Burada, bir ters akış santrifüjleme sistemi kullanarak çok katmanlı şişelerden yapışkan hücreleri kapalı yarı otomatik bir şekilde toplamak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, mevcut adımlarda birkaç değişiklikle diğer hücre genişletme platformlarından hem yapışkan hem de süspansiyon hücrelerini toplamak için uygulanabilir.
İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC’ler) şu anda çeşitli hastalıklar için umut verici bir hücre bazlı terapötik yöntem olarak araştırılmaktadır ve önümüzdeki birkaç yıl içinde klinik kullanım için daha fazla pazar onayı beklenmektedir. Bu geçişi kolaylaştırmak için ölçek, partiden partiye tekrarlanabilirlik, maliyet, mevzuata uygunluk ve kalite kontrolünün darboğazlarını ele almak kritik öneme sahiptir. Bu zorluklar, süreci kapatarak ve otomatik üretim platformlarını benimseyerek ele alınabilir. Bu çalışmada, ters akış santrifüjleme kullanarak çok katmanlı şişelerden Wharton’un jöle (WJ) türevi hMSC’lerin (WJ-hMSC’ler) geçirilmesi ve toplanması için kapalı ve yarı otomatik bir süreç geliştirdik. WJ-hMSC’ler, düzenleyici uyumlu serumsuz kseno içermeyen (SFM XF) ortam kullanılarak genişletildi ve klasik serum içeren ortamlarda genişletilen WJ-hMSC’lerle karşılaştırılabilir hücre proliferasyonu (popülasyonun iki katına çıkması) ve morfolojisi gösterdi. Kapalı yarı otomatik hasat protokolümüz yüksek hücre geri kazanımı (~% 98) ve canlılık (~% 99) göstermiştir. Karşı akış santrifüjleme kullanılarak yıkanan ve konsantre edilen hücreler, WJ-hMSC yüzey belirteci ekspresyonunu, koloni oluşturan birimleri (CFU-F), trilineaj farklılaşma potansiyelini ve sitokin sekresyon profillerini korudu. Çalışmada geliştirilen yarı otomatik hücre toplama protokolü, düşük çıktı hacmiyle hacim azaltma, yıkama ve hasat gerçekleştirmek için farklı hücre genişletme platformlarına doğrudan bağlanarak çeşitli yapışkan ve süspansiyon hücrelerinin küçük ila orta ölçekli işlenmesi için kolayca uygulanabilir.
İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC’ler), terapötik potansiyelleri ve klinik olarak ilgili hücre dozlarını üretmek için kritik olan in vitro olarak büyümek için yüksek kendini yenileme potansiyelleri göz önüne alındığında, hem doku mühendisliğinde hem de hücre terapilerinde klinik uygulamalar için mükemmel bir adaydır 1,2,3. ClinicalTrials.gov’ye göre, şu anda çeşitli hastalık koşulları için araştırılmakta olan 1.000’den fazla klinik çalışma bulunmaktadır4. hMSC’lerin kullanımına olan ilginin artması göz önüne alındığında, yakın gelecekte daha fazla klinik çalışma ve pazar onayı yakındır 5,6. Bununla birlikte, hMSC’lerin üretimi, partiden partiye değişkenlik, yüksek riskli hammaddelerin kullanımı, birçok açık ve manuel işlem nedeniyle kontaminasyonla ilgili endişeler açısından birçok doğal zorluğa sahiptir, çünkü üretim birden fazla birim operasyonu, daha yüksek işçilik maliyetleri, ölçeklendirme veya ölçeklendirme maliyeti ve düzenleyici engeller 6,7,8,9,10, 11,12. Bu sorunlar, mevcut ve gelecekteki pazar erişiminin önünde önemli bir engel olmaya devam etmektedir.
Kapalı, modüler, otomatik üretim çözümlerinin geliştirilmesi ve düşük riskli yardımcı reaktiflerin kullanılması bu zorlukların üstesinden gelecektir. Bu aynı zamanda tutarlı ürün kalitesi sağlayacak, insan hatasından kaynaklanan parti arızası olasılığını azaltacak, işçilik maliyetlerini düşürecek ve dijital partikaydı tutma 8,12,13,14 gibi süreç standardizasyonunu ve mevzuata uygunluğu iyileştirecektir. Klinik olarak ilgili bir hücre dozu elde edebilmek için, otolog veya allojenik olsun, yukarı akış hücre genişlemesini ve kapalı, otomatik bir şekilde aşağı akış işlemeyi içeren aerodinamik üretim çok önemlidir.
Yukarı akış hMSC genişlemesi için, şu anda kullanılan en yaygın iki üretim yöntemi, ölçek genişletme (2D tek katmanlı) ve ölçek büyütme (3D mikrotaşıyıcı tabanlı süspansiyon sistemi)15,16,17,18’dir. hMSC genişletme için en geleneksel ve yaygın olarak benimsenen yöntem, düşük üretim maliyeti ve kurulum kolaylığı nedeniyle 2D tek katmanlı tabanlı kültürdür19.
Bir kültür kabı içinde istiflenmiş düz yüzey tepsilerinden oluşan çok katmanlı şişeler, hMSC üretimini ölçeklendirmek için yaygın olarak kullanılır. Bu sistemler tipik olarak 1 katmanlı ila 40 katmanlı kültür kapları20 olarak gelir ve biyogüvenlik kabinlerinin içinde manuel olarak kullanılır. Hücre geçişi ve hasadı sırasındaki işleme adımları, genleşme ortamının, ayrışma reaktifinin ve yıkama tamponunun pipetleme veya fiziksel olarak eğilerek tüm kabın manuel olarak dağıtılmasını ve boşaltılmasını içerir. Ayrıca, birden fazla üniteyi kullanmak, boyutları ve ağırlıkları nedeniyle zorlu ve zaman alıcıdır.
Daha sonra, çok katmanlı şişelerden hasat sonrası, ortam değişimi için santrifüjleme, hücre yıkama ve hacim azaltma, tüm hücre üretim iş akışı21 boyunca temel adımlardır. Geleneksel tezgah üstü santrifüjleme, hücre süspansiyonunun bir biyogüvenlik kabini içindeki kapaklı tüplere veya şişelere aktarılması, hücrelerin döndürülmesi, süpernatanın manuel olarak aspire edilmesi, tamponla hücre yeniden süspansiyonu ve tekrarlanan hücre yıkamaları gibi çok sayıda adımı içeren çoğunlukla açık ve manuel bir işlemdir. Bu, hem kapakların açılıp kapanması nedeniyle kontaminasyon riskini hem de manuel aspirasyon/pipetleme işlemi sırasında hücre peletini kaybetme olasılığını önemli ölçüde artırır22. hMSC’ler gibi yapışkan tabanlı hücreler için çok katmanlı kültür sistemlerinin elleçlenmesi bağlamında, operatörün santrifüj ve biyogüvenlik kabini arasında tekrar tekrar durma ve aynı anda ağır bir üniteyi kullanma zahmetli bir süreçten geçmesi gerekecektir. Bu manuel adımlar zahmetlidir, insan hataları ve kontaminasyon açısından risk oluşturur ve23 maliyetli olan B Sınıfı temiz oda ortamında gerçekleştirilmelidir. Ek olarak, geleneksel manuel santrifüjleme işlemi ölçeklenebilir değildir ve hücresel kayma ve strese neden olabilir; Bu nedenle, hücre geri kazanımını, canlılığını ve artık safsızlıkların yıkanma verimliliğini en üst düzeye çıkarmak diğer önemli zorluklardır22. Hücre terapilerinin ticari cGMP ölçekli üretimi, kontaminasyon riskini azaltmak, tutarlı ürün kalitesi sağlamak, işçilik ve üretim maliyetlerini azaltmak ve proses güvenilirliğini artırmak için kapalı, modüler otomasyon çözümleri gerektirir24,25. Çok katmanlı şişeler, steril gaz değişimini kolaylaştırmak için portlardan birinde steril 0,2 μm filtreye ve konektörler aracılığıyla aseptik olarak bağlanmış veya hücre hasadı için doğrudan otomatik bir hücre işleme cihazına tüp kaynaklı ikinci bir porta sahip olarak kapalı bir sistem olarak kullanılabilir. Hücre, gen veya doku bazlı ürünlerin üretimine yönelik yenilikçi bir kapalı karşı akış santrifüjünü değerlendirerek WJ-hMSC geçiş ve hasadının çoğu adımını kapatmak ve otomatikleştirmek için çalıştık. Bu karşı akışlı santrifüj ayrıca, çeşitlihücre tipleri 8,26,27,28 için boyut, orta/tampon değişimi, konsantrasyon ve hasat gibi hücre ayırma gibi çeşitli hücre işleme uygulamalarını gerçekleştirme esnekliğine sahiptir. Cihaz, torbaları aktarmak için boru kaynağı veya aseptik konektörler kullanılarak steril olarak bağlanabilen veya doğrudan tercih edilen herhangi bir genişletme platformuna bağlanabilen kapalı, tek kullanımlık bir kit kullanır.
Bu çalışmada, tek kullanımlık karşı akışlı santrifüjleme kiti ile çok katmanlı şişe arasında kapalı steril bağlantılara izin vermek için özel bir boru tertibatı tasarladık. WJ-MSC’leri çok katmanlı şişeden tek bir çalıştırmada tamamen kapalı ve yarı otomatik bir şekilde enzimatik olarak ayırmak, yıkamak ve hasat etmek için bir protokolü optimize ettik. Hasat edilen WJ-hMSC’ler, nihai ürünün lot salınımı için kritik kalite özelliklerini (CQA’lar) karşıladığından emin olmak için saflık (yüzey belirteci analizi) ve potens (CFU-F, trilineage farklılaşması ve sitokin sekresyon profilleri) için karakterize edildi.
Bu çalışmada, hMSC ayrışmasını kapatma ve yarı otomatik hale getirme ve bir ters akış santrifüj cihazı kullanarak tezgahta yıkama ve hasat etme yeteneğini gösterdik. Tüm iş akışındaki kritik adımlardan biri, boruların karşı akış santrifüj sistemi protokol oluşturucusunda tanımlanan önceden ayarlanmış protokole göre bağlandığından emin olmaktır. Kurulum ve kullanım basittir ve kit montajından hücre hasadına kadar 10 katmanlı bir şişeden yaklaşık 2 L kültürün işlenmesi için geçen süre yaklaşık 60 dakikaydı. Bu iş akışındaki sınırlayıcı adımlardan biri, çok katmanlı şişeden karşı akışlı santrifüj cihazına bağlı transfer torbalarına sıvı transferidir. Yüksek akışlı tek kullanımlık kit yalnızca maksimum 165 mL/dak akış hızında çalıştırılabilir ve bu, örneğin 40 katmanlı bir şişenin işlenmesi için zor olabilir. Sıvı transferi işlemini hızlandırmak için, tripsinize edilmiş içerikleri önce bir transfer torbasına aktarmak için harici yüksek akış hızlı pompalar kullanılabilir, ardından karşı akışlı santrifüjleme sistemi kullanılarak hücrelerin transfer torbasından yıkanması/konsantre edilmesi ve toplanması yapılabilir. Ayrıca, bu protokol 4 katmanlı ila 10 katmanlı çok katmanlı şişelerden geçen hücreler için de uygulanabilir. Daha da yukarı akışta, karşı akışlı santrifüjleme sistemi, çözülmüş hMSC’lerin yıkanması ve tohum trenini başlatmak için çok katmanlı şişelere doğrudan hasat ve orta formülasyon için optimize edilebilir. Karşı akışlı santrifüjleme odasındaki akışkan yatağı oluşturmak için gereken minimum hücre sayısının yaklaşık 30 milyon hücre olduğu ve parti başına işlenmesi önerilen maksimum hacmin 20 L olduğu belirtilmelidir.
Şu anda, özel boru tertibatının biyogüvenlik kabinindeki çok katmanlı şişeye tutturulması ve bileşenlerin parçalarının otoklavlanması bir cGMP ayarında arzu edilmemektedir. Alternatif olarak, özel bir gama sterilize boru tertibatı tedarikçilere dış kaynak olarak sağlanabilir. Çok katmanlı şişeler sağlayan tedarikçiler ayrıca, şişeleri 0,2 μm filtre ve tüm kıyafetin gama sterilizasyonu dahil olmak üzere istenen boru tertibatlarıyla önceden takma seçeneği de sunar. Bu, çok katmanlı şişelerin ve ekli boruların gerçekten kapalı olmasını sağlayacaktır, bu da işlemin C Sınıfı temiz oda ortamında tezgahta tamamlanabileceği anlamına gelir.
Karşı akışlı santrifüjleme sistemini kullanan bu işlem, çok katmanlı bir kaptaki yapışkan bazlı kültürlü hücrelerle sınırlı değildir ve dinamik (karıştırılmış tank veya dalga biyoreaktörleri) ve statik (gaz geçirgen) süspansiyon bazlı hücre genleşme platformlarına uyarlanabilir. Spesifik olarak, 3D mikrotaşıyıcı kültürlerde genişletilmiş hMSC’ler için, mikrotaşıyıcılardan ayrışmış hMSC’leri toplamak, yıkamak ve formüle etmek için karşı akış santrifüj sisteminde protokoller optimize edilebilir.
Genel olarak, gelişmiş proses sağlamlığı ve güvenilirliği ile translasyonel hücresel tedavilerin geliştirilmesine olan ilginin artması, kapalı, otomatik hücre işleme platformlarının geliştirilmesine yol açmıştır. Bu sistemler, elleçleme adımlarının sayısını azalttıkları, steril bağlantılarla olası kontaminasyonu önledikleri ve işçiliği azaltarak ve temiz oda alanının etkin kullanımını artırarak üretim maliyetlerini düşürdükleri için zorunludur21. Buna paralel olarak, tedavilerini tercüme etmek için düzenleyici onay arayan hücre terapisi ürün geliştiricilerinin çoğu, süreci kapatmanın ve süreç geliştirme aşaması 14,31,32 kadar erken bir zamanda tam otomasyon veya yarı otomasyon uygulamanın öneminin farkındadır.
Düzenleyici dostu SFM XF ortamının kullanımı ve 21 CFR GMP Bölüm 11 ve uluslararası kalite yönergelerine uygun yardımcı reaktiflerle birlikte, bu yarı otomatik süreç klinik üretim için kolayca uygun olacaktır. Çok katmanlı şişelerde yapışkan bazlı hücrelerin kültürlenmesinin verimliliğini ve güvenliğini artırmak, sadece hMSC tedavi alanına değil, aynı zamanda hücre hattı bankacılığı ve yapışkan virüs üretimindeki şirketlere de fayda sağlayacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, Singapur’un A * STAR kentinden Endüstri Uyum Fonu Ön Konumlandırma (IAF-PP) fonundan (H18/01/a0/021 ve H18/AH / a0/001) gelen desteği kabul etmek ister.
2L PVC transfer bag | TerumoBCT | BB*B200TM | |
Alcian blue solution, pH 2.5 | Merck | 101647 | |
Alizarin-Red Staining Solution | Merck | TMS-008-C | |
APC anti-human CD73 Antibody | Biolegend | 344015 | |
APC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400121 | |
Bio-Plex MAGPIX Multiplex Reader | Bio-Rad | ||
Counterflow Centrifugation System | Thermo Fisher Scientific | A47679 | Gibco CTS Rotea Counterflow Centrifugation System |
Crystal Violet | Sigma-aldrich | C0775 | |
CTS (L-alanyl-L-glutamine) GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
CTS Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | A1285601 | no calcium, no magnesium |
CTS Recombinant Human Vitronectin (VTN-N) | Thermo Fisher Scientific | A27940 | |
CTS TrypLE Select Enzyme | Thermo Fisher Scientific | A1285901 | |
Custom tubing assembly | Saint-Gobain and Colder Product Company (CPC) | N/A | Gamma-sterilized 3/32” ID PVC line fitted with a sterile male MPC (1/8” barb) and sealed on the other end. Autoclave a short C-Flex line fitted with a sterile Cell Factory port connector on one end and a female MPC (3/8” barb) on the other. Connect the PVC and C-Flex lines in a biosafety cabinet |
Emflon II capsule (0.2um filter) | Pall | KM5V002P2G100 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 12662029 | Mesenchymal stem cell-qualified, USDA-approved regions |
FGF-basic | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | |
FITC anti-human CD105 Antibody | Biolegend | 323203 | |
FITC anti-human CD45 Antibody | Biolegend | 304005 | |
FITC anti-human CD90 (Thy1) Antibody | Biolegend | 328107 | |
FITC Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody | Biolegend | 400109 | |
Hi-Flow Single Use Kit | Thermo Fisher Scientific | A46575 | Gibco CTS Rotea Hi-flow single-use kit, flow rate of 30 – 165 mL/min |
Multi-layered systems | Thermo Fisher Scientific | 140360 (4-layers); 140410 (10-layers) | Nunc Standard Cell Factory Systems |
NucleoCounter NC-3000 | Chemometec | NC-3000 | |
Oil red O staining solution | Merck | 102419 | |
PDGF-BB | Thermo Fisher Scientific | PHG0045 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
PerCP anti-human CD34 Antibody | Biolegend | 343519 | |
PerCP Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody | Biolegend | 400147 | |
ProcartaPlex Multiplex Immunoassays | Thermo Fisher Scientific | Custom 19-Plex panel: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2 , MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, PDGF-BB, RANTES, SDF-1α, TGFα, TNF-alpha, VEGF-A | |
Sample port | Thermo Fisher Scientific | A50111 | Gamma-sterilized leur sample port with 2 PVC lines attached |
StemPro Adipogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10070-01 | |
StemPro Chondrocyte Differentiation | Thermo Fisher Scientific | A10071-01 | |
StemPro Custom MSC SF XF Medium Kit (SFM XF medium) | Thermo Fisher Scientific | ME20236L1 | Contains StemPro MSC SFM Basal Medium and Custom MSC SF XF Supplement (100x) |
StemPro Osteogenesis Differentiation Kit | Thermo Fisher Scientific | A10072-01 | |
T175 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 159910 | |
T75 Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
TGFβ1 | Thermo Fisher Scientific | PHG9204 | |
WJ MSCs | PromoCell | (#C12971; Germany) | Human mesenchymal stem cells |
αMEM media | Thermo Fisher Scientific | 12571063 | With nucleosides |