Summary
Das vorliegende Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren für die reproduzierbare Generierung, Aufrechterhaltung und Alterung von zerebralen Organoiden, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) gewonnen werden. Diese Methode ermöglicht die Kultivierung und Reifung zerebraler Organoide über längere Zeiträume, was die Modellierung von Prozessen erleichtert, die an der Alterung des Gehirns und der altersbedingten Pathogenese beteiligt sind.
Abstract
Die derzeit verfügbaren Tier- und Zellmodelle rekapitulieren die Komplexität der Veränderungen, die im alternden menschlichen Gehirn stattfinden, nicht vollständig. Eine neuere Entwicklung von Verfahren, die die Erzeugung von humanen zerebralen Organoiden beschreiben, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) gewonnen werden, hat das Potenzial, die Fähigkeit, die Alterung des menschlichen Gehirns und damit verbundene pathogene Prozesse zu modellieren und zu verstehen, grundlegend zu verändern. In dieser Arbeit wird ein optimiertes Protokoll für die Generierung, Aufrechterhaltung, Alterung und Charakterisierung von humanen iPSC-abgeleiteten zerebralen Organoiden vorgestellt. Dieses Protokoll kann implementiert werden, um Gehirnorganoide auf reproduzierbare Weise zu erzeugen, und dient als Schritt-für-Schritt-Anleitung, die die neuesten Techniken enthält, die zu einer verbesserten Organoidreifung und Alterung in Kultur führen. Spezifische Fragestellungen im Zusammenhang mit Organoidreifung, Nekrose, Variabilität und Chargeneffekten werden behandelt. Zusammengenommen werden diese technologischen Fortschritte die Modellierung der Gehirnalterung in Organoiden ermöglichen, die von einer Vielzahl junger und älterer menschlicher Spender sowie von Personen mit altersbedingten Gehirnerkrankungen stammen, was die Identifizierung physiologischer und pathogener Mechanismen der menschlichen Gehirnalterung ermöglicht.
Introduction
Modelle für alternde Krankheiten haben angesichts der weiter steigenden Lebenserwartung der Menschen zunehmend an Bedeutung gewonnen. Groß angelegte genomische Studien haben aufgedeckt, dass ältere Populationen mit einer Fehlregulation molekularer Prozesse und genetischen Veränderungen, die die Lebensqualität beeinträchtigen, auftreten1. Der Alterungsprozess ist gekennzeichnet durch einen allgemeinen Funktionsverlust des Organismus, einschließlich des Verlusts der kognitiven Funktion, eines erhöhten Risikos für neurodegenerative Erkrankungen und einer Vielzahl chronischer Krankheiten2.
Aktuelle Zellkulturtechniken bilden die multifaktorielle Natur des Alterns nicht angemessen ab, da diese Funktionsstörungen nicht durch Mutationen, Toxine oder Infektionen richtig repliziert werden können3. Tiermodelle, die den Prozess des Alterns erforschen, sind oft mit langen Versuchszeiten und hohen Kosten verbunden, bringen aber auch ethische Überlegungen mit sich. Die Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Patienten kann die molekularen Mechanismen aufklären, die dem Fortschreiten der Krankheit zugrunde liegen, da iPS-Zellen die natürliche Entwicklung von Zellen zu reifem Gewebe ermöglichen3. iPS-Zellen sind zum Arbeitspferd vieler Labore geworden, die neurodegenerative Erkrankungen untersuchen, da die zelluläre Reprogrammierung der geernteten Zellen die Krankheits- oder Alterungsspuren der Spender nicht zu beseitigenscheint 4. Diese Abdrücke rekapitulieren zelluläre Phänotypen, die in Human- und Tiermodellen nachgewiesen wurden, wodurch iPS-Zellen für die Untersuchung der individuellen zellulären Verschlechterung des hochdichten Hirngewebes geeignet sind 5,6. IPSC-abgeleitete Organoide haben sich zum herausragenden Modell für die dreidimensionale Kultivierung von Gewebe entwickelt und ermöglichen komplexere Zell-zu-Zell-Interaktionen und eine verbesserte Entwicklungsrekapitulation. Obwohl Organoide in erster Linie für Entwicklungsdaten verwendet werden, werden sie zunehmend für die Modellierung von Krankheiten eingesetzt, insbesondere für Modelle für Entzündungen, Neurodegeneration und Alterung7. Aufbauend auf früheren iPSC-Studien behalten Organoide Krankheitsphänotypen und zelluläre Phänotypen im physiologischen Kontext gewebeähnlicher Netzwerkverbindungenbei 8,9. Die Kultivierung von dreidimensionalem Gewebe bestimmter Abmessungen kann jedoch eine Herausforderung darstellen, insbesondere über längere Zeiträume.
In dieser Arbeit wird eine detaillierte Methode zur reproduzierbaren Erzeugung von zerebralen Organoiden vorgestellt, die es dem Gewebe ermöglicht, über längere Zeiträume hinweg erheblich an Größe zu reifen. Die Herstellung von zerebralen Organoiden ist relativ standardisiert geblieben und hat Methoden aus mehreren bekannten Protokollen übernommen10,11. Es wurden jedoch mehrere Modifikationen vorgeschlagen, um die Differenzierung und Wartung zu verbessern. Zu diesen alternativen Methoden gehören die Verwendung neurogener Faktoren zur Verbesserung der neuronalen Differenzierung12, zusätzliche Gerüste für einen verbesserten Nährstoffaustausch, die die zelluläre Langlebigkeit fördern13, und eine reine Stressagitation für eine verlängerte Kultur und ein längeres Wachstum14. Diese Verbesserungen sind in diese Methode eingeflossen, um ausgereifte Organoide zu entwickeln, die in der Lage sind, neurodegenerative und alternde Phänotypen zu exprimieren.
Protocol
Die Patientenstudien wurden vom Institutional Review Board genehmigt. Alle Teilnehmer unterzeichneten eine schriftliche Einverständniserklärung und eine Einverständniserklärung zum Repositorium, um die Wiederverwendung ihrer Daten und Bioproben zu ermöglichen. iPSC-Zeilen wurden nach IRB- und institutionellen Richtlinien erstellt. Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über den Arbeitsablauf dieses Protokolls.
1. Neuprogrammierung und Wartung von iPSCs
- Sammeln Sie 8 ml des Blutes des Probanden (älter oder kranker Patient; 65 Jahre und älter) in Zellvorbereitungsröhrchen (CPT) mit Natriumcitrat oder in EDTA- oder heparinisierte Röhrchen.
- Bei 1.800 x g für 30 min bei Raumtemperatur (RT) zentrifugieren, um Pellets zu gewinnen, die nur peripheres Blut und kein Serumenthalten 15.
- Verwenden Sie spezielle Reprogrammierungsvektoren gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle), um iPS-Zellenzu erhalten 16.
- Kultivieren Sie iPS-Zellen in feederfreien, Laktose-Dehydrogenase-erhöhenden Virus-(LDEV)-freien, mit reduziertem Wachstumsfaktor beschichteten 6-Well-Kulturplatten in Essential 8 (E8)-Medien (siehe Materialtabelle) bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2.
- Bewahren Sie iPS-Zellen in E8-Medien für 3-4 Tage auf, um eine Überfüllung oder spontane Differenzierung zu vermeiden.
- Validieren Sie die Pluripotenz der iPSC-Linien mit Hilfe von Immunfluoreszenzmarkern (Schritt 2) und testen Sie auf Mykoplasmen (Schritt 3).
2. Pluripotenz-Färbung
- Um Lösungen und Antikörper zu konservieren, säen Sie die Zellen 3-4 Tage vor der Analyse auf beschichtete (Schritt 1.4) 24-Well-Kulturplatten. Das Medium mit einer Pipette absaugen und die Zellen mit 4%igem Formaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) für 15-20 Minuten bei RT fixieren.
- Waschen Sie die Zellen 3x mit 1x PBS und permeabilisieren Sie mit 0,1% Triton-X 100 in 1% Kälberserumalbumin (BSA) in PBS für mindestens 15 min, jedoch nicht länger als 1 h bei RT.
- 3x mit 1x PBS waschen und mit 5% BSA in PBS für 30 min bei RT blockieren.
- Nochmals 3x mit 1x PBS waschen und die Antikörper Sox2 und Oct3/4 (1:100 Verdünnung; siehe Materialtabelle) sowie die Nukleinfärbung DAPI in 1% BSA (1:4.000 Verdünnung) über Nacht bei 4 °C zugeben. Zum Schutz vor Licht in Alufolie einwickeln.
- 3x mit 1x PBS waschen und die Zellen in PBS belassen. Aufnahme mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 10-20-facher Vergrößerung. Stellen Sie sicher, dass die Pluripotenzmarker Sox2 und Oct3/4 in den Zellkernen lokalisiert sind17,18.
3. Mykoplasmen-Test
HINWEIS: Im Protokoll des Detektionskits (siehe Materialtabelle) finden Sie detaillierte Schritte zur Durchführung und Analyse von Assays. Das Detektionskit enthält das Reagenz, das Substrat und den Assay-Puffer für Mykoplasmentests.
- Sammeln Sie vor dem Passieren von Zellen oder Auffrischungsmedium 2-3 ml Zellkulturmedium in einem Zentrifugenröhrchen und pelletieren Sie alle Zellen oder Trümmer bei 200 x g für 5 Minuten bei RT. Lagern Sie den Überstand bei 4 °C für ≤5 Tage. Inkubieren Sie die Zellen mindestens 24 h lang mit dem Medium, um ein nachweisbares Signal zu gewährleisten.
- Geben Sie 100 μl Zellüberstand in ein frisches Röhrchen oder eine Vertiefung einer weißwandigen 96-Well-Platte (undurchsichtiger Boden empfohlen, siehe Materialtabelle). Rekonstituieren Sie das Reagenz und das Substrat im Assay-Puffer und äquilibrieren Sie es 15 Minuten lang bei RT.
- Geben Sie 100 μL des Reagenzes in die Probe und inkubieren Sie es 5 min lang bei RT. Messen Sie die Lumineszenz mit einem Luminometer (Messung #1).
- 100 μL des Substrats in die Probe geben und 10 min bei RT inkubieren. Messen Sie die Lumineszenz (Messung #2).
- Bestimmen Sie die Mykoplasmenkontamination durch das Verhältnis von Messung #2 zu #1. Schlagen Sie im Handbuch des Kits nach, um die Ergebnisse zu interpretieren.
4. Mikrofilament-Präparation
- Beginnen Sie mit der Herstellung der Poly-(Milch-Co-Glykolsäure) (PLGA, siehe Materialtabelle), indem Sie den Nahtstrang mit dem stumpfen Ende eines Skalpells ausfransen. Verteilen Sie die ausgefranste Faser leicht mit 70% Ethanol.
- Beginnen Sie unter dem Mikroskop und mit einem Lineal damit, die PLGA-Faser in Fragmente von 500 μm bis 1 mm langen Strängen zu schneiden. Schneiden Sie insgesamt ca. 25 mm der Faser ab. Bewahren Sie die Filamente in einem 15-ml-Röhrchen mit einer 1-ml-antibiotisch-antimykotischen Lösung auf.
- In der Haube wird die Faserlösung mit 10 ml DMEM/F-12 verdünnt (Tabelle 1). Gut vortexen, um die Lösung zu mischen.
Anmerkungen: Arbeiten Sie in einer Zellkultur-Durchflusshaube in einer sterilen Umgebung.
- In der Haube wird die Faserlösung mit 10 ml DMEM/F-12 verdünnt (Tabelle 1). Gut vortexen, um die Lösung zu mischen.
- Geben Sie 20 μl der Faserlösung in drei Embryoidkörper (EB), die Vertiefungen einer 96-Well-Platte bilden. Unter der Hellfeldmikroskopie werden die Fasern pro Well gezählt und gemittelt. Verdünnen oder konzentrieren Sie sich auf durchschnittlich 5-10 PLGA-Mikrofilamente pro Well. Bereiten Sie jede Vertiefung auf diese Weise vor.
- Die Brunnen sind nun bereit, mit Zellen besät zu werden. Lagern Sie die Platte bis zur Verwendung bei Raumtemperatur oder für den nächsten Tag bei 4 °C.
5. Bildung des Embryoidkörpers (EB)
HINWEIS: Alle Medien und Lösungen müssen auf RT erwärmt werden.
- Sobald die iPS-Zellen eine Konfluenz von 70%-80% erreicht haben (Abbildung 2A), können sie für die Passage und die EB-Bildung verwendet werden. Überprüfen Sie die Zellen mit einem Mikroskop bei 10-20-facher Vergrößerung. Stellen Sie sicher, dass die Kolonien nur minimale (<10%) Bereiche der spontanen Differenzierung aufweisen.
- Saugen Sie das Medium mit einer Pipette ab und waschen Sie die Zellen einmal mit DPBS. Die Kolonien werden durch Zugabe von 500 μl Zellablöselösung (siehe Materialtabelle) oder 0,5 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) dissoziiert und 3-5 min bei 37 °C inkubiert.
Anmerkungen: Arbeiten Sie in einer Zellkultur-Durchflusshaube in einer sterilen Umgebung. - Sammeln Sie die freigesetzten Zellen, indem Sie 1 ml frisches E8-Medium in jede Vertiefung geben und vorsichtig pipettieren, bis sich alle Zellen gelöst haben.
- Übertragen Sie 1,5 ml Zellsuspension in ein 15-ml-Röhrchen und fügen Sie weitere 1 ml frisches E8-Medium hinzu, um ein Gesamtvolumen von 2,5 ml zu erreichen.
- Bei 290 x g für 3 min bei RT zentrifugieren.
- Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette an, resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Essential 6 (E6, siehe Materialtabelle), ergänzt mit einem 50 μM ROCK-Inhibitor, und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer19.
- Herstellung einer Zellsuspension von 60.000-90.000 Zellen/ml, abhängig von der gewünschten Seeding-Dichte, in E6-Medien, ergänzt mit 50 μM ROCK-Inhibitor (siehe Materialtabelle).
- Geben Sie 150 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-ULA-Platte (oder einer vorbereiteten konkaven Platte20). Säen Sie 9.000-11.000 Zellen pro Well.
- Zentrifugieren Sie die Platte, um die Zellen bei 290 x g für 1 min bei RT zu pressen. Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2.
6. Neuroepitheliale Induktion
- Nach 24 h werden 120 μl des Mediums vorsichtig mit einer Pipette abgesaugt. Stellen Sie sicher, dass Sie den EB nicht absaugen, indem Sie die Pipettenspitze zu weit in die Vertiefung senken.
- Fügen Sie 150 μl E6-Medien (bei RT) hinzu, ergänzt mit 2 μM XAV939 und den SMAD-Inhibitoren: 10 μM SB431542 und 500 nM LDN 193189 pro Well (siehe Materialtabelle).
- Wechseln Sie das Medium täglich mit frisch zubereiteten E6-Medien, ergänzt mit 2 μM XAV939, 10 μM SB431542 und 500 nM LDN-193189.
HINWEIS: An Tag 6 (DIV6) sollten die EBs einen Durchmesser von 550-600 μm haben und für eine weitere Differenzierung bereit sein.
7. Organoide Differenzierung und Reifung
HINWEIS: Alle Medien müssen auf RT erwärmt werden.
- Prüfen Sie bei ca. DIV7, ob alle EBs einen Durchmesser von 550-600 μm erreicht haben und eine glatte und klare Kante aufweisen (Abbildung 2B); In diesem Stadium sind sie bereit, in eine extrazelluläre Matrix (EZM) eingebettet zu werden.
Anmerkungen: Arbeiten Sie in einer sterilen Umgebung. - Bereiten Sie Noppeneinbettfolien aus der thermoplastischen Siegelfolie vor (siehe Materialtabelle), indem Sie eine Folienfolie (ca. 4 Zoll lang) auf eine leere P200-Schachtel legen. Drücken Sie die Filmfolie mit einem konischen 15-ml-Röhrchen oder einem 500-μl-Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig in die Löcher, um 12 Grübchen zu erhalten. Sprühen Sie die Folienfolie mit 70%igem Ethanol ein und lassen Sie sie in der Strömungshaube bei eingeschaltetem UV-Licht mindestens 30 Minuten trocknen.
- Tauen Sie eine ausreichende Menge der Basalmembranmatrix (Matrigel, siehe Materialtabelle) auf Eis auf und legen Sie sie in die Fließhaube.
HINWEIS: Pro EB werden ca. 30 μl unverdünnte Membranmatrix benötigt. Halten Sie die Membranmatrix immer unter 4 °C, um ein Gelieren zu verhindern. Vorgekühlte Pipettenspitzen werden ebenfalls empfohlen, da sie die Polymerisation der Matrix in der Spitze während des Pipettierens verlangsamen und so den Materialverlust reduzieren. - Übertragen Sie mit einer P200-Spitze mit breiter Bohrung ein EB auf jede Vertiefung und entfernen Sie so viel Medium wie möglich mit einer normalen Pipettenspitze. Achten Sie darauf, die EBs nicht trocknen zu lassen. Fügen Sie mit einer normalen P200-Spitze jedem Organoid ~30 μl unverdünnte Membranmatrix hinzu und stellen Sie sicher, dass sich das EB in der Mitte des Tröpfchens befindet.
- Sobald alle EBs in die Matrix eingebettet sind, legen Sie die Filmfolie mit den EBs in eine sterile Petrischale.
HINWEIS: Optional kann eine kleine, mit sterilem Wasser gefüllte Petrischale in die größere Petrischale neben die Filmfolie gestellt werden, um eine Verdunstung zu verhindern.- Die Schale in einen Inkubator überführen und bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2 ca. 10 min inkubieren, damit sich die Membranmatrix verfestigen kann.
- Für jeden Satz von 12 eingebetteten Organoiden werden 5 ml Differenzierungsmedien mit B27 ohne Vitamin A (Tabelle 1) in einer Vertiefung einer ULA 6-Well-Platte hergestellt. Die Platte im Inkubator auf 37 °C vorwärmen.
- Sobald die Inkubationszeit abgelaufen ist, übertragen Sie die eingebetteten EBs auf die ULA 6-Well-Platte, indem Sie die Filmfolie nehmen und die Vertiefungen von der Rückseite der Folie herausdrücken. Nehmen Sie bei Bedarf 1 ml aus der Vertiefung und pipettieren Sie ihn auf das Blatt, damit sich die Tröpfchen von der Folie lösen können.
HINWEIS: Wichtige morphologische Veränderungen sind 1 Tag nach der Einbettung zu sehen; EBs gehen von glatten Kanten zu prallen Vorsprüngen über, die Knospen bilden (Abbildung 2C). - Führen Sie nach 2 Tagen (DIV9) einen halben Medienwechsel durch. Achten Sie darauf, die Tröpfchen der Membranmatrix dabei nicht anzusaugen oder zu beschädigen.
- Führen Sie nach weiteren 2 Tagen (DIV11) einen vollständigen Medienwechsel durch, indem Sie das Medium mit 3 μM CHIR99021 ergänzen (siehe Materialtabelle).
- Wechseln Sie bei DIV14 das Medium zu Differenzierungsmedien mit B27 mit Vitamin A (Tabelle 1), um eine allmähliche Zunahme der Organoidgröße zu erreichen.
- Bei DIV16 wird die Well-Platte auf einen Orbitalschüttler mit 90 U/min in einem Inkubator gelegt. Wechseln Sie das Medium alle 2 Tage.
- Alle 40 DIV werden 500 μl der Membranmatrix pro 50 ml Medium verdünnt, um zusätzliche Nährstoffe im Medium zu erhalten.
Representative Results
Die Integration von PLGA-Fasern, die Einbettung von Grübchen und die Agitation führen zu einer robusten Generation von zerebralen Organoiden, die es ermöglichen, aus iPS-Zellen gewonnene Kulturen über längere Zeiträume zu erhalten (Abbildung 1).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs und des Zeitablaufs dieser Methode. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die anfängliche neuronale Induktionsphase ist vergleichbar mit bisher veröffentlichten Verfahren11. Die Embryoidkörper (EB) beginnen als kreisförmige Aggregate (Abbildung 2B) mit weißen oder transparenten Rändern. Wenn das EB bei DIV7 von neuronalen Induktionsmedien in neuronale Erhaltungsmedien umgewandelt wird, treten innerhalb von 24 Stunden Vorsprünge und Knospungen aus dem zirkulären Gewebe aus (Abbildung 2C). Wenn das Organoid weiter wächst, trägt die Oberfläche der PLGA-Faser außerdem dazu bei, dass sich das Organoid verlängert (Abbildung 2D). Während der Reifung müssen die Ränder des Organoids intakt bleiben, da dies ein gutes Zeichen für gesunde Zellen und Entwicklung ist. Andernfalls müssen zusätzliche Nährstoffezugeführt werden 13 (Abbildung 2E). Das Wachstum der Organoide wird durch das Rühren der Organoidkultur weiter erleichtert, da dies die Durchblutung mit Nährstoffen verbessert.
Abbildung 2: Differenzierung und Reifung zerebraler Organoide . (A) Repräsentatives Bild einer iPSC-Kultur bei 70%-80% Konfluenz. (B) Embryoid Bodies (EBs) wurden generiert und die Neuroepithelbildung bis DIV7 induziert. EBs wurden dann in die Membranmatrix eingebettet und weiter zu zerebralen Organoiden differenziert. (C) Organoide an DIV10 mit ausgeprägten Knospungsformationen. Organoide können in der Membranmatrix entweder durch (D)-Grübchen- oder (E)-Sandwich-Einbettung weiter gereift werden, hier bei DIV30 gezeigt. (F) Die Langzeitkultur zeigt, dass zerebrale Organoide zu signifikanten Größen heranwachsen (DIV70). Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Dimensionen und die äußere Morphologie des Organoids werden durch eine komplexe Architektur im Inneren des Organoids ergänzt. Nach der Fixierung des Gewebes an DIV7 nach der ersten Differenzierungsstufe exprimieren Zellen des EB SOX2, einen HMG-Box-Transkriptionsfaktor, der als Marker für multipotente neurale Stammzellenfungiert 21, sowie eine gepaarte Proteinbox Pax-6, die auf neuronale Vorläuferzellen hinweist (Abbildung 3). Unreife Neuronen, die durch TuJ1 (Klasse III β-Tubulin)22 markiert sind, sind bereits im Gewebe verstreut zu sehen.
In dieser Phase wird ein Beispiel für die Selbstorganisation deutlich, die diese Organoide durchlaufen. Die Organisation der radialen Strukturen, Rosetten genannt, ist analog zum Neuralrohr, mit SOX2+-Zellen im Rosettenzentrum21 und PAX6 zur Rosettenperipherie hin. Aus diesen Rosetten entstehen Neuronen, wenn sie auswandern. Diese strahlenden Zellen sind zunächst doppelt positiv für den neuralen Stamm-/Vorläuferzellmarker Nestin23 und das glia fibrillary acidic protein (GFAP), ähnlich den radialen Gliazellen, die in neurogenen Bereichen des in vivo Gehirns vorkommen. Wenn diese wandernden Neuronen reifen, spiegeln die Marker des Zytoskeletts diese Veränderungwider 22. Der frühe neuronale Differenzierungsmarker TuJ1 22 ist im inneren Kreis der Rosette sichtbar und verschiebt sich auf das Mikrotubuli-assoziierte Protein 2 (MAP2 )24, einen neuronenspezifischen Reifungsmarker an der Peripherie.
Abbildung 3: Embryoid Bodies an DIV7 zeigen strukturelle Organisation und unreife Charakterisierung. Immunhistochemisches Gesamtbild eines EB am DIV7. (A) Ein zusammengesetztes Bild des EB mit (B) SOX2+-Neuralrosetten, (C) unreifen Neuronen (TUJ1), die über den EB verstreut sind, (D) neuronalen Vorläuferzellen (PAX6) und (E) Kernen, die von DAPI visualisiert wurden. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Wenn die Organoide altern, beginnen die Organisation und die Marker der sich entwickelnden Neuronen, physiologische Bedingungen zu replizieren. Bei DIV30 sind viele Rosetten zu beobachten, die neurogene Regionen hervorbringen, die dem sich entwickelnden Gehirn entsprechen25. Bei DIV60 sind diese neurogenen SOX2+-Regionen nicht mehr vorhanden und werden durch reifes MAP2 und NeuN26, einen Neuronendifferenzierungsmarker, sowie positive Neuronen ersetzt (Abbildung 4 und Abbildung 5).
Abbildung 4: Organoide an DIV120 zeigen eine ausgereifte neuronale Charakterisierung. Immunhistochemische Aufnahme eines Organoidschnitts bei DIV 120. (A) Ein zusammengesetztes Bild des Schnitts, das reife neuronale Marker von (B) MAP2 (lila) und (C) NeuN (grün) zeigt. (D) Die Kerne wurden mit DAPI visualisiert. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Digitale Tröpfchen-PCR von DIV120-Organoiden. Digitale Tröpfchen-PCR-Diagramme, die den absoluten Expressionswert von (A) MAP2 (oben, blau) und (B) NeuN (unten, grün) zeigen. Gelbe Schnittlinien trennen verschiedene iPSC-Linien (A, B, C usw.), und Organoide wurden zusammengefügt. N = 5. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Diese Zytoskelettmarker können in Verbindung mit anderen postmitotischen Markern (wie Doublecortin27 und Synapsin28) verwendet werden, um die synaptische Plastizität und andere altersbedingte Abnahmen (Abbildung 6) sowie zusätzliches Hirngewebe wie Astrozyten und Gliazellen (Abbildung 7) zu untersuchen.
Abbildung 6: Beispiel für eine synaptische terminale Analyse. Immunhistochemische Aufnahme eines Abschnitts des Organoids bei DIV 120. (A) Ein zusammengesetztes Bild des Schnitts, der für (B) MAP2, (C) Doublecortin (DCX) und (D) Synapsin I (SYN) gefärbt wurde. (E) Die Kerne wurden mit DAPI visualisiert. Maßstabsbalken = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Nachweis der Gliaentwicklung. Immunhistochemische Aufnahme eines Abschnitts des Organoids bei DIV 120. (A) Ein zusammengesetztes Bild des Schnitts, der für (B) ionisiertes Kalzium-bindendes Adaptermolekül 1 (Iba1) und (C) NeuN gefärbt wurde. (D) Die Kerne wurden mit DAPI visualisiert. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Reagenz | Endkonzentration | Volumen (insgesamt 50 ml) |
| DMEM-F12 | 50% | 25 ml |
| Neurobasales Medium | 50% | 25 ml |
| N2 Ergänzung (100x) | 1x | 0,25 ml |
| B27 Nahrungsergänzungsmittel -/+ Vitamin A (50x) | 0,5-fach | 0,5 ml |
| Insulin | 0.25% | 12,5 μL |
| GlutaMAX (100x) | 1x | 0,5 ml |
| MEM-NEAA (100x) | 0,5-fach | 0,25 ml |
| HEPES (1 M) | 10 mM | 0,5 ml |
| Antibiotikum/Antimykotikum (100x) | 1x | 0,5 ml |
| 2-β-Mercaptoethanol | 50 μM | 17,5 μL |
| *HINWEIS: Einige DMEM-F12 enthalten bereits GlutaMAX, es müssen keine zusätzlichen hinzugefügt werden. | ||
Tabelle 1: Zusammensetzung der in der vorliegenden Studie verwendeten Differenzierungsmedien.
Discussion
Die standardisierte Bildung von EBs ist ein entscheidender Schritt bei der reproduzierbaren Umwandlung von pluripotenten Stammzellen in Hirnorganoide. Die Kraftaggregation von Stammzellen in einzelnen Geweben kann je nach Geometrie der konkaven Vertiefungen, der Aussaatdichte und der Vertiefungsbehandlung variieren. Obwohl die aktuelle Methode einen Durchmesserbereich von 500-600 μm nach 6 Tagen angibt, schließen diese Durchmesser andere Durchmesser mit korrekter Organoidbildung nicht aus, da sich viele andere Durchmesser als erfolgreich erwiesen haben. Es hat sich jedoch gezeigt, dass unterschiedliche Durchmesser die Differenzierungsraten und den Erfolg beeinflussen29. Aus Gründen der Reproduzierbarkeit werden Durchmesserabweichungen unter 50 μm dringend empfohlen20. Darüber hinaus kann die Anzahl der neuronalen Induktionstage von 6 auf 10 Tage verlängert werden, damit die EBs im Durchmesser wachsen können, da sich gezeigt hat, dass die Verwendung von SMAD-Inhibitoren die Bildung von Neuroepithelien nach nur 5 Tagen Exposition effizient produziert und aufrechterhält30. In Abwesenheit von SMAD-Inhibitoren kann die neuronale Induktion zu inkonsistenten Ergebnissen führen, die längere Induktionszeiten erfordern. Die in dieser Arbeit zitierten SMAD-Inhibitoren sind am wirksamsten, aber auch andere kleine Dorsomorphin- und TGF-β-Moleküle können in ihrer effektiven Konzentration eingesetzt werden.
Die Basalmembranmatrix bietet ein hervorragendes Substrat für das Wachstum und kann unterschiedlich verabreicht werden. Frühe Verwendungen der Matrix umfassten die Basalmembran als Well-Beschichtung31. Es zeigte sich jedoch, dass die Verwendung der Matrix zur Einbettung von Gewebe die Differenzierung und Reifung in diesen Geweben verbessert32. Bei Organoiden hat sich gezeigt, dass die Verwendung der Matrix die EB-Differenzierung in Organoide verbessert, die Reifung fördert und die Kulturperioden verlängert33. Während Organoide auch ohne die Matrix gebildet werden können, da viele Gruppen eine matrixfreie Gewebekultur angestrebt haben 34,35, haben Studien ergeben, dass die in die Matrix eingebetteten Organoide eine höhere Wahrscheinlichkeit für längere Kulturzeiten haben und weniger Wartung erfordern36. Die Dimple-Methode der Einbettung bietet eine gleichmäßige Abdeckung der Organoidoberfläche und gewährleistet eine ähnliche Diffusion, Zugang zu Nährstoffen und eine reproduzierbare Differenzierung. Alternativ kann eine Kuppeleinbettung verwendet werden, um die Organoide37 vollständig zu verkapseln.
Der Transfer der EBs in die Membranmatrix-Vertiefungen ist ein kritischer Schritt. Obwohl eine 1-ml-Pipettenspitze eine ausreichend breite Öffnung hat, um die EBs zu übertragen, wird eine 200-μl-Spitze bevorzugt, um den Transfer zu erleichtern. Die 200-μl-Spitzen müssen geschnitten werden, um eine ausreichend große Öffnung zu schaffen, die eine glatte Kante gewährleistet, um die Scherspannung beim Pipettieren zu reduzieren. Alternativ gibt es 200-μl-Spitzen mit breiter Bohrung, um den Transfer zu erleichtern. Das Pipettieren muss langsam durchgeführt werden, da schnelles Pipettieren die organoide Peripherie stören und das ordnungsgemäße Wachstum behindern kann. Es muss besonders darauf geachtet werden, dass genügend Medium übertragen wird, um Nährstoffe bereitzustellen. Zu wenig Medium birgt die Gefahr, dass das Organoid austrocknet und es zu Nekrosen kommt. Das Übertragen des EB mit zu viel Nährmedium kann dazu führen, dass die Matrix zu verdünnt wird und das Organoid nicht sicher verkapselt wird. Idealerweise darf die Matrix nicht um mehr als 50 % verdünnt werden, um ihre Polymerisation zu gewährleisten und als ECM für die EBs zu fungieren. Wenn die Einbettung nicht erfolgreich ist, kann die EB wiederhergestellt und neu gekapselt werden. Eine erneute Verkapselung in der frischen Matrix kann an jeder beliebigen Stelle erfolgen, um dem Organoid zusätzlichen Halt zu geben.
Ähnlich wie bei der Matrixeinbettung für Gerüste bieten PLGA-Fasern zusätzliche Unterstützung für dreidimensionales Wachstum. Ursprünglich zur Herstellung länglicher Organoide und zur Vergrößerung der Oberfläche38 eingesetzt, wurde der Einbau von PLGA-Fasern nach und nach als zusätzliches Werkzeug zur Verbesserung der Organoiddifferenzierung und -reifung39 identifiziert. Da immer mehr Labore versuchen, die Verwendung der Matrix zu reduzieren oder ganz abzuschaffen, bieten die selbstorganisierenden Eigenschaften der Organoide, die durch die eingearbeiteten Fasern unterstützt werden, ein ausreichendes Gerüst für die dreidimensionale Gewebeerzeugung und -differenzierung39. Hier wurden beide Methoden kombiniert, um die Chancen auf eine langfristige Kultur zu erhöhen38,39. Die Einarbeitung von Fasern während der anfänglichen Aggregation ist von entscheidender Bedeutung, da diese möglicherweise zu einem späteren Zeitpunkt nicht mehr eingeführt werden. Nach der Zentrifugation wird durch die Überprüfung, ob sich einige Fasern unter den aggregierten Zellen befinden, sichergestellt, dass eine Faser in den EB eingebaut wird. Wenn dies nicht gelingt, sollte eine sanfte Absaugung der Vertiefung und eine erneute Zentrifugation das Mischen gewährleisten.
Ein weiterer wichtiger Schritt bei der Aufrechterhaltung von Organoiden ist die Einführung eines Orbitalschüttlers für eine bessere Medienperfusion. In frühen Iterationen von Organoid-Protokollen wurde ein sich drehender Bioreaktor verwendet, um eine Bewegung zu erzeugen11. Ein Orbitalschüttler mit 90 U/min sorgt für ausreichende Bewegung, ohne das Matrixtröpfchen zu zerstören oder die Organoidmorphologie zu beschädigen. Einige Gruppen verzichten auf die Verwendung des Matrixgerüsts, behalten aber das Schüttelrühren bei, um eine geeignete Umgebung34 zu schaffen. Wie bei allen Protokollen muss die Geschwindigkeit der Rotationen je nach Shaker angepasst werden, um die Scherspannung zu reduzieren. Wenn eine Kuppeleinbettung gewählt wurde, konnte ein gekippter Schüttler eingesetzt werden, um die Schubspannung zu reduzieren11,34.
Zusammenfassend stellt die Integration mehrerer ausgewählter Techniken eine robuste Methode zur Bildung von iPS-basierten Organoiden dar. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, Organoide zu erzeugen und zu erhalten, aber viele von ihnen konzentrieren sich auf frühe Differenzierungsverläufe. In dieser Arbeit wurden mehrere verschiedene Techniken kombiniert, um Organoide über längere Zeiträume zu kultivieren, über die Differenzierungsphase hinaus und in eine Reifephase, in der sich alternde Phänotypen entwickeln können. Die Einbeziehung dieser Techniken ermöglicht eine verlängerte Reifung, ohne dass exogene biologische Faktoren erforderlich sind, um die Kulturen zu erhalten, wobei die Selbstorganisation und das natürliche Fortschreiten des Alterns erhalten bleiben.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Niederländischen Organ-on-Chip-Initiative unterstützt, einem NWO-Gravitationsprojekt (024.003.001), das vom Ministerium für Bildung, Kultur und Wissenschaft der niederländischen Regierung finanziert wurde. D.C.B. dankt für die finanzielle Unterstützung des Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) in Form eines Promotionsstipendiums.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-β-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 1:4000 |
| 6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate | Greiner Bio-One | 657185 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | 46964 | cell detachment solution |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) | Gibco | 17504044 | |
| B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) | Gibco | 12587010 | |
| BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-685-125 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | With plate holders |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune Sendai Reprogramming Vector | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| ddPCR primers | human | MAPT | Bio-Rad | dHsaCPE192234 | |
| ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN) | Bio-Rad | dHsaCPE5052108 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Doublecortin (DCX) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8066 | 1:500 |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | no calcium, no magnesium |
| Eppendorf cups, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| Essential 6 | Gibco | A1516401 | |
| Essential 8 | Gibco | A1517001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | |
| Falcon tubes, 15 mL, conical | Greiner Bio-One | 188271-N | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| GlutaMax (100x) | Gibco | 35050038 | |
| Hemacytometer cell counter | Hausser scientific | 1490 | |
| HEPES Buffer | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LDN 193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| MAP2 | Abcam | ab32454 | 1:200 |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356230 | basement membrane matrix |
| MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader | Perkin Elmer | 1420 | luminometer |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NeuN | Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 AF647 | 1:100 |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | thermoplastic film sheet |
| PAX6 | Thermo Fisher Scientific | 42-6600 | 1:200 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments | Ethicon | J463 | |
| QX200 Droplet digital PCR system | Bio-Rad | 1864001 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Selleck Chemicals | S1049 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614/50 | |
| SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience | Invitrogen | 53-9811-80 | 1:100 |
| Synapsin I (SYN) | Calbiochem | 574777 | 1:200 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TUJ1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80005 | Beta-3-tubulin; 1:500 |
| XAV939 | Tocris Bioscience | 3748 |
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