Summary
פרוטוקול זה מתאר את מודל הטרנספוזיציה של נוירומה טיביאלית, הכרוך בנגע של העצב הטיביאלי עם טרנספוזיציה עוקבת של קצה העצב הפרוקסימלי לכיוון מנח פרטיביאלי או לטרלי תת עורי. בדיקה התנהגותית של כאב נוירומה והיפראלגזיה פלנטרית מכומתת באמצעות מונופילמנטים של פון פריי.
Abstract
טרנספוזיציית נוירומה טיביאלית (TNT) היא מודל חולדה שבו אלודיניה באתר הנוירומה (עצב טיביאלי) ניתנת להערכה עצמאית מאלודיניה במשטח הפלנטרי של הכף האחורית העצבנית על ידי עצב סוראלי שלם. מודל TNT זה מתאים לבדיקת טיפולים לכאבי נוירומה, כגון עליונותם הפוטנציאלית של טיפולים כירורגיים מסוימים שכבר נמצאים בשימוש במרפאה, או להערכת תרופות חדשות והשפעתן על שתי שיטות הכאב באותה חיה. במודל זה, נגע דיסטלי (נוירוטמזיס) נעשה בעצב הטיביאלי, וקצה העצב הפרוקסימלי עובר טרנספוזיה ומקובע תת עורית ומדויקת כדי לאפשר הערכות של אתר הנוירומה עם מונופילמנט פון פריי 15 גרם. כדי להעריך אלודיניה מעל העצב הסורי, ניתן להשתמש במונופילמנטים של פון פריי בשיטה מעלה-מטה באזור הצידי הפלנטרי של הכף האחורית. לאחר חיתוך העצב הטיביאלי, רגישות יתר מכנית מתפתחת באתר הנוירומה תוך שבוע לאחר הניתוח ונמשכת לפחות עד 12 שבועות לאחר הניתוח. אלודיניה במשטח הפלנטרי העצבני הסוראלי מתפתחת תוך 3 שבועות לאחר הניתוח בהשוואה לגפה הנגדית. ב 12 שבועות, נוירומה נוצרת על הקצה הפרוקסימלי של עצב טיביאלי קטוע, מסומן על ידי פיזור ומערבולות של אקסונים. עבור ניתוח מודל TNT, יש לבצע מספר שלבים קריטיים (מיקרו)כירורגיים, ומומלץ לבצע חלק מהניתוחים בהרדמה סופנית. בהשוואה למודלים אחרים של כאב נוירופתי, כגון מודל הפגיעה העצבית החסוכה, אלודיניה מעל אתר הנוירומה יכולה להיבדק באופן עצמאי מרגישות יתר עצבית סוראלית במודל TNT. עם זאת, אתר נוירומה יכול להיבדק רק בחולדות, לא בעכברים. הטיפים וההנחיות הניתנים בפרוטוקול זה יכולים לסייע לקבוצות מחקר העובדות על כאב ליישם בהצלחה את מודל TNT במתקן שלהן.
Introduction
כל פצע, החל מחתכים פשוטים ועד קטיעת גפה שלמה, מלווה בדרגות שונות של פגיעה עצבית היקפית. פגיעה עצבית כזו עלולה לגרום להיווצרות נוירומה, שזירה לא מאורגנת של סיבי עצב נובטים. נוירומות מכאיבות אצל 8%-30% מהחולים, ומשפיעות קשות על איכות חייהם 1,2,3,4,5. לאחר קטיעת גפיים, כאב נוירומה מתפתח אצל 50% מהחולים 6,7,8. תסמינים מדווחים כוללים רגישות, כאב ספונטני, אלודיניה, שיכוך יתר ורגישות יתר מכנית או תרמית באזור העצבים9. כאשר לא מטופלים כראוי בתוך שנה אחת, כאב נוירומה יכול להתקדם למצב כאב כרוני, וכתוצאה מכך נטל חברתי גבוה ועלויות רפואיות נלוות 10,11,12,13,14. בשל יעילותן הירודה של ההתערבויות הפרמקולוגיות הנוכחיות, עדיף לטפל בכאבי נוירומה על ידי הסרה כירורגית של הנוירומה הכואבת, והעצב המטופל בטכניקות כירורגיות שונות, כמתואר בספרות15. חשוב לציין כי הקלה מוחלטת בכאב היא נדירה, הכאב לעיתים מחמיר עם הזמן, ו-40% מהמטופלים אינם נהנים מהניתוח, מה שמעיד על כך שיש צורך בטיפולים חדשים 1,16.
מודל חולדות סטנדרטי של כאב נוירומה מסייע בהבנת המנגנונים המניעים כאב נוירומה, ועשוי לסייע בזיהוי טיפולים חדשים או בהערכת טיפולים קיימים המשמשים במרפאה. מודל טרנספוזיציית נוירומה טיביאלית (TNT) תואר לראשונה על ידי דורסי ועמיתיו בשנת 200817 ושימש קבוצות מחקר שונות18,19,20. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להיות מסוגל לבדוק טכניקות טיפול שונות עבור כאב נוירומה. היתרון של המודל על, למשל, הפגיעה העצבית החסכנית (SNI) מודל21, הוא שהוא מאפשר לבדוק אלודיניה באתר הנוירומה. הסיבה לכך היא שהמודל כרוך בהעברת קצה העצב הפרוקסימלי של העצב הטיביאלי למצב פרטיביאלי תת עורי, שם ניתן לחקור אותו עם מונופילמנטים של פון פריי. יתר על כן, allodynia מתפתח על פני השטח plantar של הכף האחורית innervated על ידי עצב sural שלם, אשר ניתן להעריך באופן עצמאי מן כאב נוירומה באותה חיה. הדבר דומה לסימפטומים של כאבי נוירומה בחולים, שם כאב נוירופתי מתמשך לאחר הסרת נוירומה כואבת נגרם לעיתים על ידי העצבים השכנים22. יתר על כן, אלודיניה מעל עצב קטוע עם נוירומה היא שיטת כאב שונה מאשר אלודיניה מעל עצב שכן שלם. לפיכך, מודל זה מאפשר להעריך את ההשפעה של טיפולים חדשים הן על אלודיניה הקיימת באתר נוירומה והן על כאב נוירופתי נפוץ יותר שנבדק במשטח הפלנטרי של הכף האחורית. מכיוון שהניתוח המבוצע ליצירת מודל TNT יכול להיות מאתגר, מאמר זה מפרט את ההליך לתמיכה בחוקרים המיישמים את המודל במתקן שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה בוצע בהתאם ל- IVD (Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht) ולהנחיות למחקר בבעלי חיים, מספר פרויקט AVD1150020198824.
1. מדידות קו הבסיס של פון פריי
- לפני הניתוח, בצע מדידות בסיסיות בהתאם להליך הבדיקה של פון פריי, המתואר להלן בסעיף 5 ובסעיף 6.
2. הרדמה והכנה
הערה: מחקר זה נערך על 15 חולדות Sprague Dawley זכרים שהיו בני 12 שבועות.
- מרדימים את בעלי החיים על ידי זירוז עם 5% isoflurane ולשמור על הרדמה עם 2%-3% isoflurane.
הערה: תחזוקה עם 2% איזופלורן מביאה בדרך כלל להרדמה מספקת ולנשימה ספונטנית, ללא צורך באינטובציה בקנה הנשימה או אוורור מכני. - בדוק את הרפלקסים של בעלי החיים על ידי צביטת כף הרגל עם פינצטה. ודא כי בעל החיים אינו מגיב לפני שתמשיך. יש לגלח את שדה הניתוח מהברך ועד הקרסול בעזרת מכונת גילוח חשמלית ולמרוח משחת עיניים על העיניים למניעת יובש. להזריק 0.5 מ"ג / ק"ג של משכך כאבים carprofen תת עורית באזור הבטן.
- הניחו את החולדה המורדמת על גבה כשראשה משמאל או מימין והרגל לניתוח ליד המנתח. Exorotate את הגפה האחורית התחתונה כך malleolus המדיאלי פונה כלפי מעלה. הניחו את החולדה מתחת למיקרוסקופ כירורגי סטריאופוני עם הגדלה פי 6.
- יש לחטא את האזור המגולח בשלושה סבבים לסירוגין של פילינג על בסיס יוד ולאחר מכן אלכוהול. מניחים יריעה סטרילית עם חור אופרטיבי מעל הרגל, כך שרק שדה הניתוח גלוי. יש להקפיד על שמירה על תנאים סטריליים אלה במהלך הניתוח.
3. ניתוח
- מניחים צמר גפן קטן מתחת לקרסול על מנת לשמור על שדה הניתוח אופקי. אתר את הברך ובצע בעדינות חתך אורכי של 1-2 ס"מ באמצעות אזמל מעל הצד המדיאלי של הכף האחורית מאמצע השוק ועד הקרסול. במידת הצורך, יש לפתוח את העור ואת התת-חתך עוד יותר עם מספריים מיקרו עד ששכבות השריר נראות לעין.
- זהה את הצרור הנוירו-וסקולרי השטחי כשתיים או שלוש לבנות וקו סגול/אדום עבה יותר, לפעמים עם ענפים קטנים, שיכול לנוע בחופשיות על שכבות השריר. באמצעות אלקטרוקאוטריה (ראו טבלת חומרים), קרישה של דימום פעיל או נוזל בשדה הניתוח. היזהר לא לפגוע צרור neurovascular.
- יש לנתח בבוטות כדי לפתוח את הפאשיה בין שרירי הגסטרוקנמיוס, רק אחורית לצרור הנוירו-וסקולרי השטחי של 3.2. בין הפאשיה של השרירים ניתן למצוא את העצב הטיביאלי. גודלו של העצב הטיביאלי גדול בערך פי שלושה מהעצב השטחי בצרור הנוירו-וסקולרי. השתמש בעצם הטיביאלית כנקודת ציון נוספת (העצב הטיביאלי נמצא רק אחורי לעצם הטיביאלית).
- לזהות את העצב הטיביאלי ואת bifurcation שלה.
הערה: הביפורקציה נראית בדרך כלל עם קו בהיר יותר לאורך מעל העצב. - נתחו בזהירות את העצב הטיביאלי ללא צרורות כלי הדם שמסביב. בצע את הדיסקציה על ידי הזזת העצב הטיביאלי בצורה בוטה וחיתוך הרקמה החשופה שמראה מתיחה מסוימת תוך כדי הזזת העצב הטיביאלי.
הערה: אם העצב הטיביאלי מחובר לורידים חוצים לאחר דיסקציה, ורידים אלה יכולים להיות קרושים על מנת לחשוף את כל עצב הטיביאל. היזהרו שלא לקרוש את צרור הטיביאל עצמו. - חשוף את העצב הטיביאלי בסמיכות עד שהוא נעלם מתחת לשכבת שריר חוצה. בשלב זה, נראה כי העצב הטיביאלי צולל עמוק יותר לתוך הכף האחורית לכיוון הברך. חשוף את העצב הטיביאלי באופן מרוחק עד הקרסול.
הערה: כאשר העצב הטיביאלי נחשף בצורה דיסטלית יותר, כמות סיבי הקולגן החוצים (כלומר, סיבים בניצב לכיוון סיבי העצב) תגדל. סיבי קולגן אלה צריכים להיות חתוכים כדי לאפשר אורך מספיק עבור transposing העצב הטיביאלי.- כאשר כל העצב הטיביאלי נחשף, הניחו את שכבות השריר לאחור כדי למנוע התייבשות של העצב. אם העצב מתייבש (כלומר, הוא נעשה נוקשה יותר, עמום יותר ומקומט), וכיסוי בשכבות שריר אינו מספיק, הוסיפו טיפות מלח כדי ללחלח אותו.
- באמצעות כלי מיקרו-כירורגיה קהה, רצוי מחזיק מחט מיקרו, מנתחים את העור הפרטיביאלי משכבת השריר התת עורית על מנת ליצור תעלה תת עורית. כדי לעשות זאת, להחזיק את העור למעלה לדחוף את קצה קהה לתוך הרקמה, במקביל לעור. יש לוודא שקצה המנהרה ממוקם באופן מדויק או רוחבי יותר כדי להבטיח נגישות קלה של האזור לבדיקת הנוירומה.
- הגדל את isoflurane ל 5%. לחזור לעצב הטיביאלי ולחשוף אותו (כלומר, לחזור למקום המתואר בשלב 3.6). חתכו את העצב הטיביאלי (כלומר, שני הענפים הפלנטריים) ברמה הדיסטלית ביותר ליד הקרסול. להקטין את isoflurane לרמה נורמלית של 2%-3%.
- שנה את הגדלת המיקרוסקופ ל- 10x או 16x. זהה את epineurium של עצב tibial פרוקסימלי לחתוך שנעשה בשלב 3.8, או במקרה של bifurcation פרוקסימלי יותר של עצב tibial, לזהות את epineurium של שני ענפים plantar מדיאלי לרוחב פרוקסימלי לחתוך בשלב 3.8.
הערה: האפיניריום לבן ומוצק יותר בהשוואה לסיבי העצב שבתוכו, שהם צהובים ורכים יותר. - מניחים בזהירות 8-0 תפר ניילון (ראה טבלת חומרים) דרך האפיניוריום של קצה העצב הפרוקסימלי על ידי החזקה זהירה של האפיניוריום בפינצטה והנחת המחט בין העצב לאפיניוריום בנשיכה של כ -0.5 מ"מ. משכו את התפר ונשכו עם המחט תת עורית בקצה התעלה התת עורית שנעשתה בשלב 3.7. בצע קשר, אשר יהיה transpose את העצב לרוחב לתוך המנהרה תת עורית.
הערה: אם שני הענפים הפלנטריים חולקים אפינויריום משותף, תפר אחד אמור להספיק. אם לשני ענפי הפלנטר יש אפינויריום משלהם, כל אפינויריום צריך להיות מקובע בנפרד. הימנע הצבת התפר דרך העור; רק לתקן את זה תת עורית. - מניחים תפר עבה יותר בצבע כהה (רצוי תפר כחול או שחור 4-0) סומק לקצה העצב המקובע ולא חודר לעור. ודא שהתפר נראה מבחוץ של העור. בדוק אם העצב נשאר במקום לאחר הזזת הכף והשרירים. חתכו את קצוות התפר עם קצה תפר מעט ארוך יותר ב-4-0 מאשר ב-8-0 תפר.
- שנה את ההגדלה של המיקרוסקופ בחזרה ל 6x. סגור את העור עם תפרים intraepidermal באמצעות 8-0 תפרו ונקו בעדינות את העור עם 0.9% NaCl באמצעות צמר גפן.
4. טיפול לאחר הניתוח
- הניחו את החולדה בכלוב נקי מתחת למגבת נייר בתנוחה נוחה. אם החדר קר, הניחו כרית חום מתחת לחלק מהכלוב (רק מתחת לחלק מהכלוב מכיוון שבעל החיים אמור להיות מסוגל לברוח מהחום בעת הצורך). הבטיחו גישה נוחה למזון ומים.
- אין להשאיר את החולדה שלאחר הניתוח ללא השגחה עד שהיא חזרה להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבת עצם החזה. ניתן להחזיר את החולדה לחברתם של בעלי חיים אחרים לאחר שהתאוששה לחלוטין מהרדמה לאחר ניתוח. זה בדרך כלל אחרי שעה וכאשר החולדה מפגינה את דפוס ההליכה וההתנהגות הרגילים שלה.
- ב 24 שעות ו 48 שעות לאחר הניתוח, לתת מינון של 0.5 מ"ג / ק"ג carprofen תת עורית (אזור הבטן) לטיפול בכאב לאחר הניתוח.
5. בדיקת פון פריי של הצד הפלנטרי של הכפות האחוריות
הערה: בדיקת פון פריי (שלב 5 ו-6) מבוצעת לפני הניתוח (למדידת קו בסיס), ומ-3 ימים לאחר הניתוח.
- הניחו את החולדות בכלובים התחתונים של רשת שבוע לפני המדידה הבסיסית, או שבועיים לפני הניתוח, כדי להבטיח התאקלמות בסביבת הבדיקה.
- יש להתחיל במדדים בסיסיים לפחות שבוע לפני הניתוח. ודא ששלוש מדידות בסיסיות בלתי תלויות מבוצעות בימים נפרדים.
- ודאו שהחולדות רגועות בכלובים התחתונים המחווטים ברשת. החל סדרה של מונופילמנטים של פון פריי עם סולם לוגריתמי בניצב למשטח הפלנטרי של הכף האחורית.
- על מנת לעורר את העצב הסוראלי (רגישות יתר), להחיל את monofilament בצד לרוחב קרוב לגבול השיער. הימנעו מלגעת בכריות כף הרגל מכיוון שהן רגישות יותר.
- כדי לעורר את העצב הטיביאלי (תת רגישות), להחיל את monofilament באמצע פני השטח plantar של הכף האחורית. אם המונופילמנט מיושם באזור המדיאלי ביותר, זה עשוי גם לגרות את העצב הספני, ענף של עצב הירך (איור 1). הימנעו מלגעת בכריות הרגליים.
- התחל עם מונופילמנט 4 גרם. החל כוח מספיק על monofilament, כך השיער הוא מתכופף להחזיק במשך 3 שניות, ולאחר מכן לבדוק את התגובות של החיה על monofilament. תגובה חיובית היא נסיגה פתאומית של כפות הרגליים, התכווצות פתאומית, ליקוק כפות פתאומי או השמעת קול. במקרים מסוימים, החולדה זזה ומנסה למצוא/לתקוף את המונופילמנט.
- בחר את המונופילמנט הבא בהתאם לתגובה לגירוי באמצעות שיטת מעלה-מטה23. לדוגמה, אם החולדה מגיבה, לעורר הבא עם monofilament 2 גרם; אם החולדה אינה מגיבה, לעורר עם monofilament 6 גרם, וכן הלאה. בסך הכל, להחיל 5-10 גירויים בהתאם לתגובה.
6. בדיקת פון פריי לאתר הנוירומה
- טפל בבעלי החיים מדי יום במשך 5-7 ימים לפחות לפני הצעדים הבסיסיים או שבועיים לפני הניתוח. ודא שבעלי החיים מוחזקים כמתואר בשלב 6.2, כך שהם מרגישים בנוח עם התנוחה.
- החזיקו את החולדות כשאפן מכוון לכיוון קפל המרפק. אם החולדה מוחזקת ביד ימין, הכף האחורית השמאלית שלה צריכה להיות תלויה בחופשיות בין האגודל הימני לאצבע המורה (רווח האינטרנט הראשון). אם החולדה מוחזקת ביד שמאל, כפה אחורית ימנית צריכה להיות תלויה בחופשיות בין האגודל השמאלי לאצבע המורה.
- יש להתחיל במדדים בסיסיים לפחות שבוע לפני הניתוח. ודא ששלוש מדידות בסיסיות בלתי תלויות מבוצעות בימים נפרדים.
- ודאו שהחולדות רגועות ונינוחות בזמן החזקתן. בנקודת ההתחלה, הניחו את המונופילמנט 15 גרם בעדינות על המשטח הקדמי של הכף האחורית החשופה. לאחר הניתוח, הניחו את המונופילמנט של 15 גרם על התפר הנראה לעין (למשל, במיקום הנוירומה). החל כוח מספיק על monofilament כך השיער הוא מתכופף להחזיק במשך 1 s.
- רשום את התגובה לכל גירוי. אפשרויות התגובה כוללות היעדר תגובה, נסיגה איטית, נסיגה מהירה והשמעת קול. רשום את התגובה כ- 0 נקודות ללא תגובה ונקודה אחת עבור נסיגה איטית, נסיגה מהירה או השמעת קול.
- חזור על חמישה אשכולות של חמישה יישומים של המונופילמנט, עם 2-3 שניות בין כל יישום ו 2-3 דקות או יותר בין חמשת האשכולות. בסך הכל, כל כפה אחורית צריכה להיות 25 יישומים של monofilament עם תגובות מוקלטות.
7. התאוששות דגימה להיסטולוגיה והכנה
הערה: בדיקה היסטולוגית מבוצעת 12 שבועות לאחר הניתוח הראשוני.
- יש להשרות הרדמה ולהכין את בעלי החיים כמתואר בשלבים 2.2, 2.3 ו-2.4.
- בצעו בעדינות חתך של 2-3 ס"מ באמצעות אזמל מעל הצלקת שנעשתה בניתוח הראשוני, אך היזהרו שלא לחתוך עמוק מדי מכיוון שהעצב ממוקם באופן שטחי.
- לקבוע את המיקום של נוירומה, בזהירות לנתח את הנוירומה ואת העצב ללא רקמת צלקת שמסביב, ומניחים את נוירומה שנקטף קיבוע. כדי להעריך את המורפולוגיה של נוירומה, הרקמה מוטמעת בצורה אורכית בפרפין או שרף אפוקסי כפי שתואר על ידי Tork et al.18.
- לאחר קצירת הרקמה, הרדימו את החולדות בהרדמה סופנית (5% איזופלורן) באמצעות ניקוב לב או עריפת ראש.
הערה: מומלץ לקצור תחילה את הנוירומה לפני הריגת החולדות, מכיוון שאז קל יותר להבחין בין הנוירומה לבין הרקמה הסובבת אותה in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הערכה באתר נוירומה הראתה רגישות מוגברת ליישום של מונופילמנט פון פריי 15 גרם. בתחילת המחקר, חולדות הגיבו בדרך כלל ל-10%-15% (±-13%) מתוך 25 היישומים של מונופילמנט במשקל 15 גרם. שיעור התגובה עלה ל-45%-50% (±-24%) שבוע לאחר ניתוח TNT. בצד הנגדי, מספר התגובות לאחר הניתוח היה דומה לזה של נקודת ההתחלה (איור 2A). כ-20% מהחולדות לא פיתחו נוירומה כואבת; שיעור ההיענות לא עלה בהשוואה לקו הבסיס (איור 2B). זה דומה למצב האנושי, שבו לא כל החולים (50% לאחר קטיעה) לפתח כאב לאחר היווצרות של נוירומה. כל החולדות פיתחו נוירומה בקצה גדם העצב הטיביאלי שעבר טרנסקטציה וטרנספוזציה 12 שבועות לאחר הניתוח (איור 3). נוירומה זו התאפיינה באקסונים מסתחררים ובמיקרופשקלים בתוך משקעי קולגן.
חתך של העצב הטיביאלי הפחית את הרגישות המכנית באמצע הצד הפלנטרי של הכף האחורית, עצבוב על-ידי העצב הטיביאלי (איור 1). תת-הרגישות הייתה נוכחת שבוע לאחר הניתוח, הייתה שונה באופן משמעותי מהצד הנגדי וקו הבסיס מ-3 שבועות לאחר הניתוח, ונשארה לפחות עד 12 שבועות לאחר הניתוח (איור 4). בחלק הלטרלי של הצד הפלנטרי של הכף האחורית העצבני על-ידי העצב הסוריאלי השלם, החולדות פיתחו רגישות יתר מכנית שהייתה שונה באופן משמעותי מהצד הנגדי וקו הבסיס משבוע לאחר הניתוח (איור 4). רגישות יתר זו נמשכה לפחות 12 שבועות לאחר הניתוח. בכפה הנגדית, הרגישות המכנית לא הושפעה בהשוואה לקו הבסיס באזורים שעצבו על ידי העצב הסורי או הטיביאלי (איור 4).
איור 1: פיזור עצבי בצד הפלנטרי של הכף האחורית. אדום = התפלגות עצבית סוראלית (לרוחב); סגול = התפלגות עצבים טיביאלית (באמצע); ירוק = פיזור עצבי ספנוס (מדיאלי). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פון פריי מאתר הנוירומה. העצב הטיביאלי עבר טרנסקטציה ומהלך הרגישות המכנית מעל אתר הנוירומה הוערך באמצעות מונופילמנט של 15 גרם שהוחל בחמישה אשכולות של חמישה יישומים כל אחד, עם סך של 25 יישומים. תגובה מקבלת ניקוד כנקודה אחת. (A) אתר הנוירומה הראה תגובה גבוהה משמעותית שבוע לאחר הניתוח בהשוואה לקו הבסיס ולצד הנגדי. N = 15; קווי שגיאה: שגיאת תקן של הממוצע (SEM); ניתוח מודל מעורב עם השוואות מרובות ומבחן Tukey. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001. (B) ערכים אינדיבידואליים של האתר האיפסילטרלי מראים גיוון בתגובה. שלוש חולדות (20%) היו בעלות ציון בסיס גבוה יחסית, ושלוש חולדות (20%) לא הראו שינויים כלשהם ברגישות הפריטיביאלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מורפולוגיה של הנוירומה. תמונות היסטולוגיות של נוירומה בת 12 שבועות. (A) צביעת Hematoxylin-Eosin, (B) צביעת טריכרום של Masson, ו-(C) צביעת נוירופילמנט. חץ ירוק = עצב טיביאלי רק פרוקסימלי לנוירומה. חץ כתום = נוירומה, מזוהה על ידי ערבול של אקסונים ודיפוזיה של הפשקווילים. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: פון פריי מהכף האחורית הכפית (עצב טיביאלי ועצב סוראלי). העצב הטיביאלי עבר טרנסקטציה ומהלך הרגישות המכנית הוערך על ידי בדיקת פון פריי במשטח הפלנטרי של הכף האחורית. החלק האמצעי של הכף האחורית המופעלת על ידי העצב הטיביאלי הראה תת רגישות. החלק הלטרלי של הכף האחורית המנותחת איפסילטרלית העצבנית על ידי העצב הסורי הראה רגישות יתר. החלקים האמצעיים והצדדיים של הכף האחורית הנגדית הכפית לא הראו שינויים ברגישות בהשוואה לקו הבסיס. N = 15; קווי שגיאה: שגיאת תקן של הממוצע (SEM); ניתוח מודל מעורב עם השוואות מרובות ומבחן Tukey. * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001, **** = p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול
מודל TNT כולל חיתוך של העצב הטיביאלי והעברתו לרוחב ותת עורית למיקום pretibial כדי לאפשר בדיקת רגישות של הנוירומה, בנוסף hyperalgesia plantar מעל העצב sural. במודל TNT, חשוב שמקומה של הנוירומה יהיה גלוי לחוקרים. לכן, זן חולדה לבקנים מועדף מכיוון שתפרים תת עוריים נראים בקלות דרך העור וצבע התפר צריך להיות כחול כהה או שחור.
כאשר הניתוח מתבצע והעצב הטיביאלי נחשף, קיימת שונות במקום (למשל, פרוקסימלי או דיסטלי) של הביפורקציה של העצב הטיביאלי. אם לחולדות יש ביפורקציה פרוקסימלית, ייתכן שניתן למצוא שני עצבים (העצב הפלנטרי המדיאלי והצדי) פרוקסימלי לקרסול (איור 5A), במקום רק עצב טיביאלי אחד (איור 5B). חשוב כי שני הענפים נחתכים ו transposed על מנת לגרום hyperalgesia plantar מעל עצב sural. אפשר לבחור להחליף רק עצב פלנטרי אחד; עם זאת, הבחנה בין העצב הפלנטרי הצידי והמדיאלי אינה נעשית בקלות ברמה זו ויכולה להשפיע על התוצאות. לכן, מומלץ להחליף את שני העצבים. יתר על כן, לחלק מהחולדות עשויה להיות התפצלות דיסטלית יותר של העצב הטיביאלי, והעברה של עצב פלנטרי אחד בלבד עשויה להיות בלתי אפשרית.
איור 5: ביפורקציה פרוקסימלית ודיסטלית של העצב הטיביאלי. שונות אנטומית ברמת הביפורקציה (*) של העצב הטיביאלי. (A) ביפורקציה פרוקסימלית של העצב הטיביאלי; (B) ביפורקציה דיסטלית של העצב הטיביאלי. קיצורים: MPN = עצב פלנטרי מדיאלי, LPN = עצב פלנטרי לטרלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
במאמר המקורי של Dorsi et al.17, ליגטורה ממוקמת סביב קצה העצב הטיביאלי הפרוקסימלי והעצב עובר טרנספוזיציה ומקובע באמצעות תפר ליגטורה זה. מכיוון שהרצועה סביב העצב יכולה לגרום לכאב התכווצות24, חלופה המתוארת בשיטה זו היא לתקן את העצב באמצעות תפרים אפינורינליים. אם חותכים ומעבירים את העצב הטיביאלי, חשוב שהתפר לקיבוע העצב באופן תת-עורי ימוקם דרך האפיניוריום ולא דרך הפאשקלס העצבי עצמו, שכן הדבר עלול להשפיע גם על מדדי הכאב. בנוסף, יש להימנע מהצבת התפר דרך העור, שכן חולדות נוטות לכרסם את התפרים הנראים לעין, וכתוצאה מכך עקירה של הנוירומה ובכך תוצאות לא אמינות של אמצעי כאב.
כאשר העור סגור, חשוב גם להשתמש בתפרים תוך אפידרמיסים כדי למנוע כרסום שיגרום לפצע פתוח. יתר על כן, לאחר העברת עצב tibial, הוא יהיה ממוקם בשכבה שטחית יותר ממש מתחת לעור. פצע פתוח בשילוב עם עצב הממוקם באופן שטחי אינו רצוי.
ניתן לבצע מדידות פון פריי כדי לבדוק כאבי נוירומה באתר הנוירומה ולבדוק היפראלגזיה פלנטרית מעל העצב הסורי, בצד הלטרלי של הכף האחורית. אתר הנוירומה נראה לאחר הניתוח בשל צבעו הכהה של התפר. לבדיקת רגישות יתר עצבית סוראלית, יש לבחור מיקום אחד שבו מוחל מונופילמנט פון פריי. זה יכול להיות פרוקסימלי או דיסטלי לכרית המזון הצידית, אבל צריך להיות בערך באותו מקום במהלך מדידות קו הבסיס ומדידות בשבועות שלאחר הניתוח.
פתרון בעיות של השיטה
אם החולדות מגיבות לכל הגירויים המופעלים על האזור הפרטיביאלי כבר במהלך מדידות הבסיס, ודאו שהן רגועות ונינוחות, ושהן התאקלמו כראוי לאזור הבדיקה. חזרו על מדידת קו הבסיס עד שהחולדות יגיבו פחות לגירויים. בנוסף, עדיף לא ללבוש שום בושם בעת ביצוע מדידות. באופן אידיאלי, חולדות אינן מגיבות לגירוי pretibial כאשר monofilament 15 גרם מוחל לפני הניתוח. עם זאת, אם החולדות רגועות, ו-50%-100% מהחולדות עדיין מגיבות למונופילמנט של 15 גרם, שנו אותו למונופילמנט שיש לו שיעור תגובה של 10%-20% במהלך נקודת ההתחלה. עם זאת, אם המונופילמנט משתנה, מומלץ לבצע תחילה ניסוי פיילוט כדי לבדוק אם חולדות TNT מגיבות לעוצמה נמוכה יותר זו של מונופילמנט. במאמר הראשוני של מודל TNT, אתר הנוירומה נמדד על ידי יישום המונופילמנט דרך פתח בתחתית קופסת פרספקס17. בניסויי פיילוט נמצא כי חולדות מגיבות לכל גירוי כאשר הן מופעלות דרך תחתית הכלוב ונוטות לתקוף את המונופילמנט. כאשר החולדות הוחזקו מקרוב על ידי החוקר, הן היו במצב רגוע, וכתוצאה מכך שיעור התגובה על המונופילמנט במהלך המדידה הבסיסית.
אם קצה העצב הטיביאלי הפרוקסימלי אינו יכול להגיע מספיק רחוק בתעלה התת עורית, עקוב אחר מהלך העצב הטיביאלי פרוקסימלי יותר והסר כל רקמת קולגן ושומן סביב העצב. לחתוך כל ענפי עצב קטנים או כלי דם לשמור על העצב קבוע לסביבתו. זה ייתן לעצב טווח רחב יותר של תנועה כדי להיות transposed לרוחב יותר. שימו לב שבמאמר המקורי של דורסי ואחרים 17, העצב הועתק יותר לרוחב. בניסויי פיילוט נמצא כי לא ניתן להגיע למצב הרוחבי. לכן, שיטה זו מתארת מיקום pretibial של אתר נוירומה.
מגבלות השיטה
מגבלה של מודל TNT היא שהניתוח כולל מספר שלבים (מיקרו) כירורגיים שיש לבצע. מגבלה נוספת היא שמודל TNT אינו מתורגם בקלות לעכברים. מניסיון, עכברים נוטים להיות רגישים למדי לגירויים החלים באזור pretibial, אפילו עם היישום של monofilament 0.008 גרם.
משמעות השיטה ביחס לשיטות קיימות/חלופיות
במודל TNT, כאב נוירומה יכול להיבדק באופן עצמאי מהיפראלגזיה פלנטרית מעל העצב הסורי. זה האחרון מושרה גם במודלים אחרים של כאב נוירופתי כגון מודל SNI, אך כאן, כאב נוירומה לא יכול להיבדק באופן עצמאי21. בנוסף, הן העצב הטיביאלי והן העצב הפרוניאלי נחתכים במודל SNI, וכתוצאה מכך אובדן רב יותר של תפקוד מוטורי הגורם לשיתוק השרירים הפנימיים של כף21. מכיוון שרק העצב הטיביאלי נחתך ברמה דיסטלית במודל TNT, השרירים הפנימיים של כפות הרגליים מראים אובדן זניח בלבד של תפקוד מוטורי.
יישומים פוטנציאליים של השיטה
מחקרים קודמים כבר הראו כי מודל TNT יכול לשמש לבדיקת תרופות שונות נגד כאבים, כובעי עצבים או כלים כירורגיים אחרים לטיפול בנוירומה18,19,20. עם זאת, כל קבוצות המחקר שמתעניינות בכאב יכולות להפיק תועלת פוטנציאלית משימוש במודל TNT, שכן ניתן לבדוק שתי שיטות כאב שונות באותה חיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מדווחים כי אין להם ניגוד עניינים. למרות שעבודת מחקר זו מומנה בחלקה על ידי אקסוגן, לחברה לא הייתה השפעה על ביצוע המחקר ועל תוצאותיו.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לסבין ורסטיג על הסיוע במהלך מיקרו-כירורגיה ולאניה ואן דר סאר וטרודי אוסטרוולד-רומיין ממעבדת החיות הנפוצות (Gemeenschappelijk Dieren Laboratorium) על עזרתן בהכנת המיקרוסקופ וחדר הניתוח ובטיפול בבעלי החיים.
מחקר זה מומן על ידי Axogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aesthesio | Linton Instrumentation | 514007 until 514015 | 0.6 g until 15 g monofilaments |
| Carprofen | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution |
| Cotton swabs | Nobamed | 974255 | |
| Electrocautery | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ethanol 70% | Interchema BV | 400406 | |
| Ethilon 4.0 | Johnson & Johnson | 1854G | IMPORTANT: the color should be blue or black |
| Ethilon 8.0 | Johnson & Johnson | BV130-5 | |
| Isoflo, isoflurane Zoetis | Dechra Veterinary Products | B506 | |
| Mesh bottom cages | StoeltingCo | 57816 and 57824 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Micro needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Micro scissors | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Micro tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| NaCl 0.9% | Trademed | H7 1000-FRE | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| Ophthalmic ointment | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Stereo surgical microscope | Leica | A60 F | |
| Sterile sheet with hole | Evercare OneMed | 1555-01 | |
| Surgical blade nr.15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11617-12 |
References
- Stokvis, A., vander Avoort, D. J., van Neck, J. W., Hovius, S. E., Coert, J. H. Surgical management of neuroma pain: a prospective follow-up study. Pain. 151 (3), 862-869 (2010).
- Domeshek, L. F., et al. Surgical treatment of neuromas improves patient-reported pain, depression, and quality of life. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (2), 407-418 (2017).
- Lame, I. E., Peters, M. L., Vlaeyen, J. W., Kleef, M., Patijn, J. Quality of life in chronic pain is more associated with beliefs about pain, than with pain intensity. European Journal of Pain. 9 (1), 15-24 (2005).
- Koch, H., Haas, F., Hubmer, M., Rappl, T., Scharnagl, E. Treatment of painful neuroma by resection and nerve stump transplantation into a vein. Annals of Plastic Surgery. 51 (1), 45-50 (2003).
- Fisher, G. T., Boswick, J. A. Neuroma formation following digital amputations. Journal of Trauma. 23 (2), 136-142 (1983).
- Bowen, J. B., Ruter, D., Wee, C., West, J., Valerio, I. L. Targeted muscle reinnervation technique in below-knee amputation. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (1), 309-312 (2019).
- Jensen, T. S., Krebs, B., Nielsen, J., Rasmussen, P. Phantom limb, phantom pain and stump pain in amputees during the first 6 months following limb amputation. Pain. 17 (3), 243-256 (1983).
- Woo, S. L., et al. Regenerative peripheral nerve interfaces for the treatment of postamputation neuroma pain: a pilot study. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 4 (12), 1038 (2016).
- Arnold, D. M. J., et al. Diagnostic criteria for symptomatic neuroma. Annals of Plastic Surgery. 82 (4), 420-427 (2019).
- Liedgens, H., Obradovic, M., De Courcy, J., Holbrook, T., Jakubanis, R. A burden of illness study for neuropathic pain in Europe. Clinicoeconomics and Outcomes Research. 8, 113-126 (2016).
- Langley, P. C., Van Litsenburg, C., Cappelleri, J. C., Carroll, D. The burden associated with neuropathic pain in Western Europe. Journal of Medical Economics. 16 (1), 85-95 (2013).
- Dworkin, R. H., et al. Interpreting the clinical importance of group differences in chronic pain clinical trials: IMMPACT recommendations. Pain. 146 (3), 238-244 (2009).
- Mackinnon, S. E., Dellon, A. L. Results of treatment of recurrent dorsoradial wrist neuromas. Annals of Plastic Surgery. 19 (1), 54-61 (1987).
- Harden, R. N. Chronic neuropathic pain. Mechanisms, diagnosis, and treatment. Neurologist. 11 (2), 111-122 (2005).
- Poppler, L. H., et al. Surgical interventions for the treatment of painful neuroma: a comparative meta-analysis. Pain. 159 (2), 214-223 (2018).
- Eberlin, K. R., Ducic, I. Surgical algorithm for neuroma management: a changing treatment paradigm. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 6 (10), 1952 (2018).
- Dorsi, M. J., et al. The tibial neuroma transposition (TNT) model of neuroma pain and hyperalgesia. Pain. 134 (3), 320-334 (2008).
- Tork, S., et al. Application of a porcine small intestine submucosa nerve cap for prevention of neuromas and associated pain. Tissue Engineering Part A. 26 (9-10), 503-511 (2020).
- Miyazaki, R., Yamamoto, T. The efficacy of morphine, pregabalin, gabapentin, and duloxetine on mechanical allodynia is different from that on neuroma pain in the rat neuropathic pain model. Anesthesia and Analgesia. 115 (1), 182-188 (2012).
- Tian, J., et al. Swimming training reduces neuroma pain by regulating neurotrophins. Medicine and Science in Sports Exercise. 50 (1), 54-61 (2018).
- Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87 (2), 149-158 (2000).
- Poublon, A. R., et al. The anatomical relationship of the superficial radial nerve and the lateral antebrachial cutaneous nerve: A possible factor in persistent neuropathic pain. Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery. 68 (2), 237-242 (2015).
- Dixon, W. J.
- Austin, P. J., Wu, A., Moalem-Taylor, G. Chronic constriction of the sciatic nerve and pain hypersensitivity testing in rats. Journal of Visualized Experiments. (61), e3393 (2012).
