन्यूप्लोइडी कोशिकाओं के अनुपात महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं हुए थे। इसके अलावा, टेट्राप्लोइड कोशिकाओं का अनुपात नियंत्रण समूह में 17.76 ± 1.52% से बढ़कर GSK923295 समूह में 28.88 ± 2.05% हो जाता है (चित्रा 4 जी)। एक साथ लिया गया, हम पाते हैं कि सीईएनपी-ई निषेध के बाद शुक्राणुजन्य कोशिकाओं की कोशिका आबादी थोड़ी बदल जाती है। सीईएनपी-ई निषेध के परिणामस्वरूप अगुणित कोशिकाओं की कमी और टेट्राप्लोइड कोशिकाओं की वृद्धि होती है, जो इंगित करता है कि सीईएनपी-ई निषेध विभाजित शुक्राणुकोशिकाओं में मेटाफ़ेज़ गिरफ्तारी से जुड़ा हुआ है।

इसके अलावा, हमने ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 5) का उपयोग करके शुक्राणुजनक कोशिकाओं की उप-सूक्ष्म संरचना का अवलोकन किया। क्रोमैटिन संगठन, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और शुक्राणुकोशिकाओं के माइटोकॉन्ड्रिया को चित्रा 5 में दिखाया गया था। हमने पाया कि GSK923295 समूह (चित्रा 5) में शुक्राणुजन्य कोशिकाओं का संगठन थोड़ा बाधित था।

Figure 1
चित्रा 1: पेट की सर्जरी और वृषण प्रशासन के माध्यम से माउस वृषण के एक इनविवो निषेध मॉडल की स्थापना। (ए) पेट की सर्जरी में उपयोग किए जाने वाले सभी शल्य चिकित्सा उपकरण। 1) विच्छेदन कैंची, 2) सुई बल, 3) सीधे बल, 4) पिनसेट, 5) रिओडीन, 6) 1 एमएल सिरिंज, 7) नंबर 3 हैंडल और नंबर 11 ब्लेड के साथ स्केलपेल, 8) स्टाइलोलाइट, 9) गोल सिलाई सुई, 1/2 0.6 x 14 मिमी, 1/2 0.7 x 17 मिमी, 10) इथेनॉल स्वैब। (बी) संज्ञाहरण के बाद, चूहों को मोम ट्रे पर लापरवाह स्थिति में रखा गया था, निचले पेट को तैयार किया गया था और 75% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित किया गया था। (सी) पेट के निचले हिस्से के बीच में <5 मिमी का उद्घाटन किया गया था। (डी) वृषण का पता लगाने के लिए एपिडीडिमल वसा पैड को बाँझ विच्छेदन बल के साथ खींचा गया था। टेस्टिस को 10 μL GSK923295 के साथ 10 μL rheodyne का उपयोग करके इंजेक्ट किया गया था। (ई) पेरिटोनियम और त्वचा को एक साथ दो टांके के साथ जोड़ा गया था। (एफ) घाव को 75% इथेनॉल के साथ कीटाणुरहित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सीईएनपी-ई निषेध के परिणामस्वरूप माउस शुक्राणुकोशिकाओं में अर्धसूत्रीविभाजन I और गुणसूत्र गलत संरेखण की गिरफ्तारी हुई। (ए) नियंत्रण समूह में शुक्राणुजन्य कोशिकाओं का धुंधला होना। तीर शुक्राणुकोशिकाओं को इंगित करते हैं। (बी) GSK923295 समूह में शुक्राणुजन्य कोशिकाओं का धुंधला होना। वृषण को 10 μM की अंतिम एकाग्रता पर 4 दिनों के लिए GSK923295 के साथ इंजेक्ट किया गया था। तीर शुक्राणुकोशिकाओं में गुणसूत्र गलत संरेखण का संकेत देते हैं। सभी छवियों के लिए, स्केल बार, 10 μm. (C) सेमिनिफेरस नलिकाओं में मेटाफ़ेज़ शुक्राणुकोशिकाओं का अनुपात। नियंत्रण, 13.43 ± 1.68%; GSK923295, 42.29 ± 3.94% एन = 1308 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया था। समूह = 4. छात्र का टी-टेस्ट। त्रुटि पट्टियाँ, का अर्थ है ± SEM. ** *, P < 0.001. (डी) शुक्राणुकोशिकाओं को विभाजित करने के साथ सेमिनिफेरस नलिकाओं का अनुपात। नियंत्रण, 5.38 ± 2.64%; GSK923295, 33.96 ± 3.87% एन = 151 सेमिनिफेरस नलिकाओं का विश्लेषण किया गया था। समूह = 4. (ई) नियंत्रण और GSK923295 समूहों में हिस्टोन एच 3 (फॉस्फो सेर 10) और टीयूबीए 4 ए की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। टीयूबीए 4 ए, लाल; हिस्टोन एच 3 (फॉस्फो सेर 10), हरा; DAPI, नीला. स्केल बार, 10 μm. बढ़े हुए बॉक्स को ज़ूम किया जाता है। (एफ) सेमिनिफेरस नलिकाओं में मेटाफ़ेज़ कोशिकाओं की संख्या का परिमाणीकरण। नियंत्रण, 11.45 ± 1.55; GSK923295, 18.91 ± 2.36. N = 11 (जी, एच) नियंत्रण समूह (जी) और GSK923295 समूह (एच) के मेटाफ़ेज़ I शुक्राणुकोशिकाओं में हिस्टोन एच 3 और टीयूबीए 4 ए की फ्लोरोसेंट तीव्रता का लाइन-स्कैन विश्लेषण। टीयूबीए 4 ए, लाल; हिस्टोन एच 3 (फॉस्फो सेर 10), हरा; DAPI, नीला. एक्स अक्ष सापेक्ष दूरी को इंगित करता है। वाई अक्ष फ्लोरोसेंट तीव्रता को इंगित करता है। छात्र का टी-टेस्ट। त्रुटि पट्टियाँ, मतलब ± SEM. *, P < 0.05; ** *, पी < 0.001. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: GSK923295 द्वारा सीईएनपी-ई अवरोध ने सेमिनिफेरस नलिकाओं के विघटन और शुक्राणुजनन के विघटन को जन्म दिया। (ए) नियंत्रण और GSK923295 समूहों में एसवाईसीपी 3 और टीयूबीए 4 ए की प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। SYCP3, लाल; टीयूबीए 4 ए, हरा; DAPI, नीला. स्केल बार, 10 μm. (B) SYCP3 सकारात्मक कोशिकाएं प्रति सेमिनिफेरस नलिकाएं नियंत्रण और GSK923295 समूहों में। नियंत्रण, 56.00 ± 5.43%; GSK923295, 39.00 ± 1.73% N = 10। (सी) प्रति मेटाफ़ेज़ कोशिकाओं में एसवाईसीपी 3 डॉट्स की मात्रा। नियंत्रण, 10.00 ± 1.02; GSK923295, 9.71 ± 0.86, N = 7. (घ) नियंत्रण और GSK923295 समूहों में प्रति सेल एसवाईसीपी 3 की मात्रा का परिमाणीकरण। नियंत्रण, 8.63 ± 0.22; GSK923295, 8.21 ± 0.21. N = 19 (ई) मेटाफ़ेज़ I शुक्राणुकोशिकाओं में स्पिंडल ध्रुवों की दूरी का विश्लेषण। नियंत्रण, 8.20 ± 0.28 μm; GSK923295, 9.30 ± 0.29 μm. N = 30. (एफ) नियंत्रण और GSK923295 समूहों में सेमिनिफेरस नलिकाओं की इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवियां। तीर शुक्राणुकोशिकाओं को इंगित करते हैं। DAPI, हरा; β-ट्यूबुलिन, हरा। डैश किए गए बॉक्स की बढ़ी हुई छवियों को ज़ूम में दिखाया गया था। सभी छवियों के लिए, स्केल बार, 10 μm. छात्र का टी-टेस्ट। त्रुटि पट्टियाँ, मतलब ± SEM. ns, P > 0.05; **, पी < 0.01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: माउस वृषण में शुक्राणुजन्य कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। (ए) माउस शुक्राणुजन्य कोशिकाओं के सेल चक्र विश्लेषण में प्रमुख चरणों के योजनाबद्ध चित्र। द्विगुणित शुक्राणुकोशिकाएं अगुणित शुक्राणुओं को बनाने के लिए अर्धसूत्रीविभाजन I और II से गुजरती हैं। सी मान डीएनए सामग्री को इंगित करता है। एन मान (प्लोइडी) गुणसूत्रों के सेट की संख्या को इंगित करता है। (बी, सी) नियंत्रण समूह (बी) और GSK923295 समूह (सी) में शुक्राणुजनित कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। विवो सीईएनपी-ई निषेध में, GSK923295 को 4 दिनों के लिए 10 μM पर अंतिम एकाग्रता पर 3 सप्ताह के पुरुष आईसीआर माउस वृषण में इंजेक्ट किया गया था। सेल चक्र विश्लेषण के लिए, एन = 3,000 कोशिकाओं को मापा और विश्लेषण किया गया था। पी 4, अगुणित कोशिकाएं (1 सी)। पी 5, द्विगुणित कोशिकाएं (2 सी)। पी 6, टेट्राप्लोइड कोशिकाएं (4 सी)। (डी) नियंत्रण और GSK923295 समूहों में अगुणित कोशिकाओं का अनुपात। नियंत्रण, 42.95 ± 1.09%; GSK923295, 38.26 ± 1.86% N = 8. (ई) नियंत्रण और GSK923295 समूहों में द्विगुणित कोशिकाओं का अनुपात। नियंत्रण, 20.10 ± 0.91%; GSK923295, 17.95 ± 0.81% N = 8. (एफ) नियंत्रण और GSK923295 समूहों में एन्यूप्लोइड कोशिकाओं (2 सी ~ 4 सी) का अनुपात। नियंत्रण, 3.41 ± 0.23%; GSK923295, 3.39 ± 0.25% N = 8. (जी) नियंत्रण और GSK923295 समूहों में टेट्राप्लोइड कोशिकाओं का अनुपात। नियंत्रण, 17.76 ± 1.52%; GSK923295, 28.88 ± 2.05% N = 8. सभी ग्राफ़ के लिए, छात्र का टी टेस्ट। त्रुटि पट्टियाँ, मतलब ± SEM. ns, P > 0.05; *, पी < 0.05; , पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: नियंत्रण और GSK923295 समूह में शुक्राणुजन्य कोशिकाओं का इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण । (ए) नियंत्रण समूह में सेमिनिफेरस नलिकाओं की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार, 5 μm. (B) शुक्राणु के नाभिक की बढ़ी हुई छवि। तीर शुक्राणुकोशिकाओं के समरूप क्रोमैटिन का संकेत देते हैं। स्केल बार, 1 μm. (C) शुक्राणुकोशिकाओं के साइटोप्लाज्म की बढ़ी हुई छवि। स्केल बार, 1 μm. (D) GSK923295 समूह में सेमिनिफेरस नलिकाओं की प्रतिनिधि छवियां। वृषण को 4 दिनों के लिए 10 μM GSK923295 के साथ इलाज किया गया था। स्केल बार, 5 μm. (E) GSK923295 समूह में शुक्राणुकोशिका के नाभिक की बढ़ी हुई छवि। स्केल बार, 1 μm. (F) GSK923295 समूह में शुक्राणुकोशिकाओं के साइटोप्लाज्म की बढ़ी हुई छवि। स्केल बार, 1 μm. सभी ग्राफ़ के लिए, एससी, शुक्राणु; एसडी, शुक्राणु। ईआर, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम; एमटी, माइटोकॉन्ड्रिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन में, हमने पेट की सर्जरी और GSK923295 के माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग करके माउस वृषण के विवो सीईएनपी-ई निषेध मॉडल की स्थापना की है। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली पेट की सर्जरी और वृषण इंजेक्शन विधि के निम्नलिखित फायदे हैं। सबसे पहले, यह चूहों की उम्र तक सीमित नहीं है। प्रयोगकर्ता प्रारंभिक चरण में वृषण इंजेक्शन कर सकते हैं, उदाहरण के लिए, 3 सप्ताह या छोटे चूहों पर। दूसरा, सीईएनपी-ई पर GSK923295 का एक विशिष्ट और उत्कृष्ट निरोधात्मक प्रभाव पड़ता है। तीसरा, यह विधि संचालित करने के लिए सरल है और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। इसके अलावा, वृषण की अखंडता को बनाए रखा जाता है, जो अंगों के संदर्भ में बरकरार ऊतकों के अध्ययन के लिए उपयुक्त है।

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं। उदाहरण के लिए,पोस्टऑपरेटिव संक्रमण की रोकथाम के लिए पेट की सर्जरी के दौरान बाँझ वातावरण बनाए रखना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, विभिन्न उम्र या विभिन्न प्रयोगात्मक जानवरों के चूहों के लिए, इंजेक्शन की मात्रा को वृषण के आकार और दवाओं की प्रभावशीलता19,32 के अनुसार उचित रूप से समायोजित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, फ्लो साइटोमेट्री के दौरान एकल कोशिकाओं के निर्धारण और बाद में सेल जनसंख्या परीक्षण के लिए उचित पाचन समय और सूक्ष्म अवलोकन की आवश्यकता होती है। हालाँकि, इस प्रोटोकॉल में कई सीमाएँ हैं। माउस मॉडल बनाने के लिए पेट की सर्जरी का उपयोग करना मुश्किल है जब माउस की उम्र 2 सप्ताह से कम होती है। मुख्य कारण यह है कि चूहे बहुत छोटे हैं, पोस्टऑपरेटिव आहार मुश्किल है और जीवित रहने की दर कम है। पशु मॉडल में उपयोग की जाने वाली दवाएं तरल होती हैं और आसानी से प्रवेश करने वाली कोशिका झिल्ली 19,32,33 की विशेषताएं होती हैं, जो इस प्रशासन विधि के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं।

अर्धसूत्रीविभाजन को समझना इन विट्रो सेल संस्कृति और जीन नॉकआउट अध्ययनों द्वारा प्रेरित होता है, हालांकि, यह स्तनधारी शुक्राणुकोशिकाओं28 में आसानी से लागू नहीं होता है। पुरुष अर्धसूत्रीविभाजन के यांत्रिक अध्ययन के लिए बाधा अर्धसूत्रीविभाजन27 में शुक्राणुकोशिकाओं को विभाजित करने के हेरफेर और अवलोकन के लिए एक उपयुक्त प्रणाली की कमी रही है। शुक्राणुजनन के दौरान अर्धसूत्रीविभाजन के सेलुलर और आणविक तंत्र के अनुसंधान में माउस एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है। माउस शुक्राणुकोशिकाओं की पहली लहर 10 वें दिन पोस्ट-पार्टम (डीपीपी) में अर्धसूत्रीविभाजन शुरू करती है और 35 डीपीपी पर परिपक्व शुक्राणुओं में विकसित होती है, जो मियोटिक विभाजन और शुक्राणुजनन34 के अध्ययन के लिए एक विकासात्मक समय-खिड़की प्रदान करती है।

टेस्टिस इंजेक्शन, जिसमें पेट की सर्जरी के माध्यम से अंडकोश और माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से प्रत्यक्ष इंजेक्शन शामिल है, शुक्राणुजनन35,36 के अध्ययन के लिए एक उपयोगी तकनीक है। अंडकोश के माध्यम से प्रत्यक्ष इंजेक्शन त्वरित और सरल है, और केवल एक मामूली सर्जिकल आघात का कारण बनता है, जो 4 सप्ताह या उससे अधिक उम्र के चूहों के लिए उपयुक्त है, जिसमें वृषण अंडकोश में उतरते हैं। हालांकि, 3 सप्ताह या उससे कम उम्र के चूहों के अविकसित वृषण को इंजेक्ट करना असंभव है। इंट्रापरिटोनियल सर्जरी या अंडकोश सर्जरी के माध्यम से माइक्रोइंजेक्शन अविकसित वृषण के इंजेक्शन के लिए उपयुक्त है, जिसके लिए प्रयोगात्मक ऑपरेटरों, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप और सर्जिकल और प्रयोगशाला उपकरणों के कुशल शल्य चिकित्सा कौशल की आवश्यकता होती है। इंजेक्शन साइटों के अनुसार, माइक्रोइंजेक्शन को सेमिनिफेरस नलिका इंजेक्शन, टेस्टिकुलर नेट इंजेक्शन और टेस्टिकुलर इंटरस्टीशियल इंजेक्शन में वर्गीकृत किया जा सकता है। अन्य इंजेक्शन-आधारित टेस्टिस मॉडल की तुलना में, पेट की सर्जरी के माध्यम से अवरोधकों का इंजेक्शन प्रोटीन के कार्यों को प्रभावी ढंग से रोक सकता है और कोशिका झिल्ली प्रवेश, आसान प्रक्रियाओं और दीर्घकालिक निषेध19,32 में फायदे हो सकते हैं। एसआईआरएनए, एंटीसेंस ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स या लेंटिवायरस का उपयोग करने वाले तरीकों में कोशिका झिल्ली की कम प्रवेश दक्षता, ऑफ-टारगेट साइड इफेक्ट्स और विवो 37,38,39,40 में सीआरएनए या ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स के आसान क्षरण में अधिक सीमाएं हैं।

जीवित ऊतकों में मियोटिक विभाजन संस्कृति की स्थिति की तुलना में अधिक जटिल है, जिसमें विवो में ऊतक वास्तुकला, विकासात्मक संकेतन और पर्यावरणीय कारकोंको ध्यान में रखा जाना चाहिए। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि संस्कृति मीडिया और सेल स्वायत्त कारक मियोटिक विभाजन चरण की शुरुआत की उत्तेजना के लिए महत्वपूर्ण हैं। उदाहरण के लिए, फॉस्फेट अवरोधक ओकाडिक एसिड (ओए) 42, शुक्राणु-विशिष्ट हिस्टोन HIST1H1T 43, टोपोइसोमेरेस II44, और मेटाफ़ेज़ को बढ़ावा देने वाला कारक (एमपीएफ)45 सुसंस्कृत शुक्राणुकोशिकाओं में जी2 / एमआई संक्रमण को बढ़ावा देते हैं। ये जटिल संस्कृति की स्थिति और कारक शुक्राणुकोशिकाओं की अल्पकालिक संस्कृति की सीमाओं में योगदान करते हैं।

वृषण में प्लास्मिड डीएनए का प्रत्यक्ष इंजेक्शन सफलतापूर्वक वृषण मध्यस्थता जीन हस्तांतरण और ट्रांसजेनिकचूहों के उत्पादन में लागू होता है। विवो इलेक्ट्रोपोरेशन में सेमिनिफेरस नलिकाओं के लुमेन में एक डीएनए अभिव्यक्ति प्लास्मिड का इंजेक्शन शामिल है, और फिर कोशिका झिल्ली पारगम्यता को बदलने, ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की दक्षता में सुधार करने और आनुवंशिक संशोधन 45,46,47,48,49 के लिए विद्युत दालों की एक श्रृंखला का उपयोग करना शामिल है। हमारी विधि को विवो इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ-साथ फ्लोरोसेंट टैग किए गए प्रोटीन और जीन संपादन उपकरणों के साथ जोड़ा जा सकता है, जिससे ऊतकों और अंगों के शारीरिक संदर्भ में पुरुष मियोटिक विभाजन के विश्लेषण के लिए यह दृष्टिकोण अधिक शक्तिशाली हो जाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम उपयोगी चर्चाओं के लिए फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी में साइटोस्केलेटन प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम फ्लो साइटोमेट्री में तकनीकी सहायता के लिए सार्वजनिक प्रौद्योगिकी सेवा केंद्र, फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी में जून-जिन लिन को धन्यवाद देते हैं। हम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में तकनीकी सहायता के लिए सार्वजनिक प्रौद्योगिकी सेवा केंद्र, फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी लैब में मिंग-ज़िया वू और लिन-यिंग झोउ को धन्यवाद देते हैं। हम फुजियान मेडिकल यूनिवर्सिटी में बेसिक मेडिकल साइंसेज के प्रायोगिक शिक्षण केंद्र में सी-यी झेंग, यिंग लिन, क्यूई के, और जून सांग को उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था: चीन का राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 82001608), फ़ुज़ियान प्रांत, चीन का प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 2019 जे 05071), फ़ुज़ियान प्रांतीय स्वास्थ्य प्रौद्योगिकी परियोजना (अनुदान संख्या 2018-1-69), वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए स्टार्टअप फंड, फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी (अनुदान संख्या 2017एक्सक्यू 1001), फ़ुज़ियान मेडिकल यूनिवर्सिटी उच्च स्तरीय प्रतिभा वैज्ञानिक अनुसंधान स्टार्ट-अप फंडिंग परियोजना (अनुदान संख्या XRCZX2017025) और अनुसंधान परियोजना। चीनी चिकित्सा स्नातक छात्रों की ऑनलाइन शिक्षा और शिक्षण (अनुदान संख्या बी-YXC20200202-06)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1 ml Syringe Several commercial brands available Sterile.
1.5 mL Centrifuge tube Axygen MCT-150-C
50 mL Centrifuge Tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009164
tubulin rabbit polyclonal antibody Beyotime AF0001 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody Abcam ab267372 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody Sangon Biotech D110022 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody Abcam ab175191 For immunofluorescence assays. Use at 1:100.
Adhesion microscope slides CITOTEST 188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody Beyotime A0423 Sencodary antibody. Use at 1:500.
Aluminium potassium sulphate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10001060
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 100092690
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Prevent photobleching of flourescent signals.
BD FACS Canto II BD Biosciences FACS Canto II
Bovine Serum Albumin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69003435
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Chloral hydrate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80037516
Citric acid Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 122670
Collagenase Sangon Biotech A004194-0100
Coverslips CITOTEST 10212020C 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm.
DAPI Beyotime C1006
Dye vat Several commercial brands available 91347802
Eosin Y, alcohol soluble Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71014460
Ether Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10009318
Formaldehyde - aqueous solution Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10010018
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
Hematoxylin, anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 71020784
ICR mouse Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Fluorescent image analysis.
Leica ultramicrotome Leica
Leica EM UC-7 ultramicrotome Leica EM UC7
Modfit MFLT32 Verity Software House For analysis of flow cytometry results.
Nail polish Several commercial brands available
Neutral gum Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10004160
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Picric acid Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd J60807
Rheodyne Sangon Biotech F519160-0001 10 μl rheodyne
Sliced paraffin Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 69019461
Sodium iodate Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80117214
Surgical instruments Several commercial brands available For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscope FEI Tecnai G2
Trisodium citrate dihydrate Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd 173970
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30188928 Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 30189328 Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution.
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 80096618
Xylene Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd 10023418

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References

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JoVE में इस महीने अंक 178 काइन्सिन शुक्राणुसाइटो अर्धसूत्रीविभाजन सीईएनपी-ई स्पिंडल क्रोमोसोम सूक्ष्मनलिकाएं।
विवो निषेध, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और फ्लो साइटोमेट्री <em>का</em> उपयोग करके शुक्राणुकोशिकाओं में काइन्सिन -7 सीईएनपी-ई का कार्यात्मक मूल्यांकन
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Xu, M. F., Yang, Y. H., Wei, Y. L.,… More

Xu, M. F., Yang, Y. H., Wei, Y. L., Zhang, J. L., Lin, X., Lin, X. Y., Chen, H., She, Z. Y. Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (178), e63271, doi:10.3791/63271 (2021).

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