Summary
Bu makalenin genel amacı, tavuk embriyolarına eksojen materyallerin hücre içi enjeksiyonunda nasıl gerçekleştirileceğini tanımlamaktır. Bu yaklaşım, tavuk embriyolarının gelişimsel biyolojisini incelemek için çok yararlıdır.
Abstract
Embriyo biyolojisinin klasik bir model sistemi olarak, tavuk embriyosu embriyonik gelişimi ve farklılaşmayı araştırmak için kullanılmıştır. Eksojen materyallerin tavuk embriyolarına verilmesi, embriyonik gelişim sırasında gen fonksiyonunu, transgenik ıslahı ve kimera preparatını incelemek için büyük bir avantaja sahiptir. Burada, plazmid vektörleri veya modifiye primordial germ hücreleri (PGC'ler) gibi eksojen materyallerin erken gelişim evrelerinde donör tavuk embriyolarına aktarılabildiği in ovo intravasküler enjeksiyon yöntemini gösteriyoruz. Sonuçlar, dorsal aort ve kafa yoluyla intravasküler enjeksiyonun, enjekte edilen materyallerin kan dolaşım sistemi yoluyla tüm embriyoya yayılmasına izin verdiğini göstermektedir. Sunulan protokolde, eksojen plazmid ve lentiviral vektör girişinin etkinliği ve alıcı gonadda enjekte edilen eksojen PGC'lerin kolonizasyonu, embriyolarda floresan gözlenerek belirlenmiştir. Bu makalede, bu yöntemin ayrıntılı prosedürleri açıklanmakta ve böylece gen fonksiyonu, embriyo ve gelişim biyolojisi ve gonad-kimerik tavuk üretimini incelemek için mükemmel bir yaklaşım sağlanmaktadır. Sonuç olarak, bu makale araştırmacıların tavuk embriyolarına eksojen materyallerin ovo intravasküler enjeksiyonunda büyük başarı ve tekrarlanabilirlik ile gerçekleştirmelerini sağlayacaktır.
Introduction
Tavuk embriyoları gelişimsel, immünolojik, patolojik ve diğer biyolojik uygulamalarda yüzyıllardır yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2,3. Toksikoloji ve hücre biyolojisi çalışmalarında diğer hayvan modellerine göre birçok doğal avantaja sahiptirler4. Tavuk embriyolarına kolayca erişilebilir ve in vitro olarak manipüle edilebilir ve kullanışlı bir embriyo araştırma modeli sistemi sağlayan herhangi bir gelişim aşamasında doğrudan gözlemlenebilir.
Genel olarak, elektrotransfeksiyon ve subgerminal kavite enjeksiyonu gibi mevcut tavuk embriyosu verme yöntemleri, uzman ekipman ve tasarlanmış bir programın gerekliliği ve yumurta sarısı ve albümen 5,6,7'nin varlığından kaynaklanan verimsizlik gibi sınırlamalara sahiptir. Burada, eksojen materyalleri tavuk embriyolarına iletmek için basit ve etkili bir taşıma yöntemi gösteriyoruz. Bu, gelişim biyolojisi çalışmalarında kullanılan güçlü bir araç olabilir. Enjekte edilen materyaller kan dolaşımı yoluyla tüm embriyoya yayılır. Tavuk embriyolarının erken gelişimi sırasında, PGC'ler kan yoluyla göç edebilir, genital sırtı kolonize edebilir ve daha sonra eksojen materyalleri vermek için değerli bir olası yol sağlayan gametlere dönüşebilir8. Şimdi, bu yöntem gen fonksiyonu, embriyo ve gelişim biyolojisi ve kimerik ve transgenik tavuk üretimi 9,10,11 çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır.
In ovo tavuk embriyolarında intravasküler enjeksiyon köklü ve yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir12,13,14. Bu yazıda, enjeksiyon malzemeleri, bölgeler, dozaj ve temsili sonuçlar dahil olmak üzere bu protokolün kapsamlı bir tanımını göstereceğiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanların bakımı ve kullanımını içeren tüm prosedürler, ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü yönergelerine (NIH Pub. No. 85-23, revize edilmiş 1996) ve tavuk embriyosu protokollerine uygun olarak, Çin Yangzhou Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Yönetimi ve Deneysel Hayvan Etiği Komitesi (No.201803124) tarafından onaylanmıştır.
1. Döllenmiş yumurta toplama ve hazırlama
NOT: Memelilerin aksine, tavuğun tek bir yumurtalıkta milyonlarca folikülü vardır, ancak bu foliküllerin sadece birkaçı yumurtlamak için yeterince olgundur. Her folikül bir yumurta veya germ hücresi içerir. Folikül olgunlaşır olgunlaşmaz ve sarısını serbest bırakır bırakmaz, fallop tüpünün hunisine dahil edilir. Folikül, yumurta kanalının juguler karnına girdiğinde, meni tavuğun vücudundaki yumurtaya bağlanır ve tavuğun vücudundaki kalsiyum, döllenmiş yumurtayı saran ve vücutta yumuşak kabuklu bir yumurta oluşturan bir kabuk oluşturur. Kalsiyum kabuğu, yumurta üretilene kadar yavaş yavaş kalınlaşır.
- Döllenmiş yumurtaları, 1 hafta boyunca 16 ° C'de saklanabilen yerel bir satıcıdan veya kurumdan toplayın.
NOT: Yüksek depolama sıcaklığı embriyonun gelişmesine yardımcı olurken, düşük sıcaklık embriyonun yaşayabilirliğini azaltacaktır. Depolama süresi çok uzunsa embriyolar gelişemez. - Yumurtaları inkübatöre aktarmadan önce yumurta kabuğunu% 75 etanol ile yumuşak ve yavaş bir şekilde ovalayın.
- Yumurtaları yanlara, 37.8 ° C'de ve% 60 nemde bir inkübatördeki bir rafa düzgünce yerleştirin. 60 saatlik inkübasyondan sonra (HH evre 17), embriyolar görünür kan damarları geliştirecek ve kalp15 atmaya başlayacaktır.
NOT: 2 günlük inkübasyondan sonra, kalbin erken evresi olan küçük ilkel noktalar ortaya çıkar. Bu işleme kiraz boncuklama denir. ~ 2.5 günde, kalp ve diğer vücut segmentleri görünür damarlarla oluşur.
2. Enjeksiyondan önce hazırlık
- İğne olarak kullanılacak cam kılcal damarlar hazırlayın. Enjeksiyondan önce, çektirmeyi kullanarak dış çapı 1 mm ve iç çapı 0,6 mm olan 90 mm cam kılcal damarları çekin. Forseps kullanarak uçları kırın (cam kılcal damarın açısı genellikle 45 ° 'dir) ve kılcal damarları UV ışığı altında 2 saat boyunca sterilize edin.
- Plazmidler, paketlenmiş lentivirüsler ve PGC'ler gibi eksojen malzemeler hazırlayın.
- Plazmid pEGFP-N1'i (plazmidi eksprese eden gelişmiş bir GFP, 1μg / μL) lipozomla 1: 3 oranında (m / v) yavaşça karıştırın. 10 ng / μL'lik nihai bir DNA konsantrasyonu elde etmek için su ekleyin. DNA karışımının enjeksiyondan önce 20 dakika boyunca 37 ° C'de oturmasına izin verin.
- Enjeksiyondan önce virüsleri buz üzerinde çözün. Enjeksiyon için kullanılan lentivirüs titresi 5 x 106 Tu / mL'nin üzerinde olmalıdır.
- Ebeveyn veya modifiye gonad PGC'leri (E4.5, HH evre 24) 2.000-5.000 hücre/μL'ye seyreltin.
NOT: Burada tripan mavisi kullanarak enjeksiyon prosedürünü gösterdik.
3. Pencereleme
- Embriyoları açığa çıkarmadan önce, yumurta kabuklarının yüzeyini bir pamuk topu kullanarak% 75 alkolle nazikçe ve yumuşak bir şekilde silerek sterilize edin ve yumurtaların kör kenarını iyice sterilize edin.
- Sterilizasyondan sonra, embriyoyu açığa çıkarmak için yumurta kabuğu yüzeyinde küçük bir pencere (0,5 cm x 0,5 cm) oluşturmak için forseps ile künt uca hafifçe dokunun. Embriyo zarını çıkarın ve ardından yumurtayı diseksiyon mikroskobu altında tutucuya yerleştirin.
4. Enjeksiyon
- Mikroskop altında kan damarlarını arayın ve embriyoyu bulmak için diseksiyon mikroskobunun odağını ayarlayın ve ardından enjeksiyon için hazır kan damarını bulun.
- Cam iğneyi eksojen çözelti (plazmid, lentivirüs veya PGC'ler) ile yavaşça bir pipet kullanarak doldurun ve iğnedeki hava kabarcıklarını önleyin.
- İğneyi kan damarında eksojen çözelti ile, iğne enjekte edilen kan damarına paralel olarak hedefleyin.
- Doldurulmuş iğneyi yavaşça kabın içine yerleştirin ve çözeltiyi mikroskop altında çıkarmak için pompayı açın (genellikle enjekte edilen hacim ~ 1-5 μL'dir). Hava pompası basıncı, damarların tahrip olmasını önleyecek kadar düşük olmalıdır, çünkü aşırı yüksek hava basıncı, yüksek hızlı akışa yol açan kan damarlarına zarar verecektir.
- Eksojen çözelti kaba enjekte edildikten sonra, kabın renginin çözelti rengine dönüştüğünden ve eksojen çözeltinin kaba başarıyla verildiğini gösteren 2-5 s'de kırmızıya geri döndüğünden emin olun. Bu noktada çözelti artere girer ve kalbin atmasıyla birlikte arter yoluyla embriyoya ve daha sonra damara geri döner.
NOT: Vasküler enjeksiyon için iki enjeksiyon bölgesi vardır (Şekil 1B): Birincisi, eksojen çözeltinin embriyonun başındaki damardan ve kan akışı yoluyla kalbe enjekte edildiği, daha sonra kalp atışı ile tüm embriyoya dolaştığı kafadır (Şekil 1B, Ok 1). Bir diğeri embriyo kanının dorsal aortundan geçer; eksojen çözelti enjekte edilir ve tüm embriyoya yayılır (Şekil 1B. Ok 2) embriyonik kalbin atışı ile.
- Eksojen çözelti kaba enjekte edildikten sonra, kabın renginin çözelti rengine dönüştüğünden ve eksojen çözeltinin kaba başarıyla verildiğini gösteren 2-5 s'de kırmızıya geri döndüğünden emin olun. Bu noktada çözelti artere girer ve kalbin atmasıyla birlikte arter yoluyla embriyoya ve daha sonra damara geri döner.
- Enjeksiyondan sonra, yumurtayı stereo mikroskoptan çıkarın ve yumurta kabuğunun içine 200 μL Penisilin çözeltisi bırakın. 3 cm uzunluğunda bir tıbbi bant parçası kesin ve pencereyi kapatın. Hava kabarcıklarını sıkmak için bandı makasla yavaşça kazıyın ve ardından açıklığı kapatmak için başka bir parça kesin.
- Enjekte edilen yumurtayı etiketleyin ve inkübatöre geri yerleştirin ve gerekli gelişim aşamasına veya kuluçkaya kadar inkübe edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada tavuk embriyolarının in ovo intravasküler enjeksiyonunu gösteriyoruz. İntravasküler enjeksiyonun şematik bir süreci Şekil 1'de gösterilmiştir; Çalışmamızda, enjeksiyonu test etmek ve doğrulamak için çeşitli eksojen çözümler kullandık.
Enjekte edilen materyalleri daha iyi görselleştirmek için, Tripan Mavisi (% 0.4) embriyoya izleyici olarak enjekte edildi. İzleyicinin (mavi) dorsal aort veya kafa enjeksiyonu ile kan dolaşımı yoluyla tüm embriyoya yayıldığı gözlendi (Şekil 2). İki farklı bölgeye enjekte edilen materyaller, kan dolaşımı yoluyla difüzyonu gösteren tüm embriyoya yayılabildi. Mavi rengin görselleştirilmesi, enjeksiyonun başarısını doğrular.
pEGFP-N1 vektörü, 1 μg / μL'lik bir konsantrasyon elde etmek için PEI ile sarılırken, lentiviral vektör pLVX-EGFP PEI ile sarıldı ve 5 x 106 Tu / μL'lik bir virüs konsantrasyonu elde etmek için titrasyondan sonra seyreltildi. 4.5 günde (HH evre 24), embriyolar stereoskopik floresan mikroskopi kullanılarak gözlendi. Embriyoda enjeksiyon sonrası vektör ekspresyonunu gösteren yeşil floresan gözlendi. Sonuçlar, enjeksiyondan 2 gün sonra tavuk embriyosunda lipozomlar (PEI) ve paketlenmiş lentivirüs ile kapsüllenmiş plazmidlerin eksprese edildiğini göstermektedir (Şekil 3). Plazmid ve lentiviral vektör enjeksiyon sonuçları, embriyodaki eksojen gen ekspresyonunu kanıtladı ve gen transferinde olası uygulamayı ima etti.
PGC'ler embriyoların genital sırtından izole edildi (E4.5, HH evre 24) ve önceki yayın16'da olduğu gibi saflaştırma için kültürlendi. Enjekte edilen PGC'ler kırmızı floresan protein (RFP) ile etiketlendi. E6.0 günlerinde (HH evre 28), alıcı embriyoların gonadı izole edildi ve gözlendi. Sonuçlar, donör PGC'lerin (kırmızı noktalar) alıcının gonadlarına etkili bir şekilde girebildiğini ve kolonize edebildiğini göstermiştir (Şekil 4).
Şekil 1: İntravasküler enjeksiyonun şeması. (A) İntravasküler enjeksiyonun zaman çizelgesi; (B) Siyah oklarla gösterilen iki enjeksiyon bölgesi, baş (1) ve dorsal aort (2); (C) İntravasküler enjeksiyon işlemi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: İzleme boyasının farklı enjeksiyon bölgelerinde difüzyonu. Üst: dorsal aort; Alt: Baş. Ölçek çubuğu = 50 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Lentiviral vektör ve kapsüllenmiş plazmid enjeksiyonundan 2 gün sonra embriyolarda GFP ekspresyonu. Ölçek çubuğu = 100 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Alıcı tavuk embriyosunda enjekte edilen kırmızı floresan etiketli PGC'lerin görselleştirilmesi . (E6.0, HH evre 28) gonad. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tavuk embriyolarının in ovo intravasküler enjeksiyonu yöntemi, embriyoya aktarılacak eksojen materyaller (vektör, viral veya PGC'ler) için optimize edilmiştir. Bu yönteme dayanarak, kararlı gen aşırı ekspresyonu veya girişimi (SpinZ, JUN, UBE2I, vb.) 17,18,19. Bu köklü modeller bu yaklaşımın fizibilitesini kanıtlamaktadır. Ek olarak, izole PGC'leri sadece alıcının embriyo gonadına transfer etmekle kalmadık, aynı zamanda indüklenmiş PGC'lerle nakledilen embriyo gonadlı canlı yavruları da başarıyla ürettik, bu da bu yöntemin gelecekte büyük ölçüde uygulanması anlamına geliyor20.
Yöntemin kritik adımı enjeksiyondur. Eksojen materyaller doğrudan kan damarlarına enjekte edilmelidir, çok derin veya çok sığ olmamalıdır. Bu nedenle, tavuk embriyoları ile çalışma deneyimi ve uygulama yoluyla kolayca elde edilebilecek yüksek enjeksiyon becerileri gerektirir. Hava hücresi enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında, bu yöntem kullanılarak yüksek enjeksiyon etkinliği ve doğruluğu daha kolay elde edilir. Yüksek maliyet ve karmaşık adımların sınırlamalarına ek olarak, elektrotransfeksiyon, düşük bir hayatta kalma oranına yol açabileceğinden, büyük bir pencere yapıldığında uygulanmaz.
Tavuk embriyolarında gen manipülasyonu için bir yöntem olarak, yöntemin bazı sınırlamaları da vardır. Yumurtaların yaklaşık yarısı, enjeksiyondan sonra inkübasyon sırasında% 40-60 hayatta kalma oranıyla% 40 oranında öldü. Bu arada, doğum verimliliği, özellikle PGC enjeksiyonu için dikkate alınması gereken bir diğer önemli faktördür (bizim durumumuzda, plazmid ve lentivirüs enjeksiyonunun etkinliği ~% 50 -% 60 ve PGC enjeksiyonunun etkinliği ~% 30 -% 40'tır). Gelecekte, protokol optimize edilebilir ve hayatta kalma oranı önemli ölçüde artırılabilir, bu da bu yöntemin uygulama alanını daha da geliştirebilir.
Sonuç olarak, bu protokol, in ovo tavuk embriyosu intravasküler enjeksiyonunun, embriyolara aktarılacak eksojen materyaller (vektörler veya PGC'ler) için spesifik olduğunu göstermektedir. Üstelik bu yöntem birçok alanda kolaylıkla öğrenilebilir ve uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Herhangi bir çıkar çatışması ilan edilmedi.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31972547) tarafından desteklenmiştir. Jing Wang'ın metin editörlüğünü ve Malik Donlic'in Washington State Üniversitesi, ABD'deki seslendirmesini takdir ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164 (2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , Humana Press. New York, NY. 25-29 (2000).
- Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034 (2018).
- Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408 (2007).
- Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792 (2012).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628 (2017).
- van de Lavoir, M. -C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
- Ballantyne, M., et al. Avian primordial germ cells are bipotent for male or female gametogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 726827 (2021).
- Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
- Lee, H. J., et al. Targeted gene insertion into Z chromosome of chicken primordial germ cells for avian sexing model development. The FASEB Journal. 33 (7), 8519-8529 (2019).
- Han, J. Y., Lee, B. R. Isolation and characterization of chicken primordial germ cells and their application in transgenesis. Avian and Reptilian Developmental Biology: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 229-242 (2017).
- Naito, M., Harumi, T., Kuwana, T. Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaeric chickens. Animal Reproduction Science. 153, 50-61 (2015).
- Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Zhang, Z., et al. Crucial genes and pathways in chicken germ stem cell differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (21), 13605-13621 (2015).
- Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
- Shi, X., et al. HMGCS1 promotes male differentiation of chicken embryos by regulating the generate of cholesterol. All Life. 14 (1), 577-587 (2021).
- Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521 (2021).
- Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989 (2021).
