Summary
MALDI-TOF, oksitlenmiş RNA ve eksoribonükleaz Xrn-1 arasındaki reaktiviteden elde edilen fragmanları karakterize etmek için kullanıldı. Mevcut protokol, RNA ve / veya DNA içeren diğer işlemlere uygulanabilecek bir metodolojiyi açıklamaktadır.
Abstract
RNA, yaşamın tüm alanlarında bulunan bir biyopolimerdir ve DNA, proteinler, iyonlar, ilaçlar ve serbest radikaller gibi diğer moleküller ve / veya reaktif türlerle etkileşimleri her yerde bulunur. Sonuç olarak, RNA, bölünmesini, bozulmasını veya modifikasyonunu içeren çeşitli reaksiyonlara uğrar ve bu da farklı işlevlere ve etkilere sahip biyolojik olarak ilgili türlere yol açar. Bir örnek, guaninin reaktif oksijen türlerinin (ROS) varlığında ortaya çıkabilecek 7,8-dihidro-8-oksoguanine (8-oksoG) oksidasyonudur. Genel olarak, bu tür ürünleri ve dönüşümleri karakterize eden prosedürler bilimsel topluluk için büyük ölçüde değerlidir. Bu amaçla, matris yardımlı lazer desorpsiyon iyonizasyon uçuş süresi (MALDI-TOF) kütle spektrometresi yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Mevcut protokol, enzimatik tedaviden sonra oluşan RNA fragmanlarının nasıl karakterize edileceğini açıklamaktadır. Seçilen model, RNA ile okside bölgelerde enzimatik sindirimin durdurulduğu eksoribonükleaz Xrn-1 arasında bir reaksiyon kullanır. İki adet 20-nükleotid uzunluğunda RNA dizisi [5'-CAU GAA ACA A (8-oxoG)G CUA AAA GU] ve [5'-CAU GAA ACA A (8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] katı faz sentezi yoluyla elde edildi, UV-vis spektroskopisi ile ölçüldü ve MALDI-TOF ile karakterize edildi. Elde edilen iplikçikler daha sonra (1) 5'-fosforile edildi ve MALDI-TOF ile karakterize edildi; (2) Xrn-1 ile tedavi edilir; (3) filtrelenmiş ve tuzdan arındırılmış; (4) MALDI-TOF ile analiz edilmiştir. Bu deneysel düzenek, Xrn-1'in durmasıyla ilişkili parçaların kesin olarak tanımlanmasına yol açtı: [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] ve [5'-H2PO 4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Tarif edilen deneyler 200 pikomol RNA (MALDI analizleri için kullanılan 20 pmol) ile gerçekleştirildi; Bununla birlikte, daha düşük miktarlar, bu çalışmada kullanılandan daha fazla güce sahip lazer kaynakları kullanan spektrometrelerle tespit edilebilir zirvelere neden olabilir. Önemli olarak, tarif edilen metodoloji genelleştirilebilir ve potansiyel olarak RNA ve DNA'yı içeren diğer süreçler için ürün tanımlamaya genişletilebilir ve diğer biyokimyasal yolların karakterizasyonuna / aydınlatılmasına yardımcı olabilir.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3, farklı boyut ve özelliklerdeki moleküllerin karakterizasyonu ve / veya tespiti için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Kullanımlarından bazıları, doğal kaynaklardan tanenlerin tespit edilmesi4, gıda5'teki metabolitlerin görüntülenmesi, hücresel ilaç hedeflerinin veya belirteçlerinin keşfi veya izlenmesi6 ve klinik teşhis7 gibi çeşitli uygulamaları içerir. Bu çalışmayla ilgili olarak, MALDI-TOF'un DNA veya RNA ile birlikte kullanılması, oligonükleotidler üzerindeki kullanımı otuz yıldan fazla bir süredirdevam etmektedir 8, burada çeşitli sınırlamalar belirtilmiştir. Bu teknik şimdi hem biyopolimerleri9 karakterize etmek hem de kimyasal ve biyokimyasal reaksiyonları tanımlamak / anlamak için güvenilir, yaygın olarak kullanılan bir araca dönüşmüştür, örneğin, RNA 10'daki platinlenmiş bölgelerin karakterizasyonu, iplik bölünmesi 11,12'yi takiben RNA fragmanlarının tanımlanması veya protein-DNA çapraz bağlantılarının oluşumu 13 . Bu nedenle, bu tekniği kullanmanın önemli yönlerini göstermek ve vurgulamak değerlidir. MALDI-TOF'un temelleri video formatında da açıklanmıştır14 ve burada daha fazla ayrıntılandırılmayacaktır. Ayrıca, DNA veya protein bağlamında uygulanması daha önce tarif edilmiş ve söz konusu formatta 15,16,17 olarak gösterilmiştir.
Enzimatik hidroliz sonrası oluşan RNA fragmanlarının tespiti için protokol burada bildirilmiştir. Deneysel model, eksoribonükleaz Xrn-1 ile oksidatif lezyon 8-oksoG içeren RNA'nın oligonükleotidleri arasındaki benzersiz reaktiviteyi belirlemek için MALDI-TOF kullanıldığı grup 18 tarafından yayınlanan yeni bir bulguya dayanarak seçildi. 20-nükleotid uzun iplikçikler katı faz sentezi19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] ve [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] ile elde edilirken, Xrn-1 daha önce açıklanan rapor20'yi takiben eksprese edildi ve saflaştırıldı. Kısacası, Xrn-121, oksitlenmiş RNA22 de dahil olmak üzere birden fazla RNA tipini bozan çeşitli anahtar biyolojik rollere sahip bir 5'-3' eksoribonükleazdır. Enzimin işlenebilirliğinin, 5'-fosforile uçlar [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H 2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] ve [5'-H2PO 4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18 içeren RNA fragmanlarına yol açan 8-oksoG ile karşılaşıldığında durduğu bulunmuştur.
Son olarak, kütle spektrometresinin, çeşitli metodolojiler aracılığıyla, diğer amaçlara uyarlanabilecek güçlü bir yöntem olduğunu belirtmek önemlidir23,24; Bu nedenle, doğru iyonizasyon yönteminin yanı sıra diğer deney düzeneğinin seçilmesi de son derece önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada RNaz içermeyen ultra saf su (Tablo 1) kullanılmıştır.
1. RNA çözeltisinin konsantrasyon tayini
- Aşağıdaki adımları izleyerek RNA örneğini hazırlayın.
- 1 μL stok çözeltisini (katı faz sentezi yoluyla elde edilen) 19 μL RNaz içermeyenH2O'ya seyrelterek bir RNA çözeltisi hazırlamak için bir mikrosantrifüj tüpü (0.6 mL) kullanın.
NOT: Çok çeşitli küvetler ticari olarak temin edilebildiğinden, gerekli hacimler farklı olabilir. Bu çalışmada 1 cm yol uzunluğuna ve düşük hacimli (150 μL) küvetler kullanılmıştır. - UV-vis küvetini metanol (2x), ardından su ile durulayın (ultra saf H2O, 3x, bakınız Malzeme Tablosu). Küveti iyice kurutmak için bir azot gazı akışı kullanın.
- Çözeltiyi (adım 1.1.1) küvete aktarmak için bir pipet kullanın ve hava kabarcığı olmadığından emin olun. Küveti kapatın ve ihtiyaç duyulana kadar yana yerleştirin.
- 1 μL stok çözeltisini (katı faz sentezi yoluyla elde edilen) 19 μL RNaz içermeyenH2O'ya seyrelterek bir RNA çözeltisi hazırlamak için bir mikrosantrifüj tüpü (0.6 mL) kullanın.
- UV-vis Spektrofotometre kullanarak hazırlanan RNA çözeltisinin konsantrasyonunu belirleyin.
- Cihazın arkasında bulunan anahtarı çevirerek UV-Vis spektrofotometresini açın. Cihazın başlatma prosedürünü tamamlamasına izin verin ve cihazın çalışma/kontrol penceresini açmak için UV WinLab simgesine tıklayın.
- Cihazın sağında bulunan anahtarı kullanarak Peltier Sıcaklık Kontrol Cihazı spektrofotometresini açın.
- Temel Yöntemler altında, Tara - Lambda 365'e tıklayın. Başka bir ekran açılır ve kullanıcıdan hücre tutucuların boş olduğundan emin olmasını ister. Tamam'a tıklayın ve cihazın sistem kontrollerini yapmasına izin verin. Sistem daha sonra kontrollerin bir listesini görüntüleyecek, hepsinin "Geçti" olduğundan emin olacak ve Tamam'a tıklayacaktır.
NOT: Verilen sırayla 1.2.1-1.2.3 adımlarını izlemeniz önerilir; Bu olay dizisini değiştirmek yazılım arızasına neden olabilir. - Veri Toplama'yı seçerek tarama parametrelerini ayarlayın. Tarama Ayarları altındaki yeni pencerede Başlangıç'ı 350 nm'ye, Son'u 215 nm'ye değiştirin.
- Aksesuarın solundaki + işaretini seçerek Peltier'i etkinleştirin. Çoklu Hücreli Peltier'e tıklayın, Sıcaklık ° C'yi 25 olarak değiştirin ve Peltier On'a tıklayın.
- Örnek Bilgileri sekmesine gidin ve örneklerin sayısını, adlarını ve hücre konumunu istediğiniz gibi girin.
- Autozero'ya tıklayın ve arka plan çözümünü içeren küveti yerleştirin. Bu küvetin ölçümlerin yapılacağı aynı yuvaya yerleştirildiğinden emin olun.
- Başlat'a tıklayın ve küveti (adım 1.1.3) istediğiniz hücreye yerleştirin. Küvet penceresinin cihazın ön yüzüne paralel olarak yönlendirildiğinden emin olun. İlk taramaya 25 °C'de başlamak için Tamam'a tıklayın.
- Daha yüksek sıcaklıklardaki ölçümler için, 1.2.5-1.2.8 adımlarını tekrarlayın ve sıcaklığı istenen numune sıcaklığına değiştirin (mevcut durumda 90 ° C).
- Dosya > Dışa Aktar'a tıklayın ve istediğiniz dosya konumunu seçin. .txt bir dosya edinmek için XY Verileri'ni seçin.
NOT: Adım 1.2'nin açıklayıcı bir yardımı Ek Dosya 1'de (S1-S7 ) bulunabilir.
- RNA konsantrasyonunu belirlemek için veri toplama gerçekleştirin.
- Sonuçlar sekmesi altında her spektrum için dosyayı bulun. Absorbansı elde etmek için, imleci çizginin üzerine getirin, 260 nm'ye gidin ve görüntülenen absorbansları kaydedin. Alternatif olarak, Dosya > Dışa Aktarma basamakları aracılığıyla, diğer çizim yazılımlarını kullanarak daha fazla grafik analiz için verileri bir .txt dosyası olarak dışa aktarın.
NOT: Eğer 0.1 < A ≥ 1 ise, adım 1.1.1'de hazırlanan RNA örneğinin konsantrasyonunu seyreltmek veya arttırmak gerekecektir. - Çözeltinin konsantrasyonunu hesaplamak için Beer-Lambert yasasını kullanın.
NOT: Bira Yasası: A = εcl, burada:
C: Absorbans (bu durumda 260 nm'de, adım 1.3.1'den)
ε: Yok olma katsayısı. Burada kullanılan dizi için, 208.000 L mol-1 cm-1, bir OligoAnalyzer aracından elde edilen değerdir.
l: Yol uzunluğu, 1 cm
c: numunenin konsantrasyonu - Sonraki deneylerde kullanılmak üzere istenen RNA çözeltisini hazırlamak için bu hesaplamaları kullanın. Bu çalışmada [RNA] = 200 μM içeren çözeltiler kullanılmıştır.
- Sonuçlar sekmesi altında her spektrum için dosyayı bulun. Absorbansı elde etmek için, imleci çizginin üzerine getirin, 260 nm'ye gidin ve görüntülenen absorbansları kaydedin. Alternatif olarak, Dosya > Dışa Aktarma basamakları aracılığıyla, diğer çizim yazılımlarını kullanarak daha fazla grafik analiz için verileri bir .txt dosyası olarak dışa aktarın.
2. RNA'nın oligonükleotidlerinin Xrn-1 ile hidrolizi
- Aşağıdaki adımları izleyerek RNA'nın 5' fosforilasyonunu gerçekleştirin.
- Aşağıdaki çözeltiyi (toplam 50 μL hacim) hazırlamak için 0,6 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü kullanın.
- RNase içermeyen H2O (33,5 μL) ekleyin; hacimler [RNA]'ya bağlı olarak değişebilir.
- Ardından, A çözümünü ekleyin (5 L, Tablo 1).
- Sulu bir adenozin trifosfat çözeltisi ekleyin (ATP, Malzeme Tablosuna bakınız) (6 L, 10 mM, 60 nmol).
- RNA sulu çözeltisi ekleyin (1 μL, 200 μM, 200 pmol).
- Polinükleotid kinaz (PNK enzimi, bakınız Malzeme Tablosu) çözeltisi (4.5 L, 45 ünite) ekleyin. Karışımı yukarı ve aşağı (10x) pipetleyerek nazikçe karıştırın.
- Reaksiyon karışımını bir su banyosuna koyarak 37 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin.
- Reaksiyon tüpünü önceden ısıtılmış bir ısı bloğuna (65 ° C) yerleştirerek ve çözeltiyi 10 dakika boyunca inkübe ederek enzimi etkisiz hale getirin.
- Son 5'-fosforile RNA çözeltisi (4 μM, 50 μL) elde etmek için çözeltinin oda sıcaklığına soğumasına izin verin (RNA fosforilasyonu MALDI-TOF analizi ile karakterize edildi, Temsili Sonuçlara bakınız).
- Aşağıdaki çözeltiyi (toplam 50 μL hacim) hazırlamak için 0,6 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü kullanın.
- Aşağıdaki adımları izleyerek Xrn-1 ile RNA hidrolizi gerçekleştirin.
- 2.1.4 adımındaki çözeltiyi (50 μL) kullanarak, aşağıdaki adımları uygulayın.
- B çözeltisini ekleyin (5 L, Tablo 1).
- Bir Xrn-1 çözeltisi ekleyin (0.5 L, 1 ng, 30 fmol). Çözeltiyi hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek, (10x) karıştırın.
- Reaksiyon tüpünü oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin.
- Reaksiyon karışımını (adım 2.2.1.3) 10 kDa gözenek boyutunda bir santrifüj cihazına aktarın ( bakınız Malzeme Tablosu) ve enzimleri santrifüjleme yaparak filtreleyin (oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 700 x g).
- Filtrasyonu 0,6 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Artık RNA'yı santrifüj tüpü üzerinde (adım 2.2.2.) RNaz içermeyen H2 O (20L) ekleyerek yıkayın, ardından santrifüjleme (oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 700 x g) ekleyin.
- Filtratın adım 2.2.3'ten elde edilenle birleştirin.
- Elde edilen çözeltiyi içeren tüpü bir dondurucuda (0 ° C) veya analiz için gemide saklayın.
- 2.1.4 adımındaki çözeltiyi (50 μL) kullanarak, aşağıdaki adımları uygulayın.
3. RNA çözeltisinin tuzdan arındırılması, MALDI-TOF plaka lekelenmesi
- Ticari olarak temin edilebilen katyon değişimi C18 pipet uçlarını kullanarak numunenin tuzunu çözün ve konsantre edin (bkz.
- 10 L C18 pipet ucunu (ucuna sabitlenmiş C18 kromatografi ortamı yatağı yüklü pipet ucu) 10 μL'lik bir pipet üzerine yerleştirin ve ardından aşağıdakilerle devam edin:
- C18 ucunu iki kez% 50 sulu asetonitril (10 μL) çözeltisi ile yıkayın. Kullanılan hacimleri her seferinde ayrı bir atık tüpüne atın.
- C18 ucunu iki kez sulu bir trifloroasetik asit çözeltisi (% 0.1 TFA, 10 μL) ile dengeleyin. Kullanılan hacimleri her seferinde ayrı bir atık tüpüne atın.
- C18 ucunu pipetten manuel olarak çıkarın ve P200 pipet ucu içeren 200 μL'lik bir pipete sabitleyin (C18 ucu artık P200 pipet ucuna takılacaktır).
- C18 ucunu çözeltiye batırın (adım 2.2.6) ve çözeltiyi C18 ucundan on kez aspire ederek serbest bırakın.
NOT: RNA örneği, ucun içindeki katyon değişim reçinesine bağlanır. - C18 ucunu P200 pipetten çıkarın ve 10 μL'lik bir pipet üzerine yerleştirin.
- C18 ucunu iki kez% 0.1 TFA (10 μL) sulu bir çözelti kullanarak yıkayın. Kullanılan hacimleri her seferinde ayrı bir atık tüpüne atın.
- C18 ucunu RNaz içermeyen suyla (10 μL) iki kez yıkayın. Kullanılan hacimleri her seferinde ayrı bir atık tüpüne atın.
- 10 L C18 pipet ucunu (ucuna sabitlenmiş C18 kromatografi ortamı yatağı yüklü pipet ucu) 10 μL'lik bir pipet üzerine yerleştirin ve ardından aşağıdakilerle devam edin:
- Aşağıdaki adımları izleyerek MALDI plakasını tespit edin.
- RNA oligonükleotidini C18 ucundan (adım 3.1.1.7) numuneyi istenen matrise daldırarak (10 μL, 1: 1 C ve D çözeltisi, Tablo 1) ve ardından çözeltiyi tekrar tüpe dağıtarak süzün. Bu işlemi on kez tekrarlayın.
- Çözeltiyi 3.2.1'den plakadaki iki ayrı noktaya pipetleyin (her biri 1 μL, 20 pmol). Lekelerin havayla kurumasına izin verin (Şekil 1A ve Video 1).
NOT: Bu işlem, her bir noktadaki numune konsantrasyonunu artırmak için aynı noktada tekrarlanabilir. - Pipet istenen kalibrantın (1 L) numune konumuna fiziksel olarak yakın iki ayrı nokta üzerinde ve havanın kurumasını sağlar.
NOT: Bu çalışmada kullanılan test standardı ticari kaynaklardan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). - [Tamamen kurutulmuş] kalibrantı istenen matrisle (1 L) üst üste yerleştirin. Havanın kurumasına izin verin.
NOT: Numunelerin ve kalibrantların cihaza yerleştirilmeden önce tespit edildiği konumu izlemek önemlidir. Plaka koordinat sistemini kullanarak bunu not edin, örneğin, örnek 1 konumunda bulunur (C,3)
4. Veri toplama ve işleme
NOT: Genel olarak, THAP iyonizasyon elde etmek için daha yüksek lazer gücü gerektirir. Ek olarak, oligoların parçalanmadan iyonlaşması zor olabilir. Bu nedenle, algılamayı en üst düzeye çıkarmak ve parçalanmayı en aza indirmek için mümkün olduğunca düşük lazer gücü kullanmak ve dedektör kazançlarını artırmak ve / veya lazer frekansını düşürmek genellikle gereklidir.
- Aşağıdaki adımları izleyerek veri toplama işlemini gerçekleştirin.
NOT: Moleküler ağırlık ölçümleri kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu) pozitif iyonda, iyon kaynağı voltajı 20 kV, dedektör kazancı ~ 2.8 kV ve lazer frekansı 20 Hz olan doğrusal mod. Bunlar hesaplandı ve yükün 1 olduğu yük üzerinden kütle (m / z) olarak ifade edildi. Harici kalibrasyon bir protein kalibrasyon karışımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Bakteriyel Test Standardı, bkz. Malzeme Tablosu) numuneye bitişik bir noktada. Ham veriler daha sonra flexAnalysis yazılımında işlendi (bkz. Malzeme tablosu).- İşlem için "Flexcontrol yazılımı"nı açın. Cihazın yeşil giriş/çıkış düğmesine basın, hedef aşamanın hareket etmesini bekleyin ve havalandırmak için vakumlayın. Kapağı açın, tamamen kurutulmuş hedef plakayı cihaza yerleştirin. Doğru yönde hizaladığınızdan emin olun (Şekil 1B).
- Kapağı yavaşça indirin ve ardından yeşil giriş/çıkış düğmesine basın. Plakanın geri çekilmesini ve cihazın geri pompalanmasını bekleyin. Durum çubuğu (yazılım penceresinin sağ alt köşesi) 'Hazır'ı yansıttığında, kalibrasyona devam edin.
- Yazılımı kullanarak cihazları kalibre etmek için aşağıdakileri gerçekleştirin.
- Dosya > Yöntem Seç'e tıklayarak veya yüklenen yöntemin yanındaki Seç düğmesine basarak istediğiniz yöntemi seçin. Kalibrant noktası için Koordinat'a tıklayın. Kalibrasyon sekmesine gidin ve doğru kalibrantın seçildiğini onaylayın. Rastgele Yürüyüşün kapalı olduğundan emin olun (Örnek Taşıyıcı sekmesinde).
- Başlat'a basın ve lazeri bir kristal boyunca manuel olarak yönlendirin (kamera görünümünde istenen konuma fare okunu tıklayın). Gerekirse lazer gücünü ayarlayın. Ayarlardan memnun kaldıktan sonra, spektrumları toplamak ve bunları toplam arabelleğe eklemek için Başlat düğmesine basın.
- Yeterli yoğunluğa ulaşılana kadar toplama spektrum ekleyin. Yalnızca toplam arabelleğini görüntülemek, taban çizgisini çıkarmak ve pürüzsüz hale getirmek için geçiş yapın. Ardından Otomatik Atama'ya tıklayın. Atanan her tepe noktasını kontrol edin ve ppm hatasını not edin. Atamalardan ve hatalardan memnunsanız, Uygula'ya tıklayın.
- Toplam arabelleği temizleyin ve ilk numunenin konumuna gidin.
- İstediğiniz tarama aralığını onaylayın ("Algılama" sekmesi). "Kütle Aralığı" ndaki çubukları, yeşil bölge beklenen kütle (ler) i temsil edecek şekilde ayarlayın.
- Artı işaretlerinin istenen kristalize parçaya yönlendirilmesi için doğrudan Büyütme penceresine tıklayın (daha büyük kristaller genellikle en iyi sonuçları verir, Şekil 2).
- Büyük kristaller boyunca birkaç spektrum toplayın, lazer gücünü gerektiği gibi ayarlayın. Uygun ayar, zirvelerin göründüğü gücün% 5 -% 10 üzerindedir.
- Spektrum elde etmek için aşağıdakileri gerçekleştirin.
- Lazer flaşını artan spektral yoğunlukla birlikte gözlemlemek için Başlat'a tıklayın (sağ üstteki pencerede gösterilmiştir). Fare okunu kristalde yukarı ve aşağı tıklatarak lazeri kristalin uzunluğu boyunca hareket ettirin (Video 2).
- Doğrudan Başlat'ın altındaki Ekle'ye tıklayın.
- İstenilen yoğunluğa/çekim sayısına ulaşılana kadar bunu birkaç kez tekrarlayın (spektral pencerenin y eksenine yansır)
- İlk taramalar tatmin edici değilse lazer gücünü ve / veya hızını ve / veya dedektör kazanımlarını ayarlayın. 4.1.4.1-4.1.4.3 adımlarını gerektiği gibi yineleyin.
- Spektrumdan memnunsanız, spektrumu belirli bir ad altında kaydetmek için Farklı Kaydet'e tıklayın. Ardından, başka örneklere ihtiyaç duyulursa, Clear Sum'a tıklayın ve adım 4.1.4 altındaki adımları tekrarlayın.
- Veri işleme gerçekleştirin.
NOT: Adım 4.2, flexAnalysis yazılımını kullanarak verileri analiz etmenin bir yolunu açıklar.- İstediğiniz yazılımı açın. Ardından, Dosya'yı seçerek spektrumu (a) açın. Açılır menüden Aç'ı seçin.
- Yeni bir pencere açılacaktır. Adım 4.1.4'ten kaydedilen dosyaları bulmak için Gözat'a tıklayın. İstediğiniz dosyaların kutularını işaretleyin ve ardından soldaki Aç'a tıklayın. Yalnızca tek bir spektrum analiz gerektiriyorsa, dosyayı sürükleyip yazılım penceresine bırakmanız yeterlidir.
- Toplu analiz için yüklenen dosyaları vurgulayın. Araç çubuğundaki İşlem sekmesine gidin. Açılır menüde, Kütle Spektrumu Taban Çizgisini Çıkar'ı seçin.
NOT: Çıkarma işlemi için kullanılan algoritma, adım 4.1.3'te seçilen yöntemle belirlenecektir. - Araç çubuğundaki İşlem sekmesine gidin. Açılır menüde Pürüzsüz Kütle Spektrumu'nu seçin.
NOT: Yumuşatma için kullanılan algoritma, adım 4.1.3'te seçilen yöntemle belirlenecektir. - Toplu Liste sekmesine tıklayın; açılır menüde Bul'u seçin. Bu komut, zirveleri kütleleriyle otomatik olarak etiketler; sağdaki ekranda kitlelerin bir listesi görüntülenecektir.
- Tepe noktaları eklemek veya silmek için Kütle Listesi sekmesine gidin. Açılır menüde Düzenle'ye tıklayın.
- İmleci spektrumun x ekseni üzerinde getirin; dikey çizgi, imlecin açık olduğu spektrumun konumunu temsil eder.
NOT: Tıklanarak yeni bir kütle eklenebildiğinde grafik ve imleç içeren bir simge görünecektir. Bu simge, tıklanarak silinebilecek tepe noktalarının üzerine gelindiğinde görünür ( Ek Dosya 1'deki adım 4.2.7'ye bakın). - Ek spektrumlar için 4.1.3-4.1.7 arasındaki adımları yineleyin. Soldaki dosyaları vurgulamak için tıklayıp sürükleyerek tüm spektrumlar için kütle listesini dışa aktarın ve aşağıdaki menüyü uygulayın basamaklı Dosya > > Toplu Listesini Excel'e Dışa Aktar.
- Spektrumları ekranda gösterildiği gibi dışa aktarmak için ekran görüntüsü alın veya rapor olarak dışa aktarın. İkincisi için, Rapor menüsüne gidin. Açılır menüde PDF Olarak Kaydet'i seçin.
NOT: Spektrumların altındaki üç sekmeyi kullanarak ve/veya vurgulanan dosyaları değiştirerek spektrumların görüntülenme şeklini değiştirebilirsiniz. Bir ekran açılacaktır. PDF belgesini istediğiniz gibi adlandırın, ayarları/mizanpajı ayarlayın ve spektrumun bir görüntüsünü oluşturmak için Kaydet'e tıklayın. - Oluşturulan görüntü, yazılım programındaki spektral görünümü yansıtacaktır. Görünümü değiştirmek için aşağıdakileri gerçekleştirin.
- Yakınlaştırma: Araç çubuğundaki Yakınlaştır düğmesini tıklayın.
- Fareyi x ekseninin üzerine getirin ve istenen aralığa ulaşılana kadar tıklayın.
- Uzaklaştırma/geri alma: Uzaklaştır düğmesine tıklayın ve tam görünüme dönmek için spektrumda herhangi bir yeri tıklayın.
NOT: Adım 4.1 ve 4.2 için açıklayıcı bir yardım Ek Dosya 1'de bulunabilir (sırasıyla pp S8-S23 ve S24-S30).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada kullanılan oligonükleotidler kullanımdan önce sentezlenmiş, karakterize edilmiş ve nicelleştirilmiştir. Tüm oligonükleotidlerin konsantrasyonu, ikincil yapıların potansiyel oluşumundan kaynaklanan hatalı okumaları önlemek için 90 ° C'de kaydedilen UV-vis spektroskopisi ile belirlendi. Şekil 3 , bu çalışmada kullanılan RNA'nın model oligonükleotidlerinin spektrumlarını, oda sıcaklığında ve ısı uygulandıktan sonra alındığını göstermektedir.
Genel prosedür, Xrn-1 duraklamasına neden olan oksidatif lezyonun yapısı ile birlikte, Şekil 4'te gösterilmiştir. Oligonükleotid (1), pozisyon-11'de bir adet 8-oksoG içerir ve Xrn-1 aktivitesinin bloke edildiği yerdir, bu da RNA ipliğinin hidrolizinin durdurulmasına neden olur. Önemli olarak, bu şekilde gösterilen sonuçlar, plakada sadece 20 pmol tespit edilmesine rağmen, ana ipliğin 200 pmol'ünü (1) içeren çözeltiler kullanılarak yapılan deneylere karşılık gelmektedir. Tüm hesaplamalarda ortalama kütlenin kullanıldığını ve 1-3 atomik kütle birimi (amu) arasında değişen tutarsızlıkların gözlendiğini belirtmek önemlidir. Şekil iki işlemi göstermektedir, (1) beklenen ürüne karşılık gelen sadece bir tepe noktasının (1') ortaya çıkmasıyla kanıtlanan RNA'nın verimli 5'-fosforilasyonu ve (2) numune karışımının Xrn-1 ile muamele edilmesinden kaynaklanan durma parçası. Ana ipliğin kinaz (PNK) yokluğunda aynı koşullar altında muamele edildiği kontrol deneyleri, ve ribonükleaz (Xrn-1), Şekil 4'te (RNA ipliği 1) gösterilenlerden farklılıklar göstermedi.
Aynı sonuçlar, iki oksidatif lezyon içeren farklı bir dizi (3) kullanılarak elde edildi (Şekil 5). Karşılık gelen fosforilasyon ve enzimatik bozunma, enzimin 8-oksoG içeren her iki bölgede de art arda durduğunu öne süren iki ana ürün verdi. İlgilenilen parçalara karşılık gelen kütle spektrumlarında gösterildiği gibi, farklı günlerde aynı oligonükleotidin spektrumları alınırken MALDI-TOF edinimi üzerinde bir tutarsızlık gözlenmiştir. Bu, iki ek atom biriminin gözlemlendiği Şekil 4'te gösterilmiştir. Bu şekilde gösterilen sonuçlar, ana ipliğin 100 pmol'ü ile yapılan deneylere karşılık gelmektedir (3). Enzimatik bozunmadan önce ve sonra numunelere dahili bir standart getirerek biyokimyasal prosesin genel verimliliğini (ve MALDI-TOF aracılığıyla tam izlemeyi) değerlendirmek için nicel verilerin elde edilebileceğini belirtmek önemlidir.
Şekil 1: RNA çözeltisinin lekelenmesi . (A) MALDI plakası üzerinde lekelenme. (B) MALDI-spektrometreye MALDI-plaka yerleşiminin gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Numunenin oluşumunu gösteren kamera çekimi: plaka üzerinde lekelenmiş matris kristalleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sırasıyla 25 °C ve 90 °C'de kaydedilen oligonükleotidlerin (1) ve (3) UV vis spektrumları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Oligonükleotid hazırlanması için deneysel süreç ve her adım için kütle spektrumları. (A) Oligonükleotid kullanan genel adımlar (1) gösterilmiştir. Olayların sırası, polinükleotid kinaz (PNK) varlığında (B) 5'-fosforilasyona, ardından Xrn-1 varlığında (C) enzimatik hidrolize karşılık gelir. Her iki biyokimyasal işlemden önce ve sonra elde edilen MALDI-TOF spektrumları görüntülenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Xrn-1 ile tedaviden önce (solda)/sonra (sağda) elde edilen oligonükleotid (3) kullanılarak MALDI-TOF spektrumları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözüm | Kompozisyon | ||
| A | Tris-HCl (700 mM), DTT (50 mM), pH 7.6, T4 polinükleotid kinaz tamponu | ||
| B | NaCl (1 M), Tris-HCl (0,5 M), MgCl2 (0,1 M), DTT (10 mM), pH 7,9 | ||
| C | 2,4,6-Tihidroksiasetofenon monohidrat (THAP, 25 mM), amonyum sitrat (10 mM) | ||
| D | Amonyum florür (% 50 aq. Asetonitril'de 300 mM) | ||
| RNase içermeyen H2O | Ultra saf su, dietil pirokarbonat (DEPC, litre su başına 1 mL) ile muamele edildi, 37 ° C'de (12 saat) inkübe edildi ve otoklavlandı (1 saat) | ||
Tablo 1: Çalışmada kullanılan çözelti bileşimleri.
Video 1: MALDI plakasına leke sürme gösterimi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 2: Veri analizlerini özetleyen gösterim. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 1: UV-vis yazılımını (adım 1.2), MS veri toplamayı (adım 4.1) ve MS veri işlemeyi (adım 4.2) işlemek için adım adım çizim. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iş akışındaki ana zorluk, deneylerin sonuçlandırılması ve kütle spektrometrik analizlerinin yapılması arasında ortaya çıktı. Deneyler Colorado Denver Üniversitesi'nde gerçekleştirildi ve tamamlandı ve Colorado Eyalet Üniversitesi tesislerine (bir gecede) gönderildi. Veri toplama, kolaylık sağlamak amacıyla alındıktan sonra gerçekleştirilmiştir. Birkaç beklenmedik durum süreçte zaman gecikmelerine neden oldu. Bir durumda, beklenmeyen cihaz arızaları, numunelerin tespit edilmeden ve elde edilmeden önce dondurulmasını (21 gün boyunca bir kez) gerektirdi; Bununla birlikte, bu zaman gecikmesi deneysel sonucu etkilememiş gibi görünmektedir, ancak RNA'nın bozulması (sinyal yoğunluklarının azalmasına yol açan) göz ardı edilemez.
Tanımlanan deneylerin RNA konsantrasyonu açısından sınırlılığı, deneylerin tek bir RNA dizisi23,24 için in vivo olarak elde edilebilenden daha yüksek [RNA] ile gerçekleştirilmesiydi. Deneyler 20 pmol RNA (plakada lekelenmiş 2 pmol) veya daha düşük miktarlarda yapıldığında, beklenen zirvelerin gözlenmediğini bulduk. Gelişmiş lazer gücüne sahip spektrometrelerin kullanımı muhtemelen gelişmiş sinyale ve daha düşük algılama sınırlarına yol açabilir.
Enzimleri ayırmak için enzimlerin filtrelendiği adımın (10 kDa filtreleme cihazı kullanılarak) önlenebilmesi beklenir. Bu adım olmadan yapılan deneyler de benzer sonuçlara yol açtı. Ancak, numunelerin bir süre gönderilmesi veya depolanması gerekiyorsa filtreleme adımı önerilir.
Sağlanan adımlar, çeşitli biyokimyasal proseslerin karakterize edilmesi ve anlaşılması için uygun olabilir. Örnekler, diğerlerinin yanı sıra hasarlı DNA 25, peptitler26,27 veya RNA konjugatları28'i içeren süreçlerin karakterizasyonunu içerebilir. Genel olarak, burada gösterilen sürecin nükleik asitleri, proteinleri, biyomalzemeleri ve / veya diğer biyopolimerleri içeren çeşitli deney düzeneklerine uygulanabileceğini düşünüyoruz. Ayrıca, geliştirilmiş spektrometrelerin geliştirilmesi, yukarıda belirtilen biyomolekülleri içeren alanlarda gelişmiş sonuçlara ve önemli keşiflere yol açacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışmanın üç kurum, iki araştırma grubu ve bir çekirdek tesis arasında işbirliğine dayalı bir çaba olduğunu belirtmek önemlidir. Dağılım ve iş yükü şu şekilde gerçekleştirildi: Protein (Xrn-1) ekspresyonu Denver Üniversitesi'nde (Denver, CO) gerçekleştirildi. Oligonükleotid sentezi, nicelleştirme ve deney (esas olarak enzimatik bozunma) Colorado Denver Üniversitesi'nde (Denver, CO) gerçekleştirildi. Optimizasyon da orada gerçekleştirildi. MALDI-TOF tespiti, satın alma ve analizi, Colorado Eyalet Üniversitesi'ndeki Analitik Kaynaklar Çekirdek Tesisi'nde gerçekleştirildi. (Fort Collins, CO). SS, destek için bir UROP Ödülü (CU Denver) ve Eureca hibelerini (CU Denver) kabul etmek istiyor. E. G.C., R00GM115757 aracılığıyla NIGMS'nin desteğini kabul eder. MJER, 1R15GM132816 aracılığıyla NIGMS'nin desteğini kabul eder. K.B. kaynak kimliğini kabul eder: SCR_021758. Çalışma ayrıca Henry Dreyfus Vakfı'ndan TH-21-028 Öğretmen-Bilim İnsanı Ödülü (MJER) tarafından da desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
References
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
- Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73 (2003).
- Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516 (2021).
- Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
- Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
- Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
- Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
- Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
- Chapman, E. G., DeRose, V. J.
- Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
- Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).
- Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2021).
- Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).
- Su, K. -Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).
- Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).
- Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).
- Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).
- Langeberg, C. J., et al.
- Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
- Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).
- Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
- Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).
- Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
- Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
- Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521 (2022).
- Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).
