Summary
脂質を含んだ肝細胞は肝臓の再生に固有のものですが、通常は密度勾配遠心分離で失われます。ここでは、脂肪肝細胞を保持する最適化された細胞分離プロトコルを提示し、マウスの部分肝切除後に再生肝細胞の代表的な集団を生み出します。
Abstract
部分肝切除術は、マウスの肝再生を調べるために広く使用されていますが、下流の単一細胞アプリケーションのために生存可能な肝細胞の高収率の単離は困難です。再生肝細胞内の脂質の顕著な蓄積は、マウスの正常な肝臓再生の最初の2日間に観察されます。.このいわゆる一過性再生関連脂肪症(TRAS)は一時的なものですが、主要な増殖期と部分的に重複しています。密度勾配精製は、初代肝細胞を単離するための既存のほとんどのプロトコルのバックボーンです。グラジエント精製は細胞の密度とサイズに依存するため、非脂肪性肝細胞集団と脂肪性肝細胞集団を分離します。したがって、脂肪性肝細胞はしばしば失われ、非代表的な肝細胞画分を生じる。
提示されたプロトコルは、脂質含量に関係なく、再生肝細胞の in vivo 単離のための簡単で信頼性の高い方法を記載しています。雄のC57BL / 6マウスからの肝細胞は、肝切除術の24〜48時間後に、古典的な2段階のコラゲナーゼ灌流アプローチによって単離されます。標準的な蠕動ポンプは、門脈からの流出を伴う逆行性灌流技術を使用して、カテーテル挿入された下大静脈 を介して 温められた溶液を残骸に駆動します。肝細胞は、グリッソンカプセルからの放出のためにコラゲナーゼによって解離されます。洗浄と慎重な遠心分離の後、肝細胞はあらゆる下流の分析に使用できます。結論として、この論文は、マウスの部分肝切除後の再生肝細胞の代表的な集団を単離するための簡単で再現性のある技術について説明しています。この方法は、脂肪肝疾患の研究にも役立つ可能性があります。
Introduction
肝臓は、大きな組織喪失の後でもそれ自体を再生することができます。このユニークな再生能力は、1931年にヒギンズとアンダーソンによってラットで最初に記述された部分的(70%)肝切除術の実験モデルによって明示的に示されています1。このモデルでは、肝臓の70%が、より大きな肝葉を切り取ることによって動物から外科的に除去されます。その後、残りの葉は代償性肥大によって成長し、元の肝臓構造の回復はありませんが、手術後約1週間以内に元の肝塊を回復します2,3。肝臓の残骸が小さすぎて回復できない86%拡張肝切除術など、さまざまな量の組織除去を伴う追加の肝切除術が開発されており、最終的には肝切除後肝不全(PHLF)とその後の動物の30%〜50%で死亡します4,5,6。これらのモデルは、切除された組織の量に応じて、正常な肝再生と失敗した肝再生の研究を可能にします(図1)。
肝切除術のマウスモデルは長年にわたって成功裏に使用されてきましたが、最近になってようやく、より高度な分析方法が可能になり、単一細胞レベルでより深い洞察が可能になりました。しかしながら、これらの方法のほとんどにおいて、個々の肝細胞の存在は基本的な前提条件である。初代肝細胞の単離のためのほとんどのプロトコルは、2段階のコラゲナーゼ灌流技術とそれに続く密度勾配精製に基づいており、生存肝細胞を破片や非実質細胞、および死細胞から分離します7、8、9。この方法は、1969年にBerry and Friendによって最初に記述され10、1972年にSeglenらによって適応されました11,12。ただし、グラジエント遠心分離は細胞の密度とサイズに依存するため、脂質を含んだ肝細胞は標準的な精製中に失われることがよくあります。このような喪失は多くの研究課題にとって無視できるかもしれませんが、それは初期の肝再生にとって重要な側面です。最初の2日間で、再生マウス肝臓内の肝細胞は脂質を蓄積し、それによってサイズが大きくなり、密度が低下します。この一過性再生関連脂肪症(TRAS)は、再生燃料を提供するのに役立ち、一時的ですが、主要な増殖期と部分的に重なり、肝臓の機能単位である肝小葉内に不均一に分布しています13,14。しかし、延長された86%肝切除術の後、再生が停滞し、脂質が酸化されていないため、TRASも発生しますが、持続します14。したがって、70%または86%の肝切除後の肝細胞の勾配精製は、ほとんどの脂質を含む肝細胞が低密度のために失われるため、非代表的な画分を生成します15。
この修正された分離プロトコルでは、C57BL / 6マウスからの肝細胞は、肝切除術の24〜48時間後に、古典的な2段階のコラゲナーゼ灌流アプローチによって分離されます。通常、細胞単離のための残骸のカニュレーションおよび灌流は門脈 を介して 行われる。しかし、大切除後に残った小さな残骸では門脈血管抵抗が高く16、灌流は繊細です。大静脈は肝切除の影響を受けないため、大静脈のカニューレ挿入 を介して 逆行方向に灌流を容易に行うことができます。標準的な蠕動ポンプは、門脈からの流出を伴う逆行性灌流を使用して、カテーテル挿入された下大静脈 を介して 加温された溶液を肝臓の残骸に駆動します(補足図S1)。肝細胞はコラゲナーゼによって解離され、グリソンカプセルから放出されます。低速遠心分離アプローチを使用した段階的単離による生存肝細胞の洗浄と慎重な処理の後、肝細胞はあらゆる下流の分析に使用できます。
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Protocol
すべての動物実験は、スイス連邦動物規則に準拠し、チューリッヒ獣医局(n° 007/2017、156/2019)によって承認され、人間のケアが保証されました。10〜12週齢の雄C57BL / 6マウスは、食物と水に自由にアクセスできる12時間の昼/夜のサイクルで維持されました。各実験群は6〜8匹の動物から成っていた。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、および試薬に関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。
1.マウスの肝部分切除術
- 標準的な肝切除術(70%)では、左外側葉、正中葉の右側部分、および正中葉の左部分を結紮して切除します(図1B)。拡張肝切除術(86%)4の場合は、尾状葉と右前葉も切除します(図1C)。
- 注:標準的な肝切除術は、長年にわたって肝再生研究で使用されてきた手順です。この手順のためのプロトコルは、ミッチェルおよびウィレンブリング18のビデオ支援プロトコルを含む3,17が利用可能である。肝切除術のためにここで使用される技術のさらなる詳細は、補足ファイル1で見つけることができます。
図1:マウスの標準肝切除術(70%)および拡張肝切除術(86%) 。 (A)5つのマウス肝葉と、総肝臓重量に対するそれぞれの寄与。(B)マウスの70%肝切除術の模式図。暗い葉は将来の肝臓の残骸を表しています。(C)マウスにおける86%肝切除術の概略図。暗い葉は将来の肝臓の残骸を表しています。(D)70%および86%肝切除後の切除組織の正確な量。(E)70%肝切除直後のマウス腹部;(F)86%肝切除直後(左)および48時間(右)のマウス腹部。脂肪の残骸の淡い色(白い矢印)に注意してください。n = 6-7 /グループ。略語:sHx =標準的な肝切除術;eHx =拡張肝切除術;LW =肝臓重量。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2.灌流液の調製
- 灌流バッファー、消化バッファー、および保存バッファーを準備します( 表1を参照)。
- 必要に応じて水酸化ナトリウム(NaOH)または塩化水素(HCl)を加えて、すべての緩衝液のpHを37°Cに調整します。バッファーの最適pHは7.4です。
- 保存バッファーとウィリアムズ培地Eを氷上に置きます。
- フローサイトメトリーバッファーを調製し、氷上に保存します。
表1:肝細胞の消化および精製に使用される溶液および緩衝液。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
3.灌流装置の準備
- 水浴を42°Cに温め、灌流バッファー(50 mL)と消化バッファー(10-20 mL)を水浴に入れます。消化バッファーにコラゲナーゼをまだ添加しないでください。
- 蠕動ポンプを準備し、チューブを挿入します。完全な灌流セットアップを 図2に示します。
- ルアーロックコネクタを使用して、26 G IVカニューレをチューブの出口端に接続します。チューブの入口端を水浴中の予熱灌流緩衝チューブに挿入します。チューブを70%エタノールで洗い流し、続いて50 mLの滅菌塩化ナトリウム(NaCl 0.9%)を洗い流します。チューブを温灌流バッファー(ポンプ速度3 mL/分)でプライミングします。
- イソフルラン吸入麻酔(800 mL /分のO2、導入用の3%-5%イソフルラン、手順中のメンテナンス用の2%)を使用してマウスを鎮静させます。イソフルランは実験室のフードの下で取り扱い、十分な換気を提供します。.
- 手術の30分前にブプレノルフィンを0.1 mg / kg体重の投与量で皮下投与します。.
- 低体温症を防ぐために、鎮静マウスを加温パッドに置き、上腹部の下に丸めた布組織を置いて、肝臓を他の臓器の上に持ち上げ、下大静脈へのアクセスを容易にします。
注:血管のねじれが可能であり、灌流の有効性に影響を与える可能性があるため、厚すぎる組織は使用しないでください。 - 角膜の損傷を防ぐために目の軟膏を追加します。
- 手術を開始する前に、ペダル離脱反射(両後ろ足のフットパッドピンチ)をテストして、動物が適切に麻酔されていることを確認してください。反応がある場合は、手順を開始する前に追加の麻酔を供給し、再テストしてください。
- 70%エタノールで腹部をきれいにします。
- 縫合糸を切断し、創傷の端をそっと引き離して、正中線切開を再開します。肝切除術が24〜48時間以上経過している場合は、縫合糸を取り除き、ハサミで皮膚を切断します。
- 5-0ポリプロピレン縫合糸を胸骨に固定し、頭蓋骨に引っ張って、この位置に固定します。リトラクターまたは単純なクリップを使用して、腹部を開いたままにします。アクセスと視覚化を最適化するために、腹腔をできるだけ露出させる必要があります。
- 綿棒を使用して腸を右に動かし、門脈と大静脈を明らかにします。腸を保持するために濡れた布を使用してください。
- マウスの後肢に隣接して、高さ約2cmの重量物(例えば、メスフラスコ用のシリコンコーティングされたウェイトリング)を置きます(補足図S2A)。接続された26 G IVカニューレを備えたチューブを対象物の上に置き、針を大静脈の上に慎重に配置します。チューブの長さを調整します。
- 調製したコラゲナーゼストック溶液を予温した消化バッファーチューブに入れる。250 μLのストック溶液を10 mLの消化バッファーに加えます。動物あたり10〜20 mLの消化バッファーを準備します。より大きな動物や肝臓全体の灌流の場合は、最大30 mLの消化バッファーを準備します。
注意: 消化プロセスの開始の約30分前に、温めた消化バッファーにコラゲナーゼストック溶液を追加することをお勧めします。
図2:灌流セットアップの概要。 (A)灌流に必要な機器を備えた手術台。(B)肝臓の準備、ならびに肝細胞の抽出と分離に必要な材料。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4.カニュレーションと灌流
- ポンプ速度を3mL / minに調整し、ポンプをオンにします。予熱した灌流バッファーを針に届けます。最初の2〜3 mLの灌流バッファーを廃棄します。
- 下大静脈のカニューレ挿入を行います。
- バッファーが針を通っている間に、26 G IVカニューレを腎臓の下の大静脈に浅い角度で挿入します。針の斜角が上を向いていることを確認します。
- 綿棒を使用して大静脈を穿刺部位の下に尾側にそっと引っ張り、提供された張力がカニューレの静脈への挿入を容易にします。針が内腔に入ったときにカテーテルのフラッシュチャンバーで血液を探します。
- 針をさらに2〜3 mm進めて、プラスチックカテーテルの先端も静脈に入ったことを確認します。
- プラスチックカテーテルを針の上にスライドさせ、大静脈にさらに5 mmスライドさせます。針をゆっくりと慎重に取り外します。
注意: カニューレを結紮糸で固定することはお勧めしません。この目的のために最初に容器を解剖する必要があるため、このステップには時間がかかります。カニューレがゆるく配置され、物体で支えられている場合、それ以上の固定は必要ありません( 補足図S2の灌流セットアップを参照)。カニュレーション部位を安定化させ、逆流を防ぐために、単量体n-ブチル-シアノアクリレートをカニュレーション部位に1滴加えることができます。
- 血液がカニューレから落ちたら、注射器を使用して温かい灌流バッファーで満たします。
- チューブをカニューレに再度取り付けますが、ポンプ速度は3 mL/minです。灌流バッファーを肝臓に入れます。
- 2〜3秒後、灌流バッファーが肝臓を流れ、中心静脈から肝小葉に入っていることを示す、肝臓に形成される白い斑点および/または門脈の拡張/腫れを探します(図3)。
- 肝臓表面に白い斑点が現れてから1〜2秒以内に門脈が目に見えて腫れるのを待ちます。肝門炎からできるだけ遠位にハサミで門脈を切ります。マイクロベッセルクリップを使用して、切断部位にラベルを付けます(遮らない)(図3B)。
注:これにより、灌流プロセス中の肝臓を通る流れの評価が簡単になります。肝臓は即座に血液を取り除き、数秒以内に黄白色に変わります(図3C)。腹部開口部の右側にある皮膚をさらに切ると、血液と灌流液の流出が促進されます(図3B および 補足図S2B、C)。 - 動物の体重、肝臓のサイズ、および以前の肝切除の程度に応じて、流量を最大4〜7 mL / minに増やします。.
- ピンセットまたは血管クランプで門脈を7〜10秒間クランプします。液体が通過していないことを確認してください。
注意: 肝臓はクランプ中に目に見えて腫れ、放出されるとリラックスします。これは、肝臓全体を洗い流し、残っている血液を取り除くために重要です。 - 約30秒後に2回目のクランプを実行し、肝臓が腫れて弛緩することを確認します。門脈から流出する緩衝液が透明になるまで、少なくとも3〜4分間、動物を洗い流し続けます。
注意: ポンプ速度は、チューブと肝臓のサイズによって異なります。個別に評価する必要があります。 - 手順のこの時点で、安楽死は放血に続発して行われるはずでした。体循環が停止していることを確認します(心拍や心臓のちらつきはありません)。死を確実にするために、両側性気胸は安楽死の二次物理的方法として処置のこの段階で行われる。
注意: 全身循環が停止している場合は、ポンプ速度をわずかに下げます(心拍や心臓のちらつきはありません)。
図3:カニューレ挿入から消化までの灌流プロセス 。 (A)下大静脈(白い矢印)と門脈(黄色の矢印)を持つマウス肝臓の解剖学。(B)下大静脈のカニューレ挿入。カニューレは結紮糸(白い矢印)で固定され、開いた門脈を通る流出の位置はマイクロ血管クランプでマークされています(クランプされていません)。(C)灌流バッファーが肝臓から残りのすべての血液を取り除く前の斑状の構造の出現に注意してください(白い矢印)。皮膚を切開し(黄色の矢印)、綿棒を置き、血液と灌流液を確実に排出します。間欠的なクランプは、血管クランプまたはピンセットで実行できます。(D)肝臓からすべての血液を取り除く必要があります(*)。コラゲナーゼ含有消化バッファーが肝臓に入った後、クランプ後に弛緩しなくなり、肝葉のサイズが大きくなります。(E)しばらくすると、肝臓の表面に泡立つ外観が観察されます(*)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
5.消化
- 灌流ポンプを一時停止し、入口チューブを灌流バッファーから予熱した消化バッファーにすばやく移します。ポンプを再起動します。
- 消化バッファーが肝臓に到達する前に、門脈をもう一度3〜4秒間クランプします。クランプを解除すると肝臓が弛緩し、灌流液が透明なままであることを確認してください。
注:消化バッファーにはフェノールレッドが含まれており、透明な灌流バッファーと簡単に区別できます。これにより、チューブ内の追跡が容易になります。 - 消化バッファーが肝臓に到達したらすぐに、マイクロ血管クリップで門脈をもう一度クランプします。
注意: クランプすると、肝臓は腫れますが、クランプを解除してもリラックスしません。これは正常です。 - 消化プロセスを促進するために、横隔膜の真下の血管クランプで上大静脈を閉じて、消化バッファーが下大静脈から肝臓に通過し、開いた門脈を通って流出できるようにします。
注:このクランプにより、体循環がバイパスされ、残留血液成分/阻害剤との不必要な接触が防止されます。偽手術後に肥大した肝臓組織の後ろの上大静脈に近づくことは困難であるため、このステップはオプションですが、肝切除マウスではアクセスがはるかに簡単です。 - 5 mL/分の流速で約4分間消化します。消化が進むにつれて、肝臓が腫れ始め、肝臓の表面に小さな透明/透明な部分の兆候を探します。さらに、肝臓が濡れた布の質感を帯び、ほとんどねばねばしているように見えることを確認します(図3E)。湿らせた綿棒で注意深く触れて、一貫性を調べます。
- 肝臓の表面の質感に顕著な違いが観察されるまで灌流を続けます。肝臓が非常に明るい色と泡立つ外観を呈し(図3E)、グリッソンのカプセル(すなわち、肝臓袋)が実質から分離することを確認します。過剰消化は肝細胞を損傷する可能性があるため、肝臓がこれらの特性を獲得したらすぐに消化プロセスを停止します。空気が肝臓に入る前に針を外してください。
注:十分な消化に達するには、通常10〜20mLの消化バッファーが必要です。これは、動物のサイズ、肝切除の程度、チューブのセットアップ、およびコラゲナーゼ溶液の品質によって異なります。必要に応じて、灌流速度ではなく灌流時間を増やします。血管系の圧力が高すぎると、肝臓が破裂し、灌流/消化液が後腹膜腔に失われる可能性があります。
6.肝臓の準備
- 肝臓を腹腔からそっと取り除きます。今では非常に薄っぺらで壊れやすいので、非常に注意してください。
- 鉗子を使用して葉の間の中央結合組織をつかみ、アンカーポイントとして使用してわずかに上に持ち上げます。
- 肝臓と他の臓器の接続をすべて切断し、胆嚢を取り除き、肝臓を氷冷保存バッファーに入れます。
注:理想的には、肝細胞の生存率を維持するために、肝細胞の抽出とさらなる処理を直ちに行う必要があります。しかしながら、必要であれば、肝臓を4°Cで短時間保存することができる(例えば、輸送のため)。この遅延は30〜40分を超えてはなりません。
7.肝細胞抽出
- 肝臓を10cmのペトリ皿に移し、氷冷したウィリアムズミディアムE10mLを加えます。
- 肝臓表面に沿ったいくつかの場所で細い先端のピンセットでグリッソンのカプセルを破裂させます。2対のピンセットで中央部分(肝臓群の結合組織など)をつかみ、ゆっくりと引き離して、肝細胞に損傷を与えることなくカプセルを引き裂きます。.カプセルを穏やかに振盪して細胞を放出する(補足図S3)。
注:理想的には、肝臓は簡単に引き裂かれ、細胞を解放します。力を加えないでください。セルスクレーパーは、すべての細胞を完全に除去し、細胞収量を増加させるのに役立ちます。肝臓をハサミで細かく切らないでください。 - 5 mLの肝臓パルプを100 μmのセルストレーナーを通して50 mLチューブにろ過します。10 mLの新鮮な氷冷培地でフィルターをすすぎます。残りの5 mLのパルプをセルストレーナーでろ過します。
注:25 mLの血清学的ピペットを使用して、解離した肝細胞と一緒に肝パルプを移します(図4A)。開口部が小さい小型のピペットは、せん断応力を増加させ、肝細胞に不可逆的な損傷を与えます。 - 合計30 mLの冷たい培地を加えてペトリ皿をすすぎ、ろ過し、懸濁液をいっぱいになるまで50 mLチューブに加えます。現在、すべての単離された細胞は懸濁状態にあります(図4B)。
図4:穏やかな遠心分離による精製 。 (a)抽出工程後に残った肝臓ホモジネート。(b)ホモジネートの顕微鏡図(倍率20倍)。破片による著しい汚染に注意してください。(C)精製遠心分離工程および(D)廃棄される上清の顕微鏡図。(e)精製肝細胞画分の顕微鏡図。スケールバー= 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
8.肝細胞分離
- 50 × g で4°Cで5分間回転します(可能な限り低い加速度と最小のブレーキ)。
注:肝細胞は非実質肝細胞よりも密度が高い。遠心分離力が低いため、肝細胞のみがペレット化され、他の細胞(免疫細胞、赤血球、類洞細胞など)は上清に残ります。 - 上清の大部分を吸引し、1mLを残して、チューブを穏やかに旋回させて細胞を再懸濁した。
- 40 mLの冷たいWilliams'E培地を加え、50 × g で4°Cで10分間回転させ(低加速、低ブレーキ)、死んだ肝細胞と細胞破片をさらに除去し、生細胞と脂肪肝細胞をペレット化します(図4C)。
- 上清の大部分を廃棄し、1 mLを残して、チューブを旋回させて細胞を再懸濁します。
- 40 mLの冷たいウィリアムズE培地を加え、50 × g で4°Cで5分間回転させます(低加速、低ブレーキ)。
- 上清の大部分を吸引し、1mLを残して、チューブを穏やかに旋回させて細胞を再懸濁した。
注意: 細胞が固定または分析されるまで、このプロセスを停止しないでください。肝細胞は非常に壊れやすく、灌流、消化、精製プロセスが遅れると細胞が損傷する可能性があります。 - トリパンブルーを添加した後の最終細胞濃度を、ノイバウアー改良計数チャンバーを用いて決定する。
注:ほとんどの破片と非実質細胞が除去され、70%肝切除後に約10〜15×106 個の肝細胞のきれいなペレットが残ります。 - 希望の濃度に応じて、氷冷培地を追加します。肝細胞懸濁液は、ダウンストリーム分析に使用するか、初代細胞培養を開始します。
注:この段階では、懸濁液に残っている免疫細胞と非実質細胞はごくわずか(<5%)です。さらなる精製が必要な場合は、磁気または蛍光活性化セルソーティング(MACS/FACS)により、CD31+およびCD45+細胞のネガティブセレクションを実行します。今日まで、肝実質細胞のための信頼できる堅牢な表面マーカーはありません。
9. フローサイトメトリー用の単離肝細胞の調製
- 肝細胞を100 × g で5分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、細胞懸濁液の濃度に応じて、希望量のフローサイトメトリーバッファーを加えます。
- フローサイトメトリーチューブに1 mLの細胞懸濁液を加えます。100 × g で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
- 希釈したAlexa Fluor 488ゾンビグリーン生存率染料(濃度1:400)を100〜200 μL加え、穏やかに振とうします。手動で振とうするか、ボルテックスミキサーを使用して低速(最大2〜3)で2秒間、肝細胞を慎重に再懸濁します。
注意: 細胞を再懸濁するために小さなピペットチップを使用しないでください。それらは非常に壊れやすく、加えられたせん断応力は損傷を引き起こし、細胞の生存率を低下させます。ピペッティングが避けられない場合は、先端から最小部分を切り取った後、1,000 μLのピペットを使用して直径を大きくし、細胞を非常にゆっくりとピペットでピペットします。 - チューブを氷の上に置くか、希望する染色に応じて室温で保管します。暗闇の中で20〜30分間細胞をインキュベートします。
- 2 mLのフローサイトメトリーバッファーを加え、細胞を3回洗浄します。各洗浄工程後の細胞を100 × g で5分間遠心分離します。
- 2 mLの固定バッファー(1:1 4%PFAおよびPBS)を追加します。手動で振とうするか、ボルテックスミキサーを使用して低速(最大2〜3)で2秒間、肝細胞を慎重に再懸濁します。
- セルを30分間固定します。
- 100 × g でさらに5分間遠心分離し、上清を捨て、フローサイトメトリーバッファーを加えます。
注:細胞は、単離後72時間まで、分析前にフローサイトメトリーバッファーに保存することができます。
10. フローサイトメトリーによる肝細胞の解析
- 蛍光活性化セルソーターを使用して肝細胞を分析します。
注:肝細胞の比較的大きなサイズを考慮し、電圧を調整します。低電圧から始めて、順方向散乱(FSC)の場合は350V、側方散乱(SSC)の場合は220Vを超えないようにしてください。- FSCとSSCの電圧をセルの推定サイズに調整します。肝細胞集団を同定し、SSC-AおよびFSC-Aを用いてすべての事象を記録します(図5A)。
- 破片と非実質細胞がFSC対SSC密度プロットの左下隅に表示され、除外されていることに注意してください(図5A)。
- ダブレットセルは分析に影響を与える可能性があるため、 図5Bに示すように、ダブレットを除外するために、側方散乱高さ(SSC-H)対側方散乱面積(SSC-A)の密度プロットを作成します。
- CD31- (内皮マーカー)およびCD45- (免疫マーカー)細胞をゲーティングすることにより、最終的な肝細胞集団を選択する(図5C)。
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Representative Results
TRASは肝切除後16時間でピークに達し、標準的な肝切除術後32〜48時間で徐々に消失しますが、拡張肝切除術後48時間を超えて持続します。肉眼的には、TRASは肝臓の残骸の淡い顔色として容易に見え(図1F)、手術後16時間から48時間の間に肝切除マウスで観察できます。
推定最終収量は、マウスの70%肝切除後の10〜15×106 肝細胞および拡張86%肝切除後の4〜9 × 106 であり、平均最終生存率はそれぞれ78%および65%である。これは、マウス肝臓全体からの50〜70×106 の総収量と比較して予想されるパーセンテージに対応します(図6A、C)。部分肝切除後、肝細胞は正常な肝臓と比較して細胞サイズの増加を示し、脂質含有量の増加に対応します(図6B)。ゲーティング戦略を 補足図S4に示します。
図6:肝細胞の収量、細胞サイズ、および生存率。 (A)マウス肝臓1個全体および70%および86%肝切除後の24時間の残骸の細胞数。(B)単離された肝細胞の細胞体積を計算した。肝切除後24時間の細胞サイズの顕著な増加は、70%と86%の両方で注目してください。(C)精製工程の各工程後の単離肝細胞の細胞生存率。生存率は、Alexa Fluor 488ゾンビグリーン生存率色素を用いたフローサイトメトリーにより測定した。パーセンテージは、すべての肝細胞シングレットから取得されます。ゲーティング戦略については、補足図S6および補足図S4を参照してください。エラーバーは、n = 6-8 /グループの標準偏差を指します。略語:sHx =標準的な肝切除術;eHx =拡張肝切除術;切除なし=偽手術。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
部分肝切除術後24時間後のマウス肝細胞における脂質含量の増加は、粒度の増加によって観察されるか(図7;ゲーティング戦略については補足図 S5を参照)、または拡大した肝細胞内の脂質小胞の存在によって直接観察されます(図8 および 補足ファイル1)。
図7:フローサイトメトリーで測定した粒度と細胞サイズの増加。 (A)肝切除後24時間で単離された肝細胞間の粒度の増加は、脂質小胞の存在の間接マーカーとして。(B)SSCを示すヒストグラム。(C)パーセンテージは、SSCシグナルによって測定された、細胞質顆粒強度の高い細胞の割合を表します。エラーバーは、n = 6-8 /グループの標準偏差を指します。略語:sHx =標準的な肝切除術;eHx =拡張肝切除術;切除なし=偽手術;FSC =前方散乱信号。SSC = 横方散乱。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:単離された新鮮肝細胞の脂肪含量のマーカーとしてのスーダンIV染色。 (A)事前手術なしの新鮮な全マウス肝臓からの肝細胞。肝細胞のサイズと脂肪含有量の増加24時間後(B)70%肝切除術および(C)86%肝切除術後。より大きな脂肪肝細胞とより小さな非脂肪性肝細胞の両方が同時に存在することに注意してください。スケールバー = 30 μm (B-D)。エラーバーは、n = 6-8 /グループの標準偏差を指します。略語:sHx =標準的な肝切除術;eHx =拡張肝切除術;切除なし=偽手術。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
免疫細胞および非実質細胞の非常に低い割合が最終懸濁液中に残る。必要に応じて、FACSまたはMACSによってさらなる精製が達成されます。フローサイトメトリーによるCD31+およびCD45+細胞のネガティブセレクションは、非実質細胞を実証および定量するために用いられる(図5)。
図5:フローサイトメトリーゲーティング戦略とCD31および CD45実質 細胞の選択 。 (A)すべてのイベントが記録されたゲーティングチャート。比較的大きなサイズの肝細胞を考慮し、調整された電圧を使用してください。FSCの場合は350 V、SSCの場合は220 Vを超えないようにしてください。(B) シングレットゲーティング。(C)肝細胞は、CD31- (内皮マーカー)およびCD45- (免疫マーカー)細胞をゲーティングすることによって選択される。この選択は、蛍光活性化セルソーターで実行して、必要に応じて、さらなるダウンストリーム分析のために実質細胞を選択することができます。n = 4-5 /グループ。略語:FSC =前方散乱;SSC = 横方散乱。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
脂肪細胞の保持における修正プロトコルの有効性を実証するために、肝細胞を古典的な密度勾配アプローチ7 (図9A)を用いて単離した。修正手順(図9B)とは異なり、脂肪細胞層は密度勾配の上にはっきりと見えました。細胞の分析により、密度勾配遠心分離後のペレット中に脂質を含んだ肝細胞が全体的に存在しないことが確認されました。対照的に、脂肪層からの細胞は、脂肪性肝細胞および非実質および死細胞のかなりの部分で富化されていた(図9A)。したがって、古典的な単離は脂肪細胞の収穫を奪いますが、密度勾配を省略したこの修正プロトコルは脂質を含んだ亜集団を保持し、希薄肝細胞に偏ることなく肝臓再生の偏りのない探索を可能にします。
図9:改良されたプロトコルと比較した古典的な密度勾配分離プロトコルに従った脂肪性肝細胞の収量 。 (A)従来の密度勾配精製法(リン酸緩衝生理食塩水中の最終濃度90%密度勾配溶液)では、死んだ肝細胞を密度勾配溶液の上の細胞層に集めます。 (B) この層は、非実質細胞および非生存肝細胞だけでなく、生存可能で大きな脂肪肝細胞からも構成されています。(C)密度勾配遠心分離後に得られたペレットは、より小さなサイズの希薄肝細胞を含み、脂肪細胞をほとんど含まない。これは、古典的なプロトコルで分離された「純粋な」部分です。(D)改善されたプロトコルにより、脂質で満たされた肝細胞は失われず、すべての肝細胞がペレット化されます。上清(E)は主に死んで断片化された肝細胞と非実質細胞で構成され、ペレット(F)はさまざまなサイズと脂質含有量の肝細胞の混合物です。スケールバー= 100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:補足プロトコル。 (A)スーダンIVによる脂質染色;(b)マウスにおける標準的および拡張肝切除術。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S1:灌流セットアップの概要。 (1)下大静脈をカニューレ挿入する。(2)肝臓に温かい灌流バッファーを灌流してカルシウムをキレートします。(3)消化バッファーをコラゲナーゼとCa2+ で温め、 生体内の細胞を解離させる。肝臓を取り除き、(4)氷冷保存バッファー(最大30分)に保管します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:灌流のセットアップ。 (A)イソフルランノズル、赤色光加熱ランプ、灌流管を備えた灌流テーブル。重い物体をチューブの下に置いて、チューブを安定させ、変位のリスクを減らすことができます。(B)灌流の最初の数分間、いくらかの血液が門脈を通って流出し、開いた腹腔内に溜まります。(C)腹壁を片側に切開して血液を排出する。綿棒は排水を容易にします。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S3:グリッソンのカプセル。 (A)グリソンのカプセルは、肝臓表面に沿っていくつかの場所で細い先端ピンセットで破裂し、カプセルを穏やかに振ることによって肝細胞が放出されます。(B)肝臓は簡単に引き裂かれるはずです。(C)放出された肝細胞が懸濁液中の空の肝嚢(グリソンカプセル)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S4:生存率スクリーニングのためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。 (A)すべてのイベントが記録されました。(B) シングレットゲーティング。(C)Alexa Fluor 488ゾンビグリーン生存率染料による生/死染色。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S5:粒度測定のためのフローサイトメトリーゲーティング戦略。 (A)すべてのイベントが記録されました。(B) シングレットゲーティング。(C) 側方散乱のドットプロット(SSC; x 軸)対前方散乱(FSC; Y 軸) を使用して、粒度のレベルを分析します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S6:肝細胞精製。 (a)第1の遠心分離工程後の菌体ペレット;培地の上にある脂肪層に注意してください。(b)2回目の遠心分離後の肝細胞ペレット。(C)精製プロセスの最後に精製された肝細胞。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
公開されたプロトコルは、FACSソーティング後の単一細胞下流分析または細胞のバルク分析のために、正常および脂肪性マウス肝細胞の高収率を単離するための信頼性が高く簡単な方法を提供します。密度勾配精製に対する明確な利点は、細胞脂質含有量が肝細胞の有効収量に本質的に影響を与えないことです。したがって、脂肪性肝細胞の割合は保持され、下流の分析に含まれます。これは、脂肪原性肝疾患の研究にとって重要であるだけでなく、肝細胞が再生の最初の2〜3日以内に時間的および空間的に動的な脂肪症を示す主要な肝切除後のプロセスの分析にとっても最も重要です。単離された肝細胞の(単一細胞)分析は、肝切除術19,20,21後にすでに実施されているが、分析された細胞集団は、少なくとも部分的に、脂質を含んだ肝細胞を奪われており、したがって、結果は完全に代表的ではなく、痩せた肝細胞に偏っていたと仮定しなければならない。
現在、TRASの機能は完全には解明されていません。たとえば、肝小葉内の脂質含有量の空間的な違いは、よく理解されていないままです。したがって、これらの細胞を分析から正確に除外することなく、定量的および定性的な検出を可能にする方法が必要です(例えば、単一細胞トランスクリプトミクス、フローサイトメトリー、およびメタボロミクス)。
全体として、この改善されたプロトコルによる肝細胞収量は、密度勾配精製を用いた脂肪含有肝細胞(例えば、非アルコール性脂肪性肝炎、NASHのマウスから)の単離のための他の方法よりも著しく優れている15。ただし、細胞収量、生存率、および脂肪含有量は、調製物によって異なる場合があります。いくつかの要因が原因であるようです。
第一に、コラゲナーゼまたはコラゲナーゼブレンドの異なるバッチは、それらの酵素活性において異なるであろう。ただし、ロット間の違いは、従来のコラゲナーゼほど重要ではありません。それにもかかわらず、作業濃度を調整する必要があるかもしれません。使用までの適切な保管(-15〜-25°Cの乾燥凍結乾燥物および再水和ストック溶液)と、繰り返しの凍結融解サイクルを回避することにより、違いをさらに最小限に抑えることができますが、完全に排除することはできません。したがって、特定の実験シリーズに対して特定のバッチのコラゲナーゼのみを使用することをお勧めします。さらに、酵素活性は消化バッファーが肝臓に到達する温度に依存し、コラゲナーゼIおよびIIのブレンドに最適な温度は35°C〜37°Cです22。温度が低いと酵素活性が低下し、50°Cを超える温度はタンパク質の不可逆的な変性を引き起こす可能性があります。これを事前にテストし、消化バッファーの初期温度、プラスチックチューブの長さと直径、および流速を調整することにより、実験条件を最適化します。例えば、チューブの長さ60cm以内で最大10°Cの緩衝温度の低下が予想されます。必要に応じて、加温パッドと赤外線ランプを使用して温度を修正します。コラゲナーゼは、pH 7.4で最適な消化能力を示します。したがって、使用前にすでに約37°Cの使用温度で緩衝液のpHを調整することをお勧めします。
第二に、消化プロセスを開始する前に、肝臓(またはマウス全体)を灌流バッファーで十分に洗い流して、血清やアルブミンなどの潜在的な阻害剤を排除することが最も重要です。理想的には、消化バッファーが大静脈から肝臓を通って開いた門脈 を介して 流出にのみ移動するように、体循環が停止した後にのみ灌流が開始されます。上大静脈は小さな血管クランプで閉じることができます。これにより、残留血液成分/阻害剤との接触を防ぎます。肝臓を最適に洗い流す別の方法は、門脈の間欠的なクランプである。これは慎重に行われるべきであり、そして消化緩衝液が肝臓に到達したら - すでに消化された細胞を損傷するのを避けるために一度だけ行われるべきである。
第三に、再生肝細胞は敏感であり、経験上、過剰消化や細胞への害を避けるために、より短い消化時間とより慎重な取り扱いが必要であることが示されています。肝臓をできるだけ穏やかに収穫するには、肝丘をクランプでつかみ、次に最初に上大静脈を切断し、肝臓を静脈と横隔膜への接続から解放することをお勧めします。その後、下大静脈および門脈を切断することができ、それは肝臓の動員を可能にし、そして胃腸靭帯、片側の食道および反対側の右腎臓からそれを容易に解放する。肝切除マウスでは、正中葉から結紮糸の1つを注意深くつかんで肝臓を取り除くことができます。肝臓を無理矢理引き抜こうとすると、グリソンのカプセルが破裂し、孤立した細胞が失われる可能性があります。
最後に、肝細胞の灌流手順およびさらなる処理が中断または遅延しないことが不可欠であり、これは即時かつ必然的に生存率に影響を及ぼすであろう。理想的には、灌流は少なくとも2人のチームで一度に1匹の動物で行われます。ただし、時間と人的資源のこれらの要件は、この方法の制限の1つですが、これは代替方法にも当てはまります。
別の制限は、密度勾配に対して脂肪性肝細胞を失わないという利点が、残りの非実質および/または免疫細胞のわずかな割合をもたらすので、得られる細胞懸濁液の最終的な純度である。示されたサンプルでは、CD45+(免疫細胞)とCD31+(内皮細胞)の割合は5%未満であり、フローサイトメトリー中に最初に細胞サイズを選択した場合、CD45+とCD31+の割合はそれぞれ1.2%と2.2%です(図5)。ほとんどのアプリケーションでは、このレベルの純度で十分ですが、高感度の方法や初代細胞培養でのさらなる使用には、おそらくより高い程度が必要です。多くの研究では、肝細胞集団をMACS 23,24またはFACS 25で分類するための全身マーカーとしてCD31およびCD45を使用しています。
この改良された単離法は、肝再生、特に大量の脂肪性肝細胞を示す初期の研究に最適です。PHLFは、持続的な脂肪症を特徴とする、研究を必要とする特に関連性のある主題です。限界残骸を残して長期の肝切除術に続いて、PHLFが発症する可能性があり、実際に肝臓手術による最も一般的な死因を表しています。その病理生物学は部分的にしか理解されておらず、現在利用可能な治療法はありません26。PHLFが肝手術の適用を大幅に制限していることを考えると(肝悪性腫瘍の治療など)、その原因を調査し、潜在的な対策を特定することは明らかな医学的必要性です。
肝脂肪症を出発点とする疾患の研究の必要性も存在する。顕著な例は非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)であり、これはNASHに進行し、最終的には肝細胞癌(HCC)に進行する可能性があります27。西洋型食生活に関連した座りがちな生活の広がりは、NAFLDの世界的な流行につながり、それに応じて、HCCの発生率は28,29増加すると予測されています。次に、脂肪症は、肥満、メタボリックシンドローム、および2型糖尿病とも密接に関連しており、発生率が上昇しているすべての疾患です30。したがって、脂肪症は現在の医療システムにとってますます負担がかかり、その管理のための効果的な手段を求めています。この改良された2段階コラゲナーゼ灌流法は、単一細胞レベルでの脂肪性肝細胞の研究を可能にし、したがって肝細胞脂質蓄積の原因と結果の調査に役立つはずです。
このプロトコルは、部分的(70%)および拡張(86%)肝切除後のマウスからの再生肝細胞の in vivo 単離のための簡単、迅速、かつ信頼性の高い技術を提供します。このアプローチは、勾配精製に依存せず、従来の単離プロトコルで通常失われる脂質を含んだ肝細胞を含む肝臓再生プロセスの調査に使用できます。また、この方法は、マウス種に限らず、脂肪性変化に伴う各種肝疾患の研究にも適用することができる。
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Disclosures
著者は、競合する利益がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、スイス国立財団(プロジェクト助成金310030_189262)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | - |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | - |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | - |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | - |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | - |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | - |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | - |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | - |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | - |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | - | - |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | - |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | - |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | - |
| Fenestrated sterile surgical drape | - | - | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | - |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | - |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | - | - |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | - |
| Isofluran station | Provet | - | - |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | - | - |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | - | - |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | - |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | - |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | - | - |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | - | - |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | - |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | - | Adjust to 42 °C |
References
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