Summary
Bu makalede, X kromozomal anomalileri olan kadınlardan aşılanmamış ve aşılanmış over korteks dokusundaki over hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirlemek için floresan in situ hibridizasyona dayalı iki yöntem sunulmaktadır.
Abstract
Dünya çapında milyonlarca insan doğurganlıkla ilgili sorunlarla uğraşmaktadır. Azalmış doğurganlık, hatta infertilite, kromozomal anormalliklerin en yaygın olduğu genetik bozukluklar da dahil olmak üzere birçok farklı nedenden kaynaklanabilir. Floresan in situ hibridizasyon (FISH), insanlarda kromozomal anormallikleri tespit etmek için iyi bilinen ve sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. FISH esas olarak sayısal veya yapısal kromozomal anormallikleri olan erkeklerin spermatozoasındaki kromozomal anormalliklerin analizi için kullanılır. Ayrıca, bu teknik, yumurtalık disgenezine neden olduğu bilinen X kromozomal anormalliklerini tespit etmek için kadınlarda da sıklıkla uygulanır. Bununla birlikte, lenfositlerde ve / veya bukkal hücrelerde X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriği hakkında bilgi hala eksiktir.
Bu çalışmanın amacı, over hücrelerinin X kromozomal içeriğini tanımlamak için FISH'e dayalı iki yöntem sunarak kadınlarda X kromozomal anormallikleri ile ilgili temel araştırmaları ilerletmektir. İlk olarak, X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan aşılanmamış yumurtalık korteks dokusunda izole yumurtalık hücrelerinin (oositler, granüloza hücreleri ve stromal hücreler) X kromozomal içeriğini belirlemek için bir yöntem tanımlanmıştır. İkinci yöntem, uzun süreli aşılamadan sonra X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan immün sistemi baskılanmış farelere yumurtalık dokusunda yeni oluşan sekonder ve antral foliküllerin yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirleyerek kromozomal anormalliklerin folikülogenez üzerindeki etkisini değerlendirmeye yöneliktir. Her iki yöntem de X kromozomal anormallikleri olan kadınların üreme potansiyeli hakkında fikir edinmek için gelecekteki araştırmalarda yardımcı olabilir.
Introduction
Kısırlık, erkek veya kadın üreme sisteminin bir sağlık sorunudur ve dünya çapında üreme çağındaki yaklaşık 186 milyon bireyi etkilemektedir1. İnfertil çiftlerin en az% 35'inde infertilite, kadın üreme sisteminin bir bozukluğundan kaynaklanır2. Kadın infertilitesine neden olabilecek genetik faktörler, genital sistem anormallikleri, endokrin disfonksiyon, inflamatuar hastalıklar ve iyatrojenik tedavi gibi birçok faktör vardır3.
İnfertil kadınların yaklaşık %10'unda genetik anormallikler mevcuttur 4,5. Tüm genetik anormallikler arasında, X kromozomu anormallikleri yumurtalık disgenezisinin en yaygın nedenidir2. Birçok çalışma, Turner sendromu (TS) veya Triple X sendromlu kadınlarda X kromozomal anormalliklerinin, germ hücrelerinin hızlandırılmış kaybı veya bozulmuş oogenez 6,7,8 nedeniyle erken yumurtalık yetmezliği ile ilişkili olduğunu bildirmiştir.
X kromozomunun anormallikleri ayrılabilir: 1) X kromozomlarının sayısının farklı olduğu ancak X kromozomlarının sağlam olduğu sayısal sapmalar; ve 2) X kromozomunun genetik materyal kazandığı veya kaybettiği yapısal sapmalar 3,9. X kromozomunun sayısal anormallikleri yapısal anormalliklerden daha yaygındır ve genellikle hücre bölünmesi sırasındaki kendiliğinden hatalardan kaynaklanır 3,9. Mayoz sırasında böyle bir hata meydana geldiğinde, anöploid gametlere ve nihayetinde tüm hücrelerde kromozomal anormallikleri olan yavrulara yol açabilir. Ontogenezin erken evrelerinde mitoz sırasında meydana gelen hataların bir sonucu olarak somatik hücrelerde kromozom kusurları ortaya çıktığında, mozaikliğe yol açabilir. Bu bireylerde hem normal X kromozomal içeriğine sahip hücreler hem de X kromozomal anormalliklerine sahip hücreler mevcuttur.
1980'lerde, metafaz ve interfaz kromozomları10,11 üzerindeki spesifik nükleik asit dizilerini görselleştirmek ve bulmak için floresan in situ hibridizasyon (FISH) adı verilen sitogenetik bir teknik geliştirilmiştir. Bu teknik, kromozomdaki belirli bir diziye bağlanmak için floresan etiketli DNA problarını kullanır ve daha sonra bir floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilebilir.
Günümüzde, FISH klinik bir tanı aracı olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ve kromozomal anormalliklerin saptanmasında altın standart olarak kabul edilmektedir10. Üreme tıbbı alanında, sperm üzerindeki FISH analizi, somatik hücrelerde sayısal veya yapısal kromozomal anormallikleri olan erkeklerde spermatozoanın X kromozomal içeriği hakkında fikir edinmek için kullanılmıştır12,13,14. Bu çalışmalar, kromozomal anormallikleri olan erkeklerin, normal karyotipli erkeklere kıyasla menilerinde bulunan anöploid spermatozoa sıklığının daha yüksek olduğunu göstermiştir 12,13,14.
Spermatozoanın aksine, kromozomal anormalliği olan bireylerde yumurtalık hücrelerinin (oositler, granüloza / teka hücreleri ve stromal hücreler dahil) X kromozomal içeriği ve bu hücrelerin anöploidisinin üreme potansiyelleri üzerindeki olası sonuçları hakkında çok az şey bilinmektedir. Yumurtalık hücrelerinin karyotipi hakkında spermatozoaya kıyasla az bilgi bulunmasının önemli bir nedeni, kadınların oosit veya yumurtalık korteks dokusu elde etmek için folikül delinmesi veya ameliyatı gibi invaziv bir prosedürden geçmek zorunda kalmalarıdır. Bu nedenle dişi gametlerin araştırma amacıyla elde edilmesi zordur.
Şu anda, Hollanda'da TS15'li genç kadınlarda yumurtalık dokusu kriyoprezervasyonunun etkinliğini araştırmak için gözlemsel bir müdahale çalışması yapılmaktadır. Hastanın over korteks dokusunun bir parçası, over hücrelerinin X kromozomal içeriğini tanımlamak için mevcuttu16,17. Çalışmanın bir parçası olarak, lenfositler veya bukkal hücreler gibi yumurtalık dışı somatik hücrelerde kromozomal anormallik taşıyan kadınlarda yumurtalık hücrelerinde kromozomal anormalliklerin olup olmadığını belirlemek için ayrışmış yumurtalık korteks dokusunun FISH'ine dayanan yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Ayrıca yumurtalık hücrelerinde anöploidinin folikülogenez üzerine etkisi de belirlenmiştir. Bu amaçla, immün sistemi baskılanmış farelerde uzun süreli ksenotransplantasyon sırasında yapay olarak indüklenen folikülogenez sonrası yumurtalık korteks dokusunun histolojik kesitlerinin analizini sağlayan yerleşik bir FISH protokolü değiştirilmiştir. Bu çalışmada, X kromozomal anomalileri olan kadınlarda aşılanmamış ve aşılanmış over korteks dokusundaki yumurtalık hücrelerinde X kromozomal içeriğini belirlemek için FISH'e dayalı iki yöntem sunulmuş ve bu konudaki temel bilimi geliştirmek amaçlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
TurnerFertility çalışma protokolü, İnsan Denekleri İçeren Araştırma Merkez Komitesi (NL57738.000.16) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada TS'li 93 kadının yumurtalık korteks dokusu elde edilmiştir. Güvenlik önlemleri gerektiren malzemeler Tablo 1'de listelenmiştir.
Tablo 1: Güvenlik önlemleri.
| Malzeme | Tehlike | ||
| Asetik asit | Ciddi cilt yanıkları ve solunum sisteminin tahrişi | ||
| Kollajenaz | Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder | ||
| cesaret | Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder | ||
| DNaz I | Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder | ||
| Etanol | Son derece yanıcı | ||
| Formaldehit | Soluma, yutma ve cilt temasından sonra toksiktir | ||
| Formamid (floresan problarda) |
Doğmamış çocuğa zarar verebilir | ||
| Arjantin | Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder | ||
| Metanol | Son derece yanıcıdır, soluma, yutulması ve cilt teması ile toksiktir | ||
| Nonidet P40 | Cildi veya gözleri tahriş eder | ||
| Arjantin | Gözleri, solunum sistemini ve cildi tahriş eder | ||
| Proteinaz K | Soluma sonrası solunum güçlüğü | ||
| Ksilen | Son derece yanıcıdır, inhalasyon ve cilt temasından sonra toksiktir. Gözlerle temasından kaçının. | ||
Tablo 1: Güvenlik önlemi gerektiren malzemeler.
1. İzole edilmiş bireysel yumurtalık korteks hücrelerinde FISH
- Bireysel hücreler elde etmek için yumurtalık korteks dokusunun ayrışması
- Kriyoprezervasyonlu/çözülmüş yumurtalık korteks dokusunu bir neşter kullanarak yaklaşık 1 mm x 1 mm x 1 mm'lik küçük parçalara ayırın.
- C. histolyticum'dan 0.1 mg/mL doku ayrışma enzim karışımı, 10 μg/mL DNaz I ve 1 mg/mL kollajenaz I içeren 4 mL önceden ısıtılmış (37 °C) L15 besiyerinde doku fragmanlarını 37 °C'de maksimum 75 dakika boyunca enzimatik olarak sindirin. Çürütme karışımını her 15 dakikada bir yukarı ve aşağı doğru pipetin.
- % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 4 mL soğuk L15 ekleyerek enzimatik sindirimi durdurun. Ayrışmış dokuyu bir kez 8 mL soğuk L15 ortamı ile 500 x g'de santrifüjleme ile yıkayın ve hücrelere zarar vermemek için vorteks olmadan 500 μL L15 ortamında tekrar askıya alın.
- Büyük ölçüde bireysel stromal hücreler ve küçük foliküller (tek bir granüloza hücresi tabakası ile çevrili oositler) içeren hücre süspansiyonunu plastik bir Petri kabına aktarın ve hücre süspansiyonunu stereomikroskop altında inceleyin (100x büyütme).
- 75 μm'lik plastik pipet kullanarak küçük folikülleri (<50 μm) manuel olarak toplayın ve foliküllerin birikmesini önlemek için folikülleri 4 °C'de %10 FBS ile desteklenmiş bir L15 ortam damlacığına aktarın. En fazla 30 dakika boyunca folikül toplama işlemini gerçekleştirin. FISH analizinden önce foliküler hücre yayılımını iyileştirmek için, saflaştırılmış folikülleri% 0.06 tripsin, 1 mg / mL etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 1 mg / mL glikoz çözeltisine aktarın ve 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
- Küçük foliküllerle kontaminasyonu önlemek için özel dikkat göstererek 75 μm'lik plastik pipet kullanarak korteks hücresi süspansiyonundan yumurtalık stromal hücreleri elde edin.
- Bireysel yumurtalık hücresinin FISH analizi
- Tripsin / EDTA / glikoz veya stromal hücreler (n > 1.000) ile tedavi edilen yumurtalık foliküllerini (önerilen n = 5-20) bir slayt üzerinde 5 μL 0.15 mM KCl / 15 μL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) damlacıklarına aktarın ve 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
- Slaytları 300 μL 0,05 mM KCl/%7,5 asetik asit/%22,5 metanol içinde oda sıcaklığında (RT) 2 dakika kurutun ve önceden sabitleyin. Fiksasyonu tamamlamak için slaytları RT'de 2 dakika boyunca metanol / asetik asit (3: 1) ile örtün.
- 5 L damıtılmış suya 876 g sodyum klorür ve 441 g tri-sodyum sitrat dihidrat ekleyerek 20x standart sodyum sitrat (SSC) yapın. Daha sonra, 2x SSC elde etmek için 900 mL demineralize (demi) suya 20x SSC'nin 100 mL'sini ekleyin. Numuneyi 73 °C'de 2x SSC'de yıkayın, 100 μL% 2 proteinaz K ile örtün ve bir kapak kayması ile kapatın. Slaytları hibridizasyon istasyonunda 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
- Kapak kapağını çıkarın ve slaytları RT'de DPBS'de 5 dakika yıkayın. Bu aşamada, malzeme henüz cam kızaklara tam olarak tutturulmamıştır ve bu nedenle bir sallama platformuna yerleştirilmemelidir.
- Slaytları RT'de DPBS'de 5 dakika boyunca yıkayın, ardından her biri 2 dakika boyunca% 70,% 80,% 90 ve% 100 etanolde dehidrasyon yapın. Susuz bırakılmış numuneyi havayla kurutun ve floresan etiketli problarla hibritleştirin.
- Yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirlemek için kontrol olarak X kromozomu için sentromere özgü bir prob ve başka bir kromozoma özgü sentromerik prob seçin. Bu durumda, doğrudan florokrom SpectrumGreen ile etiketlenmiş kromozom X (CEP X [DXZ1]) ve doğrudan florokrom SpectrumOrange ile etiketlenmiş kromozom 18 (CEP 18 [D18Z1]) için sentromere özgü problar kullanılır.
- Numuneye 1 μL CEP X, 1 μL CEP 18 ve 18 μL hibridizasyon tamponu ekleyin ve hibridizasyon sırasında probun buharlaşmasını önlemek için slaytlara yapıştırılmış bir kapak kayması ile kapatın. Slaytları 3 dakika boyunca 73 ° C'de denatürasyon için hibridizasyon istasyonuna aktarın, ardından 37 ° C'de bir gece inkübasyonu sırasında hibridizasyon yapın.
- Hibridizasyondan sonra kapak kaymasını ve kalan yapıştırıcıyı slayttan çıkarın. Slaytları 2 dakika boyunca 72 ° C'de 0.4x SSC / % 0.3 Ara-20'de yıkayın, ardından RT'de 2x SSC /% 0.1 Ara-20'de 1 dakika inkübasyon yapın.
- Slaytları% 70,% 80,% 90 ve% 100 etanolde 2 dakikalık inkübasyonlarla kurutun ve karanlıkta hava kurutun. Slaytları 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren bir montaj ortamı ile örtün. Floresan mikroskobu ile analizden önce -20 ° C'de en az 10 dakika bekletin.
- Görüntüleme
- X kromozomu için sinyalleri, bir görüntü işleme yazılımına bağlı bir floresan mikroskobu ile inceleyin.
- İlk olarak, florokrom DAPI'yi seçin.
- 630x büyütmede Yeni Hücre > Canlı > Yakalama'yı seçerek bir görüntü elde edin. Eşiği olan yeni bir pencere açılacaktır. Arka planı simge durumuna küçültmek için eşiğin mavi çubuğunu 0 olarak ve sinyalleri daha parlak hale getirmek için kırmızı çubuğu maksimum (255) olarak ayarlayın. Kabul Et'e tıklayın.
- Daha koyu/daha parlak (12), yarıçap (3) ve derinlik (1) için bir öneri içeren iyileştirme içeren yeni bir pencere görünecektir. Önerilen değerleri kullanın veya memnun kalmazsanız ayarlayın.
- İkinci olarak, florokrom SpectrumOrange'ı seçin ve Yakala'ya tıklayın.
- Arka planı simge durumuna küçültmek için eşiğin mavi çubuğunu 0 olarak ve sinyalleri daha parlak hale getirmek için kırmızı çubuğu maksimum (255) olarak ayarlayın. Kabul Et'e tıklayın.
- İyileştirme içeren pencere, daha koyu/daha parlak (-11), yarıçap (2,7) ve derinlik (0,6) için bir öneriyle birlikte görünür. Önerilen değerleri kullanın veya memnun kalmazsanız ayarlayın.
- Son olarak, florokrom SpectrumGreen'i seçin ve Yakala'ya tıklayın.
- Arka planı simge durumuna küçültmek için eşiğin mavi çubuğunu 0 olarak ve sinyalleri daha parlak hale getirmek için kırmızı çubuğu maksimum (255) olarak ayarlayın. Kabul Et'e tıklayın.
- İyileştirme içeren pencere, daha koyu/daha parlak (0), yarıçap (3) ve derinlik (0) için bir öneri içeren bir öneriyle birlikte görünür. Önerilen değerleri kullanın veya memnun kalmazsanız ayarlayın. Görüntüyü yeni oluşturulan bir dosyaya kaydedin.
NOT: Somatik hücreler sadece kontrol kromozomu 18'in iki sinyali görünür olduğunda değerlendirildi. Çoğu oositte, her kromozom için sadece bir sinyal tespit edilebilir.
- İlk olarak, florokrom DAPI'yi seçin.
- Sinyal kaybını önlemek için slaytları analizden sonra karanlıkta 4 ° C'de saklayın.
- X kromozomu için sinyalleri, bir görüntü işleme yazılımına bağlı bir floresan mikroskobu ile inceleyin.
2. Aşılanmış yumurtalık korteks dokusunun parafin kesitleri üzerinde FISH
NOT: TS'li 18 dişinin kriyoprezervasyonlu/çözülmüş yumurtalık korteks dokusunun bir parçası, 5 ay boyunca şiddetli kombine immün yetmezlikli (SCID) farelere ksenograf edildi. Ksenografting prosedürü daha önce tanımlanmış ve Université Catholique de Louvain'de (Brüksel, Belçika) Hayvan Araştırmaları Komitesi'nin hayvan refahı ile ilgili yerel yönergelerini izleyerek gerçekleştirilmiştir (referans 2014 / UCL / MD / 007) 18,19.
- Folikül içeren ksenograflı over korteks dokusunun bölümlerinin seçilmesi
- Ksenograflı over korteks dokusunu %4 formaldehit içinde sabitleyin ve dokuyu parafin içine yerleştirin. Ekstra parafini çıkarmak için blokları bir neşterle kesin ve parafin bloğunu bir dönme mikrotomunda 4 μm kalınlığa kesin.
- Hangi bölümlerin folikül içerdiğini belirlemek için hematoksilin ve eozin (HE) boyaması için parafin şeridinin her yedinci bölümünü seçin. Bölümü 40-45 ° C'de bir su banyosuna koyun ve immünohistokimya mikroskop slaytlarına monte edin.
- Deparafinizasyon ve HE boyama
- Slaytları 60 ° C'de 10 dakika boyunca bir sobaya koyun ve daha sonra slaytları 5 dakika boyunca% 100 ksilene batırın. Slaytları doğrudan sobanın üzerine yerleştirmek gerekli değildir. Bölümleri %100 etanolde 15 sn, ardından %96 etanolde 2 x 15 sn nemlendirin. Slaytları musluk suyunda 2 dakika durulayın.
- Slaytları hematoksilin içinde 10 dakika boyunca lekeleyin ve daha sonra slaytları musluk suyunda kısaca durulayın. Slaytları kısaca bir bikarbonat çözeltisine daldırın (5 L damıtılmış suya 100 g magnezyum sülfat ve 10 g sodyum bikarbonat). Slaytları musluk suyunda 5 dakika durulayın.
- Slaytları 4 dakika boyunca eozin ile karşı boyayın ve slaytları% 100 etanol, ardından ksilen ile üç kez dehidre edin. Slaytlardaki HE lekelerini örtün ve foliküllü bölümleri seçmek için HE bölümlerini ışık mikroskobu altında değerlendirin (100x büyütme).
- DNA FISH için parafin kesitlerinin ön işlemi ve hibridizasyonu
- Parafin şeritten foliküller içeren bölümden önce veya sonra yatan yeni bölümleri seçin. Bir bölümü cam slayta monte edin. Parafin bölümlerini 56 °C'de bir ocakta en az 45 dakika kurutun. Slaytları doğrudan sobanın üzerine yerleştirmek gerekli değildir.
- Ksilen içindeki bölümleri 10 dakika boyunca ayırın. Slaytları% 99.5 etanol içine batırın ve musluk suyunda 5 dakika durulayın. Slaytları 96 ° C'de 10 dakika boyunca hedef alma çözeltisi (düşük pH) ile ön işlemden geçirin. Soğuduktan sonra, slaytları damıtılmış suda durulayın.
- Slaytları 5 dakika boyunca 0.01 M hidroklorik asit ile tedavi edin, ardından 37 ° C'de 15 dakika boyunca pepsin sindirimi (200 U / mL) izleyin. Slaytları tekrar 0,01 M hidroklorik asitte ve daha sonra PBS'de durulayın.
- Slaytları %1 formaldehit/PBS ile 5 dakika sabitleyin. Slaytları PBS'de kısaca durulayın ve sonra tekrar yarı suda durulayın. Slaytları% 99.5 etanol içinde kurutun ve havayla kurumasını bekleyin.
- Granüloza hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirlemek için kontrol olarak X kromozomu için bir sentromere özgü prob ve başka bir kromozoma özgü sentromerik prob seçin. Burada, kromozom 18 kontrol olarak kullanılır.
- Doğrudan florokrom SpectrumGreen ile etiketlenmiş 5 μL prob CEP 18 (D18Z1) ve önceden işlenmiş slaytlara doğrudan florokrom SpectrumRed ile etiketlenmiş CEP X (DXZ1) probu uygulayın. Bir kapak fişi uygulayın ve alanı fotoğraf yapıştırıcı ile kapatın. Slaytları 10 dakika boyunca 80 ° C'de denatürasyon ve 37 ° C'de gece boyunca hibridizasyon için bir hibridizatöre yerleştirin.
- Ertesi gün, slaytları 42 ° C'de 2x SSC'de 5 dakika durulayın, ardından 73 ° C'de% 0.3 Nonidet P40'ta 2 dakika ve 1 dakika durulayın. 2x SSC'yi yenileyin ve slaytları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca tekrar durulayın. Bölmelerin karanlıkta kalması için küveti örtün.
- Slaytları damıtılmış suda kısaca durulayın. Slaytları% 99.5 etanol içinde kurutun ve tekrar hava kurumasını bekleyin. Son olarak, slaytları DAPI ve montaj ortamı içeren bir çözelti ile monte edin.
- Görüntüleme
- Sonuçları 630x büyütmede floresan mikroskobu altında analiz edin. Bilgisayarda görüntü işleme yazılımını açın. Profil olarak FISH'i seçin.
- DAPI emisyonunun 431 nm ve uyarımın 359 nm, Teksas kırmızı emisyonunun 613 nm ve uyarmanın 595 nm ve FITC emisyonunun 519 nm ve uyarımın 495 nm olarak ayarlanıp ayarlanmadığını kontrol edin.
- Canlı > Tek Görüntü Yakala'yı seçerek bir görüntü elde edin. Soldaki Görüntü menüsündeki Pozlama Kaydırıcısı ve Kazanç Kaydırıcısı'nı hareket ettirerek pozlamayı ve kazancı ayarlayarak görüntü kalitesini optimize edin (ör. pozlama: 212 ms ve kazanç: 7,9). Gerekli pozlama ve kazanç görüntüye göre değişebilir; En iyi duruma getirilmiş bir görüntü elde etmek için bu işlem sırasındaki değişiklikleri gözlemleyin. Görüntüyü yeni oluşturulan bir dosyaya kaydedin.
- Sinyal kaybını önlemek için slaytları analizden sonra karanlıkta 4 ° C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aşılamadan önce izole edilmiş yumurtalık hücrelerinde FISH
Bu protokol kullanılarak elde edilen sonuçları göstermek için 45,X/46,XX (hasta A) veya 45,X/46,XX/47,XXX (hasta B) TS'li kadınlardan kriyokorunmuş over korteks dokusu kullanıldı. Hasta A'da lenfositlerin %50'sinde 45,X karyotip, %50'sinde 46,XX karyotip saptandı. B hastasında lenfositlerin %38'i 45,X, %28'i 46,XX ve %34'ü 47,XXX idi. Kontrol (kırmızı) olarak X kromozomu (yeşil) ve kromozom 18 için sentromere özgü problar, TS hastalarının yumurtalık korteks dokusundan izole edilen bireysel granüloza hücrelerinin, stromal hücrelerin ve oositlerin X kromozomal içeriğini önceden ksenotransplantasyon yapılmadan belirlemek için kullanıldı (Şekil 1).
Şekil 1: Aşılamadan önce yumurtalık korteks dokusundan izole edilmiş yumurtalık hücrelerinin FISH analizi. Tek primordial foliküllerden (A,B) ve (C,D) çevreleyen stromal hücrelerden oositler (ok başları) ve granüloza hücreleri, kromozom X (yeşil sinyaller) ve kontrol kromozomu 18 (kırmızı sinyaller) için floresan spesifik problarla analiz edildi. Beyaz oklar 45,X hücre satırlarını, sarı oklar 46,XX hücre satırlarını ve kırmızı oklar 47,XXX hücre satırlarını gösterir. Tüm floresan sinyalleri aynı odak düzleminde değildir. Çubuklar 10 μm'yi temsil eder. FISH sinyallerinin büyütme oranı 630x olarak ayarlandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
FISH'ten önce tripsin ile ve tripsin olmadan tedavi edilen bireysel primordial foliküller arasındaki farklar Şekil 2'de gösterilmiştir. FISH analizinden önce tripsin kullanılarak, granüloza hücre kütlesi ve oositler daha az kümelenmiştir, bu da bireysel granüloza hücrelerinin ve oositlerin X kromozomal içeriğinin analizine izin vermiştir. Oositlerin DNA'sı, DNA'nın düzensiz şekli, büyüklüğü ve oositlerden dağınık görünümü nedeniyle çevredeki granüloza hücrelerininkinden kolayca ayırt edilebilir. Ek olarak, bu hücrelerdeki dört kardeş kromatitin yakınlığı nedeniyle, küçük foliküllerin oositlerinde her kromozom için sadece bir güçlü FISH sinyali gözlenir. Oositlerin X kromozomal içeriği, X kromozomu için FISH sinyalinin kromozom 18'inkine yüzey oranı kullanılarak belirlenebilir.
Şekil 2: FISH'ten önce tripsin ile ve tripsin olmadan tedavi edilen küçük foliküller. (A) Yumurtalık korteks dokusunun enzimatik sindirimi, büyük ölçüde ayrışmış hücrelerin süspansiyonu ile sonuçlandı, ancak tek bir granüloza hücresi tabakası (panel A'daki ok başları) ile çevrili sağlam bir oositten oluşan ilkel folikülleri bıraktı. (B) Küçük foliküller hücre süspansiyonundan elle seçildi, ancak granüloza hücrelerinin (C) kümelenmesi nedeniyle FISH'ten sonra sinyalleri yorumlamada zorluklar sağladı. (D,E) İzole edilmiş foliküllerin FISH'ten önce tripsin ile ilave sindirimi, bireysel granüloza hücrelerinin foliküllerin yüzeyinde küresel bir morfolojiye büzülmesine neden oldu ve FISH analizi için erişilebilir hale gelmek için folikülden ayrışma olasılığı daha yüksekti. Oosit kaynaklı FISH sinyalleri oklarla gösterilir. Siyah çubuklar 100 μm'yi ve beyaz çubuklar 10 μm'yi temsil eder. FISH sinyallerinin büyütülmesi 630x olarak ayarlandı. Panel D, Peek ve arkadaşlarının izniyle çoğaltılmıştır.16. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Aşılanmış over korteks dokusunun parafin kesitleri üzerindeki granüloza hücrelerinin FISH analizi
Sekonder ve antral foliküllerin enzimatik sindirime daha az duyarlı olduğu bulunmuştur, bu da bireysel yumurtalık hücrelerini elde etmek için daha önce tarif edilen doku ayrışma yöntemini, uzun süreli ksenograflamadan sonra yumurtalık dokusunda bulunan foliküllerin büyümesi için uygun değildir. Bu nedenle, FISH protokolü, aşılama sonrası over korteks dokusundaki sekonder ve antral foliküllerin granüloza hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirlemek için 4 μm histolojik kesitler kullanılarak optimize edilmiştir (Şekil 3). Bu ortamda, X kromozomunun veya oositlerdeki kontrol kromozomunun FISH sinyalinin, büyüyen foliküllerdeki büyük yumurta çapı nedeniyle, tek bir 4 μm bölümünde yakalanması olası değildir.
Şekil 3: Ksenotransplantasyon sonrası over korteks doku kesitlerinin histolojik ve FISH boyaması. (A,B) Hematoksilin/eozin boyamasında 5 aylık ksenograflama sonrası over korteks dokusunda morfolojik olarak normal sekonder ve antral foliküller saptandı. (C,D) Bu foliküllerin granüloza hücrelerinin X kromozomal içeriği FISH analizi ile belirlendi. Bu şekilde, X kromozomu kırmızı ve kromozom 18 yeşil renkte gösterilmiştir. A panelindeki çubuk 50 μm'yi, B panelindeki çubuk 20 μm'yi ve C ve D panellerindeki çubuklar 10 μm'yi temsil eder. FISH sinyallerinin büyütme oranı 630x olarak ayarlandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
İlk adım olarak, hangi yöntemin en iyi FISH sinyalleriyle sonuçlandığını belirlemek için dokuların farklı sabitleme teknikleriyle deneyler yapıldı. FISH analizi, hem Bouin solüsyonuna sabitlenmiş hem de daha sonra% 4 formaldehit içine batırılmış aşılanmış doku ve sadece% 4 formaldehit içine sabitlenmiş aşılanmış doku üzerinde gerçekleştirildi. İlk olarak Bouin'e sabitlenen aşılanmış doku, görüntüde yeşil bir pus gösterdi ve bu da FISH sinyallerinin sayısını doğru bir şekilde saymayı zorlaştırdı (Şekil 4).
Şekil 4: Aşılanmış yumurtalık korteks dokusu sadece Bouin çözeltisine ve formaldehitine sabitlenmiştir. (A) Bouin çözeltisindeki aşılanmış yumurtalık korteks dokusunun sabitlenmesi, yeşil bir pus nedeniyle foliküler hücrelerde bulanık ve büyük ölçüde gizlenmiş floresan sinyallerle sonuçlandı. (B) Formaldehit içine sabitlenmiş yumurtalık korteks dokusu sadece yorumlanması kolay mükemmel floresan sinyalleri sağladı. Çubuklar 10 μm'yi temsil eder. FISH sinyallerinin büyütme oranı 630x olarak ayarlandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Histolojik kesitlerde foliküllerin granüloza hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirlemek için, granüloza hücrelerinin FISH sinyallerini basitçe saymak mümkün değildir. Tek bir granüloza hücresinin kromozomlarının bir kısmı, dokunun bölümlenmesi nedeniyle belirli bir histolojik bölümde kaybolabilir. Bu nedenle, doku greftlenmesinden sonra yeni oluşan sekonder ve antral foliküllerde anöploidiye bağlı granüloza hücre popülasyonunun X kromozomal içeriğinin kaybını belirlemeden önce, kesitleme nedeniyle kaybedilen FISH sinyallerinin yüzdesini belirlemek gerekir.
Kesitleme nedeniyle kaybedilen FISH sinyallerinin yüzdesi, anöploid olmayan kontrol kromozomu 18'in granüloza hücresi başına FISH sinyallerinin sayısı belirlenerek hesaplanabilir. Kesitleme nedeniyle X kromozomunun aynı yüzdesinin kaybolması beklenir. Granüloza hücre popülasyonundaki X kromozomu FISH sinyallerinin sayısındaki herhangi bir ek azalma, anöploididen kaynaklanmaktadır. Bununla birlikte, anöploidiye bağlı X kromozomal kaybını belirlemek için bir kontrol kromozomunun FISH sinyallerinin kullanılması, X kromozomunun FISH sinyallerinin tespit hassasiyetini ve kontrol kromozomunun çok benzer olmasını gerektirir. Bu nedenle, anöploid olmayan 46,XX bireylerin histolojik kesitlerinde büyüyen foliküllerin granüloza hücrelerinde her iki FISH sondasının saptanma duyarlılığı belirlenmiştir. Kromozom X / kontrol kromozomu FISH sinyallerinin oranı 1'e yakın olduğunda, her iki probun tespit hassasiyetinin gerçekten çok benzer olduğu ve FISH problarının, ksenotransplantasyon sonrası yumurtalık dokusunun histolojik kesitlerinde büyüyen foliküllerin granüloza hücre popülasyonundaki anöploidi seviyesini belirlemek için kullanılabileceği varsayılabilir.
Örnek
46,XX bireyin yumurtalıklarından bir folikülün 130 granüloza hücresindeki kromozom 18 sinyallerinin sayısını analiz ederken, 260 sinyalin mevcut olması beklenir. Bununla birlikte, bu hücrelerin 4 μm'lik bir bölümünde, sadece 204 kromozom 18 sinyali gözlendi. Bu, sinyallerin %21,5'inin kesitleme nedeniyle kaybolduğunu gösterir ((260-204)/260 x 100 = %21,5). Bu nedenle, granüloza hücresi başına kromozom 18 sinyalinin sayısı, kesitleme nedeniyle 204/130 = 1.57'ye düşürülür.
Daha sonra, TS'li bir dişinin yumurtalık dokusunda greftleme yapıldıktan sonra bir antral folikülün granüloza hücrelerindeki X kromozomlarının sayısı analiz edilir. Toplamda, X kromozomu için 191 sinyal ve kromozom 18 için 199 sinyal sayıldı. Granüloza hücrelerinin sayısı, kromozom 18 için toplam sinyal sayısının, granüloza hücresi başına kromozom 18 sinyal sayısına bölünmesiyle belirlenebilir (199/1.57 = 127 granüloza hücresi). Son olarak, 45,X granüloza hücrelerinin yüzdesi, kromozom 18 ve kromozom X sinyallerindeki farkın granüloza hücrelerinin sayısına bölünmesiyle belirlenebilir (yani, [199-191]/127 x 100 = granüloza hücrelerinin% 6'sı 45,X ve bu hücrelerin% 94'ü 46, XX'tir).
47,XXX hücre hattına sahip hastalarda, 45,X ve 47,XXX granüloza hücrelerinin karışımı 46,XX granüloza hücreleri ile aynı sayıda X kromozom sinyaline sahip olduğundan, sadece 47,XXX karyotipli granüloza hücrelerinin minimum yüzdesini belirlemek mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FISH analizi, hem erkek hem de kadınların lenfositlerinde veya bukkal hücrelerinde X kromozomal anormalliklerini tespit etmek için iyi bilinen bir tekniktir10. Birçok çalışma, X kromozomal anormallikleri olan erkeklerin gametleri üzerinde FISH'i tanımlamıştır, ancak FISH tarafından X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan yumurtalık hücreleri hakkında elde edilen ayrıntılı bilgiler hala14'ten yoksundur. Bu makalede, X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan alınan aşılanmamış ve aşılanmış over korteks dokusunun yumurtalık hücrelerinde anöploidi bulunup bulunmadığını belirlemek için FISH'e dayalı yeni yöntemler sunulmaktadır.
Aşılanmamış yumurtalık korteks dokusunda bireysel yumurtalık hücrelerinin izolasyonu için protokolün ana zorluğu, önceden biraz pratik gerektiren dokunun enzimatik sindiriminde yatmaktadır. Yeterli yumurtalık hücrelerinin doğru FISH sinyallerini elde etmek için, enzimatik sindirim, kuluçka süreleri ve belirtilen sıcaklıklarla ilgili adımları kesinlikle takip etmek önemlidir. Protokolden sapmak, işlem sırasında önemli miktarda yumurtalık hücresi kaybına neden olabilir ve bu, özellikle düşük yumurtalık rezervine sahip hastalarda kaçınılmalıdır. Bu yöntemdeki bir diğer kritik adım, oositlerin ve granüloza hücre kütlesinin kümelenmesini önlemek için saflaştırılmış ilkel foliküllerin tripsin ile tedavi edilmesidir, bu da bireysel hücrelerin analizini engeller. Tripsin ile tedavi olmadan, FISH tarafından güvenilir bir şekilde analiz edilebilen bireysel granüloza hücrelerinin sayısı ciddi şekilde azalır.
Uzun süreli aşılamadan sonra elde edilen yumurtalık korteks dokusu üzerindeki FISH analizi, farklı bir teknik gerektirir, çünkü sadece küçük foliküllerin, bireysel yumurtalık hücrelerini elde etmek için gerekli olan enzimatik sindirime yeterince duyarlı olduğu bulunmuştur. Ek olarak, yumurtalık korteks dokusunun ototransplantasyonuna benzer şekilde, birçok folikül, hipoksi ve greft konakçı tarafından yeterince revaskülarize edilmeden önce besin eksikliği nedeniyle aşılamadan sonra kaybolur20. Bu nedenle aşılama sonrası folikül sayısının aşılama öncesinden çok daha düşük olması beklenmektedir. Histolojik kesitler için kullanılan bu FISH tekniği için, aşılanmış dokunun sadece optimal FISH sinyalleri elde etmek için% 4 formaldehit içinde sabitlenmesi önemlidir. Bouin'in fiksatifinde yumurtalık korteks dokusunun fiksasyonu laboratuvarda rutin olarak kullanılır ve bu, standart HE boyama ile birleştirildiğinde mükemmel sonuçlar verirken, dokuyu FISH'ten önce Bouin'in ile sabitlemek, yorumlanması zor olan zayıf ve bulanık floresan sinyallere yol açar.
Bu protokolün yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirlemede başarılı olduğu kanıtlanmış olmasına rağmen, hala bazı sınırlamaları vardır. Bir sınırlama, bu yöntemlerin yalnızca sayısal anormallikleri olan kadınların yumurtalık hücrelerini analiz etmek için kullanılabilmesidir. Sayısal sapmalar, tekrarlayan dizilere yönelik problar kullanılarak tespit edilebilir21. Bu problar, sentromer bölgesinde birden fazla tekrarlanan baz çifti dizisini hibridize ederek güçlü hibridizasyon sinyalleri ile sonuçlanır. Buna karşılık, yapısal sapmalar yalnızca benzersiz tek sekanslara karşı problar kullanılarak tespit edilebilir. Bu problar, haploid genomda sadece bir kez meydana gelen dizilere melezleşir ve sayısal sapmalara kıyasla çok daha az yoğun bir FISH sinyali ile sonuçlanır. Bu nispeten zayıf FISH sinyalleri nedeniyle, yapısal anormallikleri olan kadınlarda yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriğini doğru bir şekilde belirlemek zordur.
İkincisi, aşılanmamış dokudaki küçük foliküllerin oositlerinin FISH sinyallerinin, mayoz I22'nin fazındaki dört kardeş kromatidin yakınlığı nedeniyle analiz edilmesi zordur. Oositlerde sadece bir güçlü hibridizasyon sinyali bulunacaktır ve bu nedenle X kromozomal içeriğini belirlemek için oositlerdeki sinyal sayısını saymak mümkün değildir. Bunun yerine, bu hücrelerdeki X kromozomal içeriğini belirlemek için X kromozomu ve 18 FISH sinyallerinin yüzey oranı kullanılmalıdır. Bu ancak oositlerdeki FISH sinyalleri açıkça mevcutsa güvenilir bir şekilde belirlenebilir.
Ayrıca, aşılanmış doku üzerindeki FISH sadece sekonder ve antral foliküllerden granüloza hücrelerinin X kromozomal içeriğini belirlemek için kullanılabilir, çünkü aşılanmış dokunun histolojik kesitlerindeki küçük foliküller sadece uygun şekilde analiz edilebilen birkaç granüloza hücresine sahiptir. Ayrıca yumurtaların X kromozomal içeriği, yumurtaların çaplarının büyük olması nedeniyle bu yöntem kullanılarak doğru bir şekilde belirlenememektedir.
Son olarak, erkek gametlere kıyasla dişi gametleri elde etmek zor olmaya devam etmektedir, çünkü yumurtalık hücreleri veya yumurtalık korteks dokusu elde etmek için invaziv cerrahi gereklidir. Bu nedenle, bu yöntemlerin bir araştırma ortamında uygulanması muhtemeldir.
Sonuç olarak, X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan aşılanmamış ve aşılanmış yumurtalık korteks dokusunun yumurtalık hücrelerinin FISH analizi, bu spesifik gruptaki yumurtalık hücrelerinin X kromozomal içeriği hakkında fikir edinmek için benzersiz ve yararlı bir tekniktir. Bu teknikler, X kromozomal anormallikleri olan kadınlardan yumurtalık korteks dokusunun kriyoprezervasyonunun mümkün olduğunu ve kriyokorunmuş primordial foliküllerin sekonder ve antral foliküllere büyüyebildiğini göstermektedir. Bununla birlikte, her iki yöntemin de X kromozomal anormallikleri olan kadınlarda gelecekteki araştırmaları kolaylaştırmayı amaçladığı ve klinik uygulamada X kromozomal anormallikleri olan kadınların üreme sonuçlarını taramak için bir tanı aracı olarak kullanılmak üzere tasarlanmadığı akılda tutulmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef ve Milan Intezar'a uzmanlıkları ve teknik yardımları için teşekkür eder. Finansman kaynakları: Merck Serono (A16-1395), Goodlife ve Ferring.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
References
- Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
- Yatsenko, S. A., Rajkovic, A.
- Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).
- Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
- Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).
- Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
- Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
- Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).
- Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
- Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
- Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
- Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).
- Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
- Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
- Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
- Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
- Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
- Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).
