Summary
Kardiothoraciske kirurgiske modeller hos mus >7 dage gamle kræver intubation, men dette er udfordrende for præadolescent (8-14 dage gamle) musehvalpe, og der er lidt information om bedøvelsesregimer til intubation. Her præsenterer vi doseringsregimer af ketamin / xylazin / atropin i 10 dage gamle C57BL / 6J museunger, der tillader endotracheal intubation, samtidig med at dyredødeligheden minimeres.
Abstract
Murine kirurgiske modeller spiller en vigtig rolle i præklinisk forskning. Mekanistisk indsigt i myokardieregenerering efter hjerteskade kan opnås fra kardiothoraciske kirurgiske modeller hos 0-14 dage gamle mus, hvis kardiomyocytter i modsætning til voksne bevarer proliferativ kapacitet. Museunger op til 7 dage gamle immobiliseres effektivt af hypotermi og kræver ikke intubation til kardiothoracisk kirurgi. Preadolescent (8-14 dage gamle) museunger kræver dog intubation, men dette er udfordrende, og der er lidt information om anæstesi for at lette intubation. Her præsenterer vi doseringsregimer af ketamin / xylazin / atropin i 10 dage gamle C57BL / 6J museunger, der tillader endotracheal intubation, samtidig med at dyredødeligheden minimeres. Empirisk titrering af ketamin/xylazin/atropindoseringsregimer til legemsvægt indikerede, at responsen på anæstesi hos museunger af forskellig vægt var ikke-lineær, hvorved doser på 20/4/0,12 mg/kg, 30/4/0,12 mg/kg og 50/6/0,18 mg/kg lettede intubation af hvalpe, der vejer mellem 3,15-4,49 g (n = 22), 4,50-5,49 g (n = 20) og 5,50-8,10 g (n = 20), henholdsvis. Hvalpe med lavere kropsvægt krævede flere intubationsforsøg end tungere hvalpe (p < 0,001). Overlevelse efter intubation korreleret med kropsvægt (59%, 70% og 80% for henholdsvis lav-, mellem- og højvægtsgrupper,R2 = 0,995). Til myokardieinfarktkirurgi efter intubation blev et kirurgisk anæstesiplan induceret med 4,5% isofluran i 100% ilt og opretholdt med 2% isofluran i 100% ilt. Overlevelsen efter operationen var ens for de tre vægtgrupper med 92%, 86% og 88% (p = 0,91). Sammen med forbedringer i dyrehåndteringspraksis til intubation og kirurgi og minimering af kannibalisering ved dæmningen efter operationen korrelerede den samlede overlevelse for hele proceduren (intubation plus kirurgi) med kropsvægt (henholdsvis 55%, 60% og 70% for lav-, mellem- og højvægtsgrupper, R2 = 0,978). I betragtning af vanskelighederne med intubation af 10-dages gamle hvalpe og den tilhørende høje dødelighed anbefaler vi, at kardiothoracisk kirurgi hos 10-dages gamle hvalpe begrænses til hvalpe, der vejer mindst 5,5 g.
Introduction
Murine-modeller er uvurderlige værktøjer i præklinisk kardiothoracisk forskning, især på grund af den lethed, hvormed genetisk konstruerede muselinjer kan genereres, og også den lethed, hvormed musene kan manipuleres kirurgisk for at give patologiske sygdomsmodeller for at tillade for eksempel undersøgelse af myokardieregenerering efter hjerteskade1 . I denne henseende er det interessant, at i modsætning til voksne mus, hvor kardiomyocytter har trukket sig tilbage fra cellecyklussen, reparerer 0-2 dage gamle neonatale musehjerter med minimal ardannelse efter apikal resektion eller induktion af myokardieinfarkt 2,3,4. I modsætning hertil regenererer 7 dage gamle neonatale hjerter ufuldstændigt med en højere forekomst af ardannelse 2,3. Da kardiomyocytter i toppen af venstre ventrikel bevarer proliferativ kapacitet i op til 2 uger efter fødslen, kan mekanistiske undersøgelser af regenerering efter hjerteskade hos 0-14 dage gamle mus være informative til identifikation af terapeutiske mål for regenerering af det skadede voksne hjerte5.
Udviklingen af musemodeller af hjerteskade involverer kirurgisk manipulation under anæstesi. Dette kræver, at brystkassen åbnes for at få adgang til hjertet, hvilket generelt kræver intubation og mekanisk ventilation. Musebelastning, kropsvægt og alder påvirker følsomheden over for anæstetika6. Voksne mus kan bedøves med en lang række midler, et almindeligt regime for intubation er ketamin / xylazin / atropin ved 100/13/0,5 mg / kg 6,7. Neonatale mus (0-7 dage gamle) mangler en centraliseret smerterefleks og kan effektivt immobiliseres på is og udsættes for kirurgi uden intubation 6,8,9. Preadolescent (8-14 dage gamle) museunger kan ikke bedøves med hypotermi 9,10; de kræver intubation til kardiothoracic kirurgi. Der er ingen tidligere undersøgelser af kardiothoracic kirurgi i præadolescent mus mindre end 14 dage gamle. Det er vores erfaring, at intubation af isofluranbedøvede præadolescente mus under 14 dage er vanskelig. Det anbefalede injicerbare bedøvelsesregime rapporteret for mus ældre end 7 dage er 50-150 mg / kg ketamin og 5-10 mg / kg xylazin10. Preadolescent mus udvikler sig stadig neurologisk, og deres reaktioner på stoffer og lægemiddelmetabolisme er meget forskellige fra voksne dyr6. Dette udgør øget risiko for væske-, elektrolyt- og syre-base ubalance samt hypoglykæmi og hypotermi på grund af ikke kun deres høje stofskifte, som hurtigt nedbryder deres begrænsede energilagre, men også på grund af deres termoregulerende umodenhed 6,11,12. Der er således lidt information om bedøvelsesregimer, der både letter intubation og maksimerer overlevelsen af præadolescente mus.
Her titrerede vi empirisk doseringsregimer af ketamin / xylazin / atropin i 10 dage gamle C57BL / 6J museunger, der spænder i vægt fra 3-8 g for at opnå et anæstesiplan, der er tilstrækkeligt til at tillade endotracheal intubation til efterfølgende kardiothoracisk kirurgi, samtidig med at dyredødeligheden minimeres. Vi har også forbedret dyrehåndteringspraksis for at reducere dødeligheden fra intubation, kirurgi og postkirurgisk maternel kannibalisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne dyreforsøg blev godkendt af Garvan / St Vincent's Hospital Animal Ethics Committee i overensstemmelse med den australske adfærdskodeks for pleje og brug af dyr til videnskabelige formål og ARRIVE-retningslinjerne, og alle forsøg blev udført af en erfaren lille dyrekirurg (JW) med vejledning fra en pædiatrisk anæstesilæge (JJS).
1. Forberedelse af instrumenter
- På operationsdagen opsættes specialudstyr til intubation af 10 dage gamle hvalpe (figur 1A,B). Dette inkluderer en opvarmningslampe, intubationsplatform, fiberoptisk lys, små tang, et laryngoskop formet af et stykke kobbertråd med en diameter på 0,02 mm (60 mm i længden med enden af ledningen formet til en cirkel med en diameter på 3 mm i en vinkel på 175 °; Figur 1B) og en 24-gauge plast intravenøs (i.v.) kanyle, der bruges som et endotracheal rør.
- Sørg for, at kanylen består af en 19 mm lang plastslange (0,7 mm OD), der er fastgjort til en 21 mm plastlåsadapter (figur 1B). Stiv kanylens slange ved at indsætte et stykke kobbertråd via luerlåsadapteren. Brug en kanyle med et samlet volumen på 130 μL til en mus med tidevandsvolumen på ~8 μL/g13,14.
2. Anæstesi af 10 dage gamle mus
- På operationsdagen fjernes dæmningen fra et bur med 10 dage gamle C57BL/6J-hvalpe, og buret placeres på en varmepude (37 °C).
- Anæstetik hvalpe med 10 μL intraperitoneal injektion pr. g legemsvægt ved hjælp af en 0,5 ml insulinsprøjte og 29 G nål med ketamin/xylazin/atropin i de forhold, der er beskrevet i tabel 1 for forskellige vægtklasser.
- Umiddelbart efter injektionen anbringes hvalpen i et opvarmet (37 °C) plexiglaskammer, der er blevet præoxygeneret med 100 % ilt.
3. Intubation af 10 dage gamle mus
- Efter 3-4 minutters iltning overføres hvalpen til en platform til intubation i det væsentlige som for voksne mus. Udfør dette med hvalpen i liggende stilling (figur 1C) eller ophængt i en 45° vinkel15. Oprethold temperaturen med en opvarmningslampe.
- Før intubation skal du vurdere dybden af anæstesi ved hjælp af poteklemmerefleksen. For optimal intubation skal poteklemmerefleksen stadig være til stede, men markant reduceret fra et bevidst dyrs.
- Efter at have fastgjort den bedøvede hvalp liggende til en intubationsplatform (figur 1C), skal du holde tungen med små tang og bruge et laryngoskop formet af et stykke kobbertråd (figur 1B) for at udsætte glottis og stemmebånd. Hjælp visualisering af stemmebåndene ved transbelysning med et fleksibelt fiberoptisk lys (figur 1D).
- Brug en stivnet kanyle til at vippe kanylen, så luerlåsenden er lidt lavere (~ 10 °) end spidsen, og så snart stemmebåndene adskilles, skal du indsætte kanylen og fremme den, indtil luerlåsadapteren er lige uden for munden. Fjern ledningen umiddelbart efter intubation.
BEMÆRK: Der forventes ingen resistens under intubation hos mus i denne alder, medmindre kanylen er fremskreden for langt, og resistens mærkes fra carinaen.- Vurder dybden af anæstesi efter intubation ved dyrets evne til at trække vejret spontant. Bekræft vellykket trakeal intubation af spontant vejrtrækningshvalpe ved kortvarigt at blokere intubationskateteret for at kontrollere, at dette forhindrer brystbevægelse.
- Overfør straks den intuberede hvalp til en varmepude (37 ° C) og tilslut endotrachealkanylen til en ventilator, der leverer 100% ilt ved en strømningshastighed på 1 L / min med 30 μL / slag, 40 μL / slagtilfælde eller 50 μL / slag for henholdsvis 3,15-4,59 g, 4,50-5,49 g eller 5,50-8,10 g hvalpe og 150 slag / min.
- Udfør disse procedurer hurtigt inden for <15 s for at minimere genindånding.
4. Myokardieinfarktoperation af 10 dage gamle mus
- For at inducere et kirurgisk anæstesiplan til kirurgi skal du skifte gassen, der strømmer ind i ventilatoren, fra 100% ilt til 4,5% isofluran i ilt (isoflurankoncentrationen bestemmes af en fordamper) i 4-5 minutter.
- Efter at have skiftet til isofluran, skal du bekræfte trakeal intubation igen ved at kontrollere, at hyppigheden af brystvægsbevægelse svarer til ventilatorens. Tab af spontan vejrtrækning efterfulgt af fravær af en hale- eller poteklemmerefleks indikerer, at et kirurgisk anæstesiplan er nået (efter 4-5 min).
- Oprethold anæstesi med 2% isofluran i ilt.
- Udfør myokardieinfarktkirurgi under et kirurgisk mikroskop (10x og 16x mål) som beskrevet i16.
- Desinficer huden i en cirkulær bevægelse flere gange med skiftevis runder af en jodbaseret eller chlorhexidinbaseret skrubbe og 70% alkohol. Brug en fin saks til at lave et vandret hudsnit mellem den tredje og fjerde ribben (fjerde interkostale rum) i brystets venstre sidevæg. Brug fine tang til at åbne brystkassen ved stump dissektion af det interkostale rum og brug en retraktor til at holde rummet åbent.
- Inducer et myokardieinfarkt ved ligering af venstre koronararterie lige distal til venstre atriale vedhæng med 9-0 polypropylenmonofilamentsutur. Efter ~10 minutters infarktoperationen skal du lukke huden med 7-0 prolen og desinficere snittet med betadin. Rengør hvalpen for blod med 70% ethanol eller saltvand.
BEMÆRK: Ligering af venstre kranspulsåre hos præadolescent hvalpe er i det væsentlige blodløs, som det er med voksne ligeringer. - Administrer den ene efter den anden med en 0,5 ml insulinsprøjte og 29 G nål: atipamezol (1-5 mg / kg, 10 μL, intraperitoneal) til hurtig genopretning efter sedation, analgesi (buprenorphin, 0,075 mg / kg, 10 μL, subkutan) og saltvand (50 μL, intraperitoneal).
- Lad dyrene komme sig ved at afbryde isofluranen. Sørg for, at spontan vejrtrækning genoptages inden for få minutter derefter.
- Sæt hvalpen tilbage til det opvarmede præ-iltede kammer, og overvåg kontinuerligt under genopretningen, indtil den oprettende refleks genvindes, hvorefter hvalpen ekstuberes.
- Gnid forsigtigt hvalpen med hjemmeburstrøelse, hold hvalpen varm, kontroller, at vejrtrækningen er regelmæssig, og at hvalpen er i stand til spontan bevægelse. Dette vil reducere kannibalisme efter operationen ved dæmningen.
- Returner dæmningen til buret, når alle hvalpe er kommet sig helt efter anæstesi.
BEMÆRK: Den samlede tid, det tager til forberedelse, anæstesi, intubation, kirurgi og genopretning af en hvalp, kan variere fra 40-60 minutter. - Husdæmning og hvalpe natten over i et bur placeret halvt på / halvt fra en 37 ° C varmepude.
5. Vurdering efter operation af infarktstørrelse
- På 3. dag efter operationen bedøves hvalpe ved at placere dem i et plexiglaskammer, der er forækvilibreret med 4,5% isofluran i ilt ved 1 ml / min strømningshastighed.
- Når et kirurgisk anæstesiplan er nået (efter 4-5 minutter), vurderet af poteklemmerefleksen, skal du fjerne hvalpen fra kammeret og sikre i liggende stilling på en varmepude ved at tape halen.
- Placer en tråd over fortænderne og tape på plads for at holde hovedet udstrakt, og læg hovedet i en næsekegle, der er forbundet med en ventilator, der leverer 4,5% isofluran i ilt ved 200 μL / slag, 150 slag / min. Oprethold et kirurgisk anæstesiplan med 2% isofluran i ilt.
- Desinficer huden med 70% ethanol. Brug en fin saks til at lave et snit på 1 cm i huden over den højre fælles halspulsåre langs luftrøret og kannulere den udsatte beholder ved hjælp af et enkelt lumenpolyethylenrør (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) til at administrere 0,2 ml hepariniseret saltvand (200 U) i 1 minut for at forhindre blodkoagulation.
- Forøg isofluran til 4,5% i ilt i 1 min, før du hurtigt administrerer 0,2 ml 3,3 M KCl inden for 2 s for at arrestere hjertet i diastol.
- Disseker den højre jugular vene via det samme snit og transect det. Perfuse hjertet med 0,2 ml fosfatbufferet saltvand (PBS), og perfus derefter med 0,1 ml 0,2% Alcian Blue for at plette det ikke-infarkterede fjerntliggende myokardium. Kontroller vellykket perfusion, der fremgår af udvaskning af blod, PBS og derefter Alcian Blue via halsvenen.
- Åbn brystkassen og skær hjertet ud ved at dissekere det omgivende bindevæv og kar for at frigive hjertet. Skyl hjertet i PBS, fjern atrierne, hvis det ønskes, og fotografer hjertet med et kamera monteret på et kirurgisk mikroskop ved hjælp af et 10x mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anæstesi af 10 dage gamle mus. De 10 dage gamle hvalpe kan bedøves med 4,5% isofluran på 4-5 min; Men de kommer sig fra anæstesi i forberedelsesprocessen til intubation. På grund af deres lille størrelse er intubation under isofluranbedøvelse leveret af en standard næsekegle ikke mulig. Vi har tidligere brugt et ketamin/xylazin/atropinbedøvelsesregime på henholdsvis 100/13/0,5 mg/kg til hjertekirurgi hos 15- og 21-dagesårige hvalpe og voksne 4,7. I indledende forsøg, der omfattede ilttilskud, blev det konstateret, at det anbefalede injicerbare regime på 50-150 mg / kg ketamin og 5-10 mg / kg xylazin 10 resulterede i en uacceptabel dødelighed hos10 dage gamle hvalpe. I betragtning af den omvendte sammenhæng mellem kropsvægt og kuldstørrelse af 10 dage gamle hvalpe (R2 = 0,250, p < 0,0001; Figur 2), titrerede vi bedøvelsesregimet i henhold til kropsvægtgrupperinger. Reduktion af ketamin / xylazin / atropindosis til henholdsvis 50/6/0,18 mg / kg resulterede i en tilstrækkelig dybde af anæstesi til at tillade endotracheal intubation af spontant vejrtrækningshvalpe, der vejer 5,5-8,10 g (tabel 1), men denne dosis blev ikke tolereret af lettere hvalpe. Reduktion af ketamin / xylazin / atropindosis til henholdsvis 30/4/0,12 mg / kg muliggjorde intubation af hvalpe, der vejer 4,50-5,49 g, mens yderligere reduktion af ketamindoseringen til 20 mg / kg muliggjorde intubation af hvalpe, der vejer 3,15-4,49 g (tabel 1). Tabel 1 viser antallet og procentdelen af intuberede hvalpe, der fortsatte til operation; Det er imidlertid vanskeligt at udtrække anæstesirelateret dødelighed fra dødelighed forbundet med for mange intubationsforsøg fra disse data. For at reducere spild af dyr kvantificerede vi ikke specifikt anæstesirelateret dødelighed.
Intubation af 10 dage gamle mus. Resultaterne var bedst, når intubation blev opnået efter kun et eller to forsøg. Hvalpe med en lavere kropsvægt var sværere at intubere end tungere hvalpe og krævede flere forsøg (p < 0,001; Tabel 1). Overlevelse efter intubation korreleret med kropsvægt med 59%, 70% og 80% overlevelse for henholdsvis lav-, mellem- og højvægtsgrupper (R2 = 0,995, p = 0,04; Tabel 1).
Myokardieinfarkt kirurgi af 10 dage gamle mus. Hvalpe blev overvåget i 2 dage efter operationen. Der var ingen tegn på smerter efter operationen. Af de hvalpe, der ikke overlevede til opfølgning ved 48 timer (tabel 1), døde en fra lavvægtsgruppen 6 timer efter operationen, en hvalp fra hver af mellem- og højvægtsgrupperne døde, før den blev placeret tilbage med dæmningen, og en hvalp fra hver af mellem- og højvægtsgrupperne blev kannibaliseret af dæmningen inden for 16 timer efter operationen, med små kropsdele eller intet tilbage næste morgen. Overlevelse 2 dage efter myokardieinfarktkirurgi var konsistent mellem de forskellige vægtgrupper ved 86% -92% (p = 0,91; Tabel 1). Infarktmyokardium, som vurderet 2 dage efter operationen ved alcianblå perfusion af hjertet, var tydelig ved klar afgrænsning af farvet, ikke-infarkt (blå) fra iskæmisk (ufarvet) væv, distal til ligeringen (figur 1E).
Samlet overlevelse for hele proceduren (intubation plus kirurgi) korrelerede med hvalpens kropsvægt ved henholdsvis 55%, 60% og 70% for lav-, mellem- og højvægtsgrupper (R2 = 0,978, tabel 1), selvom denne korrelation ikke opnåede statistisk signifikans (p = 0,09).
Figur 1: Endotracheal intubation af en 10 dage gammel C57BL/6J musehvalp . (A) Intubationsopsætning, der viser stor opvarmningslampe (WL), intubationsplatform (IP) og fleksibel fiberoptisk belysning (FL), der bruges til at hjælpe visualisering af stemmebåndene på intubationstidspunktet. (B) Pincet, laryngoskop, 24-gauge kanyle, der bruges som et endotracheal rør, og et stykke kobbertråd, der indsættes i endotrachealrøret via luerlåsadapteren for at afstive kanylen under intubation (skalastang = 1 cm). (C) Den bedøvede hvalp fastgøres liggende ved at tape halen og forbenene på intubationsplatformen (12 cm (L) x 8,5 cm (B) x 7,5 cm (H)). En tråd placeret over fortænderne bruges til at forlænge hovedet og tapes på plads. (D) Det fiberoptiske lys placeres over halsen for at transbelyse luftrøret lige under stemmebåndene. Tungen holdes med små tang, og derefter visualiseres bevægelsen af stemmebåndene ved at udsætte glottis med laryngoskopet. Det endotrakeale rør indsættes i luftrøret, mens stemmebåndene er åbne. (E) Fotografi af et repræsentativt musehvalphjerte perfunderet med Alcian blå (frontal visning med bunden af hjertet øverst og toppen i bunden og atrier fjernet) 48 timer efter ligering (sort sutur, sort pil) af venstre kranspulsåre taget under et kirurgisk mikroskop (10x mål) monteret med et kamera. Ikke-infarktet myokardium er farvet blåt, infarkt myokardium i toppen er ufarvet og bleg; skala bar = 100 μm. Dette tal er ændret fra17. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kropsvægt af 10 dage gamle C57BL/6-hvalpe er omvendt korreleret med kuldstørrelse. Hvalpe var fra kuld i størrelse fra 4-10. Den gennemsnitlige størrelse på C57BL/6 er syv18. Data blev analyseret ved simpel lineær regression, hvor p < 0,05 blev betragtet som signifikant. Dette tal er ændret fra17. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Anæstesiregime: ketamin / xylazin / atropin (mg / kg); angivet i 10 ml/g kropsvægt, ip | Kropsvægt, g | Antal undersøgte hvalpe | Intubationsforsøg (A, 1-2; B, 3-4 eller C, >4) og antal hvalpe intuberet, n (%) | Intuberede hvalpe, der fortsætter til operation, n (%) | Overlevelse to dage efter operationen, n (%) | Samlet overlevelse efter intubation plus operation, n (%) | ||
| En | B | C | ||||||
| 20/4/0.12 | 3.15 - 4.49 | 22 | 8 (36) | 9 (41) | 5 (23) | 13 (59) | 12 (92) | 12 (55) |
| 30/4/0.12 | 4.50 - 5.49 | 20 | 13 (65) | 5 (25) | 2 (10) | 14 (70) | 12 (86) | 12 (60) |
| 50/6/0.18 | 5.50 - 7.30 | 20 | 13 (65) | 3 (15) | 4 (20) | 16 (80) | 14 (88) | 14 (70) |
| p (Chi-firkantet test) | s<0,001 | p=0,91 | ||||||
| R2 (Korrelationskoefficient, | 0.995, | 0.978, | ||||||
| p-værdi) | p=0,04 | p=0,09 | ||||||
Tabel 1: Anæstesiregime, antal intubationsforsøg og overlevelse efter proceduren af 10 dage gamle museunger. Data blev analyseret ved Chi-kvadreret test, hvor p < 0,05 blev betragtet som signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I øjeblikket er der ingen veldokumenterede metoder til anæstesi og intubation af 10 dage gamle mus til kardiothoracisk kirurgi. Til dette formål har vi titreret ketamin / xylazin / atropin doseringsregimer til legemsvægt, hvorved doser på 20/4/0,12 mg / kg, 30/4/0,12 mg / kg og 50/6/0,18 mg / kg lettede intubation af hvalpe med lav (3,15-4,49 g), mellem (4,50-5,49 g) og høj (5,50-8,10 g) kropsvægt. Overlevelse efter intubation korreleret med kropsvægt (59%, 70% og 80% for henholdsvis lav-, mellem- og højvægtsgrupper. I betragtning af vanskelighederne med intubation af 10-dages gamle hvalpe og den tilhørende høje dødelighed anbefaler vi, at kardiothoracisk kirurgi hos 10-dages gamle hvalpe begrænses til dyr, der vejer mindst 5,50 g. En begrænsning af denne intubationsteknik er, at den er afhængig af operatørens dygtighed og erfaring, og hvor hurtigt de kan lære. Det forventes dog, at en operatør med erfaring i voksenintubationer kan opnå færdigheder i præadolescent intubation efter at have øvet sig på 10 kuld på syv til otte hvalpe. En anden begrænsning er, at den samlede hvalpeoverlevelse efter intubation og myokardieinfarktkirurgi varierede fra 55% (laveste kropsvægtgruppe) til 70% (højeste kropsvægtgruppe). Ikke desto mindre svarer dette til den 60% -70% overlevelse, der er rapporteret for 1 dag gamle hvalpe, som ikke kræver intubation, når de udsættes for myokardieinfarkt efter immobilisering på is8.
Vi fandt ud af, at 10 dage gamle museunger med forskellig vægt havde et ikke-lineært respons på ketamin / xylazin / atropinbedøvelsesregimen. Dette kan afspejle udviklingsforskellene på en række vigtige områder. Basal metabolisk hastighed skaleres allometrisk til massens trekvarte kraft, fra enkeltceller til pattedyr19. Dette ville påvirke lægemiddeldisponeringen hos dyrene i undersøgelsen, som varierede i vægt med to og en halv gang. Modenheden af lægemiddelmetabolisme eller afgiftningsmekanismer er en anden faktor, der ændrer sig hurtigt i den umiddelbare postnatale periode, ligesom mekanismer, der påvirker tilgængeligheden af frie lægemidler, såsom proteinbinding20. Farmakokinetiske forskelle er muligvis ikke den eneste forklaring på ikke-lineære lægemiddeleffektforhold, da forskelle i farmakodynamiske reaktioner på beroligende midler også er mulige6. Anvendelsen af iltning efter intraperitoneal injektion af anæstetika og før intubation forbedrede sandsynligvis procedurens sikkerhed, som det for nylig er blevet bemærket for voksne21. Yderligere justeringer i dosering, især for den laveste kropsvægt gruppe, kan forbedre overlevelsen.
Dybden af anæstesi var afgørende for vellykket intubation. Intubation var vanskelig, hvis anæstesiplanet var for let, og hvis det var for dybt, stoppede hvalpe med at trække vejret spontant, enten under intubation eller efter intubation, mens de blev ventileret med ilt. Håndtering af hvalpe forårsagede også undertiden vejrtrækning, især under intubation. Hvis vejrtrækningen stoppede under intubation, var stimulering af foden eller halen eller tilbagevendende hvalpe til det opvarmede iltfyldte kammer afgørende for at genoprette regelmæssig vejrtrækning. Intubation blev forsøgt igen, da hvalpen genoptog regelmæssig vejrtrækning. Hvis vejrtrækningen stoppede efter intubation, blev dyrene ventileret i op til 10 minutter med ilt. Hvis spontan vejrtrækning genoptages i løbet af denne tid, fortsatte dyrene til operation. Vi fandt imidlertid, at hvis spontan vejrtrækning ikke blev genoprettet inden for denne tid, kom hvalpe sig ikke efter anæstesi eller, hvis de blev udsat for kirurgi, døde i genopretningsperioden.
I betragtning af det høje stofskifte hos 10 dage gamle hvalpe er det bedst at begrænse udtømning af energilagre ved at adskille dæmningen fra sine hvalpe i så kort tid som muligt og dermed begrænse antallet af kirurgiske operationer til fire eller fem hvalpe pr. Kuld pr. Dag over en maksimal periode på 5-6 timer. For at reducere moderens kannibalisme hos hvalpe, der havde gennemgået kirurgi, blev eventuelle kuldkammerater, der ikke blev opereret, fjernet til plejemødre eller aflivet, før dæmningen vendte tilbage til buret. Vores håndteringspraksis for at reducere dødeligheden fra postkirurgisk maternel kannibalisme lignede dem, der er rapporteret for nyfødte9.
Afslutningsvis antyder vores gennemførlighedsundersøgelse, at et injicerbart ketamin / xylazin / atropinbedøvelsesregime, der er betydeligt lavere end det, der anvendes til ældre mus, er påkrævet for at minimere dødeligheden ved intubation af 10 dage gamle museunger til efterfølgende kardiothoracisk kirurgi, ligesom specifikke håndteringspraksis for at reducere dødeligheden fra intubation, kirurgi og postkirurgisk maternel kannibalisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NHMRC Program Grant [ID 1074386], et Leducq Transatlantic Network of Excellence in Cardiovascular Research grant [RMG] og et tilskud fra RT Hall Trust [RMG & SEI].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole (Antisedan) | Provet (NSW) Pty Ltd | ATIP I | |
| Atropine 600 mcg/mL | Clifford Hallam Healthcare Pty Ptd | 1957699 PFIZER-0143386 | |
| Betadine | Livingstone International | BU0520 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Provet (NSW) Pty Ltd | TEMG I | |
| Fiber-optic light | Leica | 3011350 | CLS 150X |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 9.1.2 | |
| Intubation platform | - | - | Any sturdy box (e.g. plastic tip box) with approximate dimensions 12 (L) x 8.5 x (W) x 7.5 cm (H) |
| Isoflurane | Provet (NSW) Pty Ltd | ISOF 07 | |
| Ketamine 100 mg/mL | Provet (NSW) Pty Ltd | KETAI1 | |
| Plastic intravenous cannula 24-gauge Polywin Safety | BD Insyte | CE0086 | 19 mm length of plastic tubing (0.7 mm outer diameter) attached to a 21mm plastic female luer lock adaptor; total volume of annula 130 μL |
| Single lumen polyethylene tube | Critchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSW | Outer diameter 0.61 mm, inner diameter 0.28 mm | |
| Small forceps | F.S.T. | NO 11051-10 | |
| Surgical microscope (camera optional) | Leica | M651 (Leica IC80 HD camera) | 10x and 16x objective |
| Suture 7-0 prolene | Ethicon | 8708H | |
| Suture 9-0 polypropylene monofilament | Ethicon | 2813 | |
| V-1 Tabletop with Active Scavenging isoflurane anesthesia systm | VetEquip | 901820 | |
| Vented 2-Liter plexiglass induction chamber | VetQuip Pty Ltd | 942102 | 25 cm (L) x 13 cm (W) x 11 cm (H) |
| Warming lamp | Brilant Lighting | 99223 | |
| Xylazine | Provet (NSW) Pty Ltd | XYLA Z 2 |
References
- Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovascular Research. 74 (1), 29-38 (2007).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Bogush, N., et al. DUSP5 expression in left ventricular cardiomyocytes of young hearts regulates thyroid hormone (T3)-induced proliferative ERK1/2 signaling. Scientific Reports. 10 (1), 21918 (2020).
- Flecknell, P. Laboratory Animal Anaesthesia. Third edition. , Elsevier Inc. (2009).
- Iismaa, S. E., et al. Cardiac hypertrophy limits infarct expansion after myocardial infarction in mice. Scientific Reports. 8 (1), 6114 (2018).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Boston University Institutional Animal Care and Use Committee. Anesthesia and Analgesia: Neonatal Mice and Rats. , Available from: https://www.bu.edu/researchsupport/compliance/animal-care/working-with-animals/anesthesia/anesthesia-and-analgesia-neonatal-mice-and-rats-iacuc/ (2019).
- University of Texas at Austin Animal Resources Center. Mouse-Specific Anesthesia Guidance. , Available from: https://research.utexas.edu/qpcontent/uploads/sites/7/2020/02/Mouse_Anesthesia_guidance_ARC_112519.pdf (2019).
- Paddleford, R. Manual of Small Animal Anaesthesia. Second edition. , Masson. (2000).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Daubenspeck, J. A., Li, A., Nattie, E. E. Acoustic plethysmography measures breathing in unrestrained neonatal mice. Journal of Applied Physiology. 104 (1), 262-268 (2008).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visulaized Experiments. (90), e51755 (2014).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Du, X. -J., Gao, X., Ramsey, D. Surgical methods of inducing transverse aortic stenosis and myocardial infarction in the mouse. Asia Pacific Heart Journal. 7 (3), 187-192 (1998).
- Wu, J., et al. Anesthesia and intubation of 10-Day old C57BL/6J mouse pups for cardiothoracic surgery. Research Square. , (2021).
- Silver, L. M. Mouse Genetics: Concepts and Applications. Mouse Genome Informatics, The Jackson Laboratory. , (2008).
- West, G. B., Woodruff, W. H., Brown, J. H. Allometric scaling of metabolic rate from molecules and mitochondria to cells and mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, Suppl 1 2473-2478 (2002).
- Moscovitz, J. E., Aleksunes, L. M. Establishment of metabolism and transport pathways in the rodent and human fetal liver. International Journal of Molecular Science. 14 (12), 23801-23827 (2013).
- Blevins, C. E., Celeste, N. A., Marx, J. O. Effects of oxygen supplementation on injectable and inhalant anesthesia in C57BL/6 mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 60 (3), 289-297 (2021).
