Summary
MALDI-TOF用于表征从氧化RNA和外切核糖核酸酶Xrn-1之间的反应性中获得的片段。本方案描述了一种可应用于涉及RNA和/或DNA的其他过程的方法。
Abstract
RNA是存在于生命所有领域的生物聚合物，它与其他分子和/或反应物质（例如DNA，蛋白质，离子，药物和自由基）的相互作用无处不在。结果，RNA经历各种反应，包括其分裂，降解或修饰，导致具有不同功能和含义的生物学相关物种。一个例子是鸟嘌呤氧化成7，8-二氢-8-氧代嘌呤（8-氧代嘌呤），这可能在活性氧（ROS）存在下发生。总体而言，表征此类产品和转化的程序对科学界来说非常有价值。为此，基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱是一种广泛使用的方法。本方案描述了如何表征酶处理后形成的RNA片段。所选择的模型使用RNA和核糖核酸外切酶Xrn-1之间的反应，其中酶消化在氧化位点停止。 通过 固相合成获得两个20核苷酸长RNA序列[5'-CAU GAA ACA A（8-oxoG）G CUA AAA GU]和[5'-CAU GAA ACA A（8-oxoG）（8-oxoG）CUA AAA GU]，通过紫外可见光谱定量， 并通过 MALDI-TOF进行表征。然后将获得的链（1）5'-磷酸化 并通过 MALDI-TOF表征;（2）用Xrn-1处理;（3）过滤脱盐;（4） 通过 MALDI-TOF进行分析。该实验装置明确鉴定了与Xrn-1失速相关的片段：[5'-H2PO4-（8-oxoG）G CUA AAA GU]，[5'-H2PO4-（8-oxoG）（8-oxoG）CUA AAA GU]和[5'-H2PO4-（8-oxoG）CUA AAA GU]。所描述的实验是用200皮摩尔RNA（20 pmol用于MALDI分析）进行的;然而，较低的量可能会导致光谱仪使用比本工作中使用的功率更大的激光源来检测峰。重要的是，所描述的方法可以推广，并可能扩展到涉及RNA和DNA的其他过程的产物鉴定，并可能有助于表征/阐明其他生化途径。
Introduction
MALDI-TOF1，2，3 是一种广泛使用的技术，用于表征和/或检测不同大小和特征的分子。它的一些用途包括各种应用，例如检测自然资源4中的单宁，对食品中的代谢物进行成像5，发现或监测细胞药物靶标或标志物6，以及临床诊断7，仅举几例。与本工作相关的是将MALDI-TOF与DNA或RNA一起使用，其在寡核苷酸上的使用可以追溯到三十多年前8，其中注意到了几个局限性。该技术现已发展成为一种可靠的常用手段，用于表征生物聚合物9 并鉴定/理解化学和生化反应，例如，表征RNA10中的铂化位点，鉴定链裂解11，12后的RNA片段或蛋白质 - DNA交联的形成13.因此，说明和突出显示使用此技术的重要方面是有价值的。MALDI-TOF的基础知识也以视频格式进行了描述， 本文将不再赘述。此外，其在DNA或蛋白质上下文中的应用先前已以所述格式15，16，17描述和说明。
本文报道了用于检测酶水解后形成的RNA片段的方案。该实验模型是根据我们第18组最近发表的一项发现选择的，其中MALDI-TOF用于确定含有氧化病变8-oxoG的RNA的外切核糖核酸Xrn-1和寡核苷酸之间的独特反应性。 通过 固相合成19，[5'-CAU GAA ACA A（8-oxoG）G CUA AAA GU]和[5'-CAU GAA ACA A（8-oxoG）（8-oxoG）CUA AAA GU]获得20-核苷酸长链，而Xrn-1则按照先前描述的报告20表达和纯化。简而言之，Xrn-121 是一种5'-3'外切核糖核酸酶，具有各种关键的生物学作用，可降解多种类型的RNA，包括氧化RNA22。结果表明， 8-oxoG时酶的合成能力失速， 导致RNA片段含有5'-磷酸化末端[5'-H2PO4-（8-oxoG）G CUA AAA GU]，[5'-H2PO4-（8-oxoG）CUA AAA GU]和[5'-H2PO4-（8-oxoG）CUA AAA GU]18.
最后，重要的是要注意质谱是一种强大的方法，通过各种方法，可以适应其他目的23，24;因此，选择正确的电离方法以及其他实验设置至关重要。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本研究采用不含RNase的超纯水（表1）。
1. RNA溶液的浓度测定
- 按照以下步骤制备RNA样品。
- 使用微量离心管（0.6 mL）通过将1μL储备溶液（ 通过 固相合成获得）19稀释到159μL 无RNase H2O中来制备RNA溶液。通过将混合物反复上下移液（10x）来混合溶液。
注意：由于市面上有各种各样的比色皿，因此所需的体积可能会有所不同。这项工作使用了具有1 cm通透长和体积减小（150μL）的比色皿。 - 用甲醇（2x）冲洗UV-vis比色皿，然后用水（超纯H2O，3x，见 材料表）冲洗。使用氮气流彻底干燥比色皿。
- 使用移液器将溶液（步骤1.1.1）转移到比色皿中，确保没有气泡。盖上比色皿，将其放在一边，直到需要。
- 使用微量离心管（0.6 mL）通过将1μL储备溶液（ 通过 固相合成获得）19稀释到159μL 无RNase H2O中来制备RNA溶液。通过将混合物反复上下移液（10x）来混合溶液。
- 使用紫外可见分光光度计测定制备的RNA溶液的浓度。
- 通过翻转仪器背面的开关打开紫外可见分光光度计。允许仪器完成启动过程，然后单击 UV WinLab 图标以打开仪器操作/控制窗口。
- 使用仪器右侧的开关打开 帕尔贴温度控制器 分光光度计。
- 在 基本方法下，单击 扫描 - Lambda 365。将打开另一个屏幕，提示用户确保电池座为空。单击 “确定” 并允许仪器进行系统检查。然后，系统将显示检查列表，确保所有“通过”并单击 “确定”。
注：建议按提供的顺序执行步骤1.2.1-1.2.3;更改此事件序列可能会导致软件故障。 - 通过选择 数据收集来调整扫描参数。在新窗口中的 “扫描设置” 下，将 “开始” 更改为 350 nm ，将 “结束” 更改为 215 nm。
- 通过选择附件左侧的 + 来激活珀尔帖。单击多细胞帕尔贴，将温度°C更改为25，然后单击帕尔贴开。
- 导航到“ 样本信息 ”选项卡，然后根据需要输入样本数量、名称和单元格位置。
- 单击 “自动归零 ”并插入包含背景解决方案的比色皿。确保将此比色皿放置在将要进行测量的同一插槽中。
- 单击“ 开始” 并将比色皿（步骤1.1.3）插入所需的单元格中。确保比色皿窗口的方向平行于仪器的正面。单击 “确定” 开始在25°C下进行第一次扫描。
- 对于较高温度下的测量，重复步骤1.2.5-1.2.8并将温度更改为所需的样品温度（在本例中为90°C）。
- 单击 “文件>导出 ”，然后选择所需的文件位置。选择“ XY 数据 ”以获取.txt文件。
注：步骤 1.2 的说明性帮助可在 补充文件 1 （S1-S7 ） 中找到。
- 执行数据采集以确定RNA浓度。
- 在结果选项卡下找到每个频谱 的文件 。要获得吸光度，请将鼠标悬停在该线上，导航到260 nm，然后记录显示的吸光度。或者，通过 “文件>导出 ”级联，将数据导出为.txt文件，以便使用其他绘图软件进行进一步的图形分析。
注意：如果0.1- 使用比尔-朗伯定律计算溶液的浓度。
注：啤酒定律：A = εcl，其中：
答：吸光度（在本例中为 260 nm，从步骤 1.3.1 开始）
ε：消光系数。对于本文中使用的序列，208，000 L mol-1 cm-1 是从寡核苷酸分析器工具获得的值。
l： 路径长度，1 厘米
c：样品的浓度- 使用这些计算来制备用于后续实验的所需RNA溶液。本研究使用[RNA]= 200μM的溶液。
- 使用比尔-朗伯定律计算溶液的浓度。
- 在结果选项卡下找到每个频谱 的文件 。要获得吸光度，请将鼠标悬停在该线上，导航到260 nm，然后记录显示的吸光度。或者，通过 “文件>导出 ”级联，将数据导出为.txt文件，以便使用其他绘图软件进行进一步的图形分析。
2. Xrn-1水解RNA寡核苷酸
- 按照以下步骤进行5'RNA磷酸化。
- 使用0.6 mL微量离心管制备以下溶液（50μL总体积）。
- 加入不含RNA酶的H2O（33.5μL）;体积可能因 [RNA] 而异。
- 然后，加入溶液A（5升， 表1）。
- 加入三磷酸腺苷（ATP，见 材料表）的水溶液（6 L，10mM，60 nmol）。
- 加入RNA水溶液（1μL，200μM，200 pmol）。
- 加入多核苷酸激酶（PNK酶，见 材料表）溶液（4.5L，45单位）。通过上下移液混合物（10x）轻轻混合。
- 通过将反应混合物置于水浴中，在37°C下孵育45分钟。
- 通过将反应管置于预热的加热块（65°C）中并将溶液孵育10分钟来灭活酶。
- 让溶液冷却到室温（ 通过 MALDI-TOF分析表征RNA磷酸化，参见代表性结果）以产生最终的5'-磷酸化RNA溶液（4μM，50μL）。
- 使用0.6 mL微量离心管制备以下溶液（50μL总体积）。
- 按照以下步骤通过Xrn-1进行RNA水解。
- 使用步骤2.1.4中的溶液（50μL），执行以下步骤。
- 加入溶液B（5升， 表1）。
- 加入Xrn-1（0.5 L，1ng，30 fmol）的溶液。通过轻轻地上下移液（10x）来混合溶液。
- 将反应管在室温下孵育2小时。
- 将反应混合物（步骤2.2.1.3）转移到10 kDa孔径离心装置中（参见 材料表），并通过离心（室温下700× g 10分钟）过滤酶。
- 将滤液转移到0.6 mL离心管中。
- 通过加入不含RNase的H 2 O（20 L）在离心管上洗涤残留RNA（步骤2.2.2），然后离心（700× g 在室温下10分钟）。
- 将滤液与步骤2.2.3中获得的滤液合并。
- 将含有所得溶液的管子储存在冰箱（0°C）或运输中进行分析。
- 使用步骤2.1.4中的溶液（50μL），执行以下步骤。
3. RNA溶液脱盐，MALDI-TOF板点
- 使用市售的阳离子交换C18移液器吸头对样品进行脱盐和浓缩（参见 材料表）。
- 将 10 L C18 移液器吸头（移液器吸头装载有固定在其末端的 C18 色谱培养基床）置于 10 μL 移液器上，然后继续执行以下操作：
- 用50%乙腈水溶液（10μL）洗涤C18尖端两次。每次将用过的体积丢弃到单独的废液管中。
- 用三氟乙酸水溶液（0.1%TFA，10μL）平衡C18尖端两次。每次将用过的体积丢弃到单独的废液管中。
- 手动从移液器中取出C18吸头，并将其固定在含有P200移液器吸头的200μL移液器上（C18吸头现在将连接到P200移液器吸头上）。
- 将C18尖端浸入溶液中（步骤2.2.6），并通过C18尖端吸出溶液十次。
注意：RNA样品与尖端内的阳离子交换树脂结合。 - 从P200移液器上取下C18吸头，并将其置于10μL移液器上。
- 使用0.1%TFA（10μL）的水溶液洗涤C18尖端两次。每次将用过的体积丢弃到单独的废液管中。
- 用无RNase的水（10μL）洗涤C18尖端两次。每次将用过的体积丢弃到单独的废液管中。
- 将 10 L C18 移液器吸头（移液器吸头装载有固定在其末端的 C18 色谱培养基床）置于 10 μL 移液器上，然后继续执行以下操作：
- 按照以下步骤对准 MALDI 板。
- 通过将样品浸入所需的基质（10μL，C和D的1：1：1溶液， 表1）中，从C18尖端（步骤3.1.1.7）洗脱RNA寡核苷酸，然后将溶液分配回管中。重复此过程十次。
- 将溶液从3.2.1移液到板上的两个独立点上（每个1μL，20 pmol）。让斑点风干（图1A 和 视频1）。
注意：此过程可以在同一点上重复，以增加每个点上的样品浓度。 - 移液器所需的校准剂（1 L）在物理上靠近样品位置的两个独立点上，并使其风干。
注：本研究中使用的测试标准是从商业来源获得的（见 材料表）。 - 用所需的基质（1 L）覆盖[完全干燥的]校准剂。让其风干。
注意：在插入仪器之前，跟踪样品和校准剂被发现的位置非常重要。使用板坐标系对此进行记下，例如，样品 1 位于位置 （C，3）
4. 数据采集和处理
注：一般来说，THAP需要更高的激光功率才能实现电离。此外，寡核苷酸很难在没有碎裂的情况下电离。因此，通常需要使用尽可能低的激光功率，并提高探测器增益和/或较低的激光频率，以最大限度地提高检测率并最大限度地减少碎片。
- 按照以下步骤执行数据采集。
注意：分子量测量是使用质谱仪进行的（参见 材料表）在正离子下，线性模式，离子源电压为20 kV，检测器增益约为2.8 kV，激光频率为20 Hz。这些被计算并表示为超过电荷的质量（m / z），其中电荷为1。使用蛋白质校准混合物进行外部校准（细菌测试标准，参见 材料表） 在与样品相邻的点上。然后在flexAnalysis软件中处理原始数据（请参见 材料表).- 打开“Flexcontrol软件”进行操作。按下仪器的绿色 输入/输出 按钮，等待目标载物台移动，然后吸尘排空。打开盖子，将完全干燥的目标板放入仪器中。确保以正确的方向对齐（图1B）。
- 轻轻放下盖子，然后按绿色的 入/出 按钮。等待板缩回，仪器重新抽取。一旦状态栏（软件窗口的右下角）反映“就绪”，请继续校准。
- 要使用该软件校准仪器，请执行以下操作。
- 通过单击“ 文件”>“选择方法” 或按加载的方法旁边的 “选择” 按钮来选择所需的方法。单击校准点的 坐标 。导航到“ 校准 ”选项卡，确认选择了正确的校准剂。确保 随机游走 已关闭（在 “样本载波 ”选项卡中）。
- 按 “开始” 并手动将激光沿晶体方向定向（在相机视图中的所需位置单击鼠标箭头）。如有必要，调整激光功率。对设置感到满意后，按 Start 键 收集光谱并将其添加到总和缓冲区。
- 将光谱添加到总和中，直到达到足够的强度。切换为仅查看总和缓冲区、减去基线和平滑。然后单击“ 自动分配”。检查每个分配的峰值并注意 ppm 错误。如果对分配和错误感到满意，请单击“ 应用”。
- 清除总和缓冲区并导航到第一个样本的位置。
- 确认所需的扫描范围（“检测”选项卡）。调整“质量范围”中的条形，使绿色区域代表预期质量。
- 直接单击 “放大倍率 ”窗口，使十字准线朝向所需的结晶片段（较大的晶体通常产生最佳结果， 图2）。
- 沿着大晶体收集一些光谱，根据需要调整激光功率。正确的设置是比出现峰值的功率高 5%-10%。
- 要获取光谱，请执行以下操作。
- 单击“ 开始 ”以观察激光闪光与增加的光谱强度（显示在右上角的窗口中）通过单击鼠标箭头在晶体上下移动晶体的长度，沿晶体的长度移动激光器（视频 2）。
- 单击“开始”正下方的“添加”。
- 重复此操作几次，直到达到所需的强度/拍摄次数（反映在光谱窗口的y轴上）
- 如果初始扫描不满意，调整激光功率和/或速度和/或检测器增益。根据需要重复步骤 4.1.4.1-4.1.4.3。
- 如果对频谱感到满意，请单击“ 另存为 ”以以指定名称保存频谱。然后，如果需要其他示例，请单击“ 清除总 和”并重复步骤 4.1.4 下的步骤。
- 执行数据处理。
注意：步骤 4.2 描述了一种使用 flexAnalysis 软件分析数据的方法。- 打开所需的软件。然后，通过选择“ 文件”打开频谱 （a）。从下拉菜单中，选择“ 打开”。
- 将显示一个新窗口。单击“ 浏览 ”以找到从步骤 4.1.4 保存的文件。选中所需文件的框，然后单击左侧的“ 打开 ”。如果只有单个频谱需要分析，只需将文件拖放到软件窗口中即可。
- 突出显示加载的文件以进行批量分析。导航到工具栏上的“ 进程 ”选项卡。在下拉列表中，选择减去 质谱基线。
注意：用于减法的算法将由步骤4.1.3中选择的方法确定。 - 导航到工具栏上的“ 进程 ”选项卡。在下拉列表中，选择 平滑质谱。
注意：用于平滑的算法将由步骤 4.1.3 中选择的方法确定。 - 点击 群发列表 标签;在下拉列表中，选择“ 查找”。此命令自动标记峰值及其质量;群众列表将显示在右侧的屏幕上。
- 若要添加或删除峰值，请转到“ 质量列表 ”选项卡。在下拉列表中，单击“ 编辑”。
- 将鼠标悬停在光谱的x轴上;垂直线表示光标所在的频谱的位置。
注意：当可以通过单击添加新质量时，将出现带有图形和光标的图标。将鼠标悬停在可通过单击删除的峰值上时，将显示此图标（请参阅 补充文件 1 中的步骤 4.2.7）。 - 重复步骤 4.1.3-4.1.7 以获取更多光谱。通过单击并拖动以突出显示左侧的文件来导出所有光谱的质量列表，然后执行以下菜单级联 文件>将>质量列表导出到Excel。
- 要导出屏幕上显示的光谱，请截取屏幕截图或将其导出为报告。对于后者，请导航到“ 报告 ”菜单。在下拉列表中，选择 另存为 PDF。
注意：可以使用光谱下方的三个选项卡和/或改变突出显示的文件来更改光谱的显示方式。将弹出一个屏幕。根据需要命名PDF文档，调整设置/布局，然后单击“ 保存 ”以生成光谱图像。 - 生成的图像将反映软件程序中的光谱视图。要操作视图，请执行以下操作。
- 放大：点按工具栏中的“ 放大 ”按钮。
- 将鼠标悬停在 x 轴上并单击，直到达到所需的范围。
- 缩小/撤消：单击“ 缩小 ”按钮，然后单击光谱中的任意位置以返回到完整视图。
注：步骤 4.1 和 4.2 的说明性辅助工具可在 补充文件 1 中找到（分别为 S8-S23 和 S24-S30 页）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
本工作中使用的寡核苷酸在使用前被合成，表征和定量。所有寡核苷酸的浓度 通过 在90°C下记录的紫外可见光谱测定，以避免因二级结构的潜在形成而产生的错误读数。 图3 显示了本工作中使用的RNA的模型寡核苷酸的光谱，在室温下和加热后拍摄。
整个过程以及导致Xrn-1失速的氧化病变的结构如图 4所示。寡核苷酸（1）在位置-11处含有一个8-oxoG，并且是Xrn-1活性被阻断的地方，导致RNA链停止水解。重要的是，该图中描述的结果对应于使用含有200 pmol母链（1）的溶液进行的实验，尽管在板上仅发现了20 pmol。重要的是要注意，在所有计算中使用了平均质量，并且观察到1-3个原子质量单位（amu）之间的差异。该图显示了两个过程，（1）RNA的高效5'-磷酸化，仅出现一个对应于预期产物的峰（1'），以及（2）用Xrn-1处理样品混合物而产生的失速片段。 核糖核酸酶（Xrn-1）与 图4 所示（RNA链1）没有差异。
使用包含两个氧化病变的不同序列（3）获得相同的结果（图5）。相应的磷酸化和酶降解产生了两种主要产物，表明该酶在含有8-oxoG的两个位点连续停滞。如对应于感兴趣片段的质谱中所述，在不同日期采集相同寡核苷酸的光谱时，观察到MALDI-TOF采集的差异。 如图4所示，其中观察到了两个额外的原子单元。该图中描述的结果对应于用100 pmol母链（3）进行的实验。重要的是要注意，通过在酶降解之前和之后对样品引入内部标准，可以获得定量数据来评估生化过程的整体效率（ 并通过 MALDI-TOF进行完整跟踪）。
图1：RNA溶液的斑点。 （A）斑点到MALDI板上。（B） 将MALDI板放置在MALDI光谱仪上的图示。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：相机拍摄，说明了样品的形成：在板上发现的基质晶体。请单击此处查看此图的放大版本。
图 3：分别在 25 °C 和 90 °C 下记录的寡核苷酸 （1） 和 （3） 的紫外-可见光谱。请点击此处查看此图的大图。
图4：寡核苷酸制备的实验过程和每个步骤的质谱。 （A）使用寡核苷酸的总体步骤（1）如图所示。事件序列对应于（B）在多核苷酸激酶（PNK）存在下5'-磷酸化，然后在Xrn-1存在下进行（C）酶水解。显示了在两个生化过程之前和之后获得的MALDI-TOF光谱。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：使用寡核苷酸 （3） 在 Xrn-1 处理之前（左）/之后（右）获得的 MALDI-TOF 谱。请单击此处查看此图的大图。
| 溶液 | 组成 | ||
| 一个 | 盐酸三酯 （700 mM）， DTT （50 mM）， pH 7.6， T4 多核苷酸激酶缓冲液 | ||
| B | 氯化钠（1 M），三盐酸（0.5 M），MgCl2 （0.1 M），DTT（10 mM），pH 7.9 | ||
| C | 2，4，6-二羟基苯乙酮一水合物（THAP，25 mM），柠檬酸铵（10 mM） | ||
| D | 氟化铵（300 mM，含 50% 乙腈） | ||
| 无RNA酶 H2O | 用焦碳酸二乙酯（DEPC，每升水1mL）处理超纯水，在37°C（12小时）下孵育并高压灭菌（1小时） | ||
表1：研究中使用的溶液组合物。
视频 1：在 MALDI 板上发现情况的演示。请点击此处下载此视频。
视频 2：概述数据分析的演示。请点击此处下载此视频。
补充文件1：处理紫外可见分光光光度计软件（步骤1.2）、MS数据采集（步骤4.1）和MS数据处理（步骤4.2）的分步说明。请点击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
该工作流程中的主要挑战出现在完成实验和进行质谱分析之间。实验在科罗拉多大学丹佛分校进行并完成，并（一夜之间）运往科罗拉多州立大学的设施。根据方便，在收到数据后进行数据采集。一些意外情况导致该过程的时间延迟。在一种情况下，意外的仪器故障要求样品在发现和采集之前被冷冻（一次21天）;然而，这种时间延迟似乎并不影响实验结果，尽管不能排除RNA的降解（导致信号强度降低）。
所描述的实验的局限性，就RNA浓度而言，是用高于 体内可获得的RNA的[RNA]进行，对于单个RNA序列23，24。我们发现，当用20 pmol的RNA（2 pmol点缀在板上）或更低的量进行实验时，没有观察到预期的峰。使用具有改进的激光功率的光谱仪可能会导致信号增强和检测限降低。
预计可以避免过滤酶（使用10 kDa过滤装置）以分离酶的步骤。在没有此步骤的情况下进行的实验导致了类似的结果。但是，如果要运输样品或储存一段时间，则建议进行过滤步骤。
提供的步骤可能适合表征和理解几种生化过程。实例可以包括涉及受损DNA25、肽26、27或RNA偶联物28的过程的表征，等等。一般而言，我们推测本文所示的过程可能适用于涉及核酸，蛋白质，生物材料和/或其他生物聚合物的各种实验设置。此外，增强型光谱仪的开发将在涉及上述生物分子的领域带来增强的结果和重要发现。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
值得注意的是，这项工作是三个机构，两个研究小组和一个核心设施之间的合作努力。分布和工作量如下进行：蛋白质（Xrn-1）表达在丹佛大学（科罗拉多州丹佛市）进行。寡核苷酸的合成，定量和实验（主要是酶降解）在科罗拉多大学丹佛分校（科罗拉多州丹佛市）进行。那里也进行了优化。MALDI-TOF发现，采集和分析在科罗拉多州立大学的分析资源核心设施中进行。（科罗拉多州柯林斯堡）。SS希望感谢UROP奖（CU Denver）和Eureca赠款（CU Denver）的支持。E. G.C. 通过 R00GM115757 感谢 NIGMS 的支持。MJER 通过 1R15GM132816感谢NIGMS的支持。K.B. 确认资源 ID： SCR_021758。这项工作还得到了亨利·德雷福斯基金会（Henry Dreyfus Foundation）的教师学者奖（MJER）TH-21-028的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
References
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
- Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73 (2003).
- Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516 (2021).
- Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
- Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
- Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
- Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
- Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
- Chapman, E. G., DeRose, V. J.
- Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
- Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).
- Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2021).
- Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).
- Su, K. -Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).
- Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).
- Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).
- Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).
- Langeberg, C. J., et al.
- Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
- Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).
- Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
- Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).
- Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
- Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
- Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521 (2022).
- Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).
