Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Human mesenkymal stamcellebehandling til kliniske applikationer ved hjælp af en lukket semi-automatiseret arbejdsgang

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64707
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1, 2, 1
1Bioprocessing Technology Institute (BTI), Agency for Science, Technology and Research (A STAR), 2Thermo Fisher Scientific, 3Thermo Fisher Scientific

Summary

Her præsenterer vi en protokol til høst af klæbende celler fra flerlagskolber på en lukket halvautomatisk måde ved hjælp af et modstrømscentrifugeringssystem. Denne protokol kan anvendes til høst af både vedhængende og suspensionsceller fra andre celleudvidelsesplatforme med få ændringer af de eksisterende trin.

Abstract

Humane mesenkymale stamceller (hMSC'er) undersøges i øjeblikket som en lovende cellebaseret terapeutisk modalitet til forskellige sygdomme, og der forventes flere markedsgodkendelser til klinisk brug i løbet af de næste par år. For at lette denne overgang er det afgørende at tackle flaskehalse i skala, lot-to-lot reproducerbarhed, omkostninger, overholdelse af lovgivningen og kvalitetskontrol. Disse udfordringer kan løses ved at lukke processen og indføre automatiserede produktionsplatforme. I denne undersøgelse udviklede vi en lukket og halvautomatisk proces til passering og høst af Whartons gelé (WJ)-afledte hMSC'er (WJ-hMSC'er) fra flerlagskolber ved hjælp af modstrømscentrifugering. WJ-hMSC'erne blev udvidet ved hjælp af regulatorisk kompatibelt serumfrit xenofrit (SFM XF) medium, og de viste sammenlignelig celleproliferation (populationsfordobling) og morfologi med WJ-hMSC'er udvidet i klassiske serumholdige medier. Vores lukkede halvautomatiske høstprotokol viste høj cellegendannelse (~ 98%) og levedygtighed (~ 99%). Cellerne vasket og koncentreret ved hjælp af modstrømscentrifugering opretholdt WJ-hMSC overflademarkørekspression, kolonidannende enheder (CFU-F), trilineagedifferentieringspotentiale og cytokinsekretionsprofiler. Den halvautomatiske cellehøstningsprotokol, der er udviklet i undersøgelsen, kan let anvendes til behandling i lille til mellemstor skala af forskellige vedhængende celler og suspensionsceller ved direkte forbindelse til forskellige celleudvidelsesplatforme for at udføre volumenreduktion, vask og høst med et lavt outputvolumen.

Introduction

Humane mesenkymale stamceller (hMSC'er) er en god kandidat til kliniske anvendelser, både inden for vævsteknik og i celleterapier, i betragtning af deres terapeutiske potentiale og høje selvfornyelsespotentiale til at vokse in vitro, hvilket er afgørende for at generere klinisk relevante doser af celler 1,2,3. Ifølge ClinicalTrials.gov er der over 1.000 kliniske forsøg i øjeblikket under undersøgelse for forskellige sygdomstilstande4. På baggrund af den stigende interesse for at bruge hMSC'er er flere kliniske forsøg og markedsgodkendelser nært forestående i den nærmeste fremtid 5,6. Fremstillingen af hMSC'er har imidlertid mange iboende udfordringer med hensyn til batch-til-batch-variabilitet, brugen af højrisikoråmaterialer, bekymringer vedrørende forurening på grund af mange åbne og manuelle processer, da fremstillingen involverer flere enhedsoperationer, højere lønomkostninger, omkostningerne ved udskalering eller opskalering og lovgivningsmæssige forhindringer 6,7,8,9,10, 11,12. Disse spørgsmål er fortsat en væsentlig hindring for nuværende og fremtidig markedsadgang.

Udviklingen af lukkede, modulopbyggede, automatiserede produktionsløsninger og anvendelse af lavrisikohjælpereagenser vil løse disse udfordringer. Dette vil også sikre ensartet produktkvalitet, mindske sandsynligheden for batchfejl på grund af menneskelige fejl, reducere lønomkostningerne og forbedre processtandardisering og overholdelse af lovgivningen, f.eks.med hensyn til digital batchregistrering 8,12,13,14. For at kunne opnå en klinisk relevant dosering af celler, det være sig autolog eller allogen, strømlinet fremstilling, der involverer opstrøms celleudvidelse og nedstrømsbehandling på en lukket, automatiseret måde, er afgørende.

Til opstrøms hMSC-ekspansion er de to mest almindelige fremstillingsmetoder, der i øjeblikket anvendes, udskalering (2D-monolag) og opskalering (3D-mikrobærerbaseret affjedringssystem)15,16,17,18. Den mest traditionelle og udbredte metode til hMSC-udvidelse er 2D-monolagsbaseret kultur på grund af de lave produktionsomkostninger og den nemme opsætning19.

Flerlagskolber bestående af bakker med flade overflader stablet i et dyrkningskar bruges almindeligvis til at udskalere hMSC-produktionen. Disse systemer leveres typisk i 1-lags til 40-lags kulturbeholdere20 og håndteres manuelt inde i biosikkerhedsskabe. Behandlingstrinnene under cellegennemløb og høstning involverer manuel dispensering og dekantering af ekspansionsmediet, dissociationsreagenset og vaskebufferen ved pipettering eller fysisk vipning af hele beholderen. Desuden er håndtering af flere enheder udfordrende og tidskrævende på grund af deres store størrelse og vægt.

Derefter er efterhøstning fra flerlagskolber, centrifugering til medieudveksling, cellevask og volumenreduktion vigtige trin på tværs af hele cellefremstillingsarbejdsgangen21. Konventionel bordcentrifugering er en for det meste åben og manuel proces, der involverer en lang række trin, såsom overførsel af cellesuspensionen til lukkede rør eller flasker inde i et biosikkerhedsskab, spinding af cellerne, manuel aspirering af supernatanten, celleopslæmning med bufferen og gentagne cellevask. Dette øger dramatisk både risikoen for kontaminering på grund af åbning og lukning af hætterne og chancerne for at miste cellepelleten under den manuelle aspirations-/pipetteringsproces22. I forbindelse med håndtering af flerlags kultursystemer til vedhængende celler såsom hMSC'er skal operatøren gennemgå en besværlig proces med at skifte mellem centrifugen og biosikkerhedsskabet gentagne gange og håndtere en tung enhed på samme tid. Disse manuelle trin er besværlige, udgør risici med hensyn til menneskelige fejl og kontaminering og skal udføres i et renrumsmiljø i klasse B, hvilket er dyrt23. Derudover er den konventionelle manuelle centrifugeringsproces ikke skalerbar og kan forårsage cellulær forskydning og stress; Således er maksimering af cellegenvinding, levedygtighed og udvaskningseffektiviteten af resterende urenheder andre store udfordringer22. Kommerciel cGMP-skalafremstilling af celleterapier kræver lukkede, modulære automatiseringsløsninger for at reducere risikoen for kontaminering, sikre ensartet produktkvalitet, reducere arbejds- og produktionsomkostninger og øge procespålideligheden24,25. Flerlagskolber kan håndteres som et lukket system ved at have et sterilt 0,2 μm filter i en af portene for at lette steril gasudveksling og en anden port aseptisk forbundet via stik eller rørsvejset direkte til et automatiseret cellebehandlingsinstrument til cellehøstning. Vi arbejdede hen imod at lukke og automatisere de fleste trin i WJ-hMSC-passering og høst ved at evaluere en innovativ lukket modstrømscentrifuge beregnet til fremstilling af celle-, gen- eller vævsbaserede produkter. Denne modstrømscentrifuge har også fleksibiliteten til at udføre en række cellebehandlingsapplikationer, såsom celleseparation baseret på størrelse, medium / bufferudveksling, koncentration og høst for en række celletyper 8,26,27,28. Instrumentet bruger et lukket engangssæt, der kan tilsluttes sterilt ved hjælp af rørsvejsning eller aseptiske stik til overførsel af poser eller kan tilsluttes direkte til enhver ekspansionsplatform efter eget valg.

I denne undersøgelse designede vi en brugerdefineret slangesamling for at muliggøre lukkede sterile forbindelser mellem engangsmodstrømscentrifugeringssættet og flerlagskolben. Vi optimerede en protokol til enzymatisk afmontering, vask og høst af WJ-MSC'er fra flerlagskolben på en helt lukket og halvautomatisk måde inden for en enkelt kørsel. De høstede WJ-hMSC'er blev karakteriseret for renhed (overflademarkøranalyse) og styrke (CFU-F, trilineagedifferentiering og cytokinsekretionsprofiler) for at sikre, at det endelige produkt opfyldte de kritiske kvalitetsattributter (CQA'er) for batchfrigivelse.

Protocol

1. Forberedelse af kulturmediet og belægning af dyrkningsbeholderne

  1. Forberedelse af medierne
    1. Sammensætning af det klassiske serumholdige medium: Forbered det klassiske serumholdige medium ved at blande αMEM (445 ml), føtalt bovint serum (FBS) (50 ml) og 100x penicillin-streptomycin (5 ml).
    2. Forbered det komplette SFM XF-medium.
      1. Lav en 500 ml flaske ved aseptisk at tilføje 5 ml SFM XF supplement (100x) og 5 ml 100x L-alanyl-L-glutamin (se materialetabeller) til SFM XF basalmediet (500 ml).
      2. Lav en 2 L mediepose ved aseptisk at tilføje 20 ml brugerdefineret MSC SFM XF-supplement (100x) og 20 ml 100x L-alanyl-L-glutamin (se Materialetabeller) til SFM XF basal medium pose (2 L) ved at tilslutte en 50 ml sprøjte til den relevante port på posen.
        BEMÆRK: Før brug i kultur tilsættes vækstfaktorer eller cytokiner (leveres ikke med mediet) til det komplette SF XF-medium: PDGF-BB (20 ng / ml), FGF basic (4 ng / ml) og TGFβ (0,5 ng / ml).
  2. Overtrækning af cellekulturbeholderne med vitronectin til brug med serumfrie medier
    1. Optø en bestand af vitronectin (VTN-N; 0,9 mg/ml) ved 4 °C.
    2. Brug sterilt Dulbeccos bufrede saltvand uden calcium og magnesium (DPBS) til at fortynde den optøede VTN-N til en arbejdskoncentration på 5 μg / ml.
      BEMÆRK: Fortynd VTN-N umiddelbart før brug, og opbevar ikke den fortyndede vitronectinopløsning.
    3. Der tilsættes 1 ml/10cm2 af den fortyndede VTN-N-opløsning til den tilsvarende dyrkningsbeholder; Den endelige koncentration er 0,5 μg/cm2. For eksempel tilsættes 7,5 ml fortyndet VTN-N-opløsning til en T-75-kolbe (75 cm2); Der tilsættes 17,5 ml fortyndet VTN-N-opløsning til en T-175-kolbe (175 cm2); Der tilsættes 250 ml fortyndet VTN-N-opløsning til en firelags flerlagsstandardkolbe (2,528 cm2); og der tilsættes 630 ml fortyndet VTN-N-opløsning til en 10-lags flerlagskolbe (6,320 cm2).
    4. Under sterile forhold inkuberes karrene i 1 time ved stuetemperatur (RT).
      BEMÆRK: Den coatede dyrkningsbeholder kan opbevares i 4 °C i op til 1 uge. Pak kulturbeholderen ind med laboratoriefilm for at forhindre, at den tørrer ud. Før brug forvarmes kulturbeholderen til stuetemperatur i mindst 1 time.
    5. VTN-N-opløsningen suges op, kasseres, og der tilsættes straks en tilstrækkelig mængde dyrkningsmedium til at forhindre, at den belagte beholderoverflade tørrer.
      BEMÆRK: Det er ikke nødvendigt at skylle dyrkningsbeholderen af efter fjernelse af VTN-N.

2. WJ-hMSC-udvidelse

  1. WJ-hMSC'er (p2) optøs hurtigt ved at anbringe kryoialen i et vandbad ved 37 °C; Drej langsomt hætteglasset, indtil indholdet begynder at optø sig.
  2. Efter optøning sås WJ-hMSC'erne ved 5.000 celler/cm2 i en T-175-kolbe (uden VTN-N-belægning) og inkuberes i det klassiske serumholdige medium ved 37 °C i en befugtet atmosfære på 5 % CO2 til celleudvidelse. Efter to passager (p4) bankes de ekspanderede celler ned i det ønskede kryopræserveringsmedium som en fungerende cellebank (WCB).
  3. Udfør celletælling ved hjælp af en automatiseret celletæller efter levedygtigheds- og celletællingsmetoden for at bestemme det samlede celletal, cellelevedygtighed og cellestørrelse29.
  4. Fra p4 dyrkes WJ-hMSC'erne ved 5.000 celler/cm2 i T-75-kolber i enten klassisk serumholdigt medium eller SFM XF-medium (brug VTN-N-belagte kolber med SFM XF-medium).
  5. Bevar cellerne i begge dyrkningsmedier i i alt tre passager (12 dage), og mål celleudvidelsen (foldforøgelsen) ved hver passage ved at dividere antallet af levedygtige celler, der tælles i slutningen af kulturen for hver passage, med antallet af levedygtige celler i begyndelsen af kulturen (dag med cellesåning).

3. Udvidelse af udskalering af frøtog

  1. WJ-hMSC udvidelse i en T-175 kolbe
    1. WJ-hMSC'erne tøs hurtigt op ved p4 ved at anbringe kryoialen i et 37 °C vandbad; Drej langsomt hætteglasset, indtil opløsningen begynder at afrime.
    2. Der sås 5.000 celler/cm2 i en VTN-N-belagt T-175-kolbe. Lad cellerne vokse i en inkubator ved 37 °C med 5% CO2.
    3. Udskift det brugte dyrkningsmedium hver 2.-3. dag med frisklavet forvarmet komplet SFM XF-medium for optimal ydeevne og cellevækst.
  2. Håndtering af flerlagskolber (figur 1A, B)
    1. Alle aseptiske tilslutninger skal udføres i et sterilt miljø.
    2. Pak kolben i flere lag ud inde i et biologisk sikkerhedsskab.
    3. Tilslut det præsteriliserede luftfilter (0,2 μm) til en port for at tillade tryk, der frigøres under væskeoverførslen ved hjælp af modstrømscentrifugen.
    4. Sæt flerlagskolbekonnektoren fra det brugerdefinerede slangesæt i den anden port (figur 1B).
    5. Svejs PVC-linjen i det brugerdefinerede slangesæt til 2 L PVC-overførselsposen, der indeholder komplet SFM XF-medium.
      BEMÆRK: Bland den mellemstore pose helt, før du tilføjer den til flerlagssystemet ved tyngdekraftsflow. Sørg for, at PVC-overførselsposen hænger højere end kolben i flere lag.
    6. Kolben i flere lag anbringes på langsiden med luftfilteret øverst (figur 1B).
    7. Åbn klemmen på PVC-slangen for at begynde at fylde kolben i flere lag. Sørg for, at mediet er plant mellem bakkerne under påfyldning.
    8. Når mediet er helt nivelleret i alle bakkerne, drejes kolben i flere lag på den korte side med portene lodret.
    9. Luk klemmen på PVC-ledningen, og fjern overførselsposen ved at udskifte slangeforbindelsen med MPC's blå lukningshætte.
      BEMÆRK: Fjern ikke luftfilteret, da dette tillader gasudveksling under celleudvidelse.
    10. Drej flerlagskolben i inkubationspositionen.
      BEMÆRK: Filteret og slangetilslutningen skal vende opad.
    11. Tøm kolben i flere lag ved at slutte den til en aspiratorflaske; Placer den over aspiratorflasken, og væsken strømmer ud.
      BEMÆRK: Vip flerlagskolben på siden for at dræne det brugte medium helt ud af tyngdekraften. Alternativt kan det brugte medium hældes i en affaldsflaske ved hjælp af en brugerdefineret slangesamling.
    12. Gentag trin 3.2.5-3.2.11 for at genopfylde det friske substrat.
  3. Subkultur af WJ-hMSC'er i flerlagskolben (T-175 > 4-lags > 10-lags)
    1. Forvarmning af celledissociationsreagens (TrypLE) og komplet SFM XF-medium inde i en 37 °C inkubator før brug.
    2. Opsug det brugte medium fra T-175-kolben og kassér.
    3. Vask cellemonolaget med forvarmet DPBS, aspirer og kassér.
    4. Der tilsættes TrypLE til hver kolbe, der sikres fuldstændig dækning af cellemonolaget, og der inkuberes i 5-10 minutter ved 37 °C.
    5. Overfør suspensionen til et sterilt 50 ml konisk rør.
    6. Centrifuger røret ved 100-200 x g i 5 minutter ved RT. Opsug og kassér DPBS, og pas på ikke at forstyrre cellepellet.
    7. Resuspender cellepellet i et minimalt volumen (10 ml) forvarmt komplet SFM XF-medium til celletælling.
    8. Fyld en VTN-N-belagt firelags kulturbeholder med ca. 800 ml komplet SFM XF-medium som nævnt i afsnit 2 ovenfor. Der tilsættes 5.000 celler/cm2 (dvs. 1,26 x 107 levedygtige celler/kolbe). Drej forsigtigt cellesuspensionen for at sikre en jævn fordeling.
    9. Der inkuberes i en 37 °C inkubator med 5% CO2 i en befugtet atmosfære.
    10. Udskift det brugte dyrkningsmedium hver 2-3 dag med frisk, forvarmet komplet SFM XF-medium for optimal cellevækst, indtil cellerne når 60% -80% sammenløb eller er klar til at blive subdyrket i 10-lags flerlagskolbe.
    11. En VTN-N-belagt 10-lags flerlagskolbe fyldes med ca. 2 liter komplet SFM XF-substrat som nævnt i punkt 2. Der tilsættes 5.000 celler/cm2 (dvs. 3,1 x 107 celler/kolbe). Drej forsigtigt cellesuspensionen for at sikre en jævn fordeling.
    12. Der inkuberes i en 37 °C inkubator med 5% CO2 i en befugtet atmosfære.
    13. Udskift det brugte dyrkningsmedium hver 2-3 dage med frisk, forvarmet komplet SFM XF-medium for optimal cellevækst, indtil cellerne når 60% -80% sammenløb eller er klar til at blive høstet.

4. Lukket halvautomatisk WJ-hMSC-dissociation og høst ved hjælp af lukket modstrømscentrifugering

  1. Centrifugeringssæt til engangsbrug
    1. Tilslut engangssættet med PVC-overførselsposerne til engangsbrug via rørsvejsning, svarende til konfigurationen vist i figur 1A.
      BEMÆRK: Standardflowhastigheden for engangssættet er 30-165 ml/min.
    2. Fastgør en 10-lags flerlagskolbe, der indeholder sammenflydende WJ-hMSC'er, til den brugerdefinerede slangeenhed inde i et biosikkerhedsskab.
    3. Overfør den vedhæftede 10-lags kulturbeholder med den brugerdefinerede slangeenhed til en bænk, og svejs til linje E (3/32 i ID PVC) i engangssættet, som vist i figur 1B.
    4. Sørg for at svejse en steril prøveport til linje G i engangssættet med højt flow.
    5. Tilslut derefter høstlinjen H til en steril Luer udstyret med en 50 ml sprøjte.
      BEMÆRK: I alle ovenstående trin skal du sikre dig, at de manuelle klemmer er lukket for at sikre væsken i hver kitpose.
  2. Opsætning af instrumentkørslen
    1. Tænd for instrumentet ved at tænde vippekontakten bag på instrumentet.
    2. Tilslut den bærbare computer til USB-C-porten på instrumentet ved hjælp af det medfølgende USB-C-kabel (figur 1B).
    3. Kør modstrømscentrifugens grafiske brugergrænsefladesoftware (GUI) fra skrivebordet eller startmenuen.
    4. Når du er logget ind, skal du indlæse protokollen ved at klikke på knappen Vælg en protokol på velkomstsiden.
      BEMÆRK: Counterflow centrifugation harvesting protocol (tabel 1) blev oprettet ved hjælp af Protocol Builder-softwaren og gemt lokalt.
    5. Tryk på den blå oplåsningsknap på instrumentet, og åbn glasdøren.
    6. Læg det samlede engangssæt på modstrømscentrifugeringssystemet.
    7. Start med at hænge poserne ophængt på bøjlekroge i en rækkefølge, der bedst passer dem op med rørportene på boblesensorstrimlerne, med den 10-lags flerlagskolbe placeret i en vinkel, som vist i figur 1B.
    8. Stil sættet op med de to sætplaceringsknapper, stræk pumpeslangen rundt om den peristaltiske pumpe, og tryk det hvide pæreformede stik på plads.
      BEMÆRK: Sørg for, at slangen over tryksensoren er korrekt placeret i slangesporet.
    9. Fastgør centrifugekammeret ved at løfte sølvhåndtaget på modstrømscentrifugekammerbæreren og fastgøre det ved at føre håndtaget tilbage til lodret position.
    10. Tryk slangen fra hver port på sættet ind i sporene langs boblesensorstrimlerne.
      BEMÆRK: Sørg for, at poserne ikke er sammenfiltrede, så protokolprocessen let kan følges.
    11. Luk døren ved at trykke ned på dørlåsen.
      BEMÆRK: Pumpens klemmearm lukker, centrifugekammeret roterer, og ventilerne lukker. Uden at lukke døren kan systemet ikke starte og køre protokollen.
    12. Tryk på knappen Start på GUI'en. En tjekliste vises; De første fire elementer er instrumentkontrol, og de sidste to elementer er brugerkontrol (sørg for, at poserne og tilslutningerne matcher kitbilledet, og sørg for, at de manuelle klemmer er åbne).
      BEMÆRK: Ved instrumentkontrol vises røde X'er i stedet for blå flueben, hvis noget ikke er rigtigt.
    13. Tryk på Bekræft for at få vist skærmbilledet med protokolinput.
    14. Indstil værdien for dataindtastning (høstvolumen) til 45 ml, og tryk på Bekræft.
      BEMÆRK: Protokolinputskærmen bliver spurgt, hvis der er angivet variable datainput i den brugeroprettede protokol. Høstvolumenet indstilles som en variabel i denne protokol, og brugeren kan vælge at teste forskellige volumener afhængigt af de endelige celletæthedskrav. Det mindste høstvolumen, som systemet tillader, er 5 ml. Systemet tillader maksimalt kun fire datavariabler, der skal indstilles for hver protokol.
  3. Kørsel af protokollen
    1. Klik på Start på GUI'en, og tryk på den grønne Start-knap på instrumentet for at starte protokolkørslen (se tabel 1).
      BEMÆRK: Systemet starter trinnene i henhold til protokollen, der starter med primingsekvensen, ved at erstatte luften i systemet med en buffer.
    2. Når grundingen er afsluttet (tabel 1, trin 8), skal du sikre dig, at det brugte medium pumpes helt ud i affaldsposen.
      BEMÆRK: Når 10-lags flerlagskolben er tom, vil systemet bede brugeren i GUI'en om at bekræfte, om beholderen er tom. Tryk på knappen "Spring over" på instrumentet, hvis fartøjet er tomt; hvis ikke, skal du trykke på den grønne "Afspil / pause" -knap for at fortsætte med at dræne resterende væsker fra beholderen.
    3. I trin 15, 19 og 22 (tabel 1) skal du sørge for at løfte kolben i flere lag op og ryste for at fordele bufferen ligeligt på alle bakkerne. Når du er færdig, skal du placere 10-lags flerlagskolben tilbage i sin oprindelige trækposition til de næste trin.
      BEMÆRK: Kun for trin 19 i tabel 1 skal du efter omrystning sørge for at placere flerlagskolben fladt og inkubere i 10-15 minutter ved RT for at adskille cellerne.
    4. I trin 20 og trin 23 (tabel 1) skal du sikre dig, at de trypsiniserede celler overføres fuldstændigt til mellemposen.
    5. Bland mellemposen godt manuelt i trin 25 (tabel 1).
    6. I trin 26 (tabel 1) skal du bruge en 2 ml Luer-sprøjte til at prøve gennem prøvetagningsporten.
      BEMÆRK: Det anbefales at prøve mindst tre gange for nøjagtige celletællinger.
    7. I trin 29 og trin 30 (tabel 1) skal du kontrollere den stabile dannelse af det fluidiserede celleleje; det skal svare til det fluidiserede celleleje som vist i figur 1C.
      BEMÆRK: Hvis det stabile fluidiserede celleleje ikke dannes svarende til det, der er vist i figur 1C, er optimering af forholdet mellem g-kraft og strømningshastighed (G / F) afgørende for at opnå et stabilt fluidiseret celleleje (høj cellegendannelse) i kammeret under cellepåfyldnings- og vasketrinnene. G / F-forholdet afhænger af cellernes størrelse og densiteten af mediet. Der kræves et højt G/F-forhold til en prøve-/vaskebuffer med høj densitet, mens et lavt G/F-forhold kan anvendes til en prøve-/vaskebuffer med lav densitet.
    8. Kørslen er fuldført ved trinnet Ramp to Stop (trin 35 i tabel 1), og alle knibeværdierne på modstrømscentrifugeringssystemet lukkes automatisk.
      BEMÆRK: Til sidst skal du sikre dig, at de manuelle klemmer er lukket for at sikre væsken i hver sætpose, før du åbner døren.
    9. Når protokolkørslen er fuldført, skal du trykke på den blå oplåsningsknap på instrumentet og åbne glasdøren. Tag engangssættet med det høstede koncentrat ud af instrumentet.
    10. Aseptisk forsegling af høstlinjen ved hjælp af en håndbærende rørforsegler. Overfør forsigtigt den forseglede sprøjte fyldt med den koncentrerede cellehøst til det biologiske sikkerhedsskab til celletælling og kryopræservering.
    11. Fjern kammeret igen ved hjælp af håndtaget, træk pærestikket ud af beslaget, løft forsigtigt sættet væk, og deponer det i en biohazardpose.
    12. Rengør instrumentet med ethanolservietter, og sørg for at lukke døren.
    13. Luk først GUI-applikationen, før du slukker kontakten bag på instrumentet.
      BEMÆRK: Cellehøstningsprotokollen blev testet i biologiske triplikater (n = 3).

5. Vurdering af kritiske kvalitetsegenskaber (CQA)

  1. Overflademarkører for celleidentitet (CD73, CD90 og CD105) og ikke-stromale markører (CD34 og CD45)
    1. Den høstede WJ-hMSC-cellesuspension fortyndes til en koncentration på 1 x 106 levedygtige celler/ml ved tilsætning af et passende volumen flowcytometribuffer (DPBS med 1 % BSA eller 2 % FBS).
    2. Der tilsættes 100 μL af cellesuspensionen til hvert mikrocentrifugeglas eller 96-brøndplade. Sørg for, at der er mindst 0,1 x 106 celler til stede pr. 100 μL cellesuspension.
    3. Der tilsættes fluoroforkonjugeret antistof til prøven ved en passende fortynding som anbefalet af antistofleverandøren.
    4. Inkuber i 20 minutter i mørke.
    5. Efter inkubationen tilsættes 100 μL flowcytometribuffer for at vaske prøverne ved centrifugering ved 380 x g i 3 minutter.
    6. Supernatanten kasseres, og pelletsen efterlades.
    7. Resuspender cellepellet i 200 μL flowcytometribuffer og underkastes flowcytometrianalyse30.
  2. Kolonidannende enheder fibroblastisk assay (CFU-F)
    1. Cellesuspensionen fortyndes til en koncentration på 1.000 levedygtige celler/ml komplet dyrkningsmedium.
    2. Plade ~ 500 celler pr. Brønd i en 6-brønds vævskulturplade i komplet dyrkningsmedium.
    3. Inkuber i 10-14 dage ved 37 °C i 5% befugtet CO2, vask med PBS og plet med 0,5% krystalviolet i methanol i 30 minutter ved RT.
    4. Opregne kolonierne i hver brønd.
    5. Beregn CFU-F-effektiviteten: Divider antallet af kolonier dannet af det oprindelige sånummer for at opnå den procentvise effektivitet af kolonidannelse, og udtryk det som en procentdel.
  3. Trilineage differentiering potentiale
    1. Frø 5 x 103 celler / cm2 i osteogenese og adipogenese differentieringsmedium i 12-brøndplader i henhold til producentens protokol. Til kondrogenese skal du forberede 1,6 x 107 levedygtige celler / ml og generere mikromassekulturer ved såning af 5 μL dråber af celleopløsningen i midten af brøndene på 96-brøndplader i henhold til producentens protokol.
    2. Under differentiering skal du foretage komplette mellemstore ændringer hver 3-4 dage.
    3. Efter 14 dage (for adipogenese) eller 21 dage (for osteogenese og kondrogenese) skal du overvåge kulturerne for differentiering ved hjælp af afstamningsspecifikke biologiske pletter i henhold til producentens protokol. Til adipogen differentiering plettes kulturerne med 0,5% Oil Red O-opløsning. Til osteogenese udføres farvning ved hjælp af en 2% Alizarin Red S-opløsning. Til kondrogen differentiering plettes mikromassepillerne med 1% Alcian Blue.
  4. Cytokinsekretionsprofiler
    1. De kryopræserverede celler, der høstes manuelt eller ved hjælp af modstrømscentrifugeringssystemet, optøs, og der sås 5.000 celler/cm2 i en T-175-kolbe med SFM XF-medier.
    2. Efter 4 dage opsamles det brugte dyrkningsmedium og opbevares ved -80 °C indtil analyse.
    3. Kvantificer ekspressionen af cytokiner ved hjælp af et cytokinekspressionsprofiler 19-plex panelsæt på en multiplexlæser.
    4. Udfør multipleximmunoassays i henhold til producentens anbefalinger.

Representative Results

WJ-hMSC master cell bank (MCB) efter optøning blev opretholdt i tre på hinanden følgende passager (p1-p4) i klassisk serumholdigt medium til at producere nok fungerende cellebanker (WCB'er) til eksperimenterne. P4 WCB'erne blev optøet og udvidet i både serumholdigt medium og SFM XF-medium til yderligere tre passager (p4-p7) i T-175-kolber. WJ-MSC'erne tilpassede sig godt, når de blev udvidet i SFM XF-medium og var i stand til at opretholde stabil proliferation svarende til den i serumholdigt medium (figur 2A). Imidlertid udviste cellerne udvidet i SFM XF-medium lidt længere fibroblastlignende spindelformet morfologi, hvilket resulterede i en lidt større cellestørrelse (figur 2B) på et gennemsnit på ~ 17 μm sammenlignet med ~ 15 μm i serumholdigt medium. Under begge medieforhold på tværs af de tre passager nåede WJ-hMSC'erne konsekvent deres maksimale celletæthed på ~ 2,3 x 104 celler / cm2 og en populationsfordoblingstid på ~ 34 timer (figur 2C, D).

Til storstilet WJ-hMSC-udvidelse i et lukket system udførte vi en frøtogsudvidelse af WJ-hMSC'er først i en 4-lags kolbe og derefter i en 10-lags flerlagskolbe. Ved omkring 80% -90% sammenløb efter 4 dages dyrkning høstede vi 9,6 x 10 7 ± 0,9 x 107 og 2,3 x 10 8 ± 0,2 x 108 celler til henholdsvis 4-lags og 10-lags stakke. En højere celletæthed på 3,6 x 10 4-3,8 x 104 celler / cm 2 blev nået sammenlignet med i T-175-kolberne, hvilket betyder, at stablerne tillod bedre celleudvidelse med op til syv gange.

Desuden blev WJ-hMSC'erne, der blev udvidet i 10-lags kulturbeholdere, høstet direkte ved hjælp af modstrømscentrifugering. Den sterile forbindelse til engangssættet var let at etablere til direkte væskeoverførsel ved en maksimal flowhastighed på 165 ml/min ved hjælp af instrumentets peristaltiske pumpe. Den halvautomatiske cellehøstningsproces blev opnået ved først at høste cellerne ved hjælp af enzymatisk dissociation, indlæse cellerne i modstrømskammeret for volumenreduktion og koncentrering og derefter vaske med vaskebuffer, hvilket var omkring 3x volumenet af modstrømscentrifugeringskammeret. Endvidere blev de vaskede celler derefter koncentreret og høstet til det ønskede høstvolumen, der var forudindstillet i protokollen. De behandlingstrin, der blev brugt til den halvautomatiske cellebehandling, blev designet til at efterligne den manuelle høstarbejdsgang. Vi opnåede en 10 gange volumenreduktion, hvilket resulterede i generering af cellekoncentrationer så høje som 5,3 millioner celler / ml. Protokollen var i stand til at opnå høj cellegendannelse ved ~ 98% og høj cellelevedygtighed ved ~ 99% konsekvent for alle tre uafhængige kørsler (figur 3A-C).

Vi udførte omfattende cellekarakteriseringsassays for at bestemme de kritiske kvalitetsegenskaber ved cellehøsten ved hjælp af modstrømscentrifugering sammenlignet med manuel centrifugering. For at teste identiteten af WJ-hMSC'erne blev celleoverflademarkører analyseret ved flowcytometri. Som vist i figur 4A viste WJ-hMSC'erne høstet ved hjælp af begge metoder karakteristiske overflademarkørprofiler i henhold til ISCT-reglerne, positiv ekspression af CD73, CD90 og CD105 samt negativ ekspression af CD34 og CD45. Dernæst blev CFU-F-assays udført for at evaluere WJ-hMSC'ernes klonogene potentiale. Som vist i figur 4B viste celler høstet fra modstrømscentrifugering et lignende CFU-F-potentiale sammenlignet med celler høstet ved manuel centrifugering (henholdsvis 21% ± 1% vs. 20% ± 1%). Som vist i figur 4C bevarede de centrifugeringshøstede celler efter modstrømmen desuden evnen til at differentiere sig til adipocytter, osteoblaster og chondrocytter svarende til cellerne i den manuelle centrifugeringsmetode. Endelig undersøgte vi 18 forskellige cytokinsekretionsprofiler af cellerne ved hjælp af multipleximmunoassays. Som vist i figur 4D vaskede og koncentrerede cellerne ved hjælp af post-modstrømscentrifugering opretholdt cytokinsekretionsprofiler, og profilerne var sammenlignelige med profilerne for prøven taget før vask/koncentrering af cellerne (præ-modstrømscentrifugering).

Samlet set har vi demonstreret effektiv hMSC-ekspansion i et SFM XF-kultursystem, og cellerne, der blev vasket og koncentreret ved hjælp af det lukkede, automatiserede modstrømscentrifugeringssystem, gav høj cellegenvinding og levedygtighed efter vask og kunne opretholde deres fænotype og funktionalitet. Den lukkede semiautomatiserede proces, der er udviklet i denne undersøgelse, kan levere konsistens i produktkvaliteten med hensyn til endelig WJ-MSC-genvinding, som det fremgår af tre uafhængige kørsler.

Figure 1
Figur 1: Konfiguration og samling af engangssæt med højt flow til høst, vask og koncentrering af hMSC'er . (A) Kitdiagram, efter at poserne er blevet tilsluttet i overensstemmelse med den respektive slange. (B) Den 10-lags flerlagskolbe, der er forbundet med high-flow engangssættet med den brugerdefinerede slangeenhed. (C) Visualisering af det stabile fluidiserede celleleje, der dannes i modstrømskammeret via kamerafunktionen aktiveret i den grafiske brugergrænseflade til modstrømscentrifugeringssoftwaren. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Sammenligning af cellemorfologi og udvidelse af hMSC'er i serumholdigt medium og SFM XF-medium. (A) Den repræsentative cellemorfologi af hMSC'er i klassisk serummedium og SFM XF-medium. SFM XF-udvidede celler viste en længere, spindelformet, karakteristisk fibroblastlignende morfologi, mens cellerne dyrket i serumholdigt medium viste en mere flad morfologi. (B) Den gennemsnitlige MSC-størrelse mellem det serumholdige substrat og SFM XF-mediet, målt ved hjælp af en automatiseret celletæller (n = 3). Det er tydeligt at se, at SFM XF-udvidede celler generelt var større end serumudvidede celler på tværs af forskellige passager. Det samlede celleudbytte i forskellige passager (n = 3) (C) udtrykt i celler pr. Kulturoverfladeareal og (D) populationsfordoblingsniveauer. Lignende niveauer af celleudbytte blev opnået mellem SFM XF-mediet og serumholdigt medium på tværs af forskellige passager. Data udtrykkes som gennemsnittet ± standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Karakterisering af celler behandlet ved hjælp af modstrømscentrifugeringssystemet. (A) Samlede levedygtige celler før og efter vask og koncentration. (B) Der blev opnået en volumenreduktion på 10x efter modstrømscentrifugering. C) Cellernes samlede restitution og levedygtighed. Data beregnes som gennemsnit over tre biologiske replikater (n = 3) af vaske- og koncentrationskørsler. Data udtrykkes som gennemsnit ± standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Analyse af kritiske kvalitetsegenskaber . (A) Repræsentative data fra flowcytometri. (B) Repræsentative billeder, der viser den samlede CFU. C) Repræsentative mikroskopiske billeder af trilineagedifferentieringen. (D) Cytokinekspressionsanalyseresultater før og efter behandling af cellerne på modstrømscentrifugeringssystemet (n = 3). Data udtrykkes som gennemsnit ± standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Sekvens af hMSC-høsten ved trypsinisering, vask og koncentrationsprotokol på modstrømscentrifugeringssystemet, herunder de indledende primingtrin. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

I dette arbejde har vi vist evnen til at lukke og semiautomatisere hMSC-dissociation og vaske og høste på bænken ved hjælp af et modstrømscentrifugeringsinstrument. Et af de kritiske trin i hele arbejdsgangen er at sikre, at slangerne er forbundet i henhold til den forudindstillede protokol, der er defineret i modstrømscentrifugeringssystemprotokolbyggeren. Opsætningen og betjeningen er enkel, og den tid, det tog at behandle omkring 2 liter kultur fra en 10-lags kolbe fra kitsamling til cellehøst, var omkring 60 minutter. Et af de begrænsende trin i denne arbejdsgang er væskeoverførslen fra flerlagskolben til overførselsposerne, der er forbundet med modstrømscentrifugeringsinstrumentet. High-flow engangssættet kan kun køres med en maksimal flowhastighed på 165 ml/min, og dette kan være en udfordring for behandling af f.eks. en 40-lags kolbe. For at fremskynde processen med væskeoverførsel kan eksterne højstrømspumper bruges til først at overføre det trypsiniserede indhold til en overførselspose, efterfulgt af vask/koncentrering og høstning af cellerne fra overførselsposen ved hjælp af modstrømscentrifugeringssystemet. Desuden kan denne protokol også anvendes til at passere celler fra 4-lags til 10-lags flerlagskolber. Længere opstrøms kunne modstrømscentrifugeringssystemet også optimeres til vask af optøede hMSC'er og direkte høst og mediumformulering i flerlagskolber for at starte frøstammen. Det skal bemærkes, at det mindste antal celler, der kræves for at danne det fluidiserede leje i modstrømscentrifugeringskammeret, er ca. 30 millioner celler, og det maksimale anbefalede volumen, der skal behandles pr. Batch, er 20 L.

I øjeblikket er fastgørelse af den brugerdefinerede slangeenhed til flerlagskolben i biosikkerhedsskabet og autoklavering af komponenternes dele ikke ønskelig i en cGMP-indstilling. Som et alternativ kunne en brugerdefineret gammasteriliseret rørsamling outsources til leverandører. Leverandører, der leverer flerlagskolber, tilbyder også mulighed for at formontere kolberne med ønskede slangesamlinger, herunder et 0,2 μm filter og gammasterilisering af hele udstyret. Dette ville sikre, at flerlagskolberne og de påsatte slanger virkelig er lukkede, hvilket betyder, at processen kan afsluttes på bænken i et renrum i klasse C.

Denne proces, der anvender modstrømscentrifugeringssystemet, er ikke begrænset til vedhængende baserede dyrkede celler i en flerlagsbeholder og kan tilpasses dynamiske (omrørte tank- eller bølgebioreaktorer) og statiske (gasgennemtrængelige) suspensionsbaserede celleudvidelsesplatforme. Specifikt for hMSC'er, der er udvidet i 3D-mikrobærerkulturer, kan protokoller optimeres på modstrømscentrifugeringssystemet til at høste, vaske og formulere hMSC'erne adskilt fra mikrobærere.

Samlet set har stigende interesse for at udvikle translationelle cellulære terapier med forbedret procesrobusthed og pålidelighed ført til udviklingen af lukkede, automatiserede cellebehandlingsplatforme. Disse systemer er bydende nødvendige, da de reducerer antallet af håndteringstrin, forhindrer potentiel kontaminering af sterile forbindelser og reducerer produktionsomkostningerne ved at reducere arbejdskraften og forbedre den effektive brug af renrumsplads21. I tråd med dette er mange af de udviklere af celleterapiprodukter, der søger myndighedsgodkendelse til at oversætte deres terapier, opmærksomme på vigtigheden af at lukke processen og implementere fuld automatisering eller semiautomatisering allerede i procesudviklingsfasen 14,31,32.

Med brugen af regulatorisk venligt SFM XF-medium og sammen med hjælpereagenser, der er i overensstemmelse med 21 CFR GMP Part 11 og internationale kvalitetsretningslinjer, ville denne halvautomatiske proces være let egnet til klinisk fremstilling. Vi har vist reproducerbarheden af den lukkede proces og opretholdelsen af kvaliteten af WJ-MSC'erne. Forbedring af effektiviteten og sikkerheden ved dyrkning af klæbende celler i flerlagskolber ville ikke kun gavne hMSC-terapiområdet, men også virksomheder inden for cellelinjebank og vedhængende virusproduktion.

Disclosures

P.J., A.B., R.L. og J.N. er ansatte hos Thermo Fisher Scientific. A.L. og S.O. har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende støtte fra Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) finansiering (H18/01/a0/021 og H18/AH/a0/001) fra A * STAR, Singapore.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2L PVC transfer bag TerumoBCT BB*B200TM
Alcian blue solution, pH 2.5 Merck 101647
Alizarin-Red Staining Solution Merck TMS-008-C
APC anti-human CD73 Antibody Biolegend 344015
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody Biolegend 400121
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader Bio-Rad
Counterflow Centrifugation System Thermo Fisher Scientific A47679 Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System
Crystal Violet Sigma-aldrich C0775
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific A1286001
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific A1285601 no calcium, no magnesium
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) Thermo Fisher Scientific A27940
CTS TrypLE Select Enzyme Thermo Fisher Scientific A1285901
Custom tubing assembly Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) N/A Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet
Emflon II capsule (0.2um filter) Pall KM5V002P2G100
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 12662029 Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions
FGF-basic Thermo Fisher Scientific PHG0024
FITC anti-human CD105 Antibody Biolegend 323203
FITC anti-human CD45 Antibody Biolegend 304005
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody Biolegend 328107
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody Biolegend 400109
Hi-Flow Single Use Kit Thermo Fisher Scientific A46575 Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min
Multi-layered systems  Thermo Fisher Scientific 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) Nunc Standard Cell Factory Systems
NucleoCounter NC-3000 Chemometec NC-3000
Oil red O staining solution Merck 102419
PDGF-BB Thermo Fisher Scientific PHG0045
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122
PerCP anti-human CD34 Antibody Biolegend 343519
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody Biolegend 400147
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays Thermo Fisher Scientific Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A 
Sample port Thermo Fisher Scientific A50111 Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher Scientific A10070-01
StemPro Chondrocyte Differentiation Thermo Fisher Scientific A10071-01
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) Thermo Fisher Scientific ME20236L1 Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x)
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit Thermo Fisher Scientific A10072-01
T175 Nunc EasYFlask Thermo Fisher Scientific 159910
T75 Nunc EasYFlask Thermo Fisher Scientific 156472
TGFβ1 Thermo Fisher Scientific PHG9204
WJ MSCs  PromoCell (#C12971; Germany) Human mesenchymal stem cells
αMEM media Thermo Fisher Scientific 12571063 With nucleosides

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhou, T., et al. Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 24 (2021).
  2. García-Bernal, D., et al. The current status of mesenchymal stromal cells: Controversies, unresolved issues and some promising solutions to improve their therapeutic efficacy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 650664 (2021).
  3. Mastrolia, I., et al. Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: Concise review. Stem Cells Translational Medicine. 8 (11), 1135-1148 (2019).
  4. Jovic, D., et al. A brief overview of global trends in MSC-based cell therapy. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (5), 1525-1545 (2022).
  5. Lechanteur, C., Briquet, A., Bettonville, V., Baudoux, E., Beguin, Y. MSC manufacturing for academic clinical trials: From a clinical-grade to a full GMP-compliant process. Cells. 10, 1320 (2021).
  6. Fernández-Santos, M. E., et al. Optimization of mesenchymal stromal cell (MSC) manufacturing processes for a better therapeutic outcome. Frontiers in Immunology. 13, 918565 (2022).
  7. Jossen, V., vanden Bos, C., Eibl, R., Eibl, D. Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: Process and regulatory challenges. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 3981-3994 (2018).
  8. Jayaraman, P., Lim, R., Ng, J., Vemuri, M. C. Acceleration of translational mesenchymal stromal cell therapy through consistent quality GMP manufacturing. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 648472 (2021).
  9. Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), (2020).
  10. Fričová, D., Korchak, J. A., Zubair, A. C. Challenges and translational considerations of mesenchymal stem/stromal cell therapy for Parkinson's disease. npj Regenerative Medicine. 5 (1), 20 (2020).
  11. Childs, P. G., Reid, S., Salmeron-Sanchez, M., Dalby, M. J. Hurdles to uptake of mesenchymal stem cells and their progenitors in therapeutic products. Biochemical Journal. 477 (17), 3349-3366 (2020).
  12. James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell & Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
  13. Ochs, J., Barry, F., Schmitt, R., Murphy, M. Advances in automation for the production of clinical-grade mesenchymal stromal cells: The AUTOSTEM robotic platform. Cell & Gene Therapy Insights. 3 (8), 739-748 (2017).
  14. Doulgkeroglou, M. N., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811 (2020).
  15. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnology Advances. 31 (7), 1032-1046 (2013).
  16. Couto, P. S., Bersenev, A., Rafiq, Q. A. Engineering Strategies for Regenerative Medicine. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. , Academic Press. Cambridge, MA. 33-71 (2020).
  17. Tsai, A. -C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96 (2021).
  18. Cherian, D. S., Bhuvan, T., Meagher, L., Heng, T. S. P. Biological considerations in scaling up therapeutic cell manufacturing. Frontiers in Pharmacology. 11, 654 (2020).
  19. Mizukami, A., Swiech, K. Mesenchymal stromal cells: From discovery to manufacturing and commercialization. Stem Cells International. 2018, 4083921 (2018).
  20. Hassan, M., et al. Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2020, 9529465 (2020).
  21. Li, A., et al. Advances in automated cell washing and concentration. Cytotherapy. 23 (9), 774-786 (2021).
  22. Mehta, S. Single-use centrifugation solution for volume reduction and cell washing process in cell therapy manufacturing. Cytotherapy. 16, Supplement 101 (2014).
  23. Giancola, R., Bonfini, T., Iacone, A. Cell therapy: cGMP facilities and manufacturing. Muscles Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 243-247 (2012).
  24. Moutsatsou, P., Ochs, J., Schmitt, R. H., Hewitt, C. J., Hanga, M. P. Automation in cell and gene therapy manufacturing: From past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
  25. Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting. Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).
  26. Li, A., James, D., Lim, R. The Gibco™ CTS™ Rotea™ system story-A case study of industry-academia collaboration. Gene Therapy. , (2021).
  27. Li, A., et al. Improving cell viability using counterflow centrifugal elutriation. Cytotherapy. 24 (6), 650-658 (2022).
  28. Li, A., et al. Automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing. Journal of Visualized Experiments. (154), e60423 (2019).
  29. Shah, D., Naciri, M., Clee, P., Al-Rubeai, M. NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes. Cytotechnology. 51 (1), 39-44 (2006).
  30. Chan, A. K. C., Heathman, T. R. J., Coopman, K., Hewitt, C. J. Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on human mesenchymal stem cells. Biotechnology Letters. 36 (4), 731-741 (2014).
  31. Smith, D., et al. Towards automated manufacturing for cell therapies. Current Hematologic Malignancy Reports. 14 (4), 278-285 (2019).
  32. Stroncek, D. F., Somerville, R. P. T., Highfill, S. L. Point-of-care cell therapy manufacturing; it's not for everyone. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 34 (2022).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 193 Mesenkymale stamceller serumfrie xenofrie medier flerlagskolbe lukket system automatisering cellehøstning modstrømscentrifugering
Human mesenkymal stamcellebehandling til kliniske applikationer ved hjælp af en lukket semi-automatiseret arbejdsgang
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lam, A. T. L., Jayaraman, P.,… More

Lam, A. T. L., Jayaraman, P., Becker, A., Lim, R., Teo, K. L., Ng, J., Oh, S. Human Mesenchymal Stem Cell Processing for Clinical Applications Using a Closed Semi-Automated Workflow. J. Vis. Exp. (193), e64707, doi:10.3791/64707 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter