Summary
El presente protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para la generación, mantenimiento y envejecimiento reproducibles de organoides cerebrales derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC). Este método permite cultivar y madurar organoides cerebrales durante períodos prolongados, lo que facilita el modelado de los procesos involucrados en el envejecimiento cerebral y la patogénesis relacionada con la edad.
Abstract
Los modelos animales y celulares actualmente disponibles no recapitulan completamente la complejidad de los cambios que tienen lugar en el envejecimiento del cerebro humano. Un desarrollo reciente de procedimientos que describen la generación de organoides cerebrales humanos, derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC), tiene el potencial de transformar fundamentalmente la capacidad de modelar y comprender el envejecimiento del cerebro humano y los procesos patogénicos relacionados. Aquí, se presenta un protocolo optimizado para generar, mantener, envejecer y caracterizar organoides cerebrales humanos derivados de iPSC. Este protocolo se puede implementar para generar organoides cerebrales de manera reproducible y sirve como guía paso a paso, incorporando las últimas técnicas que resultan en una mejor maduración de organoides y envejecimiento en cultivo. Se están abordando problemas específicos relacionados con la maduración de organoides, la necrosis, la variabilidad y los efectos de lotes. Tomados en conjunto, estos avances tecnológicos permitirán el modelado del envejecimiento cerebral en organoides derivados de una variedad de donantes humanos jóvenes y envejecidos, así como individuos afectados por trastornos cerebrales relacionados con la edad, permitiendo la identificación de mecanismos fisiológicos y patogénicos del envejecimiento cerebral humano.
Introduction
Los modelos de enfermedades envejecidas se han vuelto cada vez más relevantes a medida que la esperanza de vida humana continúa aumentando. Estudios genómicos a gran escala han descubierto poblaciones envejecidas con desregulación de procesos moleculares y cambios genéticos que afectan la calidad de vida1. El proceso de envejecimiento se caracteriza por una pérdida general de la funcionalidad del organismo, incluida la pérdida de la función cognitiva, un mayor riesgo de trastornos neurodegenerativos y una serie de enfermedades crónicas2.
Las técnicas actuales de cultivo celular no representan adecuadamente la naturaleza multifactorial del envejecimiento, ya que estas disfunciones no pueden replicarse adecuadamente mediante el uso de mutaciones, toxinas o infecciones3. Los modelos animales que exploran el proceso de envejecimiento a menudo se asocian con largos tiempos experimentales y altos costos, pero también traen consigo consideraciones éticas. El uso de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) de pacientes puede dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión de la enfermedad, ya que las iPSCs permiten el desarrollo natural de células en tejido maduro3. Las iPSC se han convertido en el caballo de batalla de muchos laboratorios que investigan trastornos neurodegenerativos, ya que la reprogramación celular de las células recolectadas no parece borrar la enfermedad o las huellas de envejecimiento de los donantes4. Estas huellas recapitulan fenotipos celulares que han sido demostrados en modelos humanos y animales, haciendo que las iPSCs sean adecuadas para examinar el deterioro celular individual del tejido cerebral altamente denso 5,6. Los organoides derivados de IPSC se han convertido en el modelo preeminente para el cultivo tridimensional de tejido, lo que permite interacciones más complejas de célula a célula y una mejor recapitulación del desarrollo. Aunque se utilizan principalmente para datos de desarrollo, los organoides se han aplicado cada vez más hacia el modelado de enfermedades, específicamente modelos para inflamación, neurodegeneración y envejecimiento7. Basándose en estudios previos de iPSC, los organoides retienen fenotipos de enfermedades y fenotipos celulares dentro del contexto fisiológico de conexiones de red similares a tejidos 8,9. Sin embargo, cultivar tejido tridimensional de ciertas dimensiones puede ser un desafío, especialmente durante largos períodos de tiempo.
Este trabajo presenta un método detallado para la generación reproducible de organoides cerebrales que permite que el tejido madure sustancialmente en tamaño durante períodos más largos. La creación de organoides cerebrales se ha mantenido relativamente estandarizada, adoptando métodos de varios protocolos prominentes10,11. Sin embargo, se han sugerido varias modificaciones para mejorar la diferenciación y el mantenimiento. Estos métodos alternativos incluyen el uso de factores neurogénicos para mejorar la diferenciación neuronal12, andamios adicionales para mejorar el intercambio de nutrientes que promueven la longevidad celular 13 y agitación por estrés de baja pureza para un cultivo y crecimiento prolongados14. Estas mejoras se han incorporado a este método para desarrollar organoides maduros capaces de expresar fenotipos neurodegenerativos y de envejecimiento.
Protocol
Los estudios con pacientes fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional. Todos los participantes firmaron el consentimiento informado por escrito y el consentimiento del repositorio para permitir que sus datos y bioespecímenes sean reutilizados. Las líneas iPSC se generaron siguiendo las directrices IRB e institucionales. La figura 1 ilustra una introducción esquemática del flujo de trabajo de este protocolo.
1. Reprogramación y mantenimiento de iPSC
- Recolecte 8 ml de sangre del sujeto (paciente anciano o enfermo; mayores de 65 años) en tubos de preparación celular (CPT) con citrato de sodio o en tubos EDTA o heparinizados.
- Centrifugar a 1.800 x g durante 30 min a temperatura ambiente (RT) para recoger pellets que contengan solo sangre periférica y sin suero15.
- Utilice vectores de reprogramación especializados de acuerdo con el protocolo del fabricante (ver Tabla de materiales) para obtener iPSCs16.
- Cultivo de iPSCs en placas de cultivo de 6 pocillos recubiertas con una matriz de membrana basal de factor de crecimiento reducido sin lactosa deshidrogenasa (LDEV) sin alimentador en medios esenciales 8 (E8) (consulte la Tabla de materiales) a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% deCO2.
- Mantener las iPSCs en medios E8 durante 3-4 días para evitar el hacinamiento o la diferenciación espontánea.
- Validar la pluripotencia de las líneas iPSC utilizando marcadores inmunofluorescentes (paso 2) y realizar pruebas de micoplasma (paso 3).
2. Tinción de pluripotencia
- Para conservar soluciones y anticuerpos, sembrar las células en placas de cultivo recubiertas (paso 1.4) de 24 pocillos 3-4 días antes del análisis. Aspirar el medio con una pipeta y fijar las células con formaldehído al 4% en solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) durante 15-20 minutos a RT.
- Lave las células 3x con 1x PBS y permeabilice con Triton-X 100 al 0,1% en albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS durante al menos 15 min, pero no más de 1 h en RT.
- Lavar 3x con 1x PBS y bloquear con BSA al 5% en PBS durante 30 min en RT.
- Lavar de nuevo 3x con 1x PBS y añadir los anticuerpos Sox2 y Oct3/4 (dilución 1:100; ver Tabla de materiales), y la tinción nucleica DAPI en BSA al 1% (dilución 1:4.000) durante la noche a 4 °C. Envuélvalo en papel de aluminio para protegerlo de la luz.
- Lave 3x con 1x PBS y deje las celdas en PBS. Imagen con un microscopio de fluorescencia con un aumento de 10-20x. Asegurar que los marcadores de pluripotencia Sox2 y Oct3/4 estén localizados en los núcleos de las células17,18.
3. Prueba de micoplasma
NOTA: Consulte el protocolo del kit de detección (consulte la Tabla de materiales) para conocer los pasos detallados de ejecución y análisis del ensayo. El kit de detección proporciona el reactivo, el sustrato y el tampón de ensayo para las pruebas de micoplasma.
- Antes de pasar las células o el medio refrescante, recoger 2-3 ml de medio de cultivo celular en un tubo de centrífuga y granular cualquier célula o residuo a 200 x g durante 5 min en RT. Conservar el sobrenadante a 4 °C durante ≤5 días. Incubar las células con el medio durante al menos 24 h para asegurar una señal detectable.
- Agregue 100 μL de sobrenadante celular a un tubo nuevo o pocillo de una placa de pared blanca de 96 pocillos (se recomienda un fondo opaco, consulte la Tabla de materiales). Reconstituir el reactivo y el sustrato en el tampón del ensayo y equilibrarse durante 15 min a RT.
- Añadir 100 μL del reactivo a la muestra e incubar durante 5 min a RT. Mida la luminiscencia con un luminómetro (medida #1).
- Añadir 100 μL del sustrato a la muestra e incubar durante 10 min a RT. Medir la luminiscencia (medida #2).
- Determinar la contaminación por micoplasma por la relación de la medida #2 a #1. Consulte el manual del kit para la interpretación de los resultados.
4. Preparación de microfilamentos
- Comience la preparación de los microfilamentos poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA, consulte la Tabla de materiales) deshilachando la hebra de sutura con el extremo romo de un bisturí. Espache la fibra deshilachada ligeramente con etanol al 70%.
- Bajo el microscopio y usando una regla, comience a cortar la fibra PLGA en fragmentos de hebras de 500 μm a 1 mm de largo. Cortar unos 25 mm de la fibra en total. Mantenga los filamentos en un tubo de 15 ml con una solución antibiótico-antimicótica de 1 ml.
- En la campana, diluir la solución de fibra con 10 ml de DMEM/F-12 (Tabla 1). Vortex bien para mezclar la solución.
NOTA: Trabaje en una campana de flujo de cultivo celular en un ambiente estéril.
- En la campana, diluir la solución de fibra con 10 ml de DMEM/F-12 (Tabla 1). Vortex bien para mezclar la solución.
- Agregue 20 μL de la solución de fibra a tres pocillos formadores de cuerpo embrioide (EB) de una placa de 96 pocillos. Bajo microscopía de campo claro, cuente y promedie las fibras por pocillo. Diluir o concentrar a un promedio de 5-10 microfilamentos PLGA por pocillo. Prepara cada pozo de esta manera.
- Los pozos ahora están listos para ser sembrados con células. Conservar el plato a temperatura ambiente hasta que sea necesario o a 4 °C para el día siguiente.
5. Formación del cuerpo embrioide (EB)
NOTA: Todos los medios y soluciones deben calentarse a RT.
- Una vez que las iPSC han alcanzado una confluencia del 70% al 80% (Figura 2A), están listas para ser pasadas y utilizadas para la formación de EB. Verifique las células con un microscopio con un aumento de 10x-20x. Asegúrese de que las colonias muestren áreas mínimas (<10%) de diferenciación espontánea.
- Aspirar el medio con una pipeta y lavar las células una vez con DPBS. Disociar las colonias añadiendo 500 μL de solución de desprendimiento celular (ver Tabla de materiales) o 0,5 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) e incubar durante 3-5 min a 37 °C.
NOTA: Trabaje en una campana de flujo de cultivo celular en un ambiente estéril. - Recoja las células liberadas agregando 1 ml de medio E8 fresco a cada pocillo y pipete suavemente hasta que todas las células se desprendan.
- Transfiera 1,5 ml de suspensión celular a un tubo de 15 ml y agregue otro 1 ml de medio E8 fresco para alcanzar un volumen total de 2,5 ml.
- Centrífuga a 290 x g durante 3 min en RT.
- Aspirar el sobrenadante con una pipeta, resuspender la gránula celular en 1 ml de medio Essential 6 (E6, ver Tabla de materiales) suplementado con un inhibidor ROCK de 50 μM y contar las células usando un hemocitómetro19.
- Preparar una suspensión celular de 60.000-90.000 células/ml, dependiendo de la densidad de siembra deseada, en medios E6 suplementados con 50 μM de inhibidor ROCK (ver Tabla de materiales).
- Agregue 150 μL de la suspensión celular en cada pocillo de una placa ULA de 96 pocillos (o una placa cóncava preparada20). Siembra 9.000-11.000 células por pozo.
- Centrifugar la placa para forzar el agregado de las células a 290 x g durante 1 minuto a RT. Colocar la placa en la incubadora a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% deCO2.
6. Inducción neuroepitelial
- Después de 24 h, aspirar cuidadosamente 120 μL del medio con una pipeta. Asegúrese de no aspirar el EB bajando la punta de la pipeta demasiado adentro del pozo.
- Añadir 150 μL de medio E6 (en RT) suplementado con 2 μM de XAV939 y los inhibidores de SMAD: 10 μM de SB431542 y 500 nM de LDN 193189 por pocillo (ver Tabla de materiales).
- Cambie el medio diariamente con medios E6 recién preparados suplementados con 2 μM de XAV939, 10 μM de SB431542 y 500 nM de LDN 193189.
NOTA: Para el día 6 (DIV6), los EB deben tener un diámetro de 550-600 μm y estar listos para una mayor diferenciación.
7. Diferenciación y maduración de organoides
NOTA: Todos los medios deben calentarse a RT.
- Aproximadamente en DIV7, compruebe si todos los EB han alcanzado un diámetro de 550-600 μm y muestran un borde liso y claro (Figura 2B); en esta etapa, están listos para ser incrustados en una matriz extracelular (ECM).
NOTA: Trabaje en un ambiente estéril. - Prepare láminas de incrustación con hoyuelos de la película de sellado termoplástica (consulte la Tabla de materiales) colocando una hoja de película (de aproximadamente 4 pulgadas de largo) en una caja P200 vacía. Con un tubo cónico de 15 ml o un tubo de microcentrífuga de 500 μL, presione suavemente la lámina de película en los orificios para hacer 12 hoyuelos. Rocíe la lámina de película con etanol al 70% y déjela secar dentro de la campana de flujo con la luz UV encendida durante al menos 30 minutos.
- Descongele una cantidad suficiente de matriz de membrana basal (Matrigel, ver Tabla de materiales) en hielo y colóquela dentro de la campana de flujo.
NOTA: Por EB, se necesitan aproximadamente 30 μL de matriz de membrana sin diluir. Mantenga siempre la matriz de membrana por debajo de 4 °C para evitar que se gelifique. También se recomiendan las puntas de pipeta preenfriadas, ya que desaceleran la polimerización de la matriz en la punta durante el pipeteo, reduciendo así la pérdida de material. - Con una punta P200 de gran calibre, transfiera un EB a cada hoyuelo y retire la mayor cantidad de material posible con una punta de pipeta normal. Tenga cuidado de no dejar que los EB se sequen. Usando una punta P200 regular, agregue ~ 30 μL de matriz de membrana sin diluir a cada organoide, asegurándose de que el EB esté en el centro de la gota.
- Una vez que todos los EB estén incrustados en la matriz, coloque la hoja de película que contiene los EB en una placa de Petri estéril.
NOTA: Opcionalmente, se puede colocar una pequeña placa de Petri llena de agua estéril en la placa de Petri más grande junto a la hoja de película para evitar la evaporación.- Transfiera el plato a una incubadora e incube a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% deCO2 durante aproximadamente 10 minutos para que la matriz de membrana se solidifique.
- Para cada conjunto de 12 organoides incrustados, preparar 5 mL de medios de diferenciación con B27 sin vitamina A (Tabla 1) en un pocillo de una placa ULA de 6 pocillos. Precaliente la placa a 37 °C en una incubadora.
- Una vez finalizado el tiempo de incubación, transfiera los EB incrustados a la placa ULA de 6 pocillos tomando la hoja de película y empujando los hoyuelos de la parte posterior de la hoja. Si es necesario, tome 1 ml del pozo y pipetearlo sobre la hoja para ayudar a que las gotitas se desprendan de la película.
NOTA: Se pueden observar cambios morfológicos importantes 1 día después de la incrustación; Los EB pasan de tener bordes lisos a protuberancias abultadas que forman brotes (Figura 2C). - Después de 2 días (DIV9), realice un cambio de medio medio. Tenga cuidado de no aspirar o dañar las gotas de la matriz de membrana en el proceso.
- Después de 2 días más (DIV11), realice un cambio completo de medios, complementando el medio con 3 μM de CHIR99021 (consulte la Tabla de materiales).
- En DIV14, cambie los medios a medios de diferenciación con B27 con vitamina A (Tabla 1) para un aumento gradual en el tamaño de los organoides.
- En DIV16, coloque la placa de pozo en un agitador orbital a 90 rpm dentro de una incubadora. Cambie los medios cada 2 días.
- Cada 40 DIV, diluir 500 μL de la matriz de membrana por cada 50 ml de medio para obtener nutrientes adicionales en el medio.
Representative Results
La integración de fibras PLGA, incrustación de hoyuelos y agitación conduce a una generación robusta de organoides cerebrales que permite mantener cultivos derivados de iPSC durante largos períodos de tiempo (Figura 1).
Figura 1: Ilustración esquemática del flujo de trabajo y la línea de tiempo de este método. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El período inicial de inducción neural es comparable a los procedimientos publicados anteriormente11. Los cuerpos embrioides (EB) comienzan como agregados circulares (Figura 2B) con bordes blancos o transparentes. A medida que la EB cambia de medios de inducción neural a medios de mantenimiento neuronal en DIV7, las protuberancias y gemaciones emergen dentro de las 24 h del tejido circular (Figura 2C). Además, a medida que el organoide continúa creciendo, el área superficial de la fibra PLGA ayuda a que el organoide se alargue (Figura 2D). Durante la maduración, los bordes del organoide deben permanecer intactos, ya que es un buen signo de células sanas y desarrollo; de lo contrario, se deben proporcionar nutrientes adicionales13 (Figura 2E). El crecimiento de los organoides se ve facilitado por la agitación del cultivo de organoides, ya que esto mejora la perfusión con nutrientes.
Figura 2: Diferenciación y maduración de organoides cerebrales. (A) Imagen representativa de un cultivo iPSC con una confluencia del 70%-80%. (B) Se generaron cuerpos embrioides (EBs) y se indujo la formación neuroepitelial hasta DIV7. Luego, los EB se incrustaron en la matriz de membrana y se diferenciaron aún más hacia los organoides cerebrales. (C) Organoides en DIV10 que muestran distintas formaciones en ciernes. Los organoides pueden madurar aún más en la matriz de membrana utilizando (D) hoyuelo o (E) incrustación sándwich, aquí se muestra en DIV30. (F) El cultivo a largo plazo muestra organoides cerebrales que crecen a tamaños significativos (DIV70). Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las dimensiones y la morfología externa del organoide se complementan con una arquitectura compleja dentro del organoide. Después de fijar el tejido en DIV7 después de la primera etapa de diferenciación, las células del EB expresan SOX2, un factor de transcripción de caja HMG que actúa como marcador para células madre neurales multipotentes21, así como la caja de proteína pareada Pax-6, indicando células progenitoras neurales (Figura 3). Las neuronas inmaduras marcadas por TuJ1 (clase III β-tubulina)22 ya se pueden ver dispersas por todo el tejido.
En esta etapa, se hace evidente un ejemplo de la autoorganización por la que pasan estos organoides. La organización de las estructuras radiales, llamadas rosetas, es análoga al tubo neural, con células SOX2+ en el centro de la roseta21 y PAX6 hacia la periferia de la roseta. Estas rosetas dan lugar a neuronas a medida que migran hacia afuera. Estas células radiantes son inicialmente doblemente positivas para el marcador de células madre / progenitoras neurales Nestin23 y la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), similar a la glía radial que se encuentra en las áreas neurogénicas del cerebro in vivo . A medida que estas neuronas migratorias maduran, los marcadores citoesqueléticos reflejan este cambio22. El marcador de diferenciación neural en etapa temprana TuJ1 22 es visible en el círculo interno de la roseta y cambia a la proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2 )24, un marcador de maduración específico de neuronas en la periferia.
Figura 3: Los cuerpos embrioides en DIV7 muestran organización estructural y caracterización inmadura. Imagen inmunohistoquímica de montaje completo de un EB en DIV7. (A) Una imagen compuesta del EB que muestra (B) rosetas neuronales SOX2+, (C) neuronas inmaduras (TUJ1) dispersas por todo el EB, (D) células progenitoras neurales (PAX6) y (E) núcleos visualizados por DAPI. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
A medida que los organoides envejecen, la organización y los marcadores de las neuronas en desarrollo comienzan a replicar las condiciones fisiológicas. En DIV30, se pueden observar muchas rosetas que dan lugar a regiones neurogénicas equivalentes al cerebro en desarrollo25. Para DIV60, estas regiones neurogénicas SOX2+ son inexistentes y son reemplazadas por MAP2 y NeuN26 maduros, un marcador de diferenciación neuronal, y neuronas positivas (Figura 4 y Figura 5).
Figura 4: Los organoides en DIV120 muestran caracterización neuronal madura. Imagen inmunohistoquímica de una sección organoide en DIV 120. (A) Una imagen compuesta de la sección que muestra marcadores neuronales maduros de (B) MAP2 (púrpura) y (C) NeuN (verde). (D) Los núcleos fueron visualizados por DAPI. Barra de escala = 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: PCR digital de gotitas de organoides DIV120. Gráficos de PCR de gotitas digitales que muestran el valor de expresión absoluta de (A) MAP2 (arriba, azul) y (B) NeuN (abajo, verde). Las líneas amarillas cortadas separan diferentes líneas iPSC (A, B, C, etc.), y los organoides se han agrupado. N = 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Estos marcadores citoesqueléticos se pueden usar junto con otros marcadores postmitóticos (como la doble cortina27 y la sinapsina28) para detectar la plasticidad sináptica y otras disminuciones relacionadas con la edad (Figura 6), así como tejido cerebral adicional como astrocitos y glía (Figura 7).
Figura 6: Ejemplo de análisis sináptico terminal. Imagen inmunohistoquímica de una sección del organoide en DIV 120. (A) Una imagen compuesta de la sección teñida para (B) MAP2, (C) doble cortina (DCX) y (D) sinapsina I (SYN). (E) Los núcleos fueron visualizados por DAPI. Barra de escala = 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Evidencia de desarrollo glial. Imagen inmunohistoquímica de una sección del organoide en DIV 120. (A) Una imagen compuesta de la sección teñida para (B) molécula adaptadora ionizada de unión al calcio 1 (Iba1) y (C) NeuN. (D) Los núcleos fueron visualizados por DAPI. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo | Concentración final | Volumen (50 ml en total) |
| DMEM-F12 | 50% | 25 ml |
| Medio neurobasal | 50% | 25 ml |
| Suplemento N2 (100x) | 1x | 0,25 ml |
| B27 Suplemento -/+ Vitamina A (50x) | 0,5 veces | 0.5 mL |
| Insulina | 0.25% | 12,5 μL |
| GlutaMAX (100x) | 1x | 0.5 mL |
| MEM-NEAA (100x) | 0,5 veces | 0,25 ml |
| HEPES (1 M) | 10 mM | 0.5 mL |
| Antibiótico/Antimicótico (100x) | 1x | 0.5 mL |
| 2-β-mercaptoetanol | 50 μM | 17,5 μL |
| *NOTA: algunos DMEM-F12 ya contienen GlutaMAX, no es necesario agregar adicional. | ||
Tabla 1: Composición de los medios de diferenciación utilizados en el presente estudio.
Discussion
La formación estandarizada de EB es un paso crítico en la conversión reproducible de células madre pluripotentes en organoides cerebrales. La agregación forzada de células madre en tejidos singulares puede variar dependiendo de la geometría de los pocillos cóncavos, la densidad de siembra y el tratamiento del pozo. Aunque el método actual cita un rango de diámetro de 500-600 μm después de 6 días, estos diámetros no excluyen otros diámetros de formación adecuada de organoides, ya que muchos otros diámetros han demostrado ser exitosos. Sin embargo, se ha demostrado que los diámetros variables influyen en las tasas de diferenciación y el éxito29. Para fines de reproducibilidad, se recomiendan encarecidamente variaciones de diámetro por debajo de 50 μm20. Además, el número de días de inducción neural puede extenderse de 6 a 10 días para permitir que los EB crezcan en diámetro, ya que se ha demostrado que el uso de inhibidores de SMAD produce y mantiene eficientemente la formación de neuroepitelios después de solo 5 días de exposición30. En ausencia de inhibidores de SMAD, la inducción neural puede producir resultados inconsistentes, lo que requiere períodos de inducción más largos. Los inhibidores de SMAD citados en este trabajo son los más efectivos, pero otras moléculas pequeñas de dorsomorfina y TGF-β se pueden usar en su concentración efectiva.
La matriz de la membrana basal proporciona un excelente sustrato para el crecimiento y se puede administrar de manera diferente. Los primeros usos de la matriz incluyeron la membrana basal como un recubrimiento de pozo31. Sin embargo, el uso de la matriz para la incrustación de tejido demostró mejorar la diferenciación y la maduración en esos tejidos32. Para los organoides, se ha demostrado que el uso de la matriz mejora la diferenciación de EB en organoides, promueve la maduración y extiende los períodos de cultivo33. Mientras que los organoides todavía pueden formarse sin la matriz, como muchos grupos se han esforzado por lograr un cultivo de tejido libre de matriz34,35, los estudios han encontrado que los organoides incrustados en la matriz tienen una mayor probabilidad de tiempos de cultivo prolongados y requieren menos mantenimiento 36. El método de incrustación de hoyuelos proporciona una cobertura igual de la superficie organoide, asegurando una difusión similar, acceso a nutrientes y diferenciación reproducible. Alternativamente, se puede emplear la incrustación de cúpula para encapsular completamente los organoides37.
La transferencia de los EB a los hoyuelos de la matriz de membrana es un paso crítico. Aunque una punta de pipeta de 1 ml tiene una abertura lo suficientemente ancha como para transferir los EB, se prefiere una punta de 200 μL para facilitar la transferencia. Las puntas de 200 μL deben cortarse para crear una abertura lo suficientemente grande, lo que garantiza un borde liso para reducir el esfuerzo cortante durante el pipeteo. Alternativamente, existen puntas de 200 μL de gran diámetro para facilitar la transferencia. El pipeteo debe hacerse lentamente, ya que el pipeteo rápido podría interrumpir la periferia del organoide y dificultar el crecimiento adecuado. Se debe prestar especial atención para garantizar que se transfiera suficiente medio para proporcionar nutrientes. Muy poco medio corre el riesgo de secar el organoide, causando necrosis. La transferencia del EB con demasiados medios de cultivo puede hacer que la matriz esté demasiado diluida y no encapsule el organoide de forma segura. Idealmente, la matriz no debe diluirse en más del 50% para asegurar su polimerización y funcionar como un ECM para los EB. Si la incrustación no se realiza correctamente, el EB se puede recuperar y volver a encapsular. La reencapsulación en la matriz fresca se puede hacer en cualquier punto para proporcionar al organoide un soporte adicional.
Similar a la incrustación de matriz para andamios, las fibras PLGA proporcionan soporte adicional para el crecimiento tridimensional. Originalmente incorporada para producir organoides alargados y aumentar el área superficial38, la incorporación de fibras de PLGA se ha identificado progresivamente como una herramienta adicional para mejorar la diferenciación y maduración de organoides39. A medida que más laboratorios buscan reducir el uso de la matriz o abolirla por completo, las propiedades de autoorganización de los organoides soportados por las fibras incorporadas proporcionan suficiente andamiaje para la creación y diferenciación de tejidos tridimensionales39. Aquí, ambos métodos fueron combinados para aumentar las posibilidades de cultivo a largo plazo38,39. La incorporación de fibras durante la agregación inicial es crítica, ya que estas pueden no ser introducidas en una etapa posterior. Después de la centrifugación, verificar que un par de fibras estén entre las células agregadas asegurará que una fibra se incorpore en el EB. Si no tiene éxito, una aspiración suave del pozo y una recentrifugación deberían garantizar la mezcla.
Otro paso crítico en el mantenimiento de organoides es la introducción de un agitador orbital para una mejor perfusión de medios. En las primeras iteraciones de protocolos organoides, se utilizó un biorreactor giratorio para crear agitación11. Un agitador orbital a 90 rpm proporciona suficiente agitación sin destruir la gota de la matriz o dañar la morfología del organoide. Algunos grupos se abstienen de utilizar el andamio de matriz, pero conservan la agitación del agitador para proporcionar un ambiente adecuado34. Al igual que con todos los protocolos, la velocidad de las rotaciones debe ajustarse dependiendo del agitador para reducir la cantidad de esfuerzo cortante. Si se eligió una incrustación de cúpula, se podría emplear un agitador inclinado para reducir la cantidad de esfuerzo cortante11,34.
En conjunto, la integración de varias técnicas seleccionadas proporciona un método robusto de formación de organoides derivados de iPSC. Hay varias formas de crear y mantener organoides, pero muchas de ellas se centran en trayectorias de diferenciación tempranas. En este trabajo, se combinaron múltiples técnicas diferentes para cultivar organoides durante largos períodos de tiempo, más allá de la fase de diferenciación y en un período de maduración donde los fenotipos de envejecimiento pueden comenzar a desarrollarse. La incorporación de estas técnicas permite una maduración prolongada sin necesidad de factores biológicos exógenos para mantener los cultivos, conservando la autoorganización y progresión natural del envejecimiento.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Iniciativa Organ-on-Chip de los Países Bajos, un proyecto de gravitación del Nuevo Orden Mundial (024.003.001) financiado por el Ministerio de Educación, Cultura y Ciencia del gobierno de los Países Bajos. D.C.B. agradece el apoyo financiero del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) en forma de beca doctoral.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-β-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 1:4000 |
| 6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate | Greiner Bio-One | 657185 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | 46964 | cell detachment solution |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) | Gibco | 17504044 | |
| B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) | Gibco | 12587010 | |
| BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-685-125 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | With plate holders |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune Sendai Reprogramming Vector | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| ddPCR primers | human | MAPT | Bio-Rad | dHsaCPE192234 | |
| ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN) | Bio-Rad | dHsaCPE5052108 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Doublecortin (DCX) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8066 | 1:500 |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | no calcium, no magnesium |
| Eppendorf cups, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| Essential 6 | Gibco | A1516401 | |
| Essential 8 | Gibco | A1517001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | |
| Falcon tubes, 15 mL, conical | Greiner Bio-One | 188271-N | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| GlutaMax (100x) | Gibco | 35050038 | |
| Hemacytometer cell counter | Hausser scientific | 1490 | |
| HEPES Buffer | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LDN 193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| MAP2 | Abcam | ab32454 | 1:200 |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356230 | basement membrane matrix |
| MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader | Perkin Elmer | 1420 | luminometer |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NeuN | Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 AF647 | 1:100 |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | thermoplastic film sheet |
| PAX6 | Thermo Fisher Scientific | 42-6600 | 1:200 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments | Ethicon | J463 | |
| QX200 Droplet digital PCR system | Bio-Rad | 1864001 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Selleck Chemicals | S1049 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614/50 | |
| SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience | Invitrogen | 53-9811-80 | 1:100 |
| Synapsin I (SYN) | Calbiochem | 574777 | 1:200 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TUJ1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80005 | Beta-3-tubulin; 1:500 |
| XAV939 | Tocris Bioscience | 3748 |
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