Summary
Denna artikel presenterar två metoder baserade på fluorescens in situ hybridisering för att bestämma X-kromosominnehållet i äggstocksceller i icke-ympad och ympad äggstockscortexvävnad från kvinnor med X-kromosomavvikelser.
Abstract
Miljontals människor världen över hanterar frågor som rör fertilitet. Minskad fertilitet, eller till och med infertilitet, kan bero på många olika orsaker, inklusive genetiska störningar, varav kromosomavvikelser är de vanligaste. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) är en välkänd och ofta använd metod för att upptäcka kromosomavvikelser hos människor. FISH används huvudsakligen för analys av kromosomavvikelser i spermier hos män med numeriska eller strukturella kromosomavvikelser. Dessutom används denna teknik också ofta hos kvinnor för att upptäcka X-kromosomavvikelser som är kända för att orsaka äggstocksdysgenes. Information om X-kromosominnehållet i äggstocksceller från kvinnor med X-kromosomavvikelser i lymfocyter och/eller buckala celler saknas dock fortfarande.
Syftet med denna studie är att främja grundforskning om X-kromosomavvikelser hos kvinnor, genom att presentera två metoder baserade på FISH för att identifiera X-kromosominnehållet i äggstocksceller. Först beskrivs en metod för att bestämma X-kromosominnehållet i isolerade äggstocksceller (oocyter, granulosaceller och stromaceller) i icke-ympad äggstockscortexvävnad från kvinnor med X-kromosomavvikelser. Den andra metoden är inriktad på att utvärdera effekten av kromosomavvikelser på follikulogenes genom att bestämma X-kromosominnehållet i äggstocksceller i nybildade sekundära och antrala folliklar i äggstocksvävnad, från kvinnor med X-kromosomavvikelser efter långvarig ympning i immunsupprimerade möss. Båda metoderna kan vara till hjälp i framtida forskning för att få insikt i reproduktionspotentialen hos kvinnor med X-kromosomavvikelser.
Introduction
Infertilitet är en hälsofråga i det manliga eller kvinnliga reproduktionssystemet och påverkar cirka 186 miljoner individer i reproduktiv ålder över hela världen1. I minst 35% av infertila par orsakas infertilitet av en störning i det kvinnliga reproduktionssystemet2. Det finns många faktorer som kan orsaka kvinnlig infertilitet, såsom genetiska faktorer, könsorgansavvikelser, endokrin dysfunktion, inflammatoriska sjukdomar och iatrogen behandling3.
Genetiska avvikelser förekommer hos cirka 10% av infertila kvinnor 4,5. Av alla genetiska avvikelser är X-kromosomavvikelser den vanligaste orsaken till äggstocksdysgenes2. Flera studier har rapporterat att X-kromosomavvikelser hos kvinnor med Turners syndrom (TS) eller Triple X-syndrom är associerade med för tidig äggstockssvikt på grund av en accelererad förlust av könsceller eller nedsatt oogenes 6,7,8.
Aberrationer av X-kromosomen kan delas in i: 1) numeriska avvikelser, där antalet X-kromosomer är olika men X-kromosomerna är intakta; och 2) strukturella avvikelser, där X-kromosomen har fått eller förlorat genetiskt material 3,9. Numeriska avvikelser i X-kromosomen är vanligare än strukturella avvikelser och orsakas ofta av spontana fel under celldelning 3,9. När ett sådant fel inträffar under meios kan det leda till aneuploida gameter och slutligen till avkomma med kromosomavvikelser i alla celler. När kromosomdefekter uppstår i somatiska celler som ett resultat av fel som uppstår under mitos i de tidiga stadierna av ontogenes kan det leda till mosaicism. Hos dessa individer finns både celler med normalt X-kromosomalt innehåll och celler med X-kromosomavvikelser.
På 1980-talet utvecklades en cytogenetisk teknik som kallas fluorescens in situ hybridisering (FISH) för att visualisera och lokalisera specifika nukleinsyrasekvenser på metafas- och interfaskromosomer10,11. Denna teknik använder fluorescerande märkta DNA-sonder för att binda till en specifik sekvens i kromosomen, som sedan kan visualiseras med hjälp av ett fluorescensmikroskop.
Numera används FISH i stor utsträckning som ett kliniskt diagnostiskt verktyg och anses vara guldstandarden för att upptäcka kromosomavvikelser10. Inom reproduktionsmedicin har FISH-analys på spermier använts för att få insikt i X-kromosominnehållet i spermier hos män med numeriska eller strukturella kromosomavvikelser i somatiska celler12,13,14. Dessa studier visade att män med kromosomavvikelser var mer benägna att ha en högre frekvens av aneuploida spermier närvarande i sin sperma jämfört med män med normala karyotyper12,13,14.
I motsats till spermier är mycket lite känt om X-kromosominnehållet i äggstocksceller (inklusive oocyter, granulosa/theca-celler och stromaceller) hos individer med kromosomavvikelse, liksom de möjliga konsekvenserna av aneuploidi hos dessa celler på deras reproduktionspotential. En viktig orsak till den knappa informationen om karyotypen av äggstocksceller jämfört med spermatozoa är det faktum att kvinnor måste genomgå ett invasivt förfarande som follikelpunktion eller operation för att erhålla oocyter eller äggstocksbarkvävnad. Kvinnliga könsceller är därför svåra att få tag på för forskningsändamål.
För närvarande utförs en observationsinterventionsstudie i Nederländerna för att undersöka effekten av kryokonservering av äggstocksvävnad hos unga kvinnor med TS15. Ett fragment av patientens äggstocksbarkvävnad var tillgängligt för att identifiera X-kromosominnehållet i äggstockscellerna16,17. Som en del av studien utvecklades en ny metod baserad på FISH av dissocierad äggstockscortexvävnad för att avgöra om kromosomavvikelser finns i äggstocksceller hos kvinnor som bär en kromosomavvikelse i icke-äggstockssomatiska celler, såsom lymfocyter eller buckala celler. Dessutom bestämdes effekten av aneuploidi i äggstocksceller på follikulogenes. För detta ändamål modifierades ett etablerat FISH-protokoll som möjliggör analys av histologiska sektioner av äggstocksbarkvävnad efter artificiellt inducerad follikulogenes under långvarig xenotransplantation hos immunsupprimerade möss. I denna studie presenterar vi två metoder baserade på FISH för att bestämma X-kromosominnehållet i äggstocksceller i icke-ympad och ympad äggstocksbarkvävnad hos kvinnor med X-kromosomavvikelser, i syfte att förbättra grundvetenskapen om detta ämne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
TurnerFertility-studieprotokollet har godkänts av Central Committee on Research Involving Human Subjects (NL57738.000.16). I denna studie erhölls äggstocksbarkvävnaden hos 93 honor med TS. Material som kräver säkerhetsåtgärder anges i tabell 1.
Tabell 1: Säkerhetsåtgärder.
| Material | Fara | ||
| Ättiksyra | Svåra hudbrännskador och irritation i andningsorganen | ||
| kollagenas | Irriterar ögon, andningsorgan och hud | ||
| DAPI | Irriterar ögon, andningsorgan och hud | ||
| DNas I | Irriterar ögon, andningsorgan och hud | ||
| Etanol | Mycket brandfarligt | ||
| Formaldehyd | Giftigt efter inandning, förtäring och hudkontakt | ||
| Formamid (i fluorescensprober) |
Kan skada det ofödda barnet | ||
| Liberase | Irriterar ögon, andningsorgan och hud | ||
| Metanol | Mycket brandfarligt, giftigt vid inandning, förtäring och hudkontakt | ||
| Nonidet P40 | Irriterar huden eller ögonen | ||
| Pepsin | Irriterar ögon, andningsorgan och hud | ||
| Proteinas K | Andningssvårigheter efter inandning | ||
| Xylen | Mycket brandfarligt, giftigt efter inandning och hudkontakt. Undvik kontakt med ögonen. | ||
Tabell 1: Material som kräver säkerhetsåtgärder.
1. FISK på isolerade enskilda äggstocksbarkceller
- Dissociation av äggstocksbarkvävnad för att erhålla enskilda celler
- Skär vävnaden från kryokonserverade/tinade äggstocksbarken i små bitar på ca 1 mm x 1 mm x 1 mm med en skalpell.
- Enzymatiskt uppslutning av vävnadsfragmenten i 4 ml förvärmt (37 °C) L15-medium innehållande 0,1 mg/ml vävnadsdissociationsenzymblandning, 10 μg/ml DNas I och 1 mg/ml kollagenas I från C. histolyticum i högst 75 minuter vid 37 °C. Pipettera digestionsblandningen upp och ner var 15:e minut.
- Stoppa den enzymatiska matsmältningen genom att tillsätta 4 ml kallt L15 kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS). Tvätta den dissocierade vävnaden en gång med 8 ml kallt L15-medium genom centrifugering vid 500 x g och resuspendera i 500 μL L15-medium utan virvling för att undvika skador på cellerna.
- Överför cellsuspensionen som innehåller i stort sett enskilda stromaceller och små folliklar (oocyter omgivna av ett enda lager granulosaceller ) till en petriskål av plast och undersök cellsuspensionen under ett stereomikroskop (100x förstoring).
- Ta upp de små folliklarna (<50 μm) manuellt med hjälp av en 75 μm plastpipett och överför folliklarna till en droppe L15-medium kompletterat med 10% FBS vid 4 °C för att förhindra aggregering av folliklar. Utför follikelupptagning i högst 30 minuter. För att förbättra follikelcellspridningen före FISH-analys, överför de renade folliklarna till en lösning av 0,06% trypsin, 1 mg / ml etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och 1 mg / ml glukos och inkubera i 20 minuter vid 37 ° C.
- Skaffa stromaceller från äggstockscellsuspensionen med en 75 μm plastpipett, var särskilt försiktig för att undvika kontaminering med små folliklar.
- FISH-analys av enskilda äggstocksceller
- Överför de behandlade äggstocksfolliklarna (rekommenderas n = 5-20) med trypsin/EDTA/glukos eller stromaceller (n > 1 000) till droppar på 5 μl 0,15 mM KCl/15 μL Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) på ett objektsglas och inkubera i 20 minuter vid 37 °C.
- Torka och förfixera objektglasen i 300 μL 0,05 mM KCl/7,5% ättiksyra/22,5% metanol i 2 min vid rumstemperatur (RT). Täck glasen med metanol/ättiksyra (3:1) i 2 minuter vid rumstemperatur för att slutföra fixeringen.
- Gör 20x standard natriumcitrat (SSC) genom att tillsätta 876 g natriumklorid och 441 g trinatriumcitratdihydrat i 5 liter destillerat vatten. Tillsätt sedan 100 ml 20x SSC till 900 ml demineraliserat (demi) vatten för att erhålla 2x SSC. Tvätta provet i 2x SSC vid 73 °C, täck det med 100 μl 2 % proteinas K och försegla det med ett täckglas. Inkubera objektglasen i 10 minuter vid 37 °C i hybridiseringsstationen.
- Ta bort täckglaset och tvätta glasen i 5 minuter i DPBS vid RT. Fixera provet i 5 minuter med 1% formaldehyd vid RT. I detta skede är materialet ännu inte helt fäst vid glasskivorna och bör därför inte placeras på en skakplattform.
- Tvätta glasen i 5 minuter i DPBS vid RT, följt av uttorkning i efterföljande 70%, 80%, 90% och 100% etanol i 2 minuter vardera. Lufttorka det uttorkade provet och hybridisera det med fluorescerande märkta sonder.
- Välj en centromerspecifik sond för kromosom X och en annan kromosomspecifik centromer sond som en kontroll för att bestämma X-kromosominnehållet i äggstocksceller. I detta fall används centromerspecifika sonder för kromosom X (CEP X [DXZ1]) direkt märkta med fluorokrom SpectrumGreen och kromosom 18 (CEP 18 [D18Z1]) direkt märkta med fluorokrom SpectrumOrange.
- Tillsätt 1 μL CEP X, 1 μL CEP 18 och 18 μL hybridiseringsbuffert till provet och försegla med ett täckglas som limmas på objektglasen för att förhindra avdunstning av sonden under hybridisering. Överför objektglasen till hybridiseringsstationen för denaturering vid 73 °C i 3 minuter, följt av hybridisering under en inkubation över natten vid 37 °C.
- Ta bort täckglaset och eventuellt kvarvarande lim från glaset efter hybridisering. Tvätta glasen i 0,4x SSC/0,3 % Tween-20 vid 72 °C i 2 minuter, följt av inkubation i 1 min i 2x SSC/0,1 % Tween-20 vid rumstemperatur.
- Dehydrera objektglasen genom efterföljande 2 minuters inkubationer i 70%, 80%, 90% och 100% etanol och lufttorka i mörkret. Täck objektglasen med ett monteringsmedium som innehåller 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Förvaras vid -20 °C i minst 10 minuter före analys med fluorescensmikroskopi.
- Imaging
- Undersök signalen för X-kromosomen med ett fluorescensmikroskop kopplat till ett bildbehandlingsprogram.
- Välj först fluorokrom DAPI.
- Hämta en bild genom att välja Ny cell > Live > Capture med 630x förstoring. Ett nytt fönster med tröskeln visas. Ställ in tröskelns blå stapel på 0 för att minimera bakgrunden och den röda stapeln på max (255) för att göra signalerna ljusare. Klicka på Acceptera.
- Ett nytt fönster med förbättring visas med ett förslag på mörkare/ljusare (12), radie (3) och djup (1). Använd de föreslagna värdena eller justera dem om du inte är nöjd.
- För det andra, välj fluorokrom SpectrumOrange och klicka på Capture.
- Ställ in tröskelns blå stapel på 0 för att minimera bakgrunden och den röda stapeln på max (255) för att göra signalerna ljusare. Klicka på Acceptera.
- Fönstret med förbättring visas med ett förslag på mörkare/ljusare (-11), radie (2,7) och djup (0,6). Använd de föreslagna värdena eller justera dem om du inte är nöjd.
- Välj slutligen fluorokrom SpectrumGreen och klicka på Capture.
- Ställ in tröskelns blå stapel på 0 för att minimera bakgrunden och den röda stapeln på max (255) för att göra signalerna ljusare. Klicka på Acceptera.
- Fönstret med förbättring visas med ett förslag på mörkare/ljusare (0), radie (3) och djup (0). Använd de föreslagna värdena eller justera det om du inte är nöjd. Spara bilden i en nyskapad fil.
OBS: Somatiska celler utvärderades endast när två signaler från kontrollkromosom 18 var synliga. I de flesta oocyter kunde endast en signal detekteras för varje kromosom.
- Välj först fluorokrom DAPI.
- Förvara objektglasen i mörker vid 4 °C efter analys för att förhindra signalförlust.
- Undersök signalen för X-kromosomen med ett fluorescensmikroskop kopplat till ett bildbehandlingsprogram.
2. FISK på paraffinsektioner av ympad äggstocksbarkvävnad
OBS: Ett fragment av kryopkonserverad/tinad äggstocksbarkvävnad hos 18 honor med TS xenograferades till svåra kombinerade immunbristfälliga (SCID) möss i 5 månader. Xenograftingförfarandet har beskrivits tidigare och genomfördes vid Université Catholique de Louvain (Bryssel, Belgien) enligt de lokala riktlinjerna från kommittén för djurförsök om djurskydd (referens 2014/UCL/MD/007)18,19.
- Välja delar av xenograferad vävnad från äggstocksbarken som innehåller folliklar
- Fixera xenograferad äggstocksbarkvävnad i 4% formaldehyd och bädda in vävnaden i paraffin. Putsa blocken med en skalpell för att avlägsna extra paraffin och skär paraffinblocket till 4 μm tjocklek på en roterande mikrotom.
- Välj var sjunde sektion av paraffinbandet för hematoxylin och eosin (HE) färgning för att bestämma vilka sektioner som innehåller folliklar. Lägg sektionen i ett vattenbad vid 40-45 °C och montera dem på immunhistokemiska mikroskopglas.
- Avparaffinisering och HE-färgning
- Sätt objektglasen på en spis i 10 min vid 60 °C och sänk sedan ner objektglasen i 100 % xylen i 5 minuter. Det är inte nödvändigt att placera bilderna direkt på kaminen. Hydrera sektionerna i 15 s i 100% etanol, följt av 2 x 15 s i 96% etanol. Skölj rutschkanorna i kranvatten i 2 min.
- Färga objektglasen i hematoxylin i 10 minuter och skölj sedan objektglasen kort i kranvatten. Sänk ner objektglasen kort i en bikarbonatlösning (100 g magnesiumsulfat och 10 g natriumbikarbonat i 5 liter destillerat vatten). Skölj glasen i kranvatten i 5 min.
- Motfärga objektglasen med eosin i 4 minuter och torka ut glasen tre gånger med 100 % etanol, följt av xylen. Täck HE-fläckarna på objektglasen och utvärdera HE-sektionerna under ett ljusmikroskop för att välja sektioner med folliklar (100x förstoring).
- Förbehandling och hybridisering av paraffinsektioner för DNA FISH
- Välj nya sektioner som låg före eller efter avsnittet som innehöll folliklar från paraffinbandet. Montera en sektion på en glasskiva. Torka paraffinpartierna i minst 45 min på spis vid 56 °C. Det är inte nödvändigt att placera bilderna direkt på kaminen.
- Avparaffinisera sektionerna i xylen i 10 min. Sänk ner glasen i 99,5% etanol och skölj dem i 5 min i kranvatten. Förbehandla objektglasen med målsökningslösning (lågt pH) i 10 minuter vid 96 °C. Efter kylning, skölj glasen i destillerat vatten.
- Behandla glasen i 5 minuter med 0,01 M saltsyra, följt av pepsinuppslutning (200 E/ml) i 15 minuter vid 37 °C. Skölj glasen igen i 0,01 M saltsyra och därefter i PBS.
- Fixera objektglasen i 1% formaldehyd/PBS i 5 min. Skölj glasen kort i PBS och sedan igen i demivatten. Torka ut glasen i 99,5% etanol och låt dem lufttorka.
- Välj en centromerspecifik sond för kromosom X och en annan kromosomspecifik centromer sond som en kontroll för att bestämma X-kromosominnehållet i granulosaceller. Här används kromosom 18 som en kontroll.
- Applicera 5 μL sond CEP 18 (D18Z1) direkt märkt med fluorokrom SpectrumGreen och sond CEP X (DXZ1) direkt märkt med fluorokrom SpectrumRed på de förbehandlade objektglasen. Applicera ett täckglas och försegla området med fotolim. Placera objektglasen i en hybridisator för denaturering vid 80 °C i 10 minuter och hybridisering över natten vid 37 °C.
- Nästa dag, skölj glasen i 5 min i 2x SSC vid 42 °C, följt av en 2 min och en 1 min sköljning i 0,3% Nonidet P40 vid 73 °C. Uppdatera 2x SSC och skölj glasen igen i 5 minuter vid rumstemperatur. Täck kyvetten så att sektionerna hålls i mörkret.
- Skölj glasen kort i destillerat vatten. Torka ut glasen i 99,5% etanol och låt dem lufttorka igen. Slutligen montera objektglasen med en lösning som innehåller DAPI och monteringsmedium.
- Imaging
- Analysera resultaten under ett fluorescensmikroskop vid 630x förstoring. Öppna bildbehandlingsprogrammet på datorn. Välj FISK som profil.
- Kontrollera om DAPI-emissionen är inställd på 431 nm och excitationen på 359 nm, Texas röd emission på 613 nm och excitation på 595 nm och FITC-emission på 519 nm och excitation på 495 nm.
- Hämta en bild genom att välja Live > Capture Single Image. Optimera bildkvaliteten genom att justera exponeringen och förstärkningen genom att flytta skjutreglaget Exponeringsreglaget och Förstärkningsreglaget i menyn Bild till vänster (t.ex. exponering: 212 ms och förstärkning: 7,9). Den erforderliga exponeringen och förstärkningen kan variera per bild; Observera ändringarna under den här processen för att få en optimerad bild. Spara bilden i en nyskapad fil.
- Förvara objektglasen i mörker vid 4 °C efter analys för att förhindra signalförlust.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FISK på isolerade äggstocksceller före ympning
Kryokonserverad vävnad från äggstockarna från kvinnor med 45,X/46,XX (patient A) eller 45,X/46,XX/47,XXX (patient B) TS användes för att illustrera resultaten med hjälp av detta protokoll. Hos patient A hade 50 % av lymfocyterna en karyotyp på 45,X och 50 % hade 46,XX. Hos patient B var 38 % av lymfocyterna 45,X, 28 % 46,XX och 34 % 47,XXX. Centromerspecifika sonder för kromosom X (grön) och kromosom 18 som kontroll (röd) användes för att bestämma X-kromosominnehållet i enskilda granulosaceller, stromaceller och oocyter isolerade från äggstocksbarkvävnad hos TS-patienter utan föregående xenotransplantation (figur 1).
Figur 1: FISH-analys av isolerade äggstocksceller från vävnad från äggstocksbarken före ympning. Oocyter (pilhuvuden) och granulosaceller från enstaka primordiala folliklar (A,B) och (C,D) de omgivande stromaceller analyserades med fluorescerande specifika sonder för kromosom X (gröna signaler) och kontrollkromosom 18 (röda signaler). Vita pilar indikerar 45,X cellinjer, gula pilar indikerar 46,XX cellinjer och röda pilar indikerar 47,XXX cellinjer. Inte alla fluorescerande signaler är i samma fokusplan. Staplar representerar 10 μm. Förstoringen av FISH-signaler var inställd på 630x. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Skillnaderna mellan enskilda primordiala folliklar som behandlades med och utan trypsin före FISH visas i figur 2. Genom att använda trypsin före FISH-analysen klumpades granulosacellmassan och oocyterna mindre, vilket möjliggjorde analys av X-kromosominnehållet i enskilda granulosaceller och oocyter. DNA från oocyter kan lätt särskiljas från det hos de omgivande granulosacellerna på grund av den oregelbundna formen, storleken och diffusa utseendet på DNA från oocyterna. Dessutom observeras endast en stark FISH-signal för varje kromosom i oocyterna hos små folliklar, på grund av närheten av de fyra systerkromatiderna i dessa celler. X-kromosomhalten i oocyter kan bestämmas genom att använda ytförhållandet mellan FISH-signalen för kromosom X och kromosom 18.
Figur 2: Små folliklar behandlade med och utan trypsin före FISH. (A) Enzymatisk nedbrytning av vävnad från äggstocksbarken resulterade i en suspension av i stort sett dissocierade celler men lämnade de ursprungliga folliklarna, bestående av en intakt oocyt omgiven av ett enda lager granulosaceller (pilspetsar i panel A). (B) Små folliklar handplockades från cellsuspensionen men gav svårigheter att tolka signaler efter FISH på grund av klumpning av granulosaceller (C). (D,E) Ytterligare matsmältning av de isolerade folliklarna med trypsin före FISH resulterade i att enskilda granulosaceller drog ihop sig till en sfärisk morfologi på folliklarnas yta och var mer benägna att dissociera från follikeln för att bli tillgängliga för FISH-analys. Oocyt-härledda FISH-signaler indikeras med pilar. Svarta staplar representerar 100 μm och vita staplar representerar 10 μm. Förstoringen av FISH-signaler sattes till 630x. Panel D har reproducerats med tillstånd från Peek et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
FISH-analys av granulosaceller på paraffinsektioner av ympad äggstocksbarkvävnad
Sekundära och antrala folliklar visade sig vara mindre mottagliga för enzymatisk nedbrytning, vilket gör den tidigare beskrivna metoden för vävnadsdissociation för att erhålla enskilda äggstocksceller som inte är lämpliga för odling av folliklar som finns i äggstocksvävnaden efter långvarig xenotransplantation. Därför optimerades FISH-protokollet med hjälp av 4 μm histologiska sektioner för att bestämma X-kromosominnehållet i granulosaceller i sekundära och antrala folliklar i äggstocksbarkvävnad efter ympning (figur 3). I denna miljö är det osannolikt att FISH-signalen från antingen X-kromosomen eller kontrollkromosomen i oocyter skulle fångas i en enda 4 μm-sektion på grund av den stora diametern hos oocyter i de växande folliklarna.
Figur 3: Histologisk och FISH-färgning av vävnadssnitt i äggstocksbarken efter xenotransplantation. (A,B) Hematoxylin/eosinfärgning visade morfologiskt normala sekundära och antrala folliklar i vävnad från äggstocksbarken efter 5 månaders xenoympning. (C,D) X-kromosominnehållet i granulosaceller i dessa folliklar bestämdes genom FISH-analys. I denna figur visas kromosom X i rött och kromosom 18 i grönt. Stapeln i panel A representerar 50 μm, stapeln i panel B representerar 20 μm och staplarna i panelerna C och D representerar 10 μm. Förstoringen av FISH-signaler var inställd på 630x. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Som ett första steg utfördes experiment med olika fixeringstekniker av vävnaderna för att bestämma vilken metod som ger bäst FISH-signaler. FISH-analys utfördes på ympad vävnad som fixerades i både Bouins lösning och därefter nedsänktes i 4% formaldehyd och på ympad vävnad som fixerades i endast 4% formaldehyd. Ympad vävnad som först fixerades i Bouins visade en grön dis på bilden, vilket gjorde det svårt att exakt räkna antalet FISH-signaler (figur 4).
Figur 4: Ympad vävnad från äggstocksbarken fixerad i Bouins lösning och endast formaldehyd . (A) Fixering av ympad äggstockscortexvävnad i Bouins lösning resulterade i suddiga och till stor del dolda fluorescerande signaler i follikulära celler på grund av en grön dis. (B) Vävnad från äggstocksbarken som var fixerad i formaldehyd gav endast utmärkta fluorescerande signaler som var lätta att tolka. Staplar representerar 10 μm. Förstoringen av FISH-signaler var inställd på 630x. Klicka här för att se en större version av denna figur.
För att bestämma X-kromosominnehållet i granulosaceller i folliklar i histologiska sektioner är det inte möjligt att helt enkelt räkna FISH-signalerna från granulosaceller. En del av kromosomerna hos en enskild granulosacell kan gå förlorad i en viss histologisk sektion på grund av sektionering av vävnaden. Därför är det nödvändigt att först bestämma procentandelen FISH-signaler som förloras på grund av sektionering innan man slutligen bestämmer förlusten av X-kromosominnehållet i granulosacellpopulationen på grund av aneuploidi i nybildade sekundära och antrala folliklar efter ympning av vävnaden.
Procentandelen förlorade FISH-signaler på grund av sektionering kan beräknas genom att bestämma antalet FISH-signaler per granulosacell i den icke-aneuploida kontrollkromosomen 18. Det förväntas att samma procentandel av X-kromosomen förloras på grund av sektionering. Varje ytterligare minskning av antalet X-kromosom FISH-signaler i granulosacellpopulationen beror på aneuploidi. Användning av FISH-signaler från en kontrollkromosom för att bestämma X-kromosomförlust på grund av aneuploidi kräver dock att detekteringskänsligheten hos FISH-signalerna från X-kromosomen och kontrollkromosomen är mycket lika. Detektionskänsligheten hos båda FISH-proberna i granulosaceller i växande folliklar i histologiska sektioner hos icke-aneuploida 46,XX-individer bestämdes därför. När förhållandet mellan kromosom X/kontrollkromosom FISH-signaler är nära 1 kan det antas att detektionskänsligheten hos båda sonderna verkligen är mycket lika, och att FISH-sonderna därmed kan användas för att bestämma nivån av aneuploidi i granulosacellpopulationen hos växande folliklar i histologiska sektioner av äggstocksvävnad efter xenotransplantation.
Exempel
Vid analys av antalet kromosom 18-signaler i 130 granulosaceller i en follikel från en äggstock hos en 46,XX-individ förväntas det att 260 signaler är närvarande. I en 4 μm-sektion av dessa celler observerades emellertid endast 204 kromosom 18-signaler. Detta indikerar att 21,5% av signalerna går förlorade på grund av sektionering ((260-204) / 260 x 100 = 21,5%). Antalet kromosom 18-signaler per granulosacell reduceras därför till 204/130 = 1,57 på grund av snittning.
Därefter analyseras antalet X-kromosomer i granulosaceller i en antralfollikel efter ympning i äggstocksvävnad hos en kvinna med TS. Totalt räknades 191 signaler för kromosom X och 199 signaler för kromosom 18. Antalet granulosaceller kan bestämmas genom att dividera det totala antalet signaler för kromosom 18 med antalet kromosom 18-signaler per granulosacell (199/1,57 = 127 granulosaceller). Slutligen kan procentandelen 45,X granulosaceller bestämmas genom att dividera skillnaden i kromosom 18- och kromosom X-signaler med antalet granulosaceller (dvs. [199-191]/127 x 100 = 6% av granulosacellerna är 45,X och 94% av dessa celler är 46, XX).
Det är anmärkningsvärt att hos patienter med en 47,XXX cellinje är det endast möjligt att bestämma den minsta andelen granulosaceller med en 47,XXX karyotyp, eftersom en blandning av 45,X och 47,XXX granulosaceller har samma antal X-kromosomsignaler som 46,XX granulosaceller .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FISH-analys är en välkänd teknik för att detektera X-kromosomavvikelser i lymfocyter eller buckala celler hos både män och kvinnor10. Flera studier har beskrivit FISH på könsceller hos hanar med X-kromosomavvikelser, men detaljerad information som erhållits av FISH på äggstocksceller från honor med X-kromosomavvikelser saknas fortfarande14. Denna artikel presenterar nya metoder baserade på FISH för att avgöra om aneuploidi är närvarande i äggstockscellerna i icke-ympad och ympad äggstockscortexvävnad från kvinnor med X-kromosomavvikelser.
Den största utmaningen med protokollet för isolering av enskilda äggstocksceller i icke-ympad äggstockscortexvävnad ligger i den enzymatiska nedbrytningen av vävnaden, vilket kräver viss övning i förväg. För att få exakta FISH-signaler från tillräckligt många äggstocksceller är det viktigt att strikt följa stegen avseende enzymatisk matsmältning, inkubationstider och angivna temperaturer. Att avvika från protokollet kan orsaka en betydande förlust av äggstocksceller under processen, och detta bör särskilt undvikas hos patienter som redan har en låg äggstocksreserv. Ett annat kritiskt steg i denna metod är att behandla de renade primordiala folliklarna med trypsin för att förhindra att oocyter och granulosacellmassan klumpar, vilket utesluter analys av enskilda celler. Utan behandling med trypsin reduceras antalet enskilda granulosaceller som kan analyseras på ett tillförlitligt sätt av FISH kraftigt.
FISH-analysen på vävnad från äggstocksbarken som hämtats efter långvarig ympning kräver en annan teknik, eftersom endast små folliklar visade sig vara tillräckligt mottagliga för den enzymatiska nedbrytningen som är nödvändig för att erhålla enskilda äggstocksceller. Dessutom, i likhet med autotransplantation av ovariecortexvävnad, går många folliklar vilse efter ympning på grund av hypoxi och brist på näringsämnen innan transplantatet är tillräckligt revaskulariserat av värden20. Antalet folliklar efter ympning förväntas därför vara betydligt lägre än före ympning. För denna FISH-teknik som används för histologiska sektioner är det viktigt att fixera den ympade vävnaden i 4% formaldehyd endast för att få optimala FISH-signaler. Fixering av vävnad från äggstocksbarken i Bouins fixativ används rutinmässigt i laboratoriet, och även om detta ger utmärkta resultat i kombination med standard HE-färgning, leder fixering av vävnad med Bouins före FISH till svaga och suddiga fluorescerande signaler som är svåra att tolka.
Även om detta protokoll har visat sig vara framgångsrikt för att bestämma X-kromosominnehållet i äggstocksceller, har det fortfarande vissa begränsningar. En begränsning är att dessa metoder endast kan användas för att analysera äggstocksceller hos honor med numeriska avvikelser. Numeriska avvikelser kan detekteras med hjälp av sonder riktade mot repetitiva sekvenser21. Dessa sonder hybridiserar flera upprepande basparsekvenser i centromerregionen, vilket resulterar i starka hybridiseringssignaler. Däremot kan strukturella avvikelser endast detekteras genom att använda sonder mot unika enskilda sekvenser. Dessa sonder hybridiserar till sekvenser som bara förekommer en gång i det haploida genomet, vilket resulterar i en betydligt mindre intensiv FISH-signal jämfört med numeriska avvikelser. På grund av dessa relativt svaga FISH-signaler är det svårt att korrekt bestämma X-kromosominnehållet i äggstocksceller hos kvinnor med strukturella avvikelser.
För det andra är FISH-signaler från oocyter av små folliklar i icke-ympad vävnad svåra att analysera på grund av närheten av de fyra systerkromatiderna i profas av meiosI 22. Endast en stark hybridiseringssignal kommer att finnas i oocyterna, och därför är det inte möjligt att helt enkelt räkna antalet signaler i oocyterna för att bestämma X-kromosominnehållet. Istället bör ytförhållandet mellan kromosom X- och 18 FISH-signaler användas för att bestämma X-kromosominnehållet i dessa celler. Detta kan endast bestämmas på ett tillförlitligt sätt om FISH-signalerna i oocyterna är tydligt närvarande.
Dessutom kan FISH på ympad vävnad endast användas för att bestämma X-kromosominnehållet i granulosaceller från sekundära och antrala folliklar, eftersom små folliklar i histologiska sektioner av ympad vävnad endast har några få granulosaceller som kan analyseras ordentligt. Dessutom kan X-kromosominnehållet i oocyter inte bestämmas exakt med denna metod på grund av oocyternas stora diameter.
Slutligen är det fortfarande utmanande att få kvinnliga gameter jämfört med manliga gameter eftersom invasiv kirurgi krävs för att få äggstocksceller eller äggstocksbarkvävnad. Därför är det troligt att dessa metoder tillämpas i en forskningsinställning.
Sammanfattningsvis är FISH-analys av äggstocksceller av icke-ympad och ympad äggstockscortexvävnad från kvinnor med X-kromosomavvikelser en unik och användbar teknik för att få insikt i X-kromosominnehållet i äggstocksceller i denna specifika grupp. Dessa tekniker visar att kryokonservering av äggstocksbarkvävnad från kvinnor med X-kromosomavvikelser är möjlig, och att kryokonserverade primordiala folliklar kan växa till sekundära och antrala folliklar. Man bör dock komma ihåg att båda metoderna är avsedda att underlätta framtida forskning på kvinnor med X-kromosomavvikelser och inte är utformade för att användas som ett diagnostiskt verktyg för att screena reproduktionsresultat hos kvinnor med X-kromosomavvikelser i klinisk praxis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef och Milan Intezar för deras expertis och tekniska hjälp. Finansieringskällor: Merck Serono (A16-1395), Goodlife och Ferring.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
References
- Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
- Yatsenko, S. A., Rajkovic, A.
- Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).
- Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
- Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).
- Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
- Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
- Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).
- Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
- Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
- Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
- Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).
- Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
- Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
- Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
- Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
- Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
- Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).
