Summary
MALDI-TOF был использован для характеристики фрагментов, полученных из реактивности между окисленной РНК и экзорибонуклеазой Xrn-1. Настоящий протокол описывает методологию, которая может быть применена к другим процессам, включающим РНК и/или ДНК.
Abstract
РНК является биополимером, присутствующим во всех областях жизни, и его взаимодействия с другими молекулами и / или реактивными видами, например, ДНК, белками, ионами, лекарствами и свободными радикалами, распространены повсеместно. В результате РНК подвергается различным реакциям, которые включают ее расщепление, деградацию или модификацию, что приводит к биологически значимым видам с различными функциями и последствиями. Одним из примеров является окисление гуанина до 7,8-дигидро-8-оксогуанина (8-оксоG), которое может происходить в присутствии активных форм кислорода (АФК). В целом, процедуры, которые характеризуют такие продукты и преобразования, в значительной степени ценны для научного сообщества. С этой целью масс-спектрометрия времени пролета с матричной лазерной десорбцией ионизации (MALDI-TOF) является широко используемым методом. Настоящий протокол описывает, как охарактеризовать фрагменты РНК, образующиеся после ферментативной обработки. В выбранной модели используется реакция между РНК и экзорибонуклеазой Xrn-1, где ферментативное сбраживание останавливается на окисленных участках. Две 20-нуклеотидные длинные последовательности РНК [5'-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] и [5'-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] были получены путем твердофазного синтеза, количественно оценены С помощью спектроскопии UV-vis и охарактеризованы с помощью MALDI-TOF. Полученные нити затем (1) 5'-фосфорилировали и характеризовали с помощью MALDI-TOF; (2) обработанные Xrn-1; (3) отфильтрованные и обессоленные; (4) проанализировано с помощью MALDI-TOF. Эта экспериментальная установка привела к однозначной идентификации фрагментов, связанных с остановкой Xrn-1: [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] и [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. Описанные эксперименты проводились с 200 пикомолью РНК (20 пмоль, используемых для анализа MALDI); однако более низкие количества могут привести к обнаруживаемым пикам с помощью спектрометров, использующих лазерные источники с большей мощностью, чем тот, который используется в этой работе. Важно отметить, что описанная методология может быть обобщена и потенциально расширена до идентификации продукта для других процессов, включающих РНК и ДНК, и может помочь в характеристике/выяснении других биохимических путей.
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3 является широко используемым методом для характеристики и/или обнаружения молекул различных размеров и характеристик. Некоторые из его применений включают различные приложения, такие как обнаружение танинов из природных ресурсов4, визуализация метаболитов в пище5, обнаружение или мониторинг клеточных лекарственных мишеней или маркеров6 и клиническая диагностика7, чтобы назвать несколько. Для настоящей работы имеет отношение использование MALDI-TOF с ДНК или РНК, с его использованием на олигонуклеотидах, датируемых более чем тремя десятилетиями8, где было отмечено несколько ограничений. Этот метод в настоящее время превратился в надежное, широко используемое средство для характеристики как биополимеров9, так и идентификации/понимания химических и биохимических реакций, например, характеристики платинированных участков в РНК10, идентификации фрагментов РНК после расщепления нитей 11,12 или образования поперечных связей белок-ДНК 13 . Таким образом, полезно проиллюстрировать и выделить важные аспекты использования этой техники. Основы MALDI-TOF были описаны в видеоформате, а также14 и не будут более подробно рассмотрены в настоящем документе. Кроме того, его применение в контексте ДНК или белка было ранее описано и проиллюстрировано в указанном формате 15,16,17.
Протокол обнаружения фрагментов РНК, образующихся после ферментативного гидролиза, приведен в настоящем документе. Экспериментальная модель была выбрана на основе недавнего открытия, опубликованного нашей группой18, где MALDI-TOF был использован для определения уникальной реакционной способности между экзорибонуклеазой Xrn-1 и олигонуклеотидами РНК, содержащими окислительное поражение 8-oxoG. 20-нуклеотидные длинные нити получали путем твердофазного синтеза19, [5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] и [5'-CAU GAA ACA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], в то время как Xrn-1 экспрессировали и очищали в соответствии с ранее описанным отчетом20. Короче говоря, Xrn-121 представляет собой экзорибонуклеазу 5'-3' с различными ключевыми биологическими ролями, которые разлагают несколько типов РНК, включая окисленную РНК22. Было установлено, что процессичность фермента останавливается при столкновении с 8-оксоG, что приводило к фрагментам РНК, содержащим 5'-фосфорилированные концы [5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5'-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] и [5'-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]18.
Наконец, важно отметить, что масс-спектрометрия является мощным методом, который с помощью различных методологий может быть адаптирован к другим целям23,24; таким образом, выбор правильного метода ионизации, а также других экспериментальных установок имеет первостепенное значение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Для настоящего исследования использовалась ультрачистая вода без РНКазы (таблица 1).
1. Определение концентрации раствора РНК
- Подготовьте образец РНК, выполнив следующие действия.
- Используют микроцентрифужную трубку (0,6 мл) для приготовления раствора РНК путем разбавления 1 мкл исходного раствора (полученного путем твердофазного синтеза)19 в 159 мкл Н2Oбез РНКазы. Перемешайте раствор путем повторного пипетирования смеси вверх и вниз (10x).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку в продаже доступен широкий ассортимент кювет, необходимые объемы могут отличаться. В этой работе использовались кюветы с длиной пути 1 см и уменьшенным объемом (150 мкл). - Промыть УФ-вис кювету метанолом (2x), а затем водой (сверхчистой H2O, 3x, см. Таблицу материалов). Используйте поток газообразного азота, чтобы тщательно высушить кювету.
- Используйте пипетку для переноса раствора (шаг 1.1.1) в кювету, гарантируя отсутствие пузырьков воздуха. Закройте кювету крышкой и положите ее в сторону до тех пор, пока это не понадобится.
- Используют микроцентрифужную трубку (0,6 мл) для приготовления раствора РНК путем разбавления 1 мкл исходного раствора (полученного путем твердофазного синтеза)19 в 159 мкл Н2Oбез РНКазы. Перемешайте раствор путем повторного пипетирования смеси вверх и вниз (10x).
- Определить концентрацию приготовленного раствора РНК можно с помощью УФ-вис спектрофотометра.
- Включите спектрофотометр UV-Vis, щелкнув переключателем, расположенным в задней части прибора. Разрешите инструменту завершить процедуру запуска и нажмите на значок UV WinLab , чтобы открыть окно управления прибором.
- Включите спектрофотометр контроллера температуры Пельтье с помощью переключателя, расположенного справа от прибора.
- В разделе Базовые методы нажмите Сканировать - Lambda 365. Откроется другой экран и пользователю будет предложено убедиться, что держатели ячеек пусты. Нажмите OK и позвольте инструменту проводить системные проверки. Затем система отобразит список проверок, убедитесь, что все «Pass» и нажмите OK.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется выполнить шаги 1.2.1-1.2.3 в указанном порядке; изменение этой последовательности событий может привести к сбоям в работе программного обеспечения. - Настройте параметры сканирования, выбрав Сбор данных. В новом окне в разделе Параметры сканирования измените начальное значение на 350 нм и конец на 215 нм.
- Активируйте Пельтье, выбрав + слева от Аксессуара. Нажмите на Multiple Cell Peltier, измените температуру °C на 25 и нажмите Peltier On.
- Перейдите на вкладку Сведения об образце и введите необходимое количество образцов, имен и положение ячеек.
- Нажмите на Autozero и вставьте кювету, содержащую фоновое решение. Убедитесь, что эта кювета расположена в том же слоте, где будут проводиться измерения.
- Нажмите кнопку Пуск и вставьте кювету (шаг 1.1.3) в нужную ячейку. Убедитесь, что окно кюветы ориентировано параллельно передней грани инструмента. Нажмите OK , чтобы начать первое сканирование при 25 °C.
- Для измерений при более высоких температурах повторите этапы 1.2.5-1.2.8 и измените температуру до желаемой температуры образца (90°С в данном случае).
- Нажмите «Файл > «Экспорт» и выберите нужное расположение файла. Выберите Данные XY , чтобы получить файл .txt.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иллюстративное пособие по шагу 1.2 можно найти в Дополнительном файле 1 (S1-S7).
- Осуществлять сбор данных для определения концентрации РНК.
- Найдите файл для каждого спектра на вкладке Результаты . Чтобы получить поглощение, наведите курсор на линию, перейдите к 260 нм и запишите отображаемые поглощения. Кроме того, через каскад File > Export экспортируйте данные в виде файла .txt для дальнейшего графического анализа с использованием другого программного обеспечения для построения графиков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если 0,1 < А ≥ 1, то необходимо либо разбавить, либо увеличить концентрацию образца РНК, подготовленного на этапе 1.1.1. - Используйте закон Бира-Ламберта для расчета концентрации раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Закон пива: A = εcl, где:
A: Поглощение (при 260 нм в данном случае, начиная с шага 1.3.1)
ε: Коэффициент вымирания. Для последовательности, используемой в настоящем описании, 208 000 л моль-1 см-1 является значением, полученным от инструмента OligoAnalyzer.
l: Длина пути, 1 см
c: концентрация пробы - Используйте эти расчеты для подготовки желаемого раствора РНК для использования в последующих экспериментах. В настоящем исследовании использовались растворы с [РНК] = 200 мкМ.
- Найдите файл для каждого спектра на вкладке Результаты . Чтобы получить поглощение, наведите курсор на линию, перейдите к 260 нм и запишите отображаемые поглощения. Кроме того, через каскад File > Export экспортируйте данные в виде файла .txt для дальнейшего графического анализа с использованием другого программного обеспечения для построения графиков.
2. Гидролиз олигонуклеотидов РНК методом Xrn-1
- Выполните 5' фосфорилирование РНК, следуя приведенным ниже шагам.
- Используйте микроцентрифужную трубку объемом 0,6 мл для приготовления следующего раствора (общий объем 50 мкл).
- Добавьте Н2O (33,5 мкл) без РНКазы; объемы могут варьироваться в зависимости от [РНК].
- Затем добавляют раствор А (5 л, табл. 1).
- Добавить водный раствор аденозинтрифосфата (АТФ, см. Таблицу материалов) (6 л, 10 мМ, 60 нмоль).
- Добавляют водный раствор РНК (1 мкл, 200 мкМ, 200 пмоль).
- Добавляют раствор полинуклеотидкиназы (ферментА ПНК, см. Таблицу материалов) (4,5 л, 45 ед.). Осторожно перемешайте, пипетируя смесь вверх и вниз (10x).
- Инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение 45 мин, поместив ее на водяную баню.
- Инактивируют фермент, помещая реакционную трубку в предварительно нагретый тепловой блок (65 °C) и инкубируя раствор в течение 10 мин.
- Дайте раствору остыть до комнатной температуры (фосфорилирование РНК было охарактеризовано с помощью анализа MALDI-TOF, см. Репрезентативные результаты) с получением окончательного 5'-фосфорилированного раствора РНК (4 мкМ, 50 мкл).
- Используйте микроцентрифужную трубку объемом 0,6 мл для приготовления следующего раствора (общий объем 50 мкл).
- Выполните гидролиз РНК С помощью Xrn-1, следуя приведенным ниже шагам.
- Используя раствор (50 мкл) из шага 2.1.4, выполните следующие шаги.
- Добавить раствор В (5 л, таблица 1).
- Добавьте раствор Xrn-1 (0,5 л, 1 нг, 30 фмоль). Перемешайте раствор, аккуратно пипетируя вверх и вниз (10x).
- Инкубировать реакционную трубку при комнатной температуре в течение 2 ч.
- Перенесите реакционную смесь (стадия 2.2.1.3) в центробежное устройство размером с пору 10 кДа (см. Таблицу материалов) и фильтруйте ферменты центрифугированием (700 х г в течение 10 мин при комнатной температуре).
- Перенесите фильтрат в центрифужную трубку объемом 0,6 мл.
- Промыть остаточную РНК на центробежной трубке (стадия 2.2.2.) путем добавленияН2О (20л) без РНКазы с последующим центрифугированием (700 х г в течение 10 мин при комнатной температуре).
- Соедините фильтрат с фильтратом, полученным на этапе 2.2.3.
- Храните трубку, содержащую полученный раствор, в морозильной камере (0 °C) или в отгрузке для анализа.
- Используя раствор (50 мкл) из шага 2.1.4, выполните следующие шаги.
3. Обессоливание раствора РНК, пятнистость пластин MALDI-TOF
- Обессоливайте и концентрируйте образец с помощью коммерчески доступных катионообменных наконечников пипетки C18 (см. Таблицу материалов).
- Поместите наконечник пипетки C18 объемом 10 л (наконечник пипетки, загруженный слоем хроматографического носителя C18, закрепленным на его конце) на пипетку объемом 10 мкл, а затем выполните следующие действия:
- Промыть наконечник C18 50% водным раствором ацетонитрила (10 мкл) два раза. Каждый раз выбрасывайте использованные объемы в отдельную пробирку для отходов.
- Уравновешивайте наконечник C18 водным раствором трифторуксусной кислоты (0,1% TFA, 10 мкл) два раза. Каждый раз выбрасывайте использованные объемы в отдельную пробирку для отходов.
- Вручную извлеките наконечник C18 из пипетки и закрепите его на пипетке объемом 200 мкл, содержащей наконечник пипетки P200 (наконечник C18 теперь будет прикреплен к наконечнику пипетки P200).
- Погрузите наконечник C18 в раствор (шаг 2.2.6) и аспирируйте раствор через наконечник C18 десять раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец РНК связывается с катионообменной смолой внутри наконечника. - Отсоедините наконечник C18 от пипетки P200 и поместите его на пипетку объемом 10 мкл.
- Промыть наконечник C18 водным раствором 0,1% TFA (10 мкл) два раза. Каждый раз выбрасывайте использованные объемы в отдельную пробирку для отходов.
- Дважды вымойте наконечник C18 водой без РНКазы (10 мкл). Каждый раз выбрасывайте использованные объемы в отдельную пробирку для отходов.
- Поместите наконечник пипетки C18 объемом 10 л (наконечник пипетки, загруженный слоем хроматографического носителя C18, закрепленным на его конце) на пипетку объемом 10 мкл, а затем выполните следующие действия:
- Нанесите на пластину MALDI, следуя приведенным ниже шагам.
- Элюируют олигонуклеотид РНК из наконечника С18 (стадия 3.1.1.7) путем погружения образца в желаемую матрицу (10 мкл, 1:1 раствор С и D, таблица 1) с последующим дозированием раствора обратно в пробирку. Повторите этот процесс десять раз.
- Пипетку раствором из 3.2.1 на два отдельных пятна на пластине (по 1 мкл, 20 пмоль). Дайте пятнам высохнуть на воздухе (рисунок 1A и видео 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс может быть повторен на одном и том же месте, чтобы увеличить концентрацию образца на каждом месте. - Пипетка желаемого калибранта (1 л) на двух отдельных местах, физически близких к месту нахождения образца и позволяющих высохнуть на воздухе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Испытательный стандарт, использованный в настоящем исследовании, был получен из коммерческих источников (см. Таблицу материалов). - Переложите [полностью высушенный] калибр с нужной матрицей (1 л). Дайте высохнуть на воздухе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отслеживать положение, в котором образцы и калибры обнаруживаются перед вставкой в прибор. Запишите это, используя систему координат пластины, например, образец 1 расположен в положении (C,3)
4. Сбор и обработка данных
ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, THAP требует более высокой мощности лазера для достижения ионизации. Кроме того, олиго может быть трудно ионизировать без фрагментации. Таким образом, обычно необходимо использовать как можно меньшую мощность лазера и повышать усиление детектора и / или более низкую частоту лазера, чтобы максимизировать обнаружение и свести к минимуму фрагментацию.
- Выполните сбор данных, выполнив следующие действия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения молекулярной массы проводились с использованием масс-спектрометра (см. Таблица материалов) в положительном ионном, линейном режиме с напряжением источника ионов 20 кВ, коэффициентом усиления детектора ~2,8 кВ и частотой лазера 20 Гц. Диапазоны сканирования были установлены на основе ожидаемой молекулярной массы (ов). Они были рассчитаны и выражены как масса над зарядом (м/з), где заряд составлял 1. Внешнюю калибровку проводили с использованием белковой калибровочной смеси (стандарт бактериальных испытаний, см. Таблица материалов) на месте, прилегающем к образцу. Затем необработанные данные обрабатывались в программном обеспечении flexAnalysis (см. Таблица материалов).- Откройте "Программное обеспечение Flexcontrol" для работы. Нажмите зеленую кнопку входа/выхода инструмента, подождите, пока целевая ступень переместится, и пропылесосьте, чтобы выпустить. Откройте крышку, поместите полностью высушенную целевую пластину в инструмент. Убедитесь, что выравнивание в правильной ориентации (рисунок 1B).
- Осторожно опустите крышку и нажмите зеленую кнопку входа/выхода . Подождите, пока пластина будет убрана и инструмент откачается обратно вниз. Как только строка состояния (нижний правый угол окна программного обеспечения) отобразит «Готово», приступайте к калибровке.
- Чтобы откалибровать приборы с помощью программного обеспечения, выполните следующие действия.
- Выберите нужный метод, щелкнув файл > Выбрать метод или нажав кнопку Выбрать рядом с загруженным методом. Нажмите на координату для места калибранта. Перейдите на вкладку Калибровка и убедитесь, что выбран правильный калибрант. Убедитесь , что функция «Случайное блуждание » отключена (на вкладке «Носитель образцов »).
- Нажмите кнопку Пуск и вручную направьте лазер вдоль кристалла (щелкнув стрелкой мыши в нужном месте в представлении камеры). При необходимости отрегулируйте мощность лазера. Убедившись в настройках, нажмите кнопку Пуск , чтобы собрать спектры и добавить их в буфер суммирования.
- Добавляйте спектры к сумме до тех пор, пока не будет достигнута достаточная интенсивность. Переключитесь, чтобы просмотреть только буфер суммирования, вычесть базовую линию и сгладить. Затем нажмите «Автоматическое назначение». Проверьте каждый назначенный пик и обратите внимание на ошибку ppm. Если вас устраивают задания и ошибки, нажмите кнопку Применить.
- Очистите буфер суммирования и перейдите к позиции первого образца.
- Подтвердите требуемый диапазон сканирования (вкладка 'Обнаружение'). Отрегулируйте бары в «Диапазоне масс» таким образом, чтобы зеленая область была репрезентативной для ожидаемой массы (масс).
- Нажмите непосредственно на окно Увеличение , чтобы перекрестие было ориентировано на нужный кристаллизованный фрагмент (более крупные кристаллы часто дают наилучшие результаты, рисунок 2).
- Соберите несколько спектров вдоль крупных кристаллов, регулируя мощность лазера по мере необходимости. Правильная настройка на 5%-10% выше мощности, при которой появляются пики.
- Чтобы получить спектры, выполните следующие действия.
- Нажмите кнопку Пуск , чтобы наблюдать лазерную вспышку в тандеме с возрастающей спектральной интенсивностью (показано в окне в правом верхнем углу). Перемещайте лазер по длине кристалла, щелкнув стрелкой мыши вверх и вниз по кристаллу (Видео 2).
- Нажмите «Добавить» непосредственно под «Пуском».
- Повторяйте это несколько раз до тех пор, пока не будет достигнута желаемая интенсивность/количество снимков (отражено на оси Y спектрального окна)
- Отрегулируйте мощность и/или скорость лазера и/или усиление детектора, если начальные сканирования неудовлетворительны. При необходимости повторите шаги 4.1.4.1-4.1.4.3.
- Если спектр удовлетворен, нажмите «Сохранить как», чтобы сохранить спектр под указанным именем. Затем, если требуются другие примеры, нажмите Очистить сумму и повторите шаги в шаге 4.1.4.
- Выполняйте обработку данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 4.2 описывает один из способов анализа данных с помощью программного обеспечения flexAnalysis.- Откройте нужное программное обеспечение. Затем откройте спектр (a), выбрав Файл. В раскрывающемся меню выберите Открыть.
- Откроется новое окно. Нажмите кнопку Обзор , чтобы найти файлы, сохраненные на шаге 4.1.4. Установите флажки для нужных файлов, а затем нажмите кнопку Открыть слева. Если только один спектр требует анализа, просто перетащите файл в окно программного обеспечения.
- Выделите загруженные файлы для массового анализа. Перейдите на вкладку Процесс на панели инструментов. В раскрывающемся списке выберите Вычесть базовый уровень масс-спектра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Алгоритм, используемый для вычитания, будет определяться методом, выбранным на шаге 4.1.3. - Перейдите на вкладку Процесс на панели инструментов. В раскрывающемся списке выберите Гладкий массовый спектр.
ПРИМЕЧАНИЕ: Алгоритм, используемый для сглаживания, будет определяться методом, выбранным на шаге 4.1.3. - Перейдите на вкладку Массовый список ; в раскрывающемся списке выберите Найти. Эта команда автоматически помечает пики их массами; список масс будет отображаться на экране справа.
- Чтобы добавить или удалить пики, перейдите на вкладку Список масс . В раскрывающемся списке нажмите Редактировать.
- Наведите курсор на ось X спектра; вертикальная линия представляет собой расположение спектра, в котором находится курсор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значок с графиком и курсором появится, когда новую массу можно будет добавить нажатием. Этот значок появится при наведении указателя мыши на пики, которые можно удалить, щелкнув (см. шаг 4.2.7 в дополнительном файле 1). - Повторите шаги 4.1.3-4.1.7 для получения дополнительных спектров. Экспортируйте массовый список для всех спектров, щелкнув и перетащив его, чтобы выделить файлы слева, и выполните следующее меню Каскад файлов > Экспорт > Массовый список в Excel.
- Чтобы экспортировать спектры, как показано на экране, сделайте снимок экрана или экспортируйте его как отчет. Для последнего перейдите в меню Отчет . В раскрывающемся списке выберите Сохранить как PDF.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно изменить способ отображения спектров, используя три вкладки под спектрами и/или варьируя выделенные файлы. Появится экран. Присвойте PDF-документу желаемое имя, настройте параметры/макет и нажмите кнопку Сохранить , чтобы создать изображение спектра. - Сгенерированное изображение будет отражать спектральный вид в программном обеспечении. Чтобы управлять представлением, выполните следующие действия.
- Увеличение масштаба: нажмите кнопку «Увеличить» на панели инструментов.
- Наведите курсор на ось X и нажимайте до тех пор, пока не будет достигнут нужный диапазон.
- Уменьшение/отмена: нажмите кнопку Zoom Out и щелкните в любом месте спектра, чтобы вернуться к полному просмотру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иллюстративное пособие для шагов 4.1 и 4.2 можно найти в Дополнительном файле 1 (pp S8-S23 и S24-S30, соответственно).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Олигонуклеотиды, используемые в этой работе, были синтезированы, охарактеризованы и количественно определены перед использованием. Концентрацию всех олигонуклеотидов определяли с помощью УФ-вис-спектроскопии, зарегистрированной при 90 °C, чтобы избежать ошибочных показаний, возникающих в результате потенциального образования вторичных структур. На фиг.3 показаны спектры модели олигонуклеотидов РНК, использованных в данной работе, взятых при комнатной температуре и после применения тепла.
Общая процедура, наряду со структурой окислительного поражения, которое вызывает сваливание Xrn-1, проиллюстрирована на рисунке 4. Олигонуклеотид (1) содержит один 8-оксоГ в положении-11 и находится там, где активность Xrn-1 блокируется, что приводит к остановке гидролиза цепи РНК. Важно отметить, что результаты, изображенные на этом рисунке, соответствуют экспериментам, проведенным с использованием растворов, содержащих 200 пмоль родительской нити (1), хотя на пластине было обнаружено только 20 пмоль. Важно отметить, что во всех расчетах использовалась средняя масса и что наблюдались расхождения, варьирующиеся между 1-3 единицами атомной массы (аму). На рисунке показаны два процесса: (1) эффективное 5'-фосфорилирование РНК, о чем свидетельствует появление только одного пика (1'), соответствующего ожидаемому продукту, и (2) сваливающийся фрагмент, возникающий при обработке образца смеси Xrn-1. Контрольные эксперименты, где родительскую нить обрабатывали в тех же условиях, при отсутствии киназы (PNK), и рибонуклеаза (Xrn-1) не отображала отличий от показанных на рисунке 4 (цепь РНК 1).
Те же результаты были получены с использованием другой последовательности (3), которая содержала два окислительных поражения (рисунок 5). Соответствующее фосфорилирование и ферментативная деградация дали два основных продукта, которые предполагают, что фермент последовательно останавливается на обоих участках, содержащих 8-оксоG. Как показано в масс-спектрах, соответствующих интересующим фрагментам, при взятии спектров одного и того же олигонуклеотида в разные дни наблюдалось расхождение при получении MALDI-TOF. Это проиллюстрировано на рисунке 4, где наблюдались две дополнительные атомные единицы. Результаты, изображенные на этом рисунке, соответствуют экспериментам, проведенным со 100 пмоль родительской нити (3). Важно отметить, что количественные данные могут быть получены для оценки общей эффективности биохимического процесса (и полного отслеживания с помощью MALDI-TOF) путем введения внутреннего стандарта на образцы до и после ферментативной деградации.
Рисунок 1: Пятнистость раствора РНК. (А) Пятнистость на пластине MALDI. (B) Иллюстрация размещения пластины MALDI на MALDI-спектрометре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Снимок камеры, иллюстрирующий формирование образца: кристаллы матрицы, замеченные на пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: УФ-спектры олигонуклеотидов (1) и (3), зарегистрированные при 25 °C и 90 °C соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Экспериментальный процесс получения олигонуклеотидов и масс-спектры для каждой стадии. (А) Проиллюстрированы общие этапы с использованием олигонуклеотида (1). Последовательность событий соответствует (В)5'-фосфорилированию в присутствии полинуклеотидкиназы (ПНК) с последующим (С) ферментативным гидролизом в присутствии Xrn-1. Отображаются спектры MALDI-TOF, полученные до и после обоих биохимических процессов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Спектры MALDI-TOF с использованием олигонуклеотида (3), полученные до (слева)/после (справа) обработки Xrn-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Решение | Состав | ||
| A | Tris-HCl (700 мМ), DTT (50 мМ), pH 7,6, буфер полинуклеотидкиназы T4 | ||
| B | NaCl (1 М), Tris-HCl (0,5 М), MgCl2 (0,1 М), DTT (10 мМ), pH 7,9 | ||
| C | 2,4,6-тигидроксиацетофенона моногидрат (THAP, 25 мМ), цитрат аммония (10 мМ) | ||
| D | Фторид аммония (300 мМ в 50 % ацетонитрила) | ||
| Без РНКазы H2O | Сверхчистую воду обрабатывали диэтилпирокарбонатом (DEPC, 1 мл на литр воды), инкубировали при 37 °C (12 ч) и автоклавировали (1 ч) | ||
Таблица 1: Композиции растворов, используемые в исследовании.
Видео 1: Демонстрация обнаружения на пластине MALDI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2: Демонстрация анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Дополнительный файл 1: Пошаговая иллюстрация для обработки программного обеспечения UV-vis (шаг 1.2), сбора данных MS (шаг 4.1) и обработки данных MS (шаг 4.2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основная проблема в этом рабочем процессе возникла между завершением экспериментов и проведением масс-спектрометрического анализа. Эксперименты были проведены и завершены в Университете Колорадо в Денвере и отправлены (ночью) на объекты Университета штата Колорадо. Сбор данных осуществлялся при получении, в зависимости от удобства. Несколько неожиданных обстоятельств привели к временным задержкам в процессе. В одном случае неожиданные неисправности приборов потребовали замораживания образцов (один раз в течение 21 дня) до обнаружения и приобретения; однако эта временная задержка, по-видимому, не повлияла на результат эксперимента, хотя нельзя исключать деградацию РНК (приводящую к снижению интенсивности сигнала).
Ограничение описанных экспериментов, с точки зрения концентрации РНК, заключалось в том, что эксперименты проводились с [РНК] выше, чем то, что может быть получено in vivo, для одной последовательности РНК23,24. Мы обнаружили, что когда эксперименты проводились с 20 пмоль РНК (2 пмоль, замеченные на пластине) или более низкими количествами, ожидаемых пиков не наблюдалось. Использование спектрометров с улучшенной мощностью лазера, вероятно, может привести к усилению сигнала и снижению пределов обнаружения.
Ожидается, что можно избежать этапа, на котором ферменты фильтруются (с использованием фильтрующего устройства 10 кДа) для разделения ферментов. Эксперименты, проведенные без этого шага, привели к аналогичным результатам. Тем не менее, этап фильтрации рекомендуется, если образцы должны быть отправлены или храниться в течение некоторого времени.
Предоставленные этапы могут поддаваться характеристике и пониманию нескольких биохимических процессов. Примеры могут включать характеристику процессов, включающих поврежденную ДНК25, пептиды26,27 или конъюгаты РНК28, среди многих других. В общем, мы предполагаем, что процесс, проиллюстрированный в настоящем описании, может быть применим к различным экспериментальным установкам, включающим нуклеиновые кислоты, белки, биоматериалы и/или другие биополимеры. Кроме того, разработка усовершенствованных спектрометров приведет к улучшению результатов и важным открытиям в областях, связанных с вышеупомянутыми биомолекулами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Важно отметить, что эта работа была результатом совместных усилий трех учреждений, двух исследовательских групп и одного основного объекта. Распределение и рабочая нагрузка осуществлялись следующим образом: экспрессия белка (Xrn-1) проводилась в Университете Денвера (Денвер, Штат Колорадо). Синтез, количественная оценка и эксперименты олигонуклеотидов (в основном ферментативная деградация) проводились в Университете Колорадо в Денвере (Денвер, штат Колорадо). Там же проводилась оптимизация. Обнаружение, приобретение и анализ MALDI-TOF проводились в Центре аналитических ресурсов Университета штата Колорадо. (Форт-Коллинз, Колорадо). SS хотела бы отметить гранты UROP Award (CU Denver) и Eureca (CU Denver) за поддержку. E. G.C. подтверждает поддержку со стороны NIGMS через R00GM115757. MJER подтверждает поддержку от NIGMS, через 1R15GM132816. K.B. подтверждает идентификатор ресурса: SCR_021758. Работа также была поддержана премией Teacher-Scholar Award (MJER), TH-21-028, от Фонда Генри Дрейфуса.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
References
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Analytical Chemistry. 60 (20), 2299-2301 (1988).
- Zenobi, R. Chemistry nobel prize 2002 goes to analytical chemistry. Chimia. 57, 73 (2003).
- Aristri, M. A., et al. Bio-based polyurethane resins derived from tannin: Source, synthesis, characterization, and application. Forests. 12 (11), 1516 (2021).
- Pedrazzani, C., et al. 5-n-Alkylresorcinol profiles in different cultivars of einkorn, emmer spelt, common wheat, and tritordeum. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 69 (47), 14092-14102 (2021).
- Unger, M. S., Blank, M., Enzlein, T., Hopf, C. Label-free cell assays to determine compound uptake or drug action using MALDI-TOF mass spectrometry. Nature Protocols. 16 (12), 5533-5558 (2021).
- Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiology Reviews. 36 (2), 380-407 (2012).
- Kaufmann, R. Marrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry: a novel analytical tool in molecular biology and biotechnology. Journal of Biotechnology. 41 (2-3), 155-175 (1995).
- Kiggins, C., Skinner, A., Resendiz, M. J. E. 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine inhibits or changes the selectivity of the theophylline aptamer. ChemBioChem. 21 (9), 1347-1355 (2020).
- Chapman, E. G., DeRose, V. J.
- Resendiz, M. J. E., Pottiboyina, V., Sevilla, M. D., Greengerg, M. M. Direct strand scission in double stranded RNA via a C5-pyrimidine radical. Journal of the American Chemical Society. 134 (8), 3917-3924 (2012).
- Joyner, J. C., Keuper, K. D., Cowan, J. A. Analysis of RNA cleavage by MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research. 41 (1), 2 (2013).
- Ghodke, P. P., Guengerich, P. DNA polymerases η and κ bypass N2-guanine-O6-alkylguanine DNA alkyltransferase cross-linked DNA peptides. Journal of Biological Chemistry. 297 (4), 101124 (2021).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Biochemistry. MALDI-TOF Mass Spectrometry. Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2021).
- Schrötner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of rare bacterial pathogens by 16S rRNA gene sequencing and MALDI-TOF MS. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e53176 (2016).
- Su, K. -Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57862 (2018).
- Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of antibacterial immunity proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down proteomic analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62577 (2021).
- Phillips, C. N., et al. Processing of RNA containing 8-Oxo-7,8-dihydroguanosine (8-oxoG) by the exoribonuclease Xrn-1. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 780315 (2021).
- Francis, A. J., Resendiz, M. J. E. Protocol for the solid-phase synthesis of oligomers of RNA containing a 2'-O-thiophenylmethyl modification and characterization via circular dichroism. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e56189 (2017).
- Langeberg, C. J., et al.
- Stevens, A. Purification and characterization of a Saccharomyces cerevisiae exoribonuclease which yields 5'-mononucleotides by a 5' leads to 3' mode of hydrolysis. Journal of Biological Chemistry. 255 (7), 3080-3085 (1980).
- Yan, L. L., Simms, C. L., McLoughlin, F., Vierstra, R. D., Zaher, H. S. Oxidation and alkylation stresses activate ribosome-quality control. Nature Communications. 10 (1), 5611 (2019).
- Fasnacht, M., et al. Dynamic 23S rRNA modification ho5C2501 benefits Escherichia coli under oxidative stress. Nucleic Acids Research. 50 (1), 473-489 (2022).
- Estevez, M., Valesyan, S., Jora, M., Limbach, P. A., Addepalli, B. Oxidative damage to RNA is altered by the presence of interacting proteins or modified nucleosides. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 697149 (2021).
- Tomar, R., et al. DNA sequence modulates the efficiency of NEIL1-catalyzed excision of the aflatoxin B1-induced formamidopyrimidine guanine adduct. Journal of the American Chemical Society. 34 (3), 901-911 (2021).
- Gaffney, A., et al. HIV-1 env-dependent cell killing by bifunctional small-molecule/peptide conjugates. ACS Chemical Biology. 16 (1), 193-204 (2021).
- Sikorski, E. L., et al. Selective display of a chemoattractant agonist on cancer cells activates the formyl peptide receptor 1 on immune cells. ChemBioChem. , 202100521 (2022).
- Kubo, T., Nishimura, Y., Sato, Y., Yanagihara, K., Seyama, T. Sixteen different types of lipid-conjugated siRNAs containing saturated and unsaturated fatty Acids and exhibiting enhanced RNAi potency. ACS Chemical Biology. 16 (1), 150-164 (2021).
