Summary
Questo articolo riporta un'inibizione in vivo di CENP-E attraverso la chirurgia addominale e l'iniezione testicolare di GSK923295, un valido modello per la divisione meiotica maschile. Utilizzando i saggi di immunofluorescenza, citometria a flusso e microscopia elettronica a trasmissione, dimostriamo che l'inibizione di CENP-E provoca disallineamento cromosomico e instabilità del genoma negli spermatociti di topo.
Abstract
Negli eucarioti, la meiosi è essenziale per la stabilità del genoma e la diversità genetica nella riproduzione sessuale. Le analisi sperimentali degli spermatociti nei testicoli sono fondamentali per le indagini sull'assemblaggio del fuso e sulla segregazione cromosomica nella divisione meiotica maschile. Lo spermatocita di topo è un modello ideale per gli studi meccanicistici della meiosi, tuttavia mancano metodi efficaci per l'analisi degli spermatociti. In questo articolo, viene riportato un metodo pratico ed efficiente per l'inibizione in vivo della kinesina-7 CENP-E negli spermatociti di topo. Viene presentata una procedura dettagliata per l'iniezione testicolare di un inibitore specifico GSK923295 attraverso la chirurgia addominale in topi di 3 settimane. Inoltre, qui descritti una serie di protocolli per la raccolta e la fissazione dei tessuti, la colorazione dell'ematossina-eosina, l'immunofluorescenza, la citometria a flusso e la microscopia elettronica a trasmissione. Qui presentiamo un modello di inibizione in vivo tramite chirurgia addominale e iniezione testicolare, che potrebbe essere una tecnica potente per studiare la meiosi maschile. Dimostriamo anche che l'inibizione di CENP-E provoca disallineamento cromosomico e arresto della metafase negli spermatociti primari durante la meiosi I. Il nostro metodo di inibizione in vivo faciliterà gli studi meccanicistici della meiosi, servirà come metodo utile per le modificazioni genetiche delle linee germinali maschili e farà luce sulle future applicazioni cliniche.
Introduction
La meiosi è uno degli eventi evolutivi evolutivi più importanti, altamente rigidi negli organismi eucariotici, ed è essenziale per la gametogenesi, la riproduzione sessuale, l'integrità del genoma e la diversità genetica 1,2,3. Nei mammiferi, le cellule germinali subiscono due divisioni cellulari successive, meiosi I e II, dopo un singolo ciclo di replicazione del DNA. A differenza dei cromatidi fratelli nella mitosi, i cromosomi omologhi duplicati si accoppiano e si segregano in due cellule figlie durante la meiosi I 4,5. Nella meiosi II, i cromatidi fratelli si separano e si segregano per formare gameti aploidi senza replicazione del DNA6. Errori in una delle due divisioni meiotiche, inclusi difetti di assemblaggio del fuso e missegregazione cromosomica, possono causare la perdita di gameti, sterilità o sindromi aneuploidie 7,8,9.
Studi cumulativi hanno dimostrato che i motori della famiglia delle chinesine svolgono un ruolo cruciale nella regolazione dell'allineamento e della segregazione cromosomica, nell'assemblaggio del fuso, nella citochinesi e nella progressione del ciclo cellulare sia nelle cellule mitotiche che meiotiche10,11,12. Kinesin-7 CENP-E (proteina Centromero E) è un motore cinetocoro plus-end-directed richiesto per la congressualità cromosomica, il trasporto e l'allineamento cromosomico e la regolazione del checkpoint di assemblaggio del fuso nella mitosi 13,14,15,16,17,18. Durante la meiosi, l'inibizione di CENP-E da parte dell'inibitore specifico porta GSK923295 all'arresto del ciclo cellulare, al disallineamento cromosomico, alla disorganizzazione del fuso e all'instabilità del genoma nelle cellule spermatogeniche19. I modelli di localizzazione e la dinamica di CENP-E nei centromeri degli spermatociti in divisione indicano che CENP-E interagisce con le proteine cinetocore per l'assemblaggio sequenziale dei centromeri durante la meiosi I20,21. Negli ovociti, la CENP-E è necessaria per l'allineamento cromosomico e il completamento della meiosi I13,22,23. L'iniezione di anticorpi o morfolino di CENP-E provoca cromosomi disallineati, orientamento anomalo dei cinetochi e arresto della meiosi I sia negli ovociti di topo che di Drosophila 23. Rispetto ai ruoli essenziali di CENP-E nella mitosi, le funzioni e i meccanismi di CENP-E nella meiosi rimangono in gran parte sconosciuti. I meccanismi dettagliati di CENP-E nel congresso cromosomico e la stabilità del genoma nelle cellule meiotiche maschili devono ancora essere chiariti.
La spermatogenesi è un processo fisiologico complesso e di lunga durata, che coinvolge la proliferazione sequenziale degli spermatogoni, la meiosi e la spermiogenesi. Pertanto, l'intero processo è straordinariamente difficile da riprodurre in vitro nei mammiferi e in altre specie24,25. È impossibile indurre la differenziazione degli spermatociti dopo lo stadio di pachitene in vitro. Gli studi sulle divisioni meiotiche maschili sono stati generalmente limitati ad analisi sperimentali della profase meiotica precoce25,26. Nonostante molti sforzi tecnologici, tra cui la coltura a breve termine degli spermatociti27,28 e i metodi di coltura degli organi25, ci sono pochi metodi efficaci per studiare la divisione meiotica maschile. Inoltre, la delezione genetica di geni essenziali di solito provoca l'arresto dello sviluppo e la letalità embrionale. Ad esempio, gli embrioni di topo privi di CENP-E non riescono a impiantarsi e non possono svilupparsi oltre l'impianto29, che è un ostacolo negli studi meccanicistici di CENP-E nella meiosi. Nel complesso, stabilire un sistema pratico e fattibile per studiare la divisione meiotica maschile può promuovere notevolmente il campo di ricerca della meiosi.
L'inibitore permeabile alle piccole cellule è un potente strumento per studiare i motori della chinesina nella divisione cellulare e nei processi di sviluppo. L'inibitore allosterico, GSK923295, si lega specificamente al dominio motorio CENP-E, blocca il rilascio di ADP (adenosina difosfato) e infine stabilizza le interazioni tra CENP-E e microtubuli30. In questo studio, un modello murino di inibizione in vivo viene presentato attraverso la chirurgia addominale e l'iniezione testicolare di GSK923295. L'inibizione di CENP-E provoca disallineamento cromosomico nella metafase I degli spermatociti primari. Inoltre, l'inibizione del CENP-E porta all'arresto meiotico degli spermatociti e all'interruzione della spermatogenesi. Una serie di protocolli sono descritti per l'analisi degli spermatociti e possono essere applicati per osservare microtubuli meiotici fuso, cromosomi omologhi e organelli subcellulari negli spermatociti. Il nostro metodo di inibizione in vivo è un metodo efficace per lo studio della divisione meiotica e della spermatogenesi.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali presso la Fujian Medical University (numero di protocollo SYXK 2016-0007). Tutti gli esperimenti sui topi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida pertinenti della cura e dell'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health (numero di pubblicazioni NIH 8023, riviste nel 1978).
1. Costruzione di modelli murini di inibizione CENP-E mediati da GSK923295
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici a 121 °C per 30 minuti. Irradiare il banco di lavoro chirurgico ultra-pulito con ultraviolet-C (UVC) per 2 ore. Pesare i topi maschi ICR (Institute of Cancer Research) di 3 settimane utilizzati per gli esperimenti e calcolare le dosi di anestetico necessarie.
- Anestetizzare i topi somministrando una combinazione di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) tramite iniezione intraperitoneale. Controllare la profondità dell'anestesia dei topi attraverso una combinazione di riflesso corneale del topo, riflesso nocicettivo, respirazione e tono muscolare. Confermare che i topi sono profondamente anestetizzati.
NOTA: Posizionare l'animale su una piastra elettrica per fornire supporto termico durante l'intervento. - Legare gli arti del topo e fissarli sul vassoio di cera. Metti una goccia di unguento veterinario sugli occhi del topo per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Radere i peli addominali del topo dall'addome inferiore allo scroto usando un rasoio animale sperimentale. Fissare l'area chirurgica con un drappeggio sterile.
- Disinfettare l'addome ventrale con uno scrub Betadine seguito da etanolo al 75% tre volte. Aprire la cavità addominale usando un bisturi sterile e fare un'apertura di <5 mm.
- Bloccare la pelle con morsetti chirurgici sterili e tirare il cuscinetto di grasso epididimo con pinze da dissezione sterili per localizzare i testicoli usando una pinzetta sterile. Fissare il testicolo con una pinza sterile sotto uno stereoscopio e iniettare lentamente 10 μL di GSK923295 nei tubuli seminiferi ad una concentrazione finale di 10 μM usando 10 μL di reodina30. Per la costruzione del gruppo di controllo, iniettare 10 μL di soluzione all'1% di DMSO (dimetil solfossido)/PBS (soluzione salina tamponata con fosfato).
NOTA: Conservare la soluzione GSK923295 ad una concentrazione di 10 mM a -80 °C. Sciogliere 0,1 μL di 10 mM GSK923295 in 100 μL di soluzione PBS per preparare i 10 μM di soluzione GSK923295. - Spingere delicatamente il testicolo nella cavità addominale con una pinza chirurgica sterile. Suturare il peritoneo e la pelle separatamente con due o quattro punti utilizzando la linea di sutura con un diametro di 0,1 mm.
- Etichettare un posto di 3 x 3 mm sul dorso dell'animale con un pennarello permanente dopo l'intervento chirurgico addominale, rimettere il topo nella gabbia di alimentazione e garantire un ambiente pulito e privo di agenti patogeni con cibo e acqua sufficienti.
- Mantenere l'ambiente in uno stato sterile attraverso l'aria filtrata, il cibo sterilizzato e l'acqua. Prenditi cura dell'animale fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la reclinazione sternale. Per l'analgesia post-operatoria, somministrare una dose di buprenorfina (0,1 mg/kg) per via sottocutanea ogni 12 ore per 3 giorni. Assicurarsi che il topo non venga restituito alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ristabilito.
NOTA: I topi ricevono cure postoperatorie e somministrano in modo appropriato alla ferita anestesia locale utilizzando lo 0,5% di lidocaina per ridurre il dolore postoperatorio quando necessario.
2. Colorazione dell'ematossilina-eosina (HE) e istopatologia
- Quattro giorni dopo l'intervento chirurgico addominale, eutanasia i topi con CO 2 ad una portata di 2 L / min in una camera CO2. Confermare la morte per lussazione cervicale come metodo di conferma dell'eutanasia. Utilizzare le forbici chirurgiche per aprire lo scroto e rimuovere i testicoli con una pinza. Raccogliere i testicoli di topo 4 giorni dopo GSK923295 iniezione e fissarli in 30 ml di soluzione di formaldeide al 10% a temperatura ambiente per 12 ore.
- Per la disidratazione del gradiente, incubare sequenzialmente il campione in 40 ml di etanolo al 70% per 1 ora, in 40 ml di etanolo all'85% per 1 ora, in 40 ml di etanolo al 95% per 1 ora e in 40 ml di etanolo al 100% per 1 ora.
- Incubare il campione in 40 mL di xilene per 40 minuti, quindi in 40 mL di paraffina per 1 ora a 65 °C. Posizionare i tessuti nella parte inferiore della scatola di incorporamento. Aggiungere la paraffina fusa nella scatola di incorporamento. Raffreddare i tessuti per una completa solidificazione a 4 °C per 6 ore.
- Fissare i campioni sul supporto dell'ultramicrotomo, mantenere l'angolo tra i campioni e la superficie del coltello a 5-10° e regolare lo spessore della fetta a 5 μm. Preparare le sezioni spesse 5 μm utilizzando un ultramicrotomo, distribuire i vetrini a bagnomaria a 40 °C e asciugare le sezioni in un essiccatore per vetrini per 12 ore a 37 °C.
- Incubare i vetrini in 200 ml di xilene per 40 minuti, in 200 ml di etanolo al 100% per 6 minuti, in 200 ml di etanolo al 95% per 2 minuti, in 200 ml di etanolo al 90% per 2 minuti, in 200 ml di etanolo all'80% per 2 minuti e in 200 ml di etanolo al 70% per 2 minuti, rispettivamente.
- Risciacquare i vetrini in acqua distillata per 5 minuti e colorarli con la soluzione di ematossilina di Mayer per 6 minuti a temperatura ambiente.
NOTA: Soluzione di ematossilina di Mayer: 0,011 mol / L di ematossilina, etanolo anidro al 6,7%, solfato di potassio di alluminio 0,646 mol / L e iodato di sodio 0,003 mol / L. - Risciacquare i vetrini in acqua corrente per 5 minuti e incubare con acqua distillata per 2 minuti.
- Incubare i vetrini in etanolo cloridrato all'1% per 3 s, quindi sciacquarli in acqua corrente per 2 minuti.
- Colorare il campione con eosina all'1% per 15 s, quindi incubarli con etanolo al 95% per 5 s, con etanolo al 100% per 2 minuti e in xilene per 40 minuti.
- Sigillare i vetrini utilizzando 15 μL di gomma neutra e la slitta di copertura 24 x 50 mm.
3. Immunofluorescenza e microscopia confocale
- Raccogliere le sezioni di paraffina spesse 5 μm dei testicoli di topo per l'immunofluorescenza. Incubare i vetrini in xilene per 40 minuti, in etanolo al 100% per 6 minuti, in etanolo al 95% per 2 minuti, in etanolo al 90% per 2 minuti, in etanolo all'80% per 2 minuti e in etanolo al 70% per 2 minuti. Risciacquare i vetrini in acqua distillata per 5 minuti e sciacquare i vetrini con 0,01 M PBS per 5 minuti.
- Posizionare i vetrini nella soluzione di prelievo dell'antigene (tampone citrato 0,01 M) e far bollire ad alta pressione utilizzando una pentola a pressione per 4 minuti per il recupero dell'antigene. Raffreddare i vetrini naturalmente a temperatura ambiente. Risciacquare con acqua distillata per 5 minuti due volte e con PBS per 5 minuti.
NOTA: 0,01 M tampone citrato (pH 6,0): 2,1 mmol/L di acido citrico, 11,6 mmol/L di citrato trisodico diidrato. - Permeabilizzare le cellule incubando i vetrini in 500 μL di TritonX-100/PBS allo 0,25% per 10 minuti. Risciacquare i vetrini con PBS per 5 minuti tre volte.
- Per il blocco dell'antigene, incubare i campioni con 300 μL di albumina sierica bovina al 3% (BSA)/PBST (0,1% Tween-20 in PBS) per 1 ora. Incubare i campioni con gli anticorpi primari in 3% BSA/PBST per 16 ore a 4 °C. Metti i vetrini in una scatola umidificata per evitare che i tessuti si secchino. Riscaldare i vetrini naturalmente a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Eliminare l'anticorpo primario, quindi risciacquare i vetrini in PBST per 5 minuti tre volte. Anticorpi secondari diluiti in BSA/PBST al 3%. Incubare i campioni con anticorpi secondari per 1-2 ore a 37 °C. Risciacquare i campioni in PBST per 5 minuti cinque volte.
- Colorare i nuclei con 50 μL di 4', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 5 minuti a temperatura ambiente. Montare il coprislip con il supporto di montaggio anti-sbiadimento e sigillare il coprislip con lo smalto.
- Osservare e registrare i segnali fluorescenti nei vetrini utilizzando un microscopio fluorescente dotato di un obiettivo NA 40x/ 0,75.
4. Citometria a flusso
- Raccogliere i testicoli di topo in piastre di Petri da 6 cm e tagliare i testicoli in 1 mm3 pezzi usando forbici chirurgiche.
- Digerire i testicoli utilizzando 1 mL di collagenasi all'1% in una provetta da centrifuga da 1,5 mL per 10 minuti a 37 °C, quindi centrifugare i campioni a 1.000 x g per 5 minuti per precipitare le cellule spermatogene.
- Eliminare il surnatante e quindi aggiungere 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA (acido etilene diamminotetraacetico) allo 0,25% per 20 minuti a 37 °C, quindi centrifugare i campioni a 1.000 x g per 5 minuti.
- Scartare il surnatante e quindi incubare le cellule precipitate con 1 ml di etanolo freddo al 70% per più di 8 ore a 4 °C.
- Centrifugare i campioni a 1.000 x g per 5 minuti, quindi raccogliere i sedimenti cellulari. Colorare le cellule spermatogeniche con 500 μL di soluzione colorante di ioduro di propidio (PI) (50 μg/mL PI, 100 μg/mL RNasi A e 0,2% Triton X-100 in PBS) a 37 °C per 30 min.
NOTA: agitare delicatamente la provetta da centrifuga ogni 5 minuti per evitare aggregazioni cellulari. - Filtrare i campioni utilizzando uno schermo a maglie 300 per eliminare i detriti cellulari; raccogliere le cellule in un tubo di flusso e conservarle a 4 °C.
- Rilevare segnali di fluorescenza e diffusione della luce alla lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm utilizzando un citometro a flusso. Analizza il contenuto di DNA e la diffusione della luce utilizzando il software Modfit MFLT32.
5. Microscopia elettronica a trasmissione
- Tagliare i testicoli in 1 mm 3 pezzi usando il bisturi affilato e incubare rapidamente i campioni con una soluzione di glutaraldeide-paraformaldeide al3 % all'1,5% in 0,1 M PBS (pH 7,2) per 4 ore a 4 °C per evitare i cambiamenti di ultrastruttura. Risciacquare i campioni con 0,1 M PBS per 5 minuti tre volte.
NOTA: Il bisturi e le forbici devono essere affilati e cercare di evitare spremiture e tiri artificiali. La lavorazione dei campioni deve essere effettuata nel fluido di fissazione. - Fissare i campioni in una soluzione di acido osmico all'1% - ferrocianuro di potassio all'1,5% a 4 °C per 1,5 ore. Asciugare l'acqua con carta da filtro e sciacquare i campioni con 0,1 M PBS per 5 minuti tre volte.
- Disidratare i campioni in 40 ml di etanolo al 50% per 10 minuti a 4 °C. Incubare i campioni in 40 mL di colorante acetato di uranio saturo di etanolo al 70% a 4 °C per 12 ore, in 40 mL di etanolo al 90% per 10 min a 4 °C, in 40 mL di etanolo-acetone al 90% per 10 min a temperatura ambiente e in 40 mL di acetone anidro per 10 min tre volte a temperatura ambiente.
- Incubare i campioni in una miscela di agenti incorporanti acetone-resina epossidica 618 anidro (v / v = 1: 1) per 1,5 h, quindi incorporare i campioni in resina epossidica 618 agenti incorporanti a 35 ° C per 3 ore.
- Per la polimerizzazione della resina, incubare i campioni in resina epossidica 618 agenti incorporanti a 35 °C per 12 h, a 45 °C per 12 h e quindi a 60 °C per 24 h.
- Installare i campioni e il coltello di vetro, quindi regolare le distanze tra i campioni e il coltello. Preparare le sezioni ultrasottili spesse 90 nm utilizzando un microtomo ultrasottile. Tagliare i campioni a velocità costante, quindi posizionare i vetrini su una rete di nichel. Posizionare i vetrini in una capsula di Petri a temperatura ambiente.
- Colorare i vetrini con acetato di uranile al 2% per 10 minuti, quindi colorare i campioni con citrato di piombo al 2% per 10 minuti. Risciacquare i vetrini con acqua distillata. Asciugare i vetrini per 24 ore a temperatura ambiente.
- Osservare le diapositive e registrare immagini di elettroni a 70-100 kV utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione.
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Representative Results
Abbiamo costruito con successo un modello di inibizione CENP-E in vivo di testicoli murini attraverso chirurgia addominale e iniezione testicolare di GSK92329519. I passaggi tecnici chiave di questo metodo sono stati illustrati nella Figura 1. Dopo l'iniezione testicolare di GSK923295 per 4 giorni, i testicoli sono stati raccolti per ulteriori analisi. Nel gruppo di controllo, l'onda spermatogena nei tubuli seminiferi era regolare e organizzata (Figura 2A). Tuttavia, nel gruppo GSK923295, l'onda spermatogena è stata alterata nei tubuli seminiferi e gli spermatociti primari arrestati in metafase sono aumentati significativamente dopo l'inibizione di CENP-E (Figura 2B-D). È importante sottolineare che diversi cromosomi omologhi non erano allineati alla placca equatoriale dopo l'inibizione di CENP-E (Figura 2B-D). Inoltre, l'inibizione di CENP-E ha anche portato all'aumento degli spermatociti di metafase I nei tubuli seminiferi (Figura 2E,F,G). Nel loro insieme, l'inibizione di CENP-E provoca un disallineamento cromosomico negli spermatociti primari durante la meiosi I, il che suggerisce che CENP-E è responsabile della congressualità cromosomica e dell'allineamento degli spermatociti nella meiosi.
Per convalidare ulteriormente questi risultati, abbiamo eseguito i saggi di immunofluorescenza per rilevare le cellule spermatogeniche nei tubuli seminiferi. Abbiamo scoperto che l'onda spermatogena regolare mostrata nel gruppo di controllo era ovviamente cambiata e diventava irregolare nel gruppo GSK923295 (Figura 3). Il fuso meiotico degli spermatociti in divisione è stato marcato con anticorpi anti-α-tubulina e il filamento trasversale dei complessi sinaptonemali negli spermatociti è stato marcato con anticorpo anti-sinaptonemale complesso proteina 3 (SYCP3) (Figura 3A). Le cellule SYCP3 positive per tubulo seminifero sono diminuite dopo l'inibizione di CENP-E (Figura 3B). Nel frattempo, i punti SYCP3 per cellula in metafase non sono stati interrotti dopo l'inibizione di CENP-E (Figura 3C). Inoltre, anche i tratti di SYCP3 per cellula non sono stati influenzati nei gruppi GSK92395 (Figura 3D). Sorprendentemente, abbiamo scoperto che le distanze dei poli del fuso negli spermatociti in metafase I erano aumentate dopo l'inibizione di CENP-E (Figura 3E, F). Questi risultati immunofluorescenti suggeriscono che la CENP-E è necessaria per il disallineamento cromosomico e i processi di spermatogenesi, ed è indispensabile per il mantenimento del fuso bipolare e l'organizzazione del fuso meiotico.
Per studiare le popolazioni cellulari nei testicoli di topo, abbiamo digerito i testicoli ed eseguito saggi di colorazione PI e citometria a flusso (Figura 4). Le procedure tecniche importanti sono state illustrate nella figura 4A-C. Le cellule spermatogenee sono costituite da diverse popolazioni cellulari, tra cui gli spermatogoni, gli spermatociti primari, gli spermatociti secondari, gli spermatidi e gli spermatozoi. Il contenuto di DNA di queste cellule spermatogeniche è stato mostrato nella Figura 4A. Abbiamo dimostrato che l'inibizione di CENP-E ha portato alla diminuzione delle cellule aploidi dal 42,95 ± 1,09% nel gruppo di controllo al 38,26 ± 1,86% nel gruppo GSK923295 (Figura 4B-D). I rapporti delle cellule diploidi e delle cellule aneuploidiche non sono stati influenzati in modo significativo dopo l'inibizione di CENP-E (Figura 4E,F). Inoltre, i rapporti delle cellule tetraploidi aumentano da 17,76 ± 1,52% nel gruppo di controllo a 28,88 ± 2,05% nel gruppo GSK923295 (Figura 4G). Nel loro insieme, scopriamo che le popolazioni cellulari delle cellule spermatogeneche sono leggermente alterate dopo l'inibizione di CENP-E. L'inibizione di CENP-E provoca la diminuzione delle cellule aploidi e l'aumento delle cellule tetraploidi, il che indica che l'inibizione di CENP-E è associata all'arresto della metafase negli spermatociti in divisione.
Inoltre, abbiamo osservato la struttura submicroscopica delle cellule spermatogeniche utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (Figura 5). L'organizzazione della cromatina, il reticolo endoplasmatico e i mitocondri degli spermatociti sono stati mostrati nella Figura 5. Abbiamo scoperto che l'organizzazione delle cellule spermatogeniche era leggermente interrotta nel gruppo GSK923295 (Figura 5).
Figura 1: Definizione di un modello di inibizione in vivo dei testicoli murini attraverso la chirurgia addominale e la somministrazione testicolare. (A) Tutti gli strumenti chirurgici utilizzati nella chirurgia addominale. 1) forbice da dissezione, 2) pinza ad ago, 3) pinza dritta, 4) pincett, 5) reodina, 6) siringa da 1 ml, 7) bisturi con n. 3 manico e n. 11 lama, 8) stilolite, 9) aghi da cucitura rotondi, 1/2 0,6 x 14 mm, 1/2 0,7 x 17 mm, 10) tamponi etanolo. (B) Dopo l'anestesia, i topi sono stati posti in posizione supina su un vassoio di cera, l'addome inferiore è stato preparato e disinfettato con etanolo al 75%. (C) Un'apertura di <5 mm è stata fatta al centro dell'addome inferiore. (D) Il cuscinetto di grasso epididimo è stato tirato con una pinza dissecante sterile per localizzare i testicoli. Il testicolo è stato iniettato con 10 μL GSK923295 utilizzando una reodina da 10 μL. (E) Il peritoneo e la pelle sono stati suturati simultaneamente con due punti. (F) La ferita è stata disinfettata con etanolo al 75%. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: L'inibizione di CENP-E ha provocato l'arresto della meiosi I e il disallineamento cromosomico negli spermatociti di topo . (A) Colorazione HE delle cellule spermatogeniche nel gruppo di controllo. Le frecce indicano gli spermatociti. (B) Colorazione HE delle cellule spermatogeneche nel gruppo GSK923295. I testicoli sono stati iniettati con GSK923295 per 4 giorni ad una concentrazione finale di 10 μM. Le frecce indicano un disallineamento cromosomico negli spermatociti. Per tutte le immagini, barra della scala, 10 μm. (C) Rapporto degli spermatociti in metafase nei tubuli seminiferi. Controllo, 13,43 ± 1,68%; GSK923295, 42,29 ± 3,94%. N = 1308 cellule sono state analizzate. Gruppo = 4. Test t dello studente. Barre di errore, mezzi ± SEM. ***, P < 0,001 . (D) Rapporto tra tubuli seminiferi e spermatociti in divisione. Controllo, 5,38 ± 2,64%; GSK923295, 33,96 ± 3,87%. N = 151 tubuli seminiferi sono stati analizzati. Gruppo = 4. (E) Immagini di immunofluorescenza dell'istone H3 (fosfo Ser 10) e TUBA4A nei gruppi di controllo e GSK923295. TUBA4A, rosso; Istone H3 (fosfo Ser 10), verde; DAPI, blu. Barra scala, 10 μm. La casella ingrandita viene ingrandita. (F) La quantificazione del numero di cellule in metafase nei tubuli seminiferi. Controllo, 11,45 ± 1,55; GSK923295, 18.91 ± 2.36. N = 11. (G,H) Analisi line-scan delle intensità fluorescenti di Histone H3 e TUBA4A negli spermatociti di metafase I del gruppo di controllo (G) e del gruppo GSK923295 (H). TUBA4A, rosso; Istone H3 (fosfo Ser 10), verde; DAPI, blu. L'asse X indica la distanza relativa. L'asse Y indica le intensità fluorescenti. Test t dello studente. Barre di errore, media ± SEM. *, P < 0,05 ; P < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: L'inibizione di CENP-E da parte di GSK923295 ha portato alla disorganizzazione dei tubuli seminiferi e all'interruzione della spermatogenesi . (A) Immagini rappresentative di immunofluorescenza di SYCP3 e TUBA4A nei gruppi di controllo e GSK923295. SYCP3, rosso; TUBA4A, verde; DAPI, blu. Barra di scala, 10 μm. (B) cellule SYCP3 positive per tubuli seminiferi nei gruppi di controllo e GSK923295. Controllo, 56,00 ± 5,43%; GSK923295, 39,00 ± 1,73%. N = 10. (C) Le quantificazioni dei punti SYCP3 per cellule in metafase. Controllo, 10.00 ± 1.02; GSK923295, 9,71 ± 0,86, N = 7. (D) Le quantificazioni degli allungamenti di SYCP3 per cellula nei gruppi di controllo e GSK923295. Controllo, 8,63 ± 0,22; GSK923295, 8,21 ± 0,21. N = 19. (E) L'analisi della distanza dei poli del fuso negli spermatociti in metafase I. Controllo, 8,20 ± 0,28 μm; GSK923295, 9,30 ± 0,29 μm. N = 30. (F) Immagini di immunofluorescenza di tubuli seminiferi nei gruppi di controllo e GSK923295. Le frecce indicano gli spermatociti. DAPI, verde; β-tubulina, verde. Le immagini ingrandite del riquadro tratteggiato sono state mostrate nello zoom. Per tutte le immagini, barra della scala, 10 μm. Test t di Student. Barre di errore, media ± SEM. ns, P > 0,05 ; **, P < 0,01 . Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Analisi citometrica a flusso di cellule spermatogeniche nei testicoli di topo. (A) Illustrazioni schematiche delle fasi chiave dell'analisi del ciclo cellulare delle cellule spermatogeniche di topo. Gli spermatociti diploidi subiscono la meiosi I e II per formare gli spermatidi aploidi. Il valore C indica il contenuto di DNA. Il valore N (ploidia) indica il numero di set di cromosomi. (B,C) Analisi citometrica a flusso delle cellule spermatogeniche nel gruppo di controllo (B) e nel gruppo GSK923295 (C). Per l'inibizione in vivo di CENP-E, GSK923295 stato iniettato in testicoli di topo ICR maschi di 3 settimane a una concentrazione finale a 10 μM per 4 giorni. Per l'analisi del ciclo cellulare, n = 3.000 cellule sono state misurate e analizzate. P4, le cellule aploidi (1C). P5, le cellule diploidi (2C). P6, le cellule tetraploidi (4C). (D) Rapporti delle cellule aploidi nei gruppi di controllo e GSK923295. Controllo, 42,95 ± 1,09%; GSK923295, 38,26 ± 1,86%. N = 8. (E) Rapporti delle cellule diploidi nei gruppi di controllo e GSK923295. Controllo, 20,10 ± 0,91%; GSK923295, 17,95 ± 0,81%. N = 8. (F) Rapporti delle cellule aneuploidi (2C ~ 4C) nei gruppi di controllo e GSK923295. Controllo, 3,41 ± 0,23%; GSK923295, 3,39 ± 0,25%. N = 8. (G) Rapporti delle cellule tetraploidi nei gruppi di controllo e GSK923295. Controllo, 17,76 ± 1,52%; GSK923295, 28,88 ± 2,05%. N = 8. Per tutti i grafici, Student non test. Barre di errore, media ± SEM. ns, P > 0,05; *, P < 0,05; , P < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Analisi al microscopio elettronico delle cellule spermatogeniche nel gruppo di controllo e GSK923295. (A) Immagini rappresentative dei tubuli seminiferi nel gruppo di controllo. Barra della scala, 5 μm. (B) L'immagine ingrandita del nucleo dello spermatocita. Le frecce indicano cromatina omologa degli spermatociti. Barra della scala, 1 μm. (C) L'immagine ingrandita del citoplasma degli spermatociti. Barra di scala, 1 μm. (D) Immagini rappresentative di tubuli seminiferi nel gruppo GSK923295. I testicoli sono stati trattati con 10 μM GSK923295 per 4 giorni. Barra della scala, 5 μm. (E) L'immagine ingrandita del nucleo dello spermatocita nel gruppo GSK923295. Barra della scala, 1 μm. (F) L'immagine ingrandita del citoplasma degli spermatociti nel gruppo GSK923295. Barra scala, 1 μm. Per tutti i grafici, sc, spermatociti; SD, spermatide. ER, reticolo endoplasmatico; mt, mitocondri. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
In questo studio, abbiamo stabilito un modello di inibizione CENP-E in vivo dei testicoli di topo utilizzando la chirurgia addominale e la microiniezione di GSK923295. La chirurgia addominale e il metodo di iniezione testicolare utilizzati in questo studio presentano i seguenti vantaggi. Innanzitutto, non è limitato all'età dei topi. Gli sperimentatori possono eseguire l'iniezione testicolare in una fase precoce, ad esempio su topi di 3 settimane o più giovani. In secondo luogo, GSK923295 ha un effetto inibitorio specifico ed eccellente su CENP-E. In terzo luogo, questo metodo è semplice da usare e altamente riproducibile. Inoltre, viene mantenuta l'integrità dei testicoli, che è adatta per gli studi di tessuti intatti nel contesto degli organi.
Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo. Ad esempio, è importante mantenere un ambiente sterile durante la chirurgia addominale per la prevenzione delle infezioni postoperatorie31. Inoltre, per topi di età diverse o diversi animali da esperimento, le quantità di iniezione devono essere regolate in modo appropriato in base alle dimensioni dei testicoli e all'efficacia dei farmaci19,32. Inoltre, il tempo di digestione corretto e l'osservazione microscopica sono necessari per la determinazione delle singole cellule e il successivo test della popolazione cellulare durante la citometria a flusso. Tuttavia, ci sono diverse limitazioni in questi protocolli. È difficile usare la chirurgia addominale per costruire un modello murino quando l'età del topo è inferiore a 2 settimane. Le ragioni principali sono che i topi sono troppo giovani, la dieta postoperatoria è difficile e il tasso di sopravvivenza è basso. I farmaci utilizzati nei modelli animali sono liquidi e hanno le caratteristiche di penetrare facilmente nelle membrane cellulari 19,32,33, che sono adatti per le applicazioni di questo metodo di somministrazione.
La comprensione della meiosi è stimolata da studi di coltura cellulare in vitro e di knockout genico, tuttavia, non è facilmente applicabile negli spermatociti di mammifero28. L'ostacolo agli studi meccanicistici sulla meiosi maschile è stata la mancanza di un sistema appropriato per la manipolazione e l'osservazione degli spermatociti in divisione nella meiosi27. Il topo è un eccellente organismo modello nella ricerca dei meccanismi cellulari e molecolari della meiosi durante la spermatogenesi. La prima ondata di spermatociti di topo inizia la meiosi al giorno 10 post-partum (dpp) e si sviluppa in spermatozoi maturi a 35 dpp, che fornisce una finestra temporale di sviluppo per gli studi sulla divisione meiotica e sulla spermatogenesi34.
L'iniezione testicolare, compresa l'iniezione diretta attraverso lo scroto e la microiniezione attraverso la chirurgia addominale, è una tecnica utile per gli studi sulla spermatogenesi35,36. L'iniezione diretta attraverso lo scroto è rapida e semplice e provoca solo un trauma chirurgico minore, che è adatto per topi di 4 settimane o più anziani con i testicoli che scendono allo scroto. Tuttavia, è impossibile iniettare il testicolo ritenuto dei topi di 3 settimane o più giovani. La microiniezione attraverso la chirurgia intraperitoneale o la chirurgia dello scroto è adatta per l'iniezione di testicoli ritenuti, che richiede competenze chirurgiche competenti di operatori sperimentali, uno stereomicroscopio e le attrezzature chirurgiche e di laboratorio. Secondo i siti di iniezione, la microiniezione può essere classificata in iniezione di tubuli seminiferi, iniezione di rete testicolare e iniezione interstiziale testicolare. Rispetto ad altri modelli di testicoli basati su iniezione, l'iniezione di inibitori attraverso la chirurgia addominale può inibire efficacemente le funzioni delle proteine e avere i vantaggi nella penetrazione della membrana cellulare, procedure facili e inibizione a lungo termine19,32. I metodi che utilizzano siRNA, oligonucleotidi antisenso o lentivirus hanno maggiori limitazioni nella bassa efficienza di penetrazione delle membrane cellulari, effetti collaterali off-target e facile degradazione di siRNA o oligonucleotidi in vivo37,38,39,40.
La divisione meiotica nei tessuti viventi è più complessa di quella in condizioni di coltura, in cui l'architettura tissutale, la segnalazione dello sviluppo e i fattori ambientali in vivo dovrebbero essere presi in considerazione41. Studi precedenti hanno dimostrato che i terreni di coltura e i fattori autonomi cellulari sono cruciali per la stimolazione dell'inizio della fase di divisione meiotica. Ad esempio, l'inibitore della fosfatasi acido okadaico (OA)42, l'istone specifico degli spermatociti HIST1H1T43, la topoisomerasi II 44 e il fattore promotore della metafase (MPF)45 promuovono la transizione G2/MI negli spermatociti in coltura. Queste complesse condizioni e fattori di coltura contribuiscono ai limiti della coltura a breve termine degli spermatociti.
L'iniezione diretta di DNA plasmidico nei testicoli viene applicata con successo nel trasferimento genico mediato dai testicoli e nella produzione di topi transgenici32,46. L'elettroporazione in vivo prevede l'iniezione di un plasmide di espressione del DNA nel lume dei tubuli seminiferi, e quindi utilizzare una serie di impulsi elettrici per modificare la permeabilità della membrana cellulare, migliorare l'efficienza dell'espressione transgenica e la modificazione genetica 45,46,47,48,49. Il nostro metodo potrebbe essere combinato con l'elettroporazione in vivo, così come proteine marcate fluorescenti e strumenti di editing genetico, rendendo questo approccio più potente per l'analisi della divisione meiotica maschile nel contesto fisiologico di tessuti e organi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo tutti i membri del Laboratorio di Citoscheletro presso la Fujian Medical University per le utili discussioni. Ringraziamo Jun-Jin Lin del Public Technology Service Center, Fujian Medical University per l'assistenza tecnica nella citometria a flusso. Ringraziamo Ming-Xia Wu e Lin-Ying Zhou dell'Electron Microscopy Lab del Public Technology Service Center, Fujian Medical University per l'assistenza tecnica nella microscopia elettronica. Ringraziamo Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke e Jun Song del Centro di insegnamento sperimentale di scienze mediche di base presso la Fujian Medical University per il loro supporto. Questo studio è stato supportato dalle seguenti sovvenzioni: National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzione 82001608), Natural Science Foundation of Fujian Province, Cina (numero di sovvenzione 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (numero di sovvenzione 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (numero di sovvenzione 2017XQ1001), Fujian Medical University progetto di finanziamento di alto livello per la ricerca scientifica (numero di sovvenzione XRCZX2017025) e Progetto di ricerca di formazione online e insegnamento di studenti laureati in medicina cinese (numero di sovvenzione B-YXC20200202-06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1 ml Syringe | Several commercial brands available | Sterile. | |
| 1.5 mL Centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430828 | |
| 6 cm Petri dish | Corning | 430166 | |
| 95% Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009164 | |
| tubulin rabbit polyclonal antibody | Beyotime | AF0001 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibody | Abcam | ab267372 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibody | Sangon Biotech | D110022 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibody | Abcam | ab175191 | For immunofluorescence assays. Use at 1:100. |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | 188105 | |
| Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody | Beyotime | A0423 | Sencodary antibody. Use at 1:500. |
| Aluminium potassium sulphate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10001060 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 100092690 | |
| Anti-fade mounting medium | Beyotime | P0131 | Prevent photobleching of flourescent signals. |
| BD FACS Canto II | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Bovine Serum Albumin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69003435 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424BK745380 | |
| Chloral hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80037516 | |
| Citric acid | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 122670 | |
| Collagenase | Sangon Biotech | A004194-0100 | |
| Coverslips | CITOTEST | 10212020C | 20 × 20 mm. Thickness 0.13-0.16 mm. |
| DAPI | Beyotime | C1006 | |
| Dye vat | Several commercial brands available | 91347802 | |
| Eosin Y, alcohol soluble | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71014460 | |
| Ether | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009318 | |
| Formaldehyde - aqueous solution | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10010018 | |
| GSK923295 | MedChemExpress | HY-10299 | |
| Hematoxylin, anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 71020784 | |
| ICR mouse | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd | ||
| Image J software | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/ | Fluorescent image analysis. |
| Leica ultramicrotome | Leica | ||
| Leica EM UC-7 ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Modfit MFLT32 | Verity Software House | For analysis of flow cytometry results. | |
| Nail polish | Several commercial brands available | ||
| Neutral gum | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10004160 | |
| Nikon Ti-S2 microscope | Nikon | Ti-S2 | |
| Picric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | J60807 | |
| Rheodyne | Sangon Biotech | F519160-0001 | 10 μl rheodyne |
| Sliced paraffin | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 69019461 | |
| Sodium iodate | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80117214 | |
| Surgical instruments | Several commercial brands available | For abdominal surgery. Sterilize at 121 °C, 20 min. | |
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Shanghai Experiment Reagent Co., Ltd | 173970 | |
| Triton X-100 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30188928 | Dilute in sterile PBS to make a 0.25% working solution. |
| Tween 20 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 30189328 | Dilute in sterile PBS to make a 0.1% working solution. |
| Paraformaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80096618 | |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10023418 |
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