Summary
MALDI−TOFを用いて、酸化されたRNAとエキソリボヌクレアーゼXrn−1との間の反応性から得られた断片を特徴付けた。本プロトコルは、RNAおよび/またはDNAを含む他のプロセスに適用できる方法論を記載する。
Abstract
RNAは生命のすべてのドメインに存在する生体高分子であり、他の分子および/または反応種、例えばDNA、タンパク質、イオン、薬物、およびフリーラジカルとの相互作用は遍在している。その結果、RNAは、その切断、分解、または修飾を含む様々な反応を受け、別個の機能および含意を有する生物学的に関連する種をもたらす。1つの例は、グアニンの7,8−ジヒドロ−8−オキソグアニン(8−oxoG)への酸化であり、これは活性酸素種(ROS)の存在下で起こり得る。全体として、このような製品と変換を特徴付ける手順は、科学界にとって主に価値があります。この目的のために、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間(MALDI−TOF)質量分析法は広く使用されている方法である。本プロトコールは、酵素処理後に形成されたRNA断片を特徴付ける方法を記載する。選択されたモデルは、RNAとエキソリボヌクレアーゼXrn-1との間の反応を使用し、酵素消化は酸化部位で停止する。2つの20ヌクレオチド長のRNA配列[5'-CAUガアACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU]および[5'-CAUガアACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU]を固相合成によって得、UV-vis分光法によって定量し、MALDI-TOFを介して特徴付けた。次いで、得られた鎖を(1)5'-リン酸化し、MALDI−TOFを介して特徴付け;(2)Xrn-1で処理する工程;(3)濾過および脱塩;(4)マルディ-TOFを介して分析する。この実験セットアップは、Xrn-1の失速に関連する断片の明確な同定につながった:[5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU]、[5'-H2 PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG) cua aaa gu]、および[5'-H2PO4-(8-oxoG) cua aaa gu]。記載された実験を、200個のピコモールのRNA(MALDI分析に20pmol使用した)を用いて実施した。しかし、量が少ないと、この作業で使用されたものよりも強力なレーザー光源を使用する分光器で検出可能なピークが生じる可能性があります。重要なことに、記載された方法論は一般化され、RNAおよびDNAを含む他のプロセスの産物同定に拡張することができ、他の生化学的経路の特性評価/解明に役立つ可能性がある。
Introduction
MALDI-TOF 1,2,3は、さまざまなサイズおよび特性の分子の特性評価および/または検出に広く使用されている技術です。その用途には、天然資源4からのタンニンの検出、食品中の代謝産物のイメージング5、細胞薬物標的またはマーカーの発見またはモニタリング6、臨床診断7など、さまざまな用途が含まれます。本研究に関連するのは、DNAまたはRNAを用いたMALDI-TOFの使用であり、オリゴヌクレオチドに対するその使用は30年以上前にさかのぼる8、そこでいくつかの制限が指摘された。この技術は、現在、生体高分子9の両方を特徴付け、化学的および生化学的反応を同定/理解するために、信頼性が高く一般的に使用される手段、例えば、RNA10中の白金化部位の特性評価、鎖切断後のRNA断片の同定11、12、またはタンパク質-DNA架橋の形成13に進化した。.したがって、この手法を使用する際の重要な側面を説明し、強調することは有益です。MALDI-TOFの基本は、ビデオフォーマットで説明されており、14と同様に、本明細書ではさらに詳しく説明しない。さらに、DNAまたはタンパク質の文脈におけるその適用は、前記フォーマット15、16、17において以前に記載および例示されている。
酵素加水分解後に形成されるRNA断片を検出するためのプロトコールが本明細書に報告される。実験モデルは、我々のグループ18によって発表された最近の知見に基づいて選択され、MALDI-TOFを用いて、酸化的病変8-oxoGを含むRNAのエキソリボヌクレアーゼXrn-1とオリゴヌクレオチドとの間のユニークな反応性を決定した。20ヌクレオチド長鎖を固相合成19、[5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU]および[5'-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) cua AAA GU]により得、Xrn-1は前述の報告20に従って発現および精製した。簡単に言えば、Xrn−121は、酸化RNA22を含む複数のタイプのRNAを分解する様々な重要な生物学的役割を有する5'−3'エキソリボヌクレアーゼである。8-oxoGに遭遇すると酵素のプロセス性が失速し、5'-リン酸化末端[5'-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU]、[5'-H2PO 4-(8-oxoG)(8-oxoG)cua AAA GU]、および[5'-H2PO4-(8-oxoG)CUA AAA GU]18を含むRNA断片が生じたことが判明した。
最後に、質量分析は、様々な方法論を通じて、他の目的に適合させることができる強力な方法であることに注意することが重要です23,24。したがって、適切なイオン化方法と他の実験セットアップを選択することが最も重要です。
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Protocol
RNase非含有の超純水(表1)を本研究に用いた。
1. RNA溶液の濃度決定
- 以下の手順に従ってRNAサンプルを調製する。
- 微量遠心管(0.6 mL)を使用して、1 μLのストック溶液(固相合成 により 得られた)19を159 μLのRNaseフリーH2Oに希釈してRNA溶液を調製する。
注:幅広いキュベットが市販されているため、必要な容量が異なる場合があります。この作業では、1cmの経路長および減少した体積(150μL)のキュベットを使用した。 - UV-visキュベットをメタノール(2x)ですすぎ、続いて水(超高純度H2O、3x、 材料表を参照)をすすいでください。窒素ガスの流れを使用してキュベットを完全に乾燥させます。
- ピペットを使用して溶液をキュベットに移し(ステップ1.1.1)、気泡がないことを確認します。キュベットをキャップし、必要になるまで横に置きます。
- 微量遠心管(0.6 mL)を使用して、1 μLのストック溶液(固相合成 により 得られた)19を159 μLのRNaseフリーH2Oに希釈してRNA溶液を調製する。
- 調製したRNA溶液の濃度をUV-vis分光光度計を用いて決定する。
- UV-Vis分光光度計の電源を入れるには、機器の背面にあるスイッチを切り替えます。計測器が起動手順を完了できるようにし、 UV WinLab アイコンをクリックして計測器の操作/制御ウィンドウを開きます。
- ペル チェ温度コントローラ 分光光度計の電源を入れ、機器の右側にあるスイッチを使用します。
- [基本メソッド] で、[スキャン - ラムダ 365] をクリックします。別の画面が開き、セルホルダーが空であることを確認するようにユーザーに求めます。OKをクリックし、計測器がシステムチェックを実行できるようにします。その後、システムはチェックのリストを表示し、すべての「合格」を確認して[OK]をクリックします。
注: 手順 1.2.1-1.2.3 を指定された順序で実行することをお勧めします。この一連のイベントを変更すると、ソフトウェアの誤動作につながる可能性があります。 - データ収集を選択してスキャンパラメータを調整し ます。[ スキャン設定] の下の新しいウィンドウで 、[開始 ]を 350 nmに、[ 終了] を 215 nmに変更します。
- アクセサリーの左側にある+を選択してペルチェをアクティブにします。[マルチセルペルチェ]をクリックし、[温度°C]を25に変更して、[ペルチェオン]をクリックします。
- 「サンプル 情報」 タブに移動し、必要に応じてサンプル数、名前、およびセル位置を入力します。
- オートゼロをクリックし、背景溶液を含むキュベットを挿入します。このキュベットは、測定が行われるスロットと同じスロットに必ず配置してください。
- [ スタート ]をクリックし、キュベット(ステップ1.1.3)を目的のセルに挿入します。キュベット窓が器具の前面と平行に向いていることを確認します。[ OK ]をクリックして、25°Cで最初のスキャンを開始します。
- より高い温度での測定の場合は、手順1.2.5~1.2.8を繰り返し、温度を所望のサンプル温度(この場合は90°C)に変更します。
- [ ファイル>エクスポート] をクリックし、目的のファイルの場所を選択します。[ XY データ ] を選択して、.txt ファイルを取得します。
メモ: ステップ 1.2 の例示的な助けは 補足ファイル 1 (S1-S7) にあります。
- RNA濃度を決定するためのデータ取得を行う。
- [結果] タブで各スペクトルのファイルを見つけます。吸光度を得るには、線の上にカーソルを合わせ、260nmに移動して、表示された吸光度を記録します。または、ファイル>エクスポートカスケードを使用して、データを.txtファイルとしてエクスポートし、他のプロットソフトウェアを使用してさらにグラフィカルに分析します。
注:A<0.1が1≥場合、ステップ1.1.1で調製したRNAサンプルの濃度を希釈または増加させる必要があります。 - ビール・ランバートの法則を使用して、溶液の濃度を計算します。
注: ビールの法則: A = εcl、ここで:
A:吸光度(この場合は260nmで、ステップ1.3.1から)
ε: 消衰係数。本明細書で使用される配列について、208,000 L mol−1 cm−1は、オリゴアナライザーツールから得られた値である。
l: パスの長さ、1 cm
c:試料の濃度 - これらの計算を使用して、後続の実験に使用するRNAの所望の溶液を調製する。[RNA]=200μMの溶液を本研究に使用した。
- [結果] タブで各スペクトルのファイルを見つけます。吸光度を得るには、線の上にカーソルを合わせ、260nmに移動して、表示された吸光度を記録します。または、ファイル>エクスポートカスケードを使用して、データを.txtファイルとしてエクスポートし、他のプロットソフトウェアを使用してさらにグラフィカルに分析します。
Xrn-1によるRNAのオリゴヌクレオチドの加水分解
- 以下の手順に従ってRNAの5'リン酸化を行う。
- 0.6 mL マイクロ遠心チューブを使用して、以下の溶液(総容量50 μL)を調製した。
- RNaseフリーH2O(33.5 μL)を加える。ボリュームは [RNA] によって異なる場合があります。
- 次いで、溶液A(5L、 表1)を添加する。
- アデノシン三リン酸(ATP、 材料表参照)の水溶液(6L、10mM、60nmol)を加える。
- RNA水溶液(1 μL、200 μM、200 pmol)を加える。
- ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK酵素、 材料表を参照のこと)溶液(4.5L、45単位)を加える。混合物を上下にピペッティングして穏やかに混ぜる(10倍)。
- 反応混合物を水浴に入れて37°Cで45分間インキュベートする。
- 反応管を予熱したヒートブロック(65°C)に入れ、溶液を10分間インキュベートして酵素を失活させた。
- 溶液を室温まで冷却し(RNA リン酸化は MALDI-TOF 分析 によって 特徴付けられました、代表的な結果を参照)、最終的な 5'-リン酸化 RNA 溶液 (4 μM, 50 μL) を得た。
- 0.6 mL マイクロ遠心チューブを使用して、以下の溶液(総容量50 μL)を調製した。
- 以下の手順に従ってXrn-1によるRNA加水分解を行う。
- ステップ2.1.4の溶液(50 μL)を用いて、以下のステップを実行する。
- 溶液B(5L、 表1)を加える。
- Xrn-1(0.5L、1ng、30fmol)の溶液を加える。溶液を静かに上下にピペッティングして混合します(10倍)。
- 反応管を室温で2時間インキュベートする。
- 反応混合物を10 kDaの細孔サイズの遠心装置( 材料表を参照)に移し(ステップ2.2.1.3)、遠心分離(室温で10分間700 x g )によって酵素をろ過する。
- ろ液を0.6 mLの遠沈管に移す。
- 遠心管上の残留RNAをRNase非含有H2O(20L)を加えて洗浄し(ステップ2.2.2)、遠心分離(室温で700 x g、10分間)を行った。
- 濾液をステップ2.2.3から得られたものと組み合わせます。
- 得られた溶液を含むチューブを冷凍庫(0°C)または分析のために船に保管する。
- ステップ2.1.4の溶液(50 μL)を用いて、以下のステップを実行する。
3. RNA溶液の脱塩、MALDI-TOFプレートスポッティング
- 市販の陽イオン交換C18ピペットチップを用いてサンプルを脱塩および濃縮する( 材料表を参照)。
- 10 L C18 ピペットチップ (ピペットチップの端に固定された C18 クロマトグラフィー培地のベッドをロードしたピペットチップ) を 10 μL ピペットの上に置き、次に続行します。
- C18チップを50%アセトニトリル水溶液(10μL)で2回洗浄する。使用済みの容量は、毎回別の廃管に廃棄してください。
- C18チップをトリフルオロ酢酸水溶液(0.1% TFA、10 μL)で2回平衡化する。使用済みの容量は、毎回別の廃管に廃棄してください。
- C18 チップをピペットから手動で取り外し、P200 ピペットチップが入った 200 μL のピペットに固定します (C18 チップが P200 ピペットチップに取り付けられます)。
- C18チップを溶液に浸し(ステップ2.2.6)、C18チップを通して溶液を10回吸引放出する。
注:RNAサンプルは、先端内部の陽イオン交換樹脂に結合します。 - C18チップをP200ピペットから取り外し、10 μLのピペットの上に置きます。
- 0.1% TFA(10 μL)の水溶液を用いてC18チップを2回洗浄する。使用済みの容量は、毎回別の廃管に廃棄してください。
- C18チップをRNaseフリーの水(10 μL)で2回洗浄します。使用済みの容量は、毎回別の廃管に廃棄してください。
- 10 L C18 ピペットチップ (ピペットチップの端に固定された C18 クロマトグラフィー培地のベッドをロードしたピペットチップ) を 10 μL ピペットの上に置き、次に続行します。
- 以下の手順に従ってMALDIプレートにスポットを当てます。
- サンプルを所望のマトリックス(10μL、CおよびDの1:1溶液、 表1)に浸漬することによって、C18チップからRNAオリゴヌクレオチドを溶出し(ステップ3.1.1.7)、続いて溶液をチューブに戻して分注する。このプロセスを 10 回繰り返します。
- 溶液を3.2.1からプレート上の2つの別々のスポット(それぞれ1μL、20pmol)にピペットで移します。スポットを空気乾燥させます(図1A および ビデオ1)。
注:このプロセスを同じスポットで繰り返して、各スポットのサンプル濃度を高めることができます。 - 所望のキャリブラント(1L)を試料位置に物理的に近い2つの別々のスポットにピペットし、風乾させる。
注:本研究で用いた試験標準は、市販の情報源から得られたものである( 材料表参照)。 - [完全に乾燥させた]キャリブラントを目的のマトリックス(1 L)に重ねます。風乾させます。
メモ:機器に挿入する前に、サンプルとキャリブラントが斑点となる位置を追跡することが重要です。プレート座標系を使用してこれをメモします(たとえば、サンプル1は位置(C,3)にあります)。
4. データの取得と処理
注:一般に、THAPはイオン化を達成するためにより高いレーザー出力を必要とします。さらに、オリゴは断片化せずにイオン化することが困難な場合があります。したがって、通常、検出を最大化し、フラグメンテーションを最小限に抑えるために、できるだけ低いレーザー出力を使用し、検出器のゲインおよび/またはレーザー周波数を下げる必要があります。
- 以下の手順でデータ集録を実行します。
注:分子量測定は質量分析計を用いて行った( 材料表)を陽イオンで、イオン源電圧20kV、検出器ゲイン2.8kV、レーザー周波数20Hzのリニアモードで使用し、スキャン範囲は予想される分子量に基づいて設定した。これらは計算され、電荷が1であった質量過電荷(m / z)として表された。外部較正は、タンパク質較正混合物を用いて実施した(細菌試験標準、 材料表)を試料に隣接するスポット上に配置した。その後、生データは flexAnalysis ソフトウェアで処理されました ( 材料表).- 「フレックスコントロールソフトウェア」を開いて操作します。楽器の緑色の 入出力 ボタンを押し、ターゲットステージが動くのを待ち、真空で通気します。蓋を開け、完全に乾燥したターゲットプレートを機器に入れます。正しい方向に揃っていることを確認します(図1B)。
- 蓋を慎重に下ろし、緑色の 入出力 ボタンを押します。プレートが引っ込められ、機器がポンプで下ろされるのを待ちます。ステータスバー(ソフトウェアウィンドウの右下隅)に「準備完了」と表示されたら、キャリブレーションを続行します。
- ソフトウェアを使用して機器を校正するには、次の手順を実行します。
- 目的のメソッドを選択するには、[ ファイル] > [メソッドの選択 ] をクリックするか、読み込まれたメソッドの横にある [選択] ボタンを押します。キャリブラン ト スポットの座標をクリックします。「キャリ ブレーション」 タブに移動し、正しいキャリブラントが選択されていることを確認します。 ランダムウォーク がオフになっていることを確認します( サンプルキャリア タブ内)。
- スタートボタンを押し、手動でクリスタルに沿ってレーザーを向けます(カメラビューの目的の位置でマウス矢印をクリックします)。必要に応じて、レーザー出力を調整します。設定に満足したら、[開始]を押してスペクトルを収集し、合計バッファに追加します。
- 十分な強度に達するまで、スペクトルを合計に追加します。合計バッファーのみを表示し、ベースラインを減算して、滑らかに切り替えます。次に、[ 自動割り当て]をクリックします。割り当てられた各ピークを確認し、ppm誤差を書き留めます。割り当てとエラーに満足したら、[ 適用]をクリックします。
- 合計バッファーをクリアし、最初のサンプルの位置に移動します。
- 目的のスキャン範囲を確認します([検出]タブ)。「質量範囲」のバーを調整して、緑色の領域が予想される質量を表すようにします。
- 拡大ウィンドウを直接クリックして、十字線が目的の結晶化フラグメントに向くようにします(多くの場合、結晶が大きいほど最良の結果が得られます(図2)。
- 大きな結晶に沿っていくつかのスペクトルを収集し、必要に応じてレーザー出力を調整します。適切な設定は、ピークが現れる電力の 5% ~ 10% 上です。
- スペクトルを得るには、以下を実行します。
- [ 開始 ]をクリックして、スペクトル強度の増加と並行してレーザーフラッシュを観察します(右上のウィンドウに表示)。水晶を上下にマウス矢印をクリックして、水晶の長さに沿ってレーザーを動かします(ビデオ2)。
- スタート画面のすぐ下にある[追加]をクリックします。
- 目的の強度/ショット数に達するまでこれを数回繰り返します(スペクトルウィンドウのY軸に反映されます)
- 最初のスキャンが満足のいくものでない場合は、レーザーのパワー、速度、検出器のゲインを調整します。必要に応じて、手順 4.1.4.1 ~ 4.1.4.3 を繰り返します。
- スペクトルに満足したら、[名前 を付けて保存 ]をクリックして、指定した名前でスペクトルを保存します。次に、他のサンプルが必要な場合は、[ クリア合計 ]をクリックし、手順4.1.4の手順を繰り返します。
- データ処理を実行します。
メモ: ステップ 4.2 では、flexAnalysis ソフトウェアを使用してデータを分析する 1 つの方法について説明します。- 目的のソフトウェアを開きます。次に、[ ファイル]を選択してスペクトル(a)を開きます。ドロップダウン メニューから、[ 開く] を選択します。
- 新しいウィンドウが表示されます。 [参照] をクリックして、手順4.1.4から保存したファイルを見つけます。目的のファイルのチェックボックスをオンにし、左側の[ 開く ]をクリックします。分析が必要なスペクトルが 1 つだけの場合は、ファイルをドラッグしてソフトウェア ウィンドウにドロップするだけです。
- 一括分析用に読み込まれたファイルを強調表示します。ツールバーの「 プロセス 」タブに移動します。ドロップダウンで、「 マススペクトルベースラインを減算」を選択します。
注: 減算に使用されるアルゴリズムは、ステップ 4.1.3 で選択した方法によって決定されます。 - ツールバーの「 プロセス 」タブに移動します。ドロップダウンで、[ マススペクトルのスムーズ]を選択します。
注: 平滑化に使用されるアルゴリズムは、ステップ 4.1.3 で選択した方法によって決定されます。 - [マスリスト]タブをクリックします。ドロップダウンで、[検索] を選択します。このコマンドは、ピークに質量を自動的にラベル付けします。質量のリストが右側の画面に表示されます。
- ピークを追加または削除するには、[ マスリスト] タブに進みます。ドロップダウンで、[ 編集]をクリックします。
- スペクトルの x 軸にカーソルを合わせます。垂直線は、カーソルが置かれているスペクトルの位置を表します。
メモ: グラフとカーソルのアイコンは、クリックして新しい質量を追加できるときに表示されます。このアイコンは、クリックして削除できるピークにカーソルを合わせると表示されます( 補足ファイル1の手順4.2.7を参照)。 - 追加のスペクトルについて、手順 4.1.3 ~ 4.1.7 を繰り返します。クリックしてドラッグして左側のファイルを強調表示し、次のメニューのカスケードファイルを実行して、すべてのスペクトルの質量リストをエクスポートし、次のメニュー>カスケード を実行します > マスリストをExcelにエクスポートします。
- 画面に表示されるスペクトルをエクスポートするには、スクリーンショットを撮るか、レポートとしてエクスポートします。後者の場合は、[ レポート ] メニューに移動します。ドロップダウンで、「 PDF として保存」を選択します。
注:スペクトルの表示方法は、スペクトルの下にある3つのタブを使用して、および/または強調表示されたファイルを変更することができます。画面がポップアップ表示されます。必要に応じてPDFドキュメントに名前を付け、設定/レイアウトを調整し、[ 保存 ]をクリックしてスペクトルの画像を生成します。 - 生成された画像は、ソフトウェアプログラムのスペクトルビューを反映します。ビューを操作するには、次の手順に従います。
- ズームイン: ツールバーの 「ズームイン 」ボタンをクリックします。
- X 軸にカーソルを合わせ、目的の範囲に達するまでクリックします。
- ズームアウト/元に戻す: ズームアウト ボタンをクリックし、スペクトル内の任意の場所をクリックしてフルビューに戻ります。
注: ステップ 4.1 および 4.2 の例示的な援助は 補足ファイル 1 (それぞれ pp S8-S23 および S24-S30) にあります。
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Representative Results
この作業で使用したオリゴヌクレオチドは、使用前に合成、特性評価、および定量を行った。すべてのオリゴヌクレオチドの濃度は、二次構造の潜在的な形成から生じる誤った読み取り値を避けるために、90°Cで記録されたUV-vis分光法 を介して 決定された。 図3 は、この作業で用いたRNAのモデルオリゴヌクレオチドを、室温で、かつ熱を加えた後に採取したスペクトルを示す。
全体的な手順は、Xrn−1失速を引き起こす酸化的病変の構造と共に、 図4に示されている。オリゴヌクレオチド(1)は、位置−11に1つの8−oxoGを含み、Xrn−1活性が遮断され、RNA鎖の加水分解が停止する場所である。重要なことに、この図に描かれた結果は、200pmolの親鎖を含む溶液(1)を用いて実施された実験に対応するが、プレート上には20pmolのみが斑点を付けられた。すべての計算で平均質量が使用され、1〜3原子質量単位(amu)間で異なる不一致が観察されたことに注意することが重要です。この図は、(1)RNAの効率的な5'-リン酸化、予想される生成物に対応する(1')ピークが1つだけ出現することによって証明され、(2)Xrn-1によるサンプル混合物の処理から生じるストールフラグメントの2つのプロセスを示しています。 リボヌクレアーゼ(Xrn-1)は 、図4 に示すもの(RNA鎖1)との差異を示さなかった。
2つの酸化病変を含む異なる配列(3)を用いても同じ結果が得られた(図5)。対応するリン酸化および酵素分解は、酵素が8−oxoGを含む両方の部位で連続的に失速することを示唆する2つの主要な生成物を生じた。目的の断片に対応するマススペクトルに描かれているように、同じオリゴヌクレオチドのスペクトルを異なる日に撮影すると、MALDI−TOF取得時に不一致が観察された。これを 図4に示し、2つの追加の原子単位が観察された。この図に描かれた結果は、100pmolの親鎖を用いて行われた実験(3)に対応する。酵素分解の前後にサンプルに内部標準を導入することによって、生化学的プロセスの全体的な効率(およびMALDI−TOF による 完全な追跡)を評価するために定量的データが得られる可能性があることに注意することが重要です。
図1:RNA溶液のスポッティング。 (A)MALDIプレートへのスポッティング。(B)MALDI分光計へのMALDIプレートの配置の説明図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: サンプルの形成を示すカメラ ショット: プレート上に付着したマトリックス結晶。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:オリゴヌクレオチド(1)および(3)のUV-visスペクトルをそれぞれ25°Cおよび90°Cで記録した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:オリゴヌクレオチド調製の実験工程と各工程の質量スペクトル。事象の配列は、ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)の存在下での(B)5'−リン酸化、続いてXrn−1の存在下での(C)酵素加水分解に対応する。両方の生化学的プロセスの前後に得られたMALDI-TOFスペクトルが表示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:オリゴヌクレオチド(3)を用いたMALDI-TOFスペクトル(Xrn-1による処理前(左)/後(右)のXrn-1処理後。
| 解決 | 組成 | ||
| ある | トリス塩酸 (700 mM)、DTT (50 mM)、pH 7.6、T4 ポリヌクレオチドキナーゼバッファー | ||
| B | NaCl (1 M), Tris-HCl (0.5 M), MgCl2 (0.1 M), DTT (10 mM), pH 7.9 | ||
| C | 2,4,6-チヒドロキシアセトフェノン一水和物(THAP、25mM)、クエン酸アンモニウム(10mM) | ||
| D | フッ化アンモニウム (300 mM in 50 % aq. アセトニトリル) | ||
| RNaseフリーH2O | 超純水をジエチルピロカーボネート(DEPC、水1リットルあたり1mL)で処理し、37°Cでインキュベートし(12時間)、オートクレーブ処理(1時間) | ||
表1:試験に用いた溶液組成物。
ビデオ1:MALDIプレート上でのスポッティングのデモンストレーション。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ 2: データ分析の概要を示すデモ。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:UV-visソフトウェア(ステップ1.2)、MSデータ収集(ステップ4.1)、およびMSデータ処理(ステップ4.2)を処理するためのステップバイステップの図。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このワークフローの主な課題は、実験の完了と質量分析の実行の間に生じました。実験はコロラド大学デンバー校で実施され、完了し、コロラド州立大学の施設に(一晩)出荷された。データ取得は、便宜上、受領時に実施した。いくつかの予期せぬ状況により、プロセスの時間遅れが発生しました。ある例では、予期せぬ機器の誤動作により、発見と取得の前にサンプルを凍結(21日間1回)する必要がありました。しかし、この時間の遅れは実験結果に影響を与えていないようであったが、RNAの分解(シグナル強度の低下につながる)を排除することはできない。
記載された実験の限界は、RNA濃度に関して、単一のRNA配列23、24について、インビボで得ることができるものよりも高い[RNA]を用いて実験を行ったことであった。我々は、20pmolのRNA(プレート上に2pmolのスポット)またはそれより低い量で実験を行った場合、期待されるピークは観察されないことを見出した。レーザー出力が向上した分光器を使用すると、信号が強化され、検出限界が低くなる可能性があります。
酵素を分離するために酵素を濾過する工程(10kDa濾過装置を使用)を回避できることが期待される。この工程を行わずに実施した実験も同様の結果をもたらした。ただし、サンプルを出荷またはしばらく保管する場合は、ろ過ステップをお勧めします。
提供されるステップは、いくつかの生化学的プロセスを特徴付けおよび理解するのに従順であり得る。例としては、損傷したDNA25、ペプチド26、27、またはRNAコンジュゲート28を含むプロセスの特性評価など、多くのものを含み得る。一般に、本明細書に例示されるプロセスは、核酸、タンパク質、生体材料、および/または他の生体高分子を含む様々な実験セットアップに適用可能である可能性があると我々は推測する。さらに、強化された分光計の開発は、前述の生体分子を含む分野における強化された結果と重要な発見につながるでしょう。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、3つの機関、2つの研究グループ、1つのコア施設間の共同作業であったことに注意することが重要です。分布および作業負荷を以下のように実施した:タンパク質(Xrn−1)発現は、デンバー大学(コロラド州デンバー)で行った。オリゴヌクレオチドの合成、定量、および実験(主に酵素分解)をコロラド大学デンバー校(コロラド州デンバー)で行った。最適化もそこで行われました。MALDI-TOFの発見、取得、分析は、コロラド州立大学の分析資源コアファシリティで実施されました。(コロラド州フォートコリンズ)。SSはUROP賞(CUデンバー)とユーレカ助成金(CUデンバー)の支援を認めたいと思います。E. G.C. は、R00GM115757 を介して NIGMS からのサポートを認めています。MJER は、1R15GM132816 を介して NIGMS からのサポートを認識しています。K.B. はリソース ID: SCR_021758 を確認します。この研究は、ヘンリー・ドレフュス財団の教師学者賞(MJER)、TH-21-028によっても支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.6 mL MCT Graduated Violet | Fisher Scientific | 05-408-127 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Adenosine triphosphate, 10 mM | New Englang Bioscience | P0756S | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Bruker bacterial test standard | Bruker Daltonics | 8255343 | |
| Commercial source of Xrn-1 | New England BioLabs | M0338S | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Flex analysis software | Bruker daltonics | FlexAnalysis software version 3.4, Bruker Daltonics | |
| Lambda 365 UV-vis spectrophotometer | Perkin Elmer | ||
| MALDI plate: MSP 96 ground steel target | Bruker Daltonics | 280799 | |
| Mass Spectrometer | Bruker | Microflex LRFTOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Billerica, MA) | |
| Mili-Q IQ 7000 | Milipore Sigma | A Mili-Q system was used to purify all water used in this work | |
| Nanosep Centrifugal Devices with OmegaTM Membrane 10 K, blue (24/pkg) | Pall Corporation | OD010C33 | filter media, Omega (modified polyethersulfone) 10 K pore size |
| NEBuffer 3 | New England Biolabs | B7003S | This is solution B |
| Oligo Analyzer tool | IDT-DNA | https://www.idtdna.com/calc/analyzer | |
| Pipette tips P10 | Fisher Scientific | 02-707-441 | |
| Pipette tips P200 | Fisher Scientific | 02-707-419 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201S | |
| T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0201S | This is solution A |
| Triflouroacetic Acid | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| Xrn-1 exoribonuclease | Expressed in house | See ref. 20 | |
| ZipTip Pipette Tips for Sample preparation | Millipore | ZTC 18S 096 | 10 µL pipette tips loaded with a C18 standard 0.6 µL bed |
References
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