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Biochemistry

Identificación de fragmentos de ARN resultantes de la degradación enzimática mediante espectrometría de masas MALDI-TOF

Published: April 11, 2022 doi: 10.3791/63720
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 1
1Department of Chemistry, University of Colorado, Denver, 2Department of Chemistry & Biochemistry, University of Denver, 3Analytical Resources Core Bioanalysis & Omics, Colorado State University

Summary

MALDI-TOF se utilizó para caracterizar fragmentos obtenidos de la reactividad entre el ARN oxidado y la exoribonucleasa Xrn-1. El presente protocolo describe una metodología que puede aplicarse a otros procesos que involucran ARN y/o ADN.

Abstract

El ARN es un biopolímero presente en todos los dominios de la vida, y sus interacciones con otras moléculas y / o especies reactivas, por ejemplo, ADN, proteínas, iones, medicamentos y radicales libres, son omnipresentes. Como resultado, el ARN sufre varias reacciones que incluyen su escisión, degradación o modificación, lo que lleva a especies biológicamente relevantes con distintas funciones e implicaciones. Un ejemplo es la oxidación de la guanina a 7,8-dihidro-8-oxoguanina (8-oxoG), que puede ocurrir en presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS). En general, los procedimientos que caracterizan tales productos y transformaciones son en gran medida valiosos para la comunidad científica. Con este fin, la espectrometría de masas de tiempo de vuelo por ionización por láser asistida por matriz (MALDI-TOF) es un método ampliamente utilizado. El presente protocolo describe cómo caracterizar los fragmentos de ARN formados después del tratamiento enzimático. El modelo elegido utiliza una reacción entre el ARN y la exoribonucleasa Xrn-1, donde la digestión enzimática se detiene en los sitios oxidados. Dos secuencias largas de ARN de 20 nucleótidos [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] y [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] se obtuvieron mediante síntesis en fase sólida, cuantificadas por espectroscopia UV-vis, y caracterizadas mediante MALDI-TOF. Las hebras obtenidas fueron entonces (1) 5'-fosforiladas y caracterizadas vía MALDI-TOF; (2) tratado con Xrn-1; (3) filtrado y desalinizado; (4) analizado vía MALDI-TOF. Esta configuración experimental condujo a la identificación inequívoca de los fragmentos asociados con el estancamiento de Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], y [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Los experimentos descritos se llevaron a cabo con 200 picomoles de ARN (20 pmol utilizados para los análisis MALDI); sin embargo, cantidades más bajas pueden resultar en picos detectables con espectrómetros que utilizan fuentes láser con más potencia que la utilizada en este trabajo. Es importante destacar que la metodología descrita puede generalizarse y potencialmente extenderse a la identificación de productos para otros procesos que involucran ARN y ADN, y puede ayudar en la caracterización / elucidación de otras vías bioquímicas.

Introduction

MALDI-TOF 1,2,3 es una técnica ampliamente utilizada para la caracterización y/o detección de moléculas de diferentes tamaños y características. Algunos de sus usos incluyen diversas aplicaciones como la detección de taninos de recursos naturales4, la obtención de imágenes de metabolitos en alimentos5, el descubrimiento o monitoreo de dianas o marcadores celulares de fármacos6, y el diagnóstico clínico7, por nombrar algunos. De relevancia para el presente trabajo es el uso de MALDI-TOF con ADN o ARN, con su uso en oligonucleótidos que se remonta a más de tres décadas8, donde se observaron varias limitaciones. Esta técnica ahora ha evolucionado a un medio confiable y comúnmente utilizado para caracterizar ambos biopolímeros9 e identificar / comprender reacciones químicas y bioquímicas, por ejemplo, caracterización de sitios platinados en ARN10, identificación de fragmentos de ARN después de la escisión de la hebra11,12, o formación de enlaces cruzados proteína-ADN13 . Por lo tanto, es valioso ilustrar y resaltar aspectos importantes del uso de esta técnica. Los conceptos básicos de MALDI-TOF se han descrito en formato de video también14 y no se desarrollarán más en este documento. Además, su aplicación en un contexto de ADN o proteína ha sido previamente descrita e ilustrada en dicho formato 15,16,17.

El protocolo para detectar fragmentos de ARN formados después de la hidrólisis enzimática se informa aquí. El modelo experimental fue elegido en base a un hallazgo reciente publicado por nuestro grupo18, donde se utilizó MALDI-TOF para determinar la reactividad única entre la exoribonucleasa Xrn-1 y los oligonucleótidos de ARN que contienen la lesión oxidativa 8-oxoG. Las hebras largas de 20 nucleótidos se obtuvieron mediante síntesis en fase sólida19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] y [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], mientras que Xrn-1 se expresó y purificó siguiendo el informe20 descrito anteriormente. En resumen, Xrn-121 es una exoribonucleasa 5'-3' con varias funciones biológicas clave que degradan múltiples tipos de ARN, incluido el ARNoxidado 22. Se encontró que la procesividad de la enzima se detiene al encontrarse con 8-oxoG, lo que llevó a fragmentos de ARN que contienen extremos 5'-fosforilados [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], y [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.

Finalmente, es importante señalar que la espectrometría de masas es un método poderoso que, a través de diversas metodologías, puede adaptarse a otros fines23,24; por lo tanto, elegir el método de ionización correcto, así como otra configuración experimental es de suma importancia.

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Protocol

Para el presente estudio se utilizó agua ultrapura libre de RNasa (Tabla 1).

1. Determinación de la concentración de la solución de ARN

  1. Prepare la muestra de ARN siguiendo los pasos a continuación.
    1. Utilice un tubo de microcentrífuga (0,6 ml) para preparar una solución de ARN diluyendo 1 μL de solución madre (obtenida mediante síntesis en fase sólida)19 en 159 μL de H2O sin RNasa. Mezcle la solución canalizando la mezcla hacia arriba y hacia abajo repetidamente (10x).
      NOTA: Dado que una amplia gama de cubetas están disponibles comercialmente, los volúmenes necesarios pueden diferir. En este trabajo se utilizaron cubetas con una longitud de trayectoria de 1 cm y un volumen reducido (150 μL).
    2. Enjuague la cubeta UV-vis con metanol (2x), seguido de agua (ultrapuro H2O, 3x, ver Tabla de Materiales). Use un flujo de gas nitrógeno para secar bien la cubeta.
    3. Utilice una pipeta para transferir la solución (paso 1.1.1) a la cubeta, asegurándose de que no haya burbujas de aire. Tapa la cubeta y colócala a un lado hasta que sea necesario.
  2. Determine la concentración de la solución de ARN preparada utilizando el espectrofotómetro UV-vis.
    1. Encienda el espectrofotómetro UV-Vis accionando el interruptor situado en la parte posterior del instrumento. Permita que el instrumento complete el procedimiento de inicio y haga clic en el icono UV WinLab para abrir la ventana de operación/control del instrumento.
    2. Encienda el espectrofotómetro Peltier Temperature Controller con el interruptor situado a la derecha del instrumento.
    3. En Métodos base, haga clic en Escanear - Lambda 365. Se abrirá otra pantalla y se le pedirá al usuario que se asegure de que los soportes de las celdas estén vacíos. Haga clic en Aceptar y permita que el instrumento realice las comprobaciones del sistema. El sistema mostrará una lista de comprobaciones, se asegurará de que todos los "Pase" y haga clic en Aceptar.
      NOTA: Se recomienda seguir los pasos 1.2.1-1.2.3 en el orden proporcionado; la alteración de esta secuencia de eventos puede provocar un mal funcionamiento del software.
    4. Ajuste los parámetros de escaneo seleccionando Recopilación de datos. En la nueva ventana , en Configuración de análisis , cambie inicio a 350 nm y fin a 215 nm.
    5. Active el Peltier seleccionando el + a la izquierda del Accesorio. Haga clic en Multiple Cell Peltier, cambie la temperatura °C a 25 y haga clic en Peltier On.
    6. Desplácese hasta la ficha Información de muestra e introduzca el número de muestras, nombres y posición de celda como desee.
    7. Haga clic en Autozero e inserte la cubeta que contiene la solución de fondo. Asegúrese de colocar esta cubeta en la misma ranura donde se realizarán las mediciones.
    8. Haga clic en Inicio e inserte la cubeta (paso 1.1.3) en la celda deseada. Asegúrese de que la ventana de la cubeta esté orientada paralelamente a la cara frontal del instrumento. Haga clic en Aceptar para comenzar el primer escaneo a 25 °C.
    9. Para mediciones a temperaturas más altas, repita los pasos 1.2.5-1.2.8 y cambie la temperatura a la temperatura de muestra deseada (90 °C en el presente caso).
    10. Haga clic en Archivo > Exportar y elija la ubicación del archivo deseado. Seleccione Datos XY para obtener un archivo .txt.
      NOTA: Una ayuda ilustrativa del paso 1.2 se puede encontrar en el Archivo Complementario 1 (S1-S7).
  3. Realizar la adquisición de datos para determinar la concentración de ARN.
    1. Busque el archivo para cada espectro en la pestaña Resultados . Para obtener la absorbancia, sitúe el cursor sobre la línea, navegue hasta 260 nm y registre las absorbancias mostradas. Alternativamente, a través de la cascada File > Export , exporte los datos como un archivo .txt para un análisis gráfico adicional utilizando otro software de trazado.
      NOTA: Si 0,1 < A ≥ 1, será necesario diluir o aumentar la concentración de la muestra de ARN preparada en la etapa 1.1.1.
    2. Utilice la ley de Beer-Lambert para calcular la concentración de la solución.
      NOTA: Ley de la cerveza: A = εcl, donde:
      A: Absorbancia (a 260 nm en este caso, a partir del paso 1.3.1)
      ε: Coeficiente de extinción. Para la secuencia utilizada en este documento, 208,000 L mol-1 cm-1 es el valor obtenido de una herramienta OligoAnalyzer.
      l: Longitud del camino, 1 cm
      c: concentración de la muestra
    3. Utilice estos cálculos para preparar la solución deseada de ARN que se utilizará en experimentos posteriores. En el presente estudio se utilizaron soluciones con [ARN] = 200 μM.

2. Hidrólisis de oligonucleótidos de ARN por Xrn-1

  1. Realice una fosforilación de 5' de ARN siguiendo los pasos a continuación.
    1. Utilice un tubo de microcentrífuga de 0,6 ml para preparar la siguiente solución (volumen total de 50 μL).
      1. Añadir H2O sin RNasa (33,5 μL); los volúmenes pueden variar dependiendo de [ARN].
      2. Luego, agregue la solución A (5 L, Tabla 1).
      3. Añadir una solución acuosa de trifosfato de adenosina (ATP, ver Tabla de Materiales) (6 L, 10 mM, 60 nmol).
      4. Añadir solución acuosa de ARN (1 μL, 200 μM, 200 pmol).
      5. Añadir solución de polinucleótido quinasa (enzima PNK, ver Tabla de Materiales) (4.5 L, 45 unidades). Mezclar suavemente pipeteando la mezcla hacia arriba y hacia abajo (10x).
    2. Incubar la mezcla de reacción a 37 °C durante 45 min colocándola en un baño de agua.
    3. Inactivar la enzima colocando el tubo de reacción en un bloque de calor precalentado (65 °C) e incubando la solución durante 10 min.
    4. Permita que la solución se enfríe a temperatura ambiente (la fosforilación de ARN se caracterizó mediante el análisis MALDI-TOF, consulte resultados representativos) para producir una solución final de ARN fosforilada de 5'(4 μM, 50 μL).
  2. Realice la hidrólisis de ARN por Xrn-1 siguiendo los pasos a continuación.
    1. Utilizando la solución (50 μL) del paso 2.1.4, lleve a cabo los siguientes pasos.
      1. Añadir la solución B (5 L, Tabla 1).
      2. Añadir una solución de Xrn-1 (0,5 L, 1 ng, 30 fmol). Mezcle la solución canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo (10x).
      3. Incubar el tubo de reacción a temperatura ambiente durante 2 h.
    2. Transfiera la mezcla de reacción (paso 2.2.1.3) a un dispositivo centrífugo de 10 kDa del tamaño de un poro (consulte la Tabla de materiales) y filtre las enzimas mediante centrifugación (700 x g durante 10 min a temperatura ambiente).
    3. Transfiera el filtrado a un tubo centrífugo de 0,6 ml.
    4. Lave el ARN residual en el tubo centrífugo (paso 2.2.2.) añadiendo H 2 O (20L) sin RNasa, seguido de centrifugación (700 x g durante 10 min a temperatura ambiente).
    5. Combine el filtrado con el obtenido en el paso 2.2.3.
    6. Guarde el tubo que contiene la solución resultante en un congelador (0 °C) o envíelo para su análisis.

3. Desalinización de la solución de ARN, manchado de la placa MALDI-TOF

  1. Desalar y concentrar la muestra utilizando puntas de pipeta C18 de intercambio catiónico disponibles comercialmente (ver Tabla de Materiales).
    1. Coloque una punta de pipeta C18 de 10 L (punta de pipeta cargada con un lecho de medios de cromatografía C18 fijados en su extremo) sobre una pipeta de 10 μL, y luego continúe con lo siguiente:
      1. Lave la punta C18 con una solución de acetonitrilo acuoso al 50% (10 μL) dos veces. Deseche los volúmenes usados en un tubo de desecho separado cada vez.
      2. Equilibre la punta C18 con una solución acuosa de ácido trifluoroacético (0,1% TFA, 10 μL) dos veces. Deseche los volúmenes usados en un tubo de desecho separado cada vez.
      3. Retire manualmente la punta C18 de la pipeta y asegúrela en una pipeta de 200 μL que contenga una punta de pipeta P200 (la punta C18 ahora se unirá a la punta de pipeta P200).
      4. Sumerja la punta C18 en la solución (paso 2.2.6) y aspire y suelte la solución a través de la punta C18 diez veces.
        NOTA: La muestra de ARN se une a la resina de intercambio catiónico dentro de la punta.
      5. Separe la punta C18 de la pipeta P200 y colóquela sobre una pipeta de 10 μL.
      6. Lave la punta C18 con una solución acuosa de TFA al 0,1% (10 μL) dos veces. Deseche los volúmenes usados en un tubo de desecho separado cada vez.
      7. Lave la punta C18 con agua sin RNasa (10 μL) dos veces. Deseche los volúmenes usados en un tubo de desecho separado cada vez.
  2. Coloque en la placa MALDI siguiendo los pasos a continuación.
    1. Eluya el oligonucleótido de ARN de la punta C18 (paso 3.1.1.7) sumergiendo la muestra en la matriz deseada (10 μL, solución 1:1 de C y D, Tabla 1), seguido de dispensar la solución de nuevo en el tubo. Repita este proceso diez veces.
    2. Pipetear la solución de 3.2.1 en dos puntos separados en la placa (1 μL cada uno, 20 pmol). Permita que las manchas se sequen al aire (Figura 1A y Video 1).
      NOTA: Este proceso se puede repetir en el mismo lugar para aumentar la concentración de la muestra en cada punto.
    3. Pipete el calibrante deseado (1 L) en dos puntos separados físicamente cerca de la ubicación de la muestra y deje que se seque al aire.
      NOTA: El estándar de prueba utilizado en el presente estudio se obtuvo de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales).
    4. Sobreponga el calibrante [completamente seco] con la matriz deseada (1 L). Dejar secar al aire.
      NOTA: Es importante realizar un seguimiento de la posición en la que se detectan las muestras y los calibrantes antes de la inserción en el instrumento. Tome nota de esto utilizando el sistema de coordenadas de la placa, por ejemplo, la muestra 1 se encuentra en la posición (C,3)

4. Adquisición y tratamiento de datos

NOTA: En general, THAP requiere una mayor potencia láser para lograr la ionización. Además, los oligos pueden ser difíciles de ionizar sin fragmentarse. Por lo tanto, generalmente es necesario utilizar la menor potencia del láser posible y aumentar las ganancias del detector y / o reducir la frecuencia del láser para maximizar la detección y minimizar la fragmentación.

  1. Realice la adquisición de datos siguiendo los pasos a continuación.
    NOTA: Las mediciones de peso molecular se realizaron utilizando un espectrómetro de masas (ver Tabla de Materiales) en ion positivo, modo lineal con una tensión de fuente iónica de 20 kV, ganancia del detector de ~2,8 kV y una frecuencia láser de 20 Hz. Los rangos de escaneo se establecieron en función de los pesos moleculares esperados. Estos se calcularon y expresaron como masa sobre carga (m/z), donde la carga era 1. La calibración externa se realizó utilizando una mezcla de calibración de proteínas (Bacterial Test Standard, ver Tabla de Materiales) en un lugar adyacente a la muestra. Los datos sin procesar se procesaron en el software flexAnalysis (consulte Tabla de materiales).
    1. Abra "Flexcontrol software" para la operación. Presione el botón verde de entrada / salida del instrumento, espere a que se mueva la etapa objetivo y aspire para ventilar. Abra la tapa, coloque la placa objetivo completamente seca en el instrumento. Asegúrese de alinearse en la orientación correcta (Figura 1B).
    2. Baje suavemente la tapa y luego presione el botón verde de entrada / salida . Espere a que la placa se retraiga y el instrumento vuelva a bombear hacia abajo. Una vez que la barra de estado (esquina inferior derecha de la ventana del software) refleje 'Listo', continúe con la calibración.
    3. Para calibrar los instrumentos utilizando el software, lleve a cabo lo siguiente.
      1. Seleccione el método deseado haciendo clic en archivo > Seleccionar método o presionando el botón Seleccionar adyacente al método cargado. Haga clic en la coordenada para el punto del calibrante. Desplácese hasta la pestaña Calibración y confirme que el calibrante correcto está seleccionado. Asegúrese de que Random Walk esté desactivado (en la pestaña Portador de muestra ).
      2. Pulse Inicio y dirija manualmente el láser a lo largo de un cristal (haciendo clic en la flecha del ratón en la ubicación deseada en la vista de la cámara). Ajuste la potencia del láser, si es necesario. Una vez satisfecho con la configuración, presione Iniciar para recopilar espectros y agregarlos al búfer de suma.
      3. Agregue espectros a la suma hasta que se alcance la intensidad suficiente. Alterne para ver solo el búfer de suma, reste la línea base y suaviza. Luego haga clic en Asignación automática. Compruebe cada pico asignado y anote el error ppm. Si está satisfecho con las asignaciones y los errores, haga clic en Aplicar.
      4. Borre el búfer de suma y navegue hasta la posición de la primera muestra.
      5. Confirme el rango de escaneo deseado (pestaña 'Detección'). Ajuste las barras en el "Rango de masa" para que la región verde sea representativa de la(s) masa(s) esperada(s).
      6. Haga clic directamente en la ventana Ampliación para que el punto de mira esté orientado al fragmento cristalizado deseado (los cristales más grandes a menudo producen los mejores resultados, Figura 2).
      7. Recoge algunos espectros a lo largo de los cristales grandes, ajustando la potencia del láser según sea necesario. La configuración adecuada es de 5% a 10% por encima de la potencia a la que aparecen los picos.
    4. Para obtener espectros, realice lo siguiente.
      1. Haga clic en Iniciar para observar el destello láser en conjunto con el aumento de la intensidad espectral (que se muestra en la ventana en la parte superior derecha). Mueva el láser a lo largo de la longitud del cristal haciendo clic en la flecha del mouse hacia arriba y hacia abajo del cristal (Video 2).
      2. Haga clic en Agregar directamente debajo de Inicio.
      3. Repita esto varias veces hasta que se alcance la intensidad / número de disparos deseado (reflejado en el eje Y de la ventana espectral)
      4. Ajuste la potencia y/o la velocidad del láser y/o las ganancias del detector si los escaneos iniciales no son satisfactorios. Repita los pasos 4.1.4.1-4.1.4.3 según sea necesario.
      5. Si está satisfecho con el espectro, haga clic en Guardar como para guardar el espectro con un nombre especificado. Luego, si se necesitan otras muestras, haga clic en Borrar suma y repita los pasos en el paso 4.1.4.
  2. Realizar el procesamiento de datos.
    NOTA: El paso 4.2 describe una forma de analizar los datos utilizando el software flexAnalysis.
    1. Abra el software deseado. A continuación, abra spectrum (a) seleccionando Archivo. En el menú desplegable, seleccione Abrir.
    2. Se mostrará una nueva ventana. Haga clic en Examinar para localizar los archivos guardados en el paso 4.1.4. Marque las casillas de los archivos deseados y luego haga clic en Abrir a la izquierda. Si solo un solo espectro requiere análisis, simplemente arrastre y suelte el archivo en la ventana del software.
    3. Resalte los archivos cargados para el análisis masivo. Vaya a la pestaña Proceso de la barra de herramientas. En el menú desplegable, seleccione Restar línea base de espectro de masa.
      NOTA: El algoritmo utilizado para la resta se determinará mediante el método seleccionado en el paso 4.1.3.
    4. Vaya a la pestaña Proceso de la barra de herramientas. En el menú desplegable, seleccione Smooth Mass Spectrum.
      NOTA: El algoritmo utilizado para el suavizado se determinará mediante el método seleccionado en el paso 4.1.3.
    5. Haga clic en la pestaña Lista de masas ; en el menú desplegable, selecciona Buscar. Este comando etiqueta automáticamente los picos con sus masas; una lista de las masas se mostrará en la pantalla a la derecha.
    6. Para agregar o eliminar picos, vaya a la pestaña Lista de masas . En el menú desplegable, haga clic en Editar.
    7. Pase el cursor sobre el eje x del espectro; una línea vertical representa la ubicación del espectro donde está el cursor.
      NOTA: Aparecerá un icono con un gráfico y un cursor cuando se pueda agregar una nueva masa haciendo clic. Este icono aparecerá al pasar el cursor sobre los picos que se pueden eliminar haciendo clic (consulte el paso 4.2.7 en el archivo complementario 1).
    8. Repita los pasos 4.1.3-4.1.7 para obtener espectros adicionales. Exporte la lista de masas para todos los espectros haciendo clic y arrastrando para resaltar los archivos de la izquierda y ejecute el siguiente menú en cascada Archivo > Exportar > lista de masas a Excel.
    9. Para exportar espectros como se muestra en la pantalla, tome una captura de pantalla o expórtela como un informe. Para este último, vaya al menú Informe . En el menú desplegable, seleccione Guardar como PDF.
      NOTA: Se puede cambiar la forma en que se muestran los espectros utilizando las tres pestañas debajo de los espectros y / o variando los archivos resaltados. Aparecerá una pantalla. Asigne un nombre al documento PDF como desee, ajuste la configuración / diseño y haga clic en Guardar para generar una imagen del espectro.
    10. La imagen generada reflejará la vista espectral en el programa de software. Para manipular la vista, realice lo siguiente.
      1. Zoom: Haga clic en el botón Acercar en la barra de herramientas.
      2. Coloque el cursor sobre el eje X y haga clic hasta que se alcance el rango deseado.
      3. Alejar/deshacer: Haga clic en el botón Alejar y haga clic en cualquier parte del espectro para volver a la vista completa.
        NOTA: Una ayuda ilustrativa para los pasos 4.1 y 4.2 se puede encontrar en el Expediente Complementario 1 (pp S8-S23 y S24-S30, respectivamente).

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Representative Results

Los oligonucleótidos utilizados en este trabajo fueron sintetizados, caracterizados y cuantificados antes de su uso. La concentración de todos los oligonucleótidos se determinó mediante espectroscopia UV-vis registrada a 90 °C para evitar lecturas erróneas derivadas de la posible formación de las estructuras secundarias. La Figura 3 muestra los espectros del modelo de oligonucleótidos de ARN utilizados en este trabajo, tomados a temperatura ambiente y después de aplicar calor.

El procedimiento general, junto con la estructura de la lesión oxidativa que causa el estancamiento de Xrn-1, se ilustra en la Figura 4. El oligonucleótido (1) contiene un 8-oxoG en la posición-11 y es donde se bloquea la actividad de Xrn-1, lo que resulta en una hidrólisis detenida de la cadena de ARN. Es importante destacar que los resultados representados en esta figura corresponden a experimentos realizados con soluciones que contienen 200 pmol de la hebra madre (1), aunque solo se detectaron 20 pmol en la placa. Es importante tener en cuenta que la masa promedio se utilizó en todos los cálculos y que se observaron discrepancias que variaban entre 1-3 unidades de masa atómica (amu). La figura muestra dos procesos, (1) la eficiente 5'-fosforilación del ARN, evidenciada por la aparición de un solo pico (1') correspondiente al producto esperado, y (2) el fragmento estancado resultante del tratamiento de la mezcla de muestra con Xrn-1. Experimentos de control donde la hebra madre fue tratada en las mismas condiciones, en ausencia de la quinasa (PNK), y la ribonucleasa (Xrn-1) no mostró diferencias con respecto a las mostradas en la Figura 4 (cadena de ARN 1).

Los mismos resultados se obtuvieron utilizando una secuencia diferente (3) que contenía dos lesiones oxidativas (Figura 5). La fosforilación y la degradación enzimática correspondientes produjeron dos productos principales que sugirieron que la enzima se estanca sucesivamente en ambos sitios que contienen 8-oxoG. Como se muestra en los espectros de masas correspondientes a los fragmentos de interés, se observó una discrepancia en la adquisición de MALDI-TOF al tomar espectros del mismo oligonucleótido en diferentes días. Esto se ilustra en la Figura 4, donde se observaron dos unidades atómicas adicionales. Los resultados representados en esta figura corresponden a experimentos realizados con 100 pmol de la hebra madre (3). Es importante tener en cuenta que se pueden obtener datos cuantitativos para evaluar la eficiencia general del proceso bioquímico (y el seguimiento completo a través de MALDI-TOF) mediante la introducción de un estándar interno en las muestras antes y después de la degradación enzimática.

Figure 1
Figura 1: Manchado de solución de ARN. (A) Manchado en la placa MALDI. (B) Ilustración de la colocación de la placa MALDI en el espectrómetro MALDI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: La toma de la cámara que ilustra la formación de la muestra: cristales de matriz manchados en la placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Espectros UV-vis de oligonucleótidos (1) y (3) registrados a 25 °C y 90 °C, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Proceso experimental para la preparación de oligonucleótidos y espectros de masas para cada paso. (A) Se ilustran los pasos generales utilizando oligonucleótidos (1). La secuencia de eventos corresponde a (B) 5'-fosforilación en presencia de polinucleótido quinasa (PNK), seguida de (C) hidrólisis enzimática en presencia de Xrn-1. Se muestran los espectros MALDI-TOF obtenidos antes y después de ambos procesos bioquímicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Espectros MALDI-TOF, utilizando oligonucleótidos (3), obtenidos antes (izquierda)/después (derecha) del tratamiento con Xrn-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Solución Composición
Un Tris-HCl (700 mM), TDT (50 mM), pH 7.6, tampón de polinucleótido quinasa T4
B NaCl (1 M), Tris-HCl (0,5 M), MgCl2 (0,1 M), TDT (10 mM), pH 7,9
C 2,4,6-Tihidroxiacetofenona monohidrato (THAP, 25 mM), citrato de amonio (10 mM)
D Fluoruro de amonio (300 mM en acetonitrilo al 50 % aq.)
H2O sin RNasa El agua ultrapura se trató con pirocarbonato de dietilo (DEPC, 1 ml por litro de agua), se incubó a 37 °C (12 h) y se autoclavó (1 h)

Tabla 1: Composiciones de soluciones utilizadas en el estudio.

Video 1: Demostración para detectar en la placa MALDI. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Demostración que describe los análisis de datos. Haga clic aquí para descargar este video.

Archivo complementario 1: Ilustración paso a paso para el manejo de software UV-vis (paso 1.2), adquisición de datos MS (paso 4.1) y procesamiento de datos MS (paso 4.2). Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

El principal desafío en este flujo de trabajo surgió entre la finalización de los experimentos y la realización de los análisis espectrométricos de masas. Los experimentos se llevaron a cabo y completaron en la Universidad de Colorado Denver y se enviaron (durante la noche) a las instalaciones de la Universidad Estatal de Colorado. La adquisición de datos se llevó a cabo en el momento de la recepción, según conveniencia. Varias circunstancias inesperadas llevaron a retrasos en el proceso. En un caso, el mal funcionamiento inesperado del instrumento requirió que las muestras se congelaran (una vez durante 21 días) antes de detectarlas y adquirirlas; sin embargo, este retraso en el tiempo no pareció afectar el resultado experimental, aunque no se puede descartar la degradación del ARN (que conduce a una disminución de las intensidades de la señal).

La limitación de los experimentos descritos, en términos de concentración de ARN, fue que los experimentos se llevaron a cabo con [ARN] superior a lo que se puede obtener in vivo, para una sola secuencia de ARN23,24. Encontramos que cuando se llevaron a cabo experimentos con 20 pmol de ARN (2 pmol manchados en la placa), o cantidades más bajas, no se observaron los picos esperados. El uso de espectrómetros con potencia láser mejorada probablemente puede conducir a una señal mejorada y límites de detección más bajos.

Se espera que se pueda evitar el paso donde se filtran las enzimas (utilizando un dispositivo de filtrado de 10 kDa) para separar las enzimas. Los experimentos llevados a cabo sin este paso condujeron a resultados similares. Sin embargo, se recomienda el paso de filtración si las muestras se van a enviar o almacenar por un tiempo.

Los pasos proporcionados pueden ser susceptibles de caracterizar y comprender varios procesos bioquímicos. Los ejemplos pueden incluir la caracterización de procesos que involucran ADNdañado 25, péptidos26,27 o conjugados de ARN28, entre muchos otros. En general, especulamos que el proceso ilustrado aquí puede ser aplicable a varias configuraciones experimentales que involucran ácidos nucleicos, proteínas, biomateriales y / u otros biopolímeros. Además, el desarrollo de espectrómetros mejorados conducirá a mejores resultados, y descubrimientos importantes, en áreas que involucran las biomoléculas antes mencionadas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Es importante señalar que este trabajo fue un esfuerzo de colaboración entre tres instituciones, dos grupos de investigación y una instalación central. La distribución y la carga de trabajo se llevaron a cabo de la siguiente manera: La expresión de proteínas (Xrn-1) se llevó a cabo en la Universidad de Denver (Denver, CO). La síntesis, cuantificación y experimentación de oligonucleótidos (principalmente degradación enzimática) se llevaron a cabo en la Universidad de Colorado Denver (Denver, CO). La optimización también se llevó a cabo allí. La detección, adquisición y análisis de MALDI-TOF se llevaron a cabo en la Instalación Básica de Recursos Analíticos de la Universidad Estatal de Colorado. (Fort Collins, CO). SS desea agradecer un Premio UROP (CU Denver) y becas Eureca (CU Denver) por apoyo. E. G.C. agradece el apoyo de NIGMS, a través de R00GM115757. MJER reconoce el apoyo de NIGMS, a través de 1R15GM132816. K.B. reconoce el ID de recurso: SCR_021758. El trabajo también fue apoyado por un Premio Maestro-Académico (MJER), TH-21-028, de la Fundación Henry Dreyfus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6 mL MCT Graduated Violet Fisher Scientific 05-408-127
6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% Sigma Aldrich 480-66-0
Acetonitrile 99.9%, HPLC grade Fisher Scientific 75-05-8
Adenosine triphosphate, 10 mM New Englang Bioscience P0756S
Ammonium citrate, dibasic 98% Sigma Aldrich 3012-65-5
Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade Alfa Aesar 12125-01-8
Bruker bacterial test standard Bruker Daltonics 8255343
Commercial source of Xrn-1 New England BioLabs M0338S
Diethyl pyrocarbonate, 97% ACROS Organics A0368487
Flex analysis software Bruker daltonics FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics
Lambda 365 UV-vis spectrophotometer Perkin Elmer
MALDI plate: MSP 96 ground steel target Bruker Daltonics 280799
Mass Spectrometer Bruker Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA)
Mili-Q IQ 7000 Milipore Sigma A Mili-Q system was used to purify all water used in this work
Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) Pall Corporation OD010C33 filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size
NEBuffer 3 New England Biolabs B7003S This is solution B
Oligo Analyzer tool IDT-DNA https://www.idtdna.com/calc/analyzer
Pipette tips P10 Fisher Scientific 02-707-441
Pipette tips P200 Fisher Scientific 02-707-419
RNase Away Molecular BioProducts 7005-11
T4 Polynucleotide Kinase New England BioLabs M0201S
T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer New England BioLabs B0201S This is solution A
Triflouroacetic Acid Alfa Aesar 76-05-1
Xrn-1 exoribonuclease Expressed in house See ref. 20
ZipTip Pipette Tips for Sample preparation Millipore ZTC 18S 096 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed

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Bioquímica Número 182 MALDI-TOF Caracterización de ARN espectrometría de masas de ácidos nucleicos 8-oxoG en ARN reactividad de la ribonucleasa degradación enzimática
Identificación de fragmentos de ARN resultantes de la degradación enzimática mediante espectrometría de masas MALDI-TOF
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Schowe, S. W., Langeberg, C. J., Chapman, E. G., Brown, K., Resendiz, M. J. E. Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (182), e63720, doi:10.3791/63720 (2022).

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