Summary
Denna artikel föreslår en ny generation av multiparametriska analysplattformar med ökad genomströmning för karakterisering av extracellulära vesikelundergrupper. Metoden är baserad på en kombination av multiplexerade biosensormetoder med metrologiska och morfomekaniska analyser med atomkraftmikroskopi, tillsammans med Ramanspektroskopi, för att kvalificera vesikulära mål fångade på ett mikroarraybiochip.
Abstract
Extracellulära vesiklar (EV) är membranhärledda, små vesiklar som produceras av alla celler som sträcker sig från 50 till flera hundra nanometer i diameter och används som ett medel för intercellulär kommunikation. De framträder som lovande diagnostiska och terapeutiska verktyg för en mängd olika sjukdomar. Det finns två huvudsakliga biogenesprocesser som används av celler för att producera EV med skillnader i storlek, sammansättning och innehåll. På grund av deras höga komplexitet i storlek, sammansättning och cellursprung kräver deras karakterisering en kombination av analytiska tekniker. Detta projekt omfattar utveckling av en ny generation av multiparametriska analysplattformar med ökad genomströmning för karakterisering av delpopulationer av elbilar. För att uppnå detta mål utgår arbetet från den nanobioanalytiska plattformen (NBA) som inrättats av gruppen, som möjliggör en originalundersökning av EV baserat på en kombination av multiplexerade biosensormetoder med metrologiska och morfomekaniska analyser genom atomkraftmikroskopi (AFM) av vesikulära mål fångade på ett mikroarraybiochip. Målet var att komplettera denna EV-undersökning med en fenotypisk och molekylär analys med Raman-spektroskopi. Denna utveckling möjliggör förslag till en multimodal och lättanvänd analytisk lösning för diskriminering av EV-undergrupper i biologiska vätskor med klinisk potential
Introduction
Det växande intresset för EV-forskning inom diagnostik och terapi 1,2,3,4,5, i kombination med de utmaningar som detta område står inför, har resulterat i utveckling och implementering av en mängd olika metoder och tekniker för att kvantifiera eller karakterisera dessa vesiklar. De mest använda metoderna för EV-identifiering är proteinspecifik immunoblot och proteomik för att bekräfta ursprunget till EV, transmissionselektronmikroskopi (TEM) för att bekräfta deras struktur och nanopartikelspårningsanalys (NTA) för att kvantifiera deras antal och storleksfördelning i en provvolym.
Ingen av dessa tekniker på egen hand ger dock all information som krävs för att karakterisera EV-delmängder. Den inneboende heterogeniteten hos elfordon på grund av mångfalden i deras biokemiska och fysikaliska egenskaper hindrar globala analyser som är tillförlitliga och reproducerbara, särskilt för elfordon som ingår i en blandning (råprov). Detektions- och karakteriseringsmetoder behövs därför för elfordon, både individuellt och generellt för att komplettera andra metoder som är snabbare men inte selektiva6.
Högupplöst avbildning med TEM (eller kryoTEM) eller AFM gör det möjligt att bestämma morfologin och metrologin hos elfordon med nanometrisk upplösning 7,8,9,10,11,12. Den huvudsakliga begränsningen av användningen av elektronmikroskopi för biologiska föremål, såsom EV, är emellertid behovet av ett vakuum för att genomföra studien som kräver fixering och uttorkning av provet. Sådan beredning gör det svårt att översätta från de observerade strukturerna till EV-morfologin i lösningen. För att undvika denna uttorkning av provet är tekniken för kryoTEM den mest lämpliga för EV-karakterisering13. Det används ofta för att bestämma ultrastrukturen hos elbilar. Immunmärkning av vesiklar med biofunktionaliserade guldnanopartiklar gör det också möjligt att identifiera specifika subpopulationer av EV och skilja dem från andra partiklar som finns i ett komplext biologiskt prov. På grund av det låga antalet EV som analyseras med elektronisk mikroskopi är det emellertid ofta svårt att utföra en karakterisering som är representativ för ett komplext och heterogent prov.
För att avslöja denna storleksheterogenitet föreslår International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) att man analyserar ett tillräckligt antal widefield-bilder, åtföljda av mindre bilder, för att avslöja enskilda elbilar med hög upplösning14. AFM är ett alternativ till optiska metoder och elektroniska diffraktionstekniker för studier av EV. Denna teknik använder en skarp spets som hålls av en flexibel utskjutare som skannar provet deponerat på ett stöd, rad för rad, och justerar avståndet mellan spetsen och elementen som finns genom en återkopplingsslinga. Detta gör det möjligt att karakterisera provets topografi och samla in morfomekanisk information15,16,17,18. EV: erna kan skannas av AFM antingen efter att ha deponerats på ett atomiskt plant substrat eller efter att ha fångats på ett specifikt substrat funktionaliserat av antikroppar, peptider eller aptamerer för att karakterisera de olika subpopulationerna18,19. På grund av dess förmåga att kvantifiera och samtidigt undersöka strukturen, biomekaniken och det membranösa biomolekylära innehållet i EV inom komplexa biologiska prover utan behov av förbehandling, märkning eller uttorkning, används AFM nu alltmer för att karakterisera EV på ett fint och multiparametriskt sätt under fysiologiska temperatur- och mediumförhållanden.
Detta dokument föreslår en metod som använder ett kärnguldbiochip som kan (bio) kemiskt funktionaliseras i ett multiplexerat format. Detta substrat är hörnstenen i en kraftfull analytisk plattform som kombinerar biodetektion av EV-delmängder genom ytplasmonresonans, och när EV: erna är adsorberade / ympade eller immunfångade på chipet möjliggör AFM den metrologiska och morfomekaniska karakteriseringen av EV: erna. Tillsammans med Raman-signaturen för EV-delmängderna som fångats på chipet, möjliggör denna analytiska plattform kvalificering av EV: er som finns i biologiska prover på ett etikettfritt sätt och utan behov av föranalytiska steg. Detta dokument visar att kombinationen av kraftfulla tekniker, med hjälp av en mycket rigorös metod för substratberedning och datainsamling, gör EV-analysen djup, definitiv och robust.
Principen för det föreslagna tillvägagångssättet är att förbereda ett guldsubstrat, att adsorbera / ympa eller fånga EV-undertyperna och att skanna dem med AFM för att uppskatta storleken och morfologin för varje EV-delmängd. Dessutom analyseras de adsorberade EV: erna med Raman-spektroskopi. Detta substrat kan faktiskt presentera tre typer av gränssnitt av växande komplexitet: nakna, kemiskt funktionaliserade eller ligandmikroarrayer. Innan de olika stegen i protokollet beskrivs hänvisas läsarna till den schematiska presentationen av den nanobioanalytiska plattformen (NBA) -metoden i figur 1, som kombinerar ytplasmonresonansavbildning (SPRi), AFM och spektroskopi.
Figur 1: NanoBioAnalytical plattformen. Tillvägagångssättet kombinerar (A) ytplasmonresonansavbildning, (B) atomkraftmikroskopi och infraröd / Raman (nano) spektroskopi, alla engagerade på samma substrat - ett multiplexerat guldchip. Förkortningar: NBA = NanoBioAnalytical plattform; SPRi = ytplasmonresonansavbildning; AFM = atomkraftmikroskopi; EV = extracellulär vesikel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kärnguldbiochipet utgör plattformens hjärta eftersom alla etikettfria karakteriseringstekniker utförs på detta biochip. Enligt behoven hos EV-karakteriseringen (antingen globala / totala EV eller EV-delmängder) och begränsningarna / kraven på de använda metoderna har tre typer av guldbiochipytor utvecklats: antingen "naken", kemiskt funktionaliserad "C11 / C16" eller ligandbiofunktionaliserad, kallad "ligand" guldyta.
Det nakna biochipet, kallat "naket", möjliggör enkel adsorption av elbilar på guld. Det är möjligt att välja den buffert som används och realisera denna adsorption antingen på ett passivt sätt (inkubation och sedan sköljsteg) eller att övervaka den under flöde (i SPRi). Dessutom kan denna passiva adsorption realiseras antingen på hela chipet (som en makroarray) eller lokaliseras i mikroarrayer med hjälp av en mikropipettspotter. "Underflödesproceduren" gör det möjligt för utredare att följa kinetiken och nivån av EV-adsorption. Detta tillvägagångssätt på det nakna guldsubstratet antas när det kemiska skiktgränssnittet kan störa analysmetoden (t.ex. för Raman-spektroskopi).
Det kemiskt funktionaliserade biochipet, kallat "C11 / C16", används för att skapa en tät och robust "matta" av EV kovalent bundna på guldytan genom att bilda primära amidbindningar med tiolaterna när målet är att få en global bild av EV-provet. I detta fall funktionaliseras guldet faktiskt av en tiolatblandning av merkapto-1-undekanol (11-MUOH: "C11") och merkapto-1-hexadekansyra (16-MHA: "C16"), och en fraktion av tiolaterna aktiveras kemiskt för att upprätta kovalent bindning med målen. Återigen kan denna strategi realiseras antingen passivt (inkubation och sedan sköljsteg, antingen i "makroarray" eller i flera mikroarrayer med hjälp av en mikropipettspotter) eller under flödeshastigheter (i SPRi) för att följa kinetiken och nivån av EV-ympning på guldytan.
Det ligandbiofunktionaliserade biochipet, kallat "ligander", aktiveras kemiskt för att kovalent ympa olika ligander (t.ex. antikroppar, receptorer) för att selektivt fånga (med affinitet) olika EV-undergrupper som samexisterar i det biologiska provet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av guldsubstrat
OBS: Tre typer av ytor produceras på guldflis: 1) naken yta, 2) kemiskt funktionaliserad och 3) biofunktionaliserad (ligander ympade på C11C16-skikt). De kommer att kallas "nakna", "C11C16" respektive "ligander" från och med nu.
- Förberedelse av guldsubstrat:
OBS: För detta protokoll tillverkades guldbiochipsen internt i renrummet. De hemmagjorda biochipsen bestod av glasskivor (SF11) med en beläggning av krom (2 nm Cr) och guld (48 nm Au). Biochipets längd var 28 mm, bredden var 12,5 mm och tjockleken var 0,5 mm20.- Använd DC-magnetronsputtering15 för att belägga objektglasen med fysisk ångavsättning (PVD).
- Kemisk funktionalisering:
- Funktionalisera de nakna chipsen genom att inkubera dem över natten i en 90% / 10% molblandning av merkapto-1-undekanol (11-MUOH: C11) och merkapto-1-hexadekansyra (16-MHA: C16) vid 1 mM i absolut etanol, under omrörning och vid rumstemperatur.
OBS: Detta steg kommer att bilda ett stabilt, självmonterat monolager (SAM), vilket är användbart vid ympning av liganderna. - Rengör biochipet (tvätta försiktigt) med absolut etanol och ultrarent vatten, torka det under kväve och förvara det under renrumsförhållanden.
- Aktivering av det kemiskt funktionaliserade biochipet:
OBS: Från och med detta steg måste experimenten utföras i ett analytiskt laboratorium.- Rengör biochipet med ultrarent vatten genom att tvätta det försiktigt och torka sedan chipet under mjukt luftflöde. För att aktivera C16-karboxylgrupperna, inkubera biochipet i en blandning av 200 mM etyl (dimetylaminopropyl) karbodiimid/N-hydroxisuccinimid (EDC) och 50 mmol / L N-hydroxisuccinimid (Sulfo-NHS) i minst 30 minuter i mörkret vid rumstemperatur. Skölj sedan med vatten före ympningsexperimenten.
- Funktionalisera de nakna chipsen genom att inkubera dem över natten i en 90% / 10% molblandning av merkapto-1-undekanol (11-MUOH: C11) och merkapto-1-hexadekansyra (16-MHA: C16) vid 1 mM i absolut etanol, under omrörning och vid rumstemperatur.
- Ympning av liganderna på det funktionaliserade biochipet:
OBS: Immobiliseringen av liganderna (eller EV för vissa experiment) på chipet kan antingen göras passivt utanför SPRi-instrumentet (inkubation av en droppe på det aktiverade chipet) eller dynamiskt underflöde in i SPRi-instrumentet. Detta utgör EV- eller ligandmodifierade chips. Figur 2 visar guldbiochipet, mikropipettspottern och biochipet efter spotting med 16 liganddroppar på 300 nL vardera.- För ligandtransplantation, använd molekyler som antikroppar (t.ex. immunoglobuliner-antiCD41 [specifika för EV härrörande från inhemska blodplättar, kallade N-PEVs], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 och antiOVA [kontrollantikropp mot ovalbumin]) och Annexin V. Späd dem vid 200 μg / ml i en sur lösning (från pH 4,5 till 6 beroende på det optimala pH-värdet för ligandaktivitet eller funktion).
OBS: Det optimala pH-värdet för ympning av antikroppar bestämdes tidigare genom förkoncentrationsexperiment utförda på ett SPR-instrument för bestämning av det optimala pH-värdet för ligandympning (se figur 3). Eftersom ympningsförhållandena förändras med klonerna av antikroppar som används, rekommenderas att bestämma dessa förhållanden innan man fortsätter med SPRi-experimenten. - För ympningsproceduren, tillsätt 300 nL EV / ligandlösning med hjälp av spottern.
OBS: Ett papper nedsänkt i vatten bör förvaras i både vänster och höger brunn för att undvika avdunstning av droppar. Detta steg är viktigt för att bibehålla elfordonen/liganderna under optimala förhållanden för stabilitet och funktionalitet. - Efter upptäckt, håll biochipet under ett soniskt bad (frekvens: 37 kHz, effekt: 30%) under en 30 minuters inkubation. Tvätta biochipet från toppen med ultrarent vatten och placera det försiktigt på ett prisma med samma brytningsindex (RI) som biochipet. Medan du justerar biochipet på toppen av prisman, tillsätt en droppe (~ 2,3 μL) olja med samma RI som prisma för att skapa ett enhetligt, tunt lager mellan biochipet och prisman.
OBS: Detta steg säkerställer ett kontinuerligt medium av samma RI i den optiska vägen. Det är viktigt att undvika att införliva några bubblor i oljeskiktet i detta steg, eftersom detta kommer att ändra de optiska egenskaperna i banan och hindra ytterligare analys.
- För ligandtransplantation, använd molekyler som antikroppar (t.ex. immunoglobuliner-antiCD41 [specifika för EV härrörande från inhemska blodplättar, kallade N-PEVs], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 och antiOVA [kontrollantikropp mot ovalbumin]) och Annexin V. Späd dem vid 200 μg / ml i en sur lösning (från pH 4,5 till 6 beroende på det optimala pH-värdet för ligandaktivitet eller funktion).
Figur 2: Biochip och manuell spotter. Guldbiochip (vänster), mikropipettspotter (mitten) och biochipet efter spotting med liganddroppar på 300 nL vardera (höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Förkoncentrationstester för att bestämma det optimala pH-värdet för ligandtransplantation. Sensorgrammet presenterar interaktionsnivån som en funktion av tiden för en ligand som injiceras slumpmässigt (vid olika pH-värden) vid samma koncentration över 2 minuter på ytan. OG är tvättmedlet, vilket gör att baslinjen kan återvinnas mellan varje injektion. Här indikerar sensorgrammet att pH 6 tillät mest ligandtransplantation, med en SPRi-signal på 1091 RU. Förkortningar: OG = oktylglukosid; RU = svarsenhet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Avbildning av ytplasmonresonans
- Montera biochipet på SPRi-systemet. Håll PBS-buffertens flödeshastighet (löpande buffert) på 50 μl/min.
OBS: Om det finns några bubblor, öka flödeshastigheten upp till 500-1,000 μL / min och injicera 40 mM oktylglukosid (OG) ofta för att ta bort dem så snart som möjligt. - Konditionering av guldbiochipet i SPRi-instrumentet: Val av arbetsvinklar
- Klicka på rullgardinsmenyn till vänster om programvaran och klicka på arbetskatalogen för att definiera mappen där experimentella data ska sparas. Klicka sedan på Plasmon | Bildinsamling.
- Hitta bilden (som visas i figur 4A) där olika fläckar är synliga och klicka för att välja den här bilden. För att definiera intresseområdet (ROI), som visas i figur 4, klicka antingen på automatisk detektering eller manuell definition inuti fläckarna (figur 4B) eller på chipet för att hänvisa till en specifik plats även utan fläckar (figur 4C).
- När multiplexerade biochips används, skriv namnet på ligandfamiljerna och klicka sedan på motsvarande fläckar.
OBS: En ligandfamilj motsvarar flera fläckar funktionaliserade med samma ligand. Vanligtvis presenterar chipet åtminstone dubbletter och till och med ofta tredubblar varje ligand. - Klicka på finish-artdefinitionen och vänta på att riktas till fönstret som innehåller de erhållna plasmonkurvorna.
- Välj en arbetsvinkel. Dra den svarta linjen med markören till optimal arbetsvinkel och klicka på Flytta spegel till arbetsvinkel.
OBS: Plasmonkurvan består av värdet på reflektiviteten (%) kontra vinkeln, och programvaran ger en annan kurva med värdet på lutningen (%) kontra vinkeln. För att välja en bra arbetsvinkel, välj vinkeln med det högsta värdet på lutningen.- Vid ett passiverande steg (på grund av albumin) som utförs inuti apparaten, välj en arbetsvinkel för att få optimal känslighet mot ytan och därigenom upprätta en kvalitetskontroll av ytreaktiviteten.
OBS: Detta passiveringssteg är viktigt när chipet är förberett för affinitet / fånga biodetektion för att minska icke-specifika interaktioner mellan provet och biochipytan.
- Vid ett passiverande steg (på grund av albumin) som utförs inuti apparaten, välj en arbetsvinkel för att få optimal känslighet mot ytan och därigenom upprätta en kvalitetskontroll av ytreaktiviteten.
- Klicka på Kinetik för att starta den kinetiska övervakningen i realtid. När programvaran uppmanar användaren att definiera den negativa kontrollen väljer du ingen negativ kontroll vid denna punkt (eftersom detta möjliggör observation av kinetiken på de negativa kontrollpunkterna).
- Injicera serumalbumin från råtta (RSA, 200 μg/ml, beredd i acetatbuffert, pH 4,5) vid 50 μl/min i 4 minuter för att passivera ytan runt fläckarna och eventuellt fylla tomma utrymmen inuti ligandfläckarna.
OBS: RSA injiceras för att täcka biochipet, som inte är bundet till några ligander. - Injicera etanolamin (1 M) vid 20 μl/min i 10 minuter för att deaktivera de karboxylgrupper som fortfarande finns kvar och är reaktiva på ytan.
- Tvätta biochipet genom att injicera 40 mM OG vid 50 μl/ min i 4 min.
OBS: Efter passiveringssteget justeras arbetsvinkeln (som en ny baslinjebestämning före provinjektion) för att vara vid den högsta känsligheten på de intressanta fläckarna.
- Injicera serumalbumin från råtta (RSA, 200 μg/ml, beredd i acetatbuffert, pH 4,5) vid 50 μl/min i 4 minuter för att passivera ytan runt fläckarna och eventuellt fylla tomma utrymmen inuti ligandfläckarna.
- Prov injektion:
- Omdefiniera plasmonkurvorna efter passivering och välj arbetsvinkel enligt liganden den här gången.
- Vid kinetisk övervakning, minska flödeshastigheten till 20 μl/min och vänta tills baslinjen är stabil.
- Injicera provet i valfri koncentration (från 1 x 10 8 EV/ml till 1 x 10 10 EV/ml beroende på affiniteten mellan EV och de ympade liganderna) och klicka på antingen manuell injektion eller automatisk insprutning. Vid manuell injektion klickar du på avbryt injektionen efter att ha injicerat 200 μl av provet. Eftersom injektionens varaktighet i allmänhet är 10 minuter, börja följa interaktionens kinetik och mät reflektivitetsvariationen genom att beräkna skillnaden i reflektivitet mellan början och slutet av injektionen som observerats under den kinetiska övervakningen (figur 5).
OBS: De olika proverna som injicerades beskrivs i avsnittet representativa resultat.
- Efter provinjektion följer du någon av dessa två metoder för att avsluta SPRi-experimentet:
- I det ofixerade / in-flytande tillvägagångssättet, ta biochipet ur SPRi-apparaten, tillsätt en vätskedroppe på den och fortsätt för ytterligare AFM-karakterisering av ytan i vätska.
- I det fasta tillvägagångssättet injiceras glutaraldehyd (0,5%) utspätt i vatten vid 20 μl / min i 10 minuter för att fixera molekylerna som fångas på biochipet. Injicera vatten för att skölja ytan, ta ut biochipet, tvätta det mycket försiktigt med destillerat vatten och lufttorka det för att analyseras ytterligare under AFM.
Figur 4: SPRi CCD-bild av biochipet. (A,B) Multiplexerat biochip efter albuminpassivering. (A) Ett chip utan standard; (B) några defekter som uppstod på chipet: fusion av fläckar (i), svag ympning (ii) eller damm eller "föroreningar" (iii). ROI: erna, i färg i fläckarna (en färg per ligandfamilj), valdes för att undvika dessa "föroreningar". När fläckar slogs samman noterades de och antingen ignorerades eller namngavs som "blandning av ligander 1 och 2". (C) Naket guldchip utan mikromatriser för experimentet som undersöker adsorptionen av EV på guld. Den blå pilen anger flödesriktningen. Detta chip presenterade inte fläckar, och ROI valdes för att registrera reflektivitetssignalen från linje 1 (L1, röda cirklar) till linje 4 (L4, lila cirklar) under provinjektionen. Skalstång = 1 mm för alla tre bilderna. Förkortningar: SPRi = ytplasmonresonansavbildning; CCD = laddningskopplad enhet; ROI = regioner av intresse; EV = extracellulära vesiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: SPRi-experiment med EV-injektion på ett biochip. (A) Infångningsexperiment på ett multiplexerat biochip som visar reflektivitetssignalerna för olika ligander. Här var signal-brusförhållandet för de olika liganderna mycket bra (och särskilt på antiCD41-fläckarna) eftersom svaret från den negativa kontrollen var försumbar. (B) Adsorptionsexperiment av EV på ett naket biochip. Sensorgram som visar konditioneringen av chipet med två spolningar av buffert och OG-rengöring (1), med EV-provinjektion (2) och reflektivitetssignalen efter EV-interaktion (3). På detta biochip fanns det ingen negativ kontroll, men reflektivitetssignalen (dess kinetik, dess stabilitet efter injektion) var hög, vilket innebär att dessa elbilar kunde adsorbera och förbli stabila på guldchipet. Förkortningar: EV = extracellulär vesikel; OG = oktylglukosid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Atomkraftmikroskopi
- Använd kontaktläget för att skanna biochipet i luft och det kvantitativa avbildningsläget för att skanna biochipet under flytande förhållanden.
- Rikta in biochipet på toppen av masken på glasskivan (utvecklad i labbet) för att identifiera positionen för respektive mikrofläckar på biochipet (figur 6A).
OBS: Masken innehåller markeringarna av fläckarna, som motsvarar positionerna för ligandernas fläckar enligt den använda spottern. Denna mask består av en glasskiva på vilken två vinkelräta kilar möjliggör placering av chipet. Dessutom är glasskivan markerad med 16 filtpunkter som motsvarar platslokaliseringen på chipet, vilket möjliggör, genom transparens, att lokalisera fläckarna och skanna önskat område. - Placering av spetsen:
- Använd en CCD-kamera ovanpå AFM för att lokalisera utskjutaren på rätt plats som måste skannas. För att följa detta protokoll, använd triangulära utskjutande tänder med 200 μm längd, 28 μm bredd och en fjäderkonstant på 0,08 N / m.
- Rikta in lasern på toppen av utskjutaren i en position som ger ett optimalt svar i återkopplingskontrollmekanismen.
- Skanning:
- När AFM-intaget är aktiverat och i kontakt med biochipytan startar du AFM-insamlingen i kontaktläge eller kvantitativt bildläge från tre till fem stora områden (vanligtvis 10 × 10 μm²) till små områden (1 x 1 μm²).
OBS: En representation av de olika områden som kan skannas visas i figur 6D. Se till att AFM-karakteriseringen är representativ för hela mm²-punkten och att tillräckligt många EV visualiseras med en bra upplösning för en robust analys (minst 300 EV räknas och analyseras för varje tillstånd) och utför mätningarna av metrologi och morfologi.
- När AFM-intaget är aktiverat och i kontakt med biochipytan startar du AFM-insamlingen i kontaktläge eller kvantitativt bildläge från tre till fem stora områden (vanligtvis 10 × 10 μm²) till små områden (1 x 1 μm²).
- AFM bildbehandling:
- Behandla AFM-bilderna med JPK-databehandlingsprogram genom att först välja höjdkanal.
- Välj en polynompassning som ska subtraheras från varje rad för att få rätade skanningslinjer.
- Välj höjdtröskeln på guldkorn för att eliminera ytans grovhet. I den refererade programvaran (se materialförteckningen), inom kornutvinningsmodulen, markera kornen med ett höjdtröskelvärde vid 8,5 nm. När kornen har filtrerats visas antalet korn.
OBS: Vanligtvis kräver det grova guldsubstratet (RMS på ~ 3 nm) och närvaron av kemiska och ligandskikt att tröskeln ställs in på 8,5 nm. - Om du vill extrahera flera egenskaper hos de markerade kornen, till exempel höjd, volym och diameter, öppnar du bilden i den refererade programvaran och väljer databehandling | Spannmål | Markera med tröskel.
- Välj filterkorn i funktionen av egenskaper. När ett nytt fönster visas väljer du följande parametrar: Värde = maximalt z-max, Yta = projicerad yta A0. Välj sedan kriterierna A OCH B.
- Öppen kornfördelning; I fönstret som visas väljer du Värde (maximalt), Volym (bas: noll) och Gräns (längd). Observera tabellen (i .txt format) som visas, som visar tre kolumner med höjd-, volym- och diametervärdena för alla kornigheter som detekteras vid det inställda tröskelvärdet per bild.
- Från höjden, h och diametern, D, beräkna krökningsradien, Rc, för varje EV med ekvation (1) 8 och beräkna sedan volymen, V, med ekvation (2):
(1)
(2) - Från V beräknar du den effektiva diametern, d eff, för varje EV (diametern på en sfär med samma volym) med hjälp av ekvation (3):
(3) - Diagramdiagram som visar storleken (uppmätt höjd, uppmätt diameter och beräknad effektiv diameter) på elfordonen, där varje partikel räknad representeras av en punkt.
OBS: Således, i slutet av karakteriseringen, möjliggör NBA-plattformen korrelationen mellan biodetekteringssignalen och sedan fenotypningen med antalet och storlekarna på EV-delmängderna.
(1)
(2)
(3)
Figur 6: Biochipkarakterisering med AFM. Efter SPRi-experimentet fixerades och torkades chipet eller hölls i vätska för AFM-karakterisering. (A) Den bearbetade glasskivan (med två vinkelräta positionskilar, indikerade med ett "w" på bilden) som presenterar en mask som passar med lokaliseringen av de 16 biochipmikroarrayerna. Genom ljusexponering och transparens, när den väl är installerad för AFM-karakterisering, gör glasskivan att AFM-spetsen kan placeras på önskad plats för att karakterisera den. (B) Biochipet installerat på "mask" -glaset och under en droppe buffert för att skanna under flytande förhållanden. (C) SPRi-bild av de 16 mikromatriserna. (D) En mikroarray avbildad med optisk mikroskopi efter immuninfångning av biofunktionaliserade kalibreringsnanopartiklar med en diameter på 920 nm. De vita rutorna indikerar provtagningen av de olika områdena som skannas av AFM på varje intressant plats för att göra AFM-karakteriseringen robust. Skalstänger = (C) 1 mm, (D) 500 μm. Förkortningar: AFM = atomkraftmikroskopi; SPRi = ytplasmonresonanstomografi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Raman-spektroskopi
OBS: För Raman-spektroskopi, ersätt glasskivan som används som substrat med en bild av CaF2, som har en försumbar Raman-signatur.
- Optiska förhållanden för förvärvet:
- Ställ in följande villkor för Raman-bildmikroskopet: mikroskopmål: 50x; laservåglängd: 532 nm; lasereffekt: 10 mW; exponeringstid: 500 ms; antal ansamlingar: 140; spektralområde: från 450 cm-1 till 3,200 cm-1.
OBS: Att använda för mycket kraft och / eller för lång förvärvstid kan leda till skador på provet, vilket framgår av instabila spektra över tiden. Börja med en låg mängd energi och öka denna om signalen är för svag. Högre laservåglängder kan användas (633 nm, 785 nm) för att minska fluorescensen som är skadlig för Raman-mätningar. Intensiteten minskar dock med våglängdens fjärde effekt, och kamerans spektrala känslighet bör beaktas.
- Ställ in följande villkor för Raman-bildmikroskopet: mikroskopmål: 50x; laservåglängd: 532 nm; lasereffekt: 10 mW; exponeringstid: 500 ms; antal ansamlingar: 140; spektralområde: från 450 cm-1 till 3,200 cm-1.
- Raman avbildning:
- Observera först de levande spektra med ett reducerat antal ansamlingar (10) för att hitta området med det bästa signal-brusförhållandet.
OBS: En stark signal i högfrekvensområdet (2 800-3 000 cm−1) kan underlätta detektering av elbilar på ytan med låga exponeringstider, som tidigare visats10. - När ROI har valts väljer du den rumsliga upplösningen enligt den tillgängliga tiden för förvärvet.
OBS: Den rumsliga upplösningen begränsas av diffraktionsgränsen (~ 500 nm). - Starta Raman-kartläggningsförvärvet.
- Observera först de levande spektra med ett reducerat antal ansamlingar (10) för att hitta området med det bästa signal-brusförhållandet.
- Förbehandling av data:
- Använd en Python integrerad utvecklingsmiljö (IDE) (t.ex. Spyder) och öppna filen som innehåller spektra.
- Subtrahera spektras baslinje för att korrigera för interferensen från möjlig fluorescens. Använd till exempel funktionen "arpls" från paketet "irfpy"23. Testa olika värden för parametern "lam" för att hitta den som ger den bästa baslinjekorrigeringen (vanligtvis mellan 103 och 107).
- Normalisera spektra, till exempel genom att dividera alla intensiteter i ett spektrum med dess intensitet vid 2 900 cm−1 eller genom att subtrahera medelvärdet av spektrumet och sedan dividera det med dess standardavvikelse ("standard normal variat" normalisering).
OBS: Detta steg är nödvändigt för att jämföra den relativa molekylära sammansättningen av EV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestämning av optimala pH-förhållanden för ligandtransplantation
De olika ligander som används för att bereda biochipen testas som en funktion av pH och deras tillgänglighet att interagera med det tiolata kemiska skiktet (figur 3). Liganderna späds ut i acetatbuffert vid olika pH-värden och injiceras på biochipet kemiskt funktionaliserat med ett C11C16-skikt. Lösningarna injiceras slumpmässigt på ytan och ett rengöringsmedel (OG vid 40 mM) injiceras efter varje ligandinjektion för att återställa baslinjen. Detta förkoncentrationstest möjliggör bestämning av det optimala pH-värdet för varje ligandtransplantation. I exemplet som presenteras i figur 3 valdes ett pH på 6 som det bästa pH-värdet när det gäller lutningen och nivån på ligandtransplantation.
SPRi CCD-bilder
SPRi CCD-bilderna registrerade på biochipet (nakna, kemiskt funktionaliserade eller presenterande mikroarrayer) efter insättning i SPRi-maskinen presenteras i figur 4. När det gäller det mikroarraypresenterande biochipet togs bilden efter albuminpassivering av ytan. Dubbletter eller tripplat av fläckar realiserades systematiskt på chipet, och en negativ kontroll var automatiskt också närvarande på chipet. Den negativa kontrollen bestod huvudsakligen av en irrelevant antikropp. I SPRi, när biochipet användes utan spotting-för adsorption på naket guld eller för direkt ympning av EVs på ett kemiskt funktionaliserat biochip-valdes ROI godtyckligt i avkänningsområdet. Som ett exempel visar figur 4C avkastning på investeringar som valts på ett naket guldchip före injektion av elbilar.
Tack vare denna SPRi CCD-bild är det möjligt att ignorera vissa fläckar om sådana problem uppstår under ympningen. SPRi CCD-bilden möjliggör också uppskattning av ympningens homogenitet inuti platsen, säkerställer reproducerbarheten av ympningen mellan olika fläckar av samma ligand och säkerställer slutligen att EV-biodetekteringen fortsätter på matriser som är likvärdiga när det gäller ytdensitet.
SPRi resultat
När ROI väljs är baslinjen stabil, vilket innebär att provet kan injiceras. Figur 5 visar olika resultat erhållna på ett multiplexerat biochip, vilket avslöjar ett högt signal-brusförhållande för vissa immunoarrayer (reflektivitetssignalen är 1,4% på antiCD41 jämfört med svaret på den negativa kontrollen på 0,02%). Figur 5B visar resultaten för EV-adsorption som erhållits efter injektion av EV-provet på ett naket guldchip. N-PEVs-provet var från trombocyter. Lösningen centrifugerades vid 3 000 × g i 15 minuter vid 22 °C. Supernatanten centrifugerades sedan igen vid 20 000 × g i 15 minuter vid 22 °C. Den resulterande pelleten återsuspenderades i bufferten. De SPRi-resultat som erhölls på immunfångade N-PEV jämfördes med Western Blot-resultaten (WB). WB avslöjade ett starkt uttryck av CD41, CD62P och CD9 i dessa prover, vilket belyser en god korrelation med SPRi-resultaten (kompletterande figur S1).
Figur 5B visar resultaten för EV-adsorption som erhållits efter injektion av EV-provet från humana primära bröstepitelceller (HMEC) på ett naket guldchip. HMEC-cellkulturen centrifugerades vid 3 650 × g i 10 minuter och därefter centrifugerades supernatanten igen vid 10 000 × g i 30 minuter vid 4 °C. Den resulterande pelleten återsuspenderades i 1x PBS-buffert för att tvätta den och centrifugering utfördes igen vid 10 000 × g i 30 minuter vid 4 °C. Slutligen hängdes pelleten i 1x PBS-buffert.
AFM-karakterisering
Efter SPRi-experimenten och EV-laddning på biochipsen (antingen genom adsorption, ympning eller affinitetsfångst) utfördes AFM genom att följa metoden för att skanna stora skanningar (10 x 10 μm²) och sedan (~ 10 åtminstone) mindre (några μm²). Figur 7 visar exempel på storskaliga och småskaliga AFM-bilder av elfordon på biochips.
Figur 7: AFM-karakterisering av elfordon på ett biochip. Bilder som erhållits i kontaktläge av ett torkat prov. (A) Ett exempel på ett stort skanningsområde för att ge en representativ bild av mm² ROI på chipet. Detta resultat erhölls efter kovalent ympning av EV på en kemiskt modifierad yta. (B) Ett annat exempel på ett stort skanningsområde som erhållits efter fångst av EV på immunoarrays. (C) En närmare bild av objekten för att få hög upplösning och möjliggöra metrologi (i höjd och diameter) för elfordon. (D) En närmare bild av biochipet i bilden i (A) med en 3D-lutad bild. (E) En inzoomad vy av en stor EV adsorberad på ett naket guldbiochip i en lutad 3D-bild. Z-skalan är (A, B) 30 nm och (C) 20 nm. Skalstänger = (A, B) 2 μm, (C) 500 nm. Förkortningar: AFM = Atomkraftmikroskopi; EV = extracellulära vesiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Gwyddion analys
Gwyddion programvara användes för att bearbeta data för varje vesikel visualiseras på varje sats av AFM bilder. Först skannades ett stort område (i intervallet 10 x 10 μm²) som visar en representativ bild av mm² ROI på chipet. Bilden i figur 7A visar att ytan var tätt täckt med föremål. I detta fall injicerades EV (från nötkreatursmjölk) vid 2,5 × 1010 / ml på ett aktiverat tiolfunktionaliserat chip. Efter eliminering av kasein från provet koncentrerades vasslesupernatanterna genom centrifugering vid 4 000 × g och 20 °C med användning av Amicon 100 kDa centrifugalfilterenheter, och EV isolerades med hjälp av sackarosgradientultracentrifugeringsmetoden. Detta resultat motsvarar kovalent ympade EV på en kemiskt modifierad yta. Figur 7B visar ett annat exempel på ett stort skanningsområde som erhållits efter fångst av EV på immunmatriser. Även här fanns föremål på ytan men visade en mindre tät täckning än när elbilarna kovalent ympades på chipet. En närmare bild, i figur 7C, på flera ställen i ROI möjliggör hög upplösning och metrologi (i höjd och diameter) för elfordon. En annan närmare bild (figur 7D) av biochipet som visas i figur 7A, med en 3D-lutad bild, avslöjar föremål som är blåsor men också trådformiga (uppe till vänster). Faktum är att medan immunchips möjliggör selektiv och differentiell infångning av EV-undergrupper, ympar kovalent ympning alla föremål med fria amingrupper som finns i provet. I figur 7E avslöjar AFM en enda stor EV från HMEC-kulturen adsorberad på naket guld. Således kan AFM avslöja små till stora elbilar och mäta dem och hjälper till att räkna antalet objekt per mm² genom att tillåta visualisering av varje EV.
Den uppmätta höjden och diametern för varje EV bestämdes, från vilken den effektiva diametern erhölls. EV-höjderna täckte ett intervall från 10 nm till 50 nm, med ett medelvärde på 15 nm; De uppmätta EV-diametrarna täckte ett område från 50 nm till 300 nm, med ett medelvärde på 100 nm. Vi observerade att elfordonens effektiva diameter varierade från 30 nm till 300 nm, med en stor majoritet runt 60 nm (figur 8A). Dessa mätningar utfördes flytande eller efter fixering och torkning. Figur 8B visar att de resultat som erhölls under dessa två förhållanden var jämförbara.
Figur 8: Resultat genererade av AFM-karakterisering av EV på ett biochip. (A) Metrologi för EV på en plats (antiCD41 immunoarray), bestämd med ett tröskelvärde på 8,5 nm och efter injektion av ett EV-prov vid 2,5 × 1010 / ml. Den "effektiva beräknade diametern" presenteras, där varje punkt motsvarar en partikel visualiserad på AFM-bilderna. b) Histogram genererat från data i (A) som visar fördelningen av EV: s effektiva diameter. Resultat erhållna i luft (i rött: prov fixerat och torkat) och i vätska (i blått: ofixerat). Förkortningar: AFM = atomkraftmikroskopi; EV = extracellulära vesiklar . Klicka här för att se en större version av denna figur.
AFM:s N-PEV-analys jämfördes med NTA-resultaten. De sista "in-solution" resultaten, av NTA, visade en fördelning av EV-diametrar från 32 nm till 650 nm, med en stor majoritet mellan 90 nm och 250 nm i diameter. Med tanke på att NTA inte är känslig för små storlekar (nära 50 nm) visar dessa AFM-mätningar god korrelation med dessa resultat (kompletterande figur S2).
Raman-experimenten, som realiserades på elbilar adsorberade på ett naket chip, avslöjade uppmuntrande resultat; Närmare bestämt erhölls ett tydligt spektrum av elfordon (figur 9). Ramanspektra kan delas in i tre olika områden: "fingeravtrycksområdet" (under 1 800 cm−1), som innehåller toppar som bildar molekylspecifika mönster och därmed är den viktigaste delen för identifieringsändamål; den "biotysta" regionen (1 800-2 800 cm-1), som vanligtvis kasseras när man studerar biologiska prover eftersom den inte innehåller toppar; och regionen "högfrekvenser", som huvudsakligen innehåller information om lipider och ofta är den mest intensiva delen av spektrumet men är mindre specifik. Spektrumet visar toppar som huvudsakligen motsvararCH2-vibrationer (2 853 cm−1, 1 444 cm−1 och 130 cm−1), vilka är associerade med lipiderna i membranet i EV och en topp motsvarande fenylalaninaminosyran 21. En Raman-topptilldelningstabell över vanliga molekyler som finns i EV finns i artikeln av Penders et al.22.
Figur 9: Ramanspektroskopikarakterisering av EV på ett biochip. Här härleddes EV-provet från en HMECkultur och återvanns genom centrifugering vid 20 000 × g. (A) Exempel på en Raman-bild av elfordon adsorberade på ett naket biochip (genomsnittlig intensitet), överlagrad på en ljusfältsbild. b) Exempel på uppmätta Ramanspektra för elfordon. De streckade linjerna motsvarar identifierade vibrationer. α, saxning; τ, vridning; υ, sträckning (s, symmetrisk; som, asymmetrisk). Skalstapel = (A) 50 μm. Förkortningar: EV = extracellulära vesiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Nanopartikelspårningsanalys (NTA) mätningar av N-PEVs. Elbilarna späddes ut i PBS; experimenten gjordes i tre exemplar med hjälp av ett MALVERN-instrument NS300. Medeldiameter = 137,5 nm ± 1,3 nm; Lägesdiameter = 104,9 nm ± 13,3 nm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Western blot-tester av N-PEVs. N-PEV (1) och (2) motsvarar två partier N-PEV framställda av två trombocytkoncentratfickor. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De senaste metoderna för EV-identifiering som är de mest använda är proteinspecifik immunoblot för att bekräfta ursprunget till EV, TEM för att bekräfta deras struktur och NTA för att kvantifiera deras antal och storleksfördelning i en provvolym3. Ändå har det stora intresset för EV i (bio) medicinsk forskning och begränsningarna i befintliga analysverktyg fått det vetenskapliga samfundet att utveckla nya metoder för EV-karakterisering, diskriminering och kvantifiering.
De flesta utvecklingar fokuserar på att kombinera principerna för immunomärkning eller immunocapture med avancerade fysiska metoder för EV-detektering. Några av dessa metoder fokuserar på identifiering av enskilda elfordon för att få maximalt tillförlitliga data på nanoobjektskala. Andra är mer intresserade av att föreslå globala metoder som är överkomliga och pålitliga för klinisk användning.
NBA-plattformen, som kombinerar biodetektion av EV på ett multiplexerat guldsubstrat och AFM-karakterisering, möjliggör djup kvalificering av nanovesiklarna som finns i komplexa biologiska vätskor. På grund av biochipets selektivitet kan råprover injiceras och vesikelbidraget kan belysas.
Det föreslagna tillvägagångssättet består av karakterisering av EV adsorberade/ympade eller fångade genom affinitet på ett grovt guldsubstrat. AFM, som konventionellt används på atomiskt plana substrat, visar fortfarande optimal prestanda på det grova guldchipet och avslöjar olika gränssnitt som är mikro / nanostrukturerade.
Det multiplexerade biochipet som presenterar flera fläckar att skanna (upp till 16 hittills) och NBA-metoden för fasta och torkade prover utvecklades för att minska den tid som behövs för en djup och mycket upplöst AFM-undersökning av varje plats. Olika tester som utfördes i laboratoriet visade att denna procedur (fixering, torkning och avbildning i luft) inte signifikant påverkar mättekniken för elfordon.
Det finns två huvudsakliga kritiska steg i tillvägagångssättet: att hitta en kompromiss för att välja den bästa chipkänsligheten för alla olika ympade ligander och EV-dissociation från substratet i slutet efter injektion. Här användes en SPRi-maskin som arbetade med en enda resonansvinkel, vilket indikerar att den bästa kompromissen i plasmonrespons för alla liganderfläckar måste väljas. För vissa ligander kommer detekteringen att vara mycket känslig (nära den optimala vinkeln); För andra blir detekteringen mindre känslig om det fasta vinkelvärdet skiljer sig från den optimala vinkeln. Detta kan övervinnas genom att använda den senaste generationen av SPRi-instrumentation som ger upp till 10 olika arbetsvinklar.
Det andra kritiska steget är dissociationen av EV: erna från substratet efter injektion. Om dissociationen är för hög (eftersom EV: erna till exempel bara presenterar några specifika proteiner vid deras yta) kommer det inte att vara möjligt att skanna med AFM efteråt. Dessa situationer är mycket sällsynta, men när de uppstår måste flödeshastigheten och injektionstiden optimeras för att lösa problemet.
En begränsning av den föreslagna metoden kan vara att korrelationen mellan AFM-observationerna inte är representativ för observationerna med mm²-området för EV-interaktioner på biochipet. För det måste olika områden på plats skannas, inklusive från stora områden till små områden och på olika platser på platsen. Helst bör skanningen utföras i ROI-området för en bra korrelation mellan AFM-karakteriseringen och SPRi-svaret.
I andra arbeten använde författarna till denna studie optisk detektering och digital räkning av enskilda EV, som är baserade på interferometrisk avbildning av EV fångade på ett biofunktionaliserat kiselsubstrat. Denna teknik gör det möjligt att uppskatta storleken på elfordonen på grund av den observerade kontrasten. Denna plattform gjorde det således möjligt att använda de rikliga markörerna CD9, CD63 och CD81 för att multiplexera analysen och detektera närvaron av EV som uttrycker en neuronal markör, CD171, i cerebrospinalvätska hos människor24.
Detta kombinerade och etikettfria tillvägagångssätt, med hjälp av rigorös metodik vid beredningen av biochipet och i AFM-förvärvsläget, utgör en metod för att karakterisera EV genom deras fångst i realtid och under flöde i även komplexa och råa prover. Faktum är att inga föranalytiska steg med provet och inga märknings- eller avmaskningssteg behövs i den presenterade metoden. I litteraturen avslöjade Ertsgaard et al. olika rikliga EV-membranmarkörer med hjälp av en enda partikelinterferometrisk reflektansbildsensor (SP-IRIS), men i statiskt läge (inget flöde) utan kinetiska mätningar och gav bara en uppskattning av EV-storleken25.
På grund av denna optimerade procedur som möjliggör beredning av reaktiva, kontrollerade biogränssnitt och passiverade multiplexerade biochips, kan EV-undergrupper karakteriseras djupt när de injiceras som råa prover. Dessa olika element gör denna NBA-plattform till en mycket relevant metod för direkt, djup och upplöst analys av EV i råa prover.
Spektroskopi, och särskilt ytförstärkt Raman-spektroskopi (SERS), växer fram som en metod för biokemisk analys av svagt uttryckta EV-biomarkörer. Denna strategi har möjliggjort utvecklingen av multiplexerade analyser med känsligheter på några tiotals EV per μl. SERS-avbildning i kombination med sorteringsmetoder (t.ex. dielektrofores) möjliggör analys av EV-sammansättning med hög genomströmning26.
I detta arbete var Raman-experimenten som utfördes på guldbiochips också mycket uppmuntrande, eftersom ett tydligt spektrum av EV erhölls, vilket gav insikt i deras molekylära sammansättning. Framtida utveckling kan också inkludera SERS för att öka signalen som kommer från elbilarna vid ytan av biochipet och spetsförbättrad Raman-spektroskopi (TERS) för att få bilder med nanometrisk upplösning, vilket möjliggör karakterisering av en enda EV.
Den senaste utvecklingen i labbet har gjorts för att förbättra känsligheten för biodetektion och skillnaden mellan EV-undergrupper som samexisterar i ett prov och potentiellt samverkar på samma matriser. För att öka känsligheten byts experiment till SPRi-systemet, vilket gör det möjligt att välja flera vinklar för EV-detektering på olika platser. För att förbättra diskrimineringen av EV-delmängder måste olika utmaningar mötas: i) att erhålla den spektroskopiska Raman-signaturen för varje EV-delmängd på biochipet, ii) att öka antalet fläckar som identifieras på biochipet (från 16 till 100) och iii) att öka genomströmningen av analysen med hjälp av höghastighets-AFM (HS AFM). Dessutom kommer HS AFM också att möjliggöra karakterisering av EV-delmängder snabbt och under flytande förhållanden.
Några andra punkter att notera är att om hydrofiliciteten hos guldbiochipet är hög finns det risk för att ligandernas fläckar överlappar varandra och blandas ihop (som visas i figur 4B). Det är nödvändigt att undvika att injicera luftbubblor under injektion av lösningar enligt SPRi, eftersom detta skulle leda till förändringar i reflektiviteten och bidra till felaktig övervakning av SPRi-signalen.
När du skannar ytorna med AFM är det nödvändigt att observera bilderna för att kontrollera om det finns drastiska förändringar i summavärdet eller om det finns artefakter (t.ex. repetitivt utseende av objekt). Detta kan bero på kontaminering av AFM-spetsen; I detta fall måste spetsen bytas ut.
Det finns några begränsningar av tekniken som vi har observerat: den valda chipkänsligheten för alla olika ympade ligander är inte optimal för dem alla; dissociationen av elfordonen från substratet vid injektionens slut, och den lägre upplösningen (än AFM) för Raman-avbildning, vilket inte tillåter visualisering av enskilda elbilar.
Trots begränsningarna har detta protokoll många betydande fördelar med avseende på befintliga metoder. Genom att kombinera de etikettfria metoderna (SPRi + AFM + Raman-spektroskopi) på samma substrat och sedan på samma biologiska prov undviks bias mellan analyserna på grund av substratet och ger hög originalitet och förtroende för analysen av EV-delmängder.
En sådan konstruerad analytisk plattform kan hjälpa till med EV-karakterisering i olika sammanhang, såsom inom diagnos- och acellulär bioterapi och biofluider från blod till cellsupernatanter. Förutom EV-kvalificering kan andra nanoobjekt (t.ex. molekylkomplex, syntetiska nanopartiklar, virus) karakteriseras av denna multimodala analytiska plattform.
Trots det stora utbudet av metoder som utvecklats och implementerats i EV-samhället har var och en av dessa tekniker sin egen potential och skillnader i prestanda när det gäller dynamiskt omfång, noggrannhet, genomströmning och tillämpning för analys av specifika EV-parametrar26. Innovativa, ultrakänsliga och flerstegsmetoder (separation, urval, spektral signatur och analys av vesikulärt innehåll), såsom denna multimodala analytiska plattform, även när den tillämpas på små volymer på chips (lab-on-a-chip), ger nya perspektiv inom flytande biopsier, biologisk övervakning och precisionsmedicin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Kelly Aubertin och Fabien Picot från IVETh-kärnanläggningen (Paris) uppmärksammas för Raman-avbildningsexperimenten. Thierry Burnouf (Taipei Medical University, Taiwan) och Zuzana Krupova (från Helincourt, Frankrike) är erkända för att ha tillhandahållit EV-prover från blodplättar respektive nötkreatursmjölkprover. Arbetet stöddes av regionen Bourgogne Franche-Comté och forskarskolan EUR EIPHI (NOVIS-projektet, 2021–2024). En del av detta arbete gjordes med hjälp av CLIPP-plattformen och i RENATECHs renrumsanläggningar i FEMTO-ENGINEERING, vilket vi tackar Rabah Zeggari för.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD41a antibody | Diaclone SAS (France) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH, Germany | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| Ethanolamine | Sigma | P5368-10PAK | |
| Evs derived from platelet concentrates | Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) | S2889 | |
| Evs from bovine milk | Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France) | 3450 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| Magnetron sputtering | PLASSYS | SAB5300165 | |
| mercapto-1-hexadecanoic acid | Sigma | G5882 | |
| Mercapto-1-undecanol | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP ones | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| Octyl Glucoside (OG) | Sigma | ||
| Ovalbumine antibody | Sigma | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | ||
| Rat Albumin Serum (RSA) | Sigma | ||
| Sodium acetate buffer | Sigma | ||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
| SPRi Biochip | MIMENTO technology platform | The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon | |
| SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
| Sulfo-NHS | Sigma |
References
- Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001 (2021).
- Xunian, Z., Kalluri, R. Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes. Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).
- Hartjes, T. A., et al. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).
- Xing, Y., et al. Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms. Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506 (2020).
- Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations. Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604 (2022).
- Boireau, W., Elie-Caille, C. Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization. Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).
- Brisson, A. R., et al. Extracellular vesicles from activated platelets: A semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study. Platelets. 28 (3), 263-271 (2017).
- Yuana, Y., et al. Atomic force microscopy: A novel approach to the detection of nanosized blood microparticles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 315-323 (2010).
- Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., Pétry, J. Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy. Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006 (2017).
- Beekman, P., et al. Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy. Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).
- Malenica, M., et al. Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids. Biomedicines. 9 (6), 603 (2021).
- Verweij, F. J., et al. The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo. Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Obeid, S., et al. NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977 (2019).
- Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for «on-chip» qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).
- Ridolfi, A., et al. AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles. Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).
- Vorselen, D., et al. The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis. Nature Communications. 9 (1), 4960 (2018).
- Hardij, J., et al. Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045 (2013).
- Jorgensen, M., et al. Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920 (2013).
- Remy-Martin, F., et al. Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).
- Czamara, K., et al. Raman spectroscopy of lipids: A review. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).
- Penders, J., et al. Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers. ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).
- Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing. Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).
- Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Scientific Reports. 6, 37246 (2016).
- Ertsgaard, C. T., et al. Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles. Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
