Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Immunfarvningsbaseret påvisning af dynamiske ændringer i proteiner fra røde blodlegemer

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64843
Automatic Translation
1, 2
1Department of Molecular and Cellular Sports Medicine, German Sport University Cologne, 2Biorheology Research Laboratory, Menzies Health Institute, Griffith University Gold Coast

Summary

Registrering af dynamiske ændringer i proteinaktiveringen af enukleerede røde blodlegemer udgør metodologiske udfordringer, som bevarelse af dynamiske ændringer i akutte stimuli til senere vurdering. Den præsenterede protokol beskriver prøveforberedelse og farvningsteknikker, der muliggør konservering og analyse af relevante proteinændringer og efterfølgende påvisning.

Abstract

Antistofmærkning af proteiner med røde blodlegemer (RBC) er en almindeligt anvendt, semikvantitativ metode til påvisning af ændringer i det samlede proteinindhold eller akutte ændringer i proteinaktiveringstilstande. Det letter vurderingen af RBC-behandlinger, karakterisering af forskelle i visse sygdomstilstande og beskrivelse af cellulære kohærenser. Påvisning af akut ændret proteinaktivering (f.eks. gennem mekanotransduktion) kræver tilstrækkelig prøveforberedelse for at bevare ellers midlertidige proteinmodifikationer. Det grundlæggende princip omfatter immobilisering af målbindingsstederne for de ønskede RBC-proteiner for at muliggøre den indledende binding af specifikke primære antistoffer. Prøven behandles yderligere for at sikre optimale betingelser for binding af det sekundære antistof til det tilsvarende primære antistof. Udvælgelsen af ikke-fluorescerende sekundære antistoffer kræver yderligere behandling, herunder biotin-avidin-kobling og anvendelse af 3,3-diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB) for at udvikle farvningen, som skal kontrolleres i realtid under et mikroskop for at stoppe oxidationen og dermed farvningsintensiteten til tiden. Til detektion af farvningsintensitet tages billeder ved hjælp af et standard lysmikroskop. I en modifikation af denne protokol kan et fluoresceinkonjugeret sekundært antistof anvendes i stedet, hvilket har den fordel, at der ikke er behov for yderligere udviklingstrin. Denne procedure kræver imidlertid et fluorescensmål fastgjort til et mikroskop til farvningsdetektion. I betragtning af disse metoders semikvantitative karakter er det bydende nødvendigt at tilvejebringe flere kontrolpletter for at tage højde for ikke-specifikke antistofreaktioner og baggrundssignaler. Her præsenterer vi både farvningsprotokoller og de tilsvarende analytiske processer for at sammenligne og diskutere de respektive resultater og fordele ved de forskellige farvningsteknikker.

Introduction

Røde blodlegemer (RBC'er) krydser det kardiovaskulære system i 70 til 140 dage med en gennemsnitlig RBC-alder på ca. 115 dage 1,2. Senescerende eller beskadigede RBC'er fjernes fra cirkulationen ved erythrofagocytose, en effektiv clearingproces drevet af makrofager3. Den forudbestemte levetid for disse celler er en konsekvens af overgivelse af celleorganellerne, herunder kernen, mitokondrier og ribosomer, under differentiering og modning4. Således er cirkulerende RBC'er blottet for et translationelt maskineri, der udelukker syntese af nye proteiner3. Det følger heraf, at dynamiske, posttranslationelle modifikationer af eksisterende proteiner repræsenterer den eneste levedygtige mekanisme for akut, biokemisk regulering som reaktion på ekstracellulære og intracellulære stressorer, der virker på RBC'er5.

Mekaniske kræfter synes at være de vigtigste ekstracellulære signaler, der forårsager aktivering eller modulering af biokemiske veje inden for RBC'er. Opdagelsen af det mekanofølsomme protein, Piezo1, i RBC-membraner6 inspirerede flere forskningslinjer, der undersøgte mekanisk aktiveret signalering i disse celler7. For eksempel har nylige fremskridt vist, at RBC'ernes fysiske egenskaber reguleres aktivt af akutte og dynamiske ændringer af proteiner8, som omfatter posttranslationel phosphorylering og ubiquitination9. Da disse normale modifikationer adskiller sig i visse sygdomme 9,10,11, synes det at være af videnskabelig og klinisk interesse at bestemme aktiveringstilstanden for RBC-proteiner, specifikt i forhold til mekanobiologiske processer.

Bestemmelsen af akutte ændringer i RBC-proteinaktiveringstilstande udgør nogle metodologiske udfordringer. For eksempel kræver opbevaring af RBC-prøver til senere analyse konservering af de modificerede RBC-proteiner, da posttranslationelle modifikationer er ikke-holdbare. Desuden er klassiske proteindetekteringsmetoder (f.eks. Western blotting) notorisk vanskelige at standardisere i RBC'er på grund af den lave overflod af proteiner i forhold til hæmoglobin, som tegner sig for ~ 98% af proteinindholdet i disse celler12. Antistofbaseret farvning af kemisk konserverede RBC'er har således været den foretrukne metode til undersøgelse af akutte modifikationer af vigtige RBC-proteiner, såsom den RBC-specifikke isoform af nitrogenoxidsyntase (RBC-NOS)13,14. RBC-NOS har vist sig enzymatisk at producere nitrogenoxid (NO), hvilket synes uundværligt for væsentlige RBC-egenskaber, herunder RBC-deformerbarhed15,16,17. Posttranslationelle modifikationer af RBC-NOS regulerer katalytisk enzymaktivitet, idet phosphorylering af serin 1177-resten beskrives for at øge enzymaktiviteten, mens phosphorylering af resterne serin 114 eller threonin 495 er blevet forbundet med nedsat RBC-NOS-aktivitet18,19.

Samlet set bidrager midlertidige modifikationer af RBC-proteiner til vigtig cellulær funktion, og standardiserede protokoller, der muliggør påvisning af disse modificerede proteiner, er af høj værdi. Her præsenterer vi to forskellige protokoller, der udnytter specifikke antistoffer til at lette påvisning af RBC-NOS-proteinaktivering, og diskuterer anbefalinger til dataanalyse og fortolkning.

De beskrevne protokollers ydeevne blev vurderet ved at måle den velrapporterede stigning i phosphoryleringen af RBC-NOS ved serin 1177-resterne som reaktion på mekaniske kræfter, der reflekteres af dem, der forekommer i den humane vaskulatur (5 Pa).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De protokoller, der er beskrevet her, er i overensstemmelse med Helsingforserklæringen og blev godkendt af de etiske komitéer ved det tyske sportsuniversitet Köln (16.9.2013) og Griffith-universitetet (2019/808). Frivillige blev screenet for at sikre fraværet af relevante patologier og gav skriftligt informeret samtykke.

1. Farvning af RBC-proteiner ved anvendelse af immunhistokemiske protokoller

BEMÆRK: En detaljeret liste over de krævede kemikalier og materialer findes i materialetabellen. I de følgende afsnit beskrives fremstillingen af de nødvendige opløsninger, efterfulgt af en detaljeret beskrivelse af immunhistokemiprotokollen (figur 1).

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over de individuelle trin, der kræves til immunhistokemisk farvning og immunfluorescensfarvning af RBC-NOS på phosphoryleringssted 1177. En typisk arbejdsgang for de præsenterede protokoller, der strækker sig fra opløsningsforberedelse og blodprøvetagning til antistofbaseret detektion og visualisering, præsenteres. Klik her for at se en større version af denne figur.

  1. Indsamling af blodprøve
    1. Få blodprøver (10 ml fuldblod) fra syv raske mænd. De frivillige var raske individer, der angiveligt var fri for kardiovaskulære, hæmatologiske, neurologiske, endokrine, eller metaboliske sygdomme. De frivillige var også ikke-rygere.
    2. Opsaml blod ved hjælp af en steril nål og sprøjte fra en fremtrædende vene i underarmens antecubitale region og overfør straks til rør belagt med et af følgende antikoagulantia: natriumheparin (til immunhistokemi) eller ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA; til fluorescerende mærkning).
    3. Udsæt de antikoagulerede blodprøver for præcist styrede mekaniske kræfter ved hjælp af et skæresystem af Couette-typen, som beskrevet før 7,20.
      1. Skæreapparatet består af en drejelig kop og en stationær bob, adskilt af et mellemrum på 300 μm. Overfør blodprøven ind i mellemrummet, hvilket får koppens præcist kontrollerbare rotationshastighed til at udøve velkontrollerede mekaniske kræfter på prøven. Repræsentative data, der præsenteres her, blev produceret ved at anvende mekaniske kræfter, der reflekterer dem, der forekommer i den menneskelige vaskulatur (5 Pa) i længere varighed (300 s).
  2. Fremstilling af opløsninger, der er nødvendige til immunfarvning
    1. Forbered opløsningerne som i tabel 1. Opløsningerne kan fremstilles inden immunfarvningsproceduren udføres og opbevares ved en given temperatur, indtil det er nødvendigt.
      BEMÆRK: Opbevaringstiden kan variere mellem kemikalierne. Se sikkerhedsdatabladet.
  3. Forberedelse af prøver
    1. Behandle fuldblod umiddelbart efter seponering eller eksperimentel behandling (hvis relevant; f.eks. mekanisk stimulus i vores prøver; se trin 1.1.3) for at kunne detektere kortvarige virkninger, for eksempel efter anvendelse af forskydningsstress, motion, kortvarig eksponering for hypoxi osv.
    2. Udfør RBC-proteinfiksering ved hjælp af formaldehyd som følger: Fortynd fuldblod i et forhold på 1: 2 i 4% paraformaldehydopløsning i 20 minutter ved stuetemperatur (RT). Prøven centrifugeres ved 132 x g i 3 minutter ved RT, og supernatanten fjernes forsigtigt ved pipettering.
    3. RBC-pelleten resuspenderes i to volumener 0,1 mol/l phosphatbufferet saltvand (PBS) (1:3 fortynding) og inkuberes i 5 minutter ved RT. Centrifugeringen gentages som beskrevet ovenfor, og supernatanten, som skal være klar, fjernes ved pipettering. RBC-pellet suspenderes igen i et volumen på 0,1 mol/l PBS (1:2 fortynding).
    4. Forbered blodudstrygninger som følger: mærk et mikroskopglas med prøve-id, antistof påført osv. ved hjælp af en alkoholbestandig pen (f.eks. Blyant). Derefter tilsættes 10 μL af den fremstillede RBC-opløsning lige over etiketfeltet.
    5. Der anbringes endnu et objektglas på prøven i en vinkel på ca. 45°, og prøven fordeles jævnt langs objektglasset. Varmefiks glideren over en bunsenbrænder ved at svæve prøven over brænderen med konstant bevægelse i 5-7 sekunder.
      BEMÆRK: Det anbefales at lufttørre prøverne inden varmefiksering. Prøverne kan opbevares ved RT indtil farvning (figur 2).
  4. Immunohistokemisk farvning
    1. Der markeres to områder på hvert dias: et testområde, hvor RBC'erne inkuberes med det respektive primære og sekundære antistof, og et kontrolområde, hvor det primære antistof erstattes af en kontrolopløsning. Dette område fungerer som en inden for assaykontrol for at bestemme baggrundssignalet for RBC'erne.
    2. Forbered opløsninger før eller under proceduren, jf. tabel 2. Der kræves et volumen på 300 μL pr. testområde og 200 μL pr. kontrolområde.
      BEMÆRK: Det er vigtigt at bemærke, at disse antistofbaserede farvningsprocedurer giver semikvantitative snarere end kvantitative data. For at sikre, at der kan drages meningsfulde konklusioner af de producerede data, er der derfor absolut behov for passende kontrolprøver (dvs. for at tilvejebringe et referencepunkt for de vurderede relative ændringer i proteinaktivering).
    3. Til fordøjelsen af trypsin optø 0,1% trypsin og ekvilibrer til RT. Marker to områder på hvert dias ved hjælp af en fedtblyant: et testområde (2/3 af diaset) og et kontrolområde (1/3 af diaset). Påfør forsigtigt tris-bufret saltvand (TBS) ved hjælp af overførselspipetter til at vaske prøveområderne. Lad TBS sidde i 30 s og hæld det derefter af. Gentag vasketrinnet.
      BEMÆRK: Tilføj følgende løsninger til både kontrol- og testområdet, medmindre andet er beskrevet. Områderne skal være tilstrækkeligt dækket med den respektive løsning. Påfør opløsningerne ved hjælp af engangsoverførselspipetter, og skift pipetter efter hver opløsning.
    4. Tilsæt 0,1% trypsin, dæk diasene ved hjælp af et specialbygget inkubationskammer med enten et låg eller aluminiumsfolie, og inkuber i 30 minutter ved 37 ° C i en inkubator. Efter inkubation stoppes enzymreaktionen ved at tilsætte ledningsvand. Hæld opløsningen af. Begge områder vaskes 3x med TBS som beskrevet ovenfor.
    5. For at blokere peroxidaseaktivering tilsættes methanolopløsning og inkuberes i 30 minutter ved RT. Dæk diasene i løbet af denne tid. Hæld opløsningen af.
      BEMÆRK: Til påvisning af immunfluorescens (punkt 2) kan dette trin udelades, da blokering af endogene peroxidaser tjener til at forhindre kunstigt signal forårsaget af påvisning med peberrodsperoxidase (HRP) og 3,3′-Diaminobenzidinhydrat (DAB).
    6. Begge områder vaskes 3x med TBS som beskrevet i trin 1.4.3. Tilsæt 3% skummetmælksopløsning og inkuber i 30 minutter ved RT for at blokere. Hæld opløsningen af. Må ikke vaskes bagefter.
    7. Der tilsættes kun primært antistof (AB) til testområdet. Tilføj AB-kontrolopløsning (se tabel 2) til kontrolområdet. Prøverne inkuberes ved 4 °C natten over. Dæk dias i løbet af denne tid for at forhindre tørring.
      BEMÆRK: Undgå at overføre løsningerne fra testen til kontrolområdet, da dette vil påvirke kontrolværdierne.
    8. Hæld antistofopløsningen af. Begge områder vaskes 3x med TBS som beskrevet i trin 1.4.3.
    9. Udfør et blokeringstrin for at forhindre uspecifik binding. Tilsæt 3% normalt gedeserum og inkuber i 30 minutter ved RT. Hæld opløsningen af.
    10. Tilsæt den sekundære antistofopløsning og inkuber i 30 minutter ved RT. Hæld antistofopløsningen af. Områderne vaskes 3x med TBS som beskrevet i trin 1.4.3.
  5. Udvikling af farvning og dækning
    1. Den avidinkoblede HRP-reaktion udføres (se fortynding i tabel 2) ved tilsætning af fortyndet avidinperoxidaseopløsning og inkubation i 30 minutter ved RT. Opløsningen hældes af.
    2. Forbered DAB-blandingen for at udvikle immunfarvningen før brug, jf. tabel 3.
      FORSIGTIG: DAB er farligt. Overvej faresætningerne H341 (mistænkt for at forårsage genetiske defekter) og H350 (kan forårsage kræft). Overvej følgende sikkerhedssætninger: P201, P202, P280, P308+P313, P405 og P501.
    3. Udfør DAB-kontrolfarvning på følgende måde: HRP-opløsningen fra trin 1.5.1 opsamles fra et objektglas og blandes med et lille volumen (f.eks. 1 ml) forberedt DAB-opløsning i et separat centrifugerør inden farvning. Blandingen skal udvikle en brun / grå farve.
    4. Placer diasene under et mikroskop (forstørrelse på mindst 200x) og tilføj DAB-opløsning til begge områder. Overvåg farvningen af RBC'erne kontinuerligt, og stop farvningen ved at fjerne DAB-opløsningen med en engangspipette, før baggrunden begynder at farve. For RBC-NOS serin 1177 farvning er DAB-inkubationstiden ca. 17 min.
    5. Udfør prøvedehydrering. Anbring diasene i et glasstativ og nedsænk i 5 s hver i ethanolopløsninger af forskellige fortyndinger, begyndende med 70%, efterfulgt af 96% og derefter 100% og endelig i xylol. Fjern diasene fra stativet og læg dem på et væv med RBC'er øverst for at absorbere overskydende væske.
    6. Tilsæt to eller tre dråber monteringsmedium i hele diaset. Dæk diaset ved hjælp af en coverslip. Undgå inkludering af luftbobler, da dette forhindrer den mikroskopiske evaluering. Prøverne tørres mindst natten over i en stinkhætte.
  6. Udførelse af mikroskopisk evaluering
    1. Til visualisering og billeddannelse skal du placere dias i et transmitteret lysmikroskop med en forstørrelse på mindst 200x. Sørg for, at mikroskopet er koblet til et kamera for at tage billeder af de farvede RBC'er.
    2. Tænd mikroskopets lyskilde. Tænd for det mikroskopmonterede kamera, og start mikroskopstyringssoftwaren. Brug brightfieldmikroskopi til at bestemme det passende fokus ved at dreje de grove og fine fokusjusteringsknapper og finde fokusniveauet, hvor RBC'er er synlige.
    3. Indstil baggrundsværdierne for billederne til 220 ± 5 grå værdier målt på tre cellefrie områder af sliden. For at gøre det skal du åbne det første billede ved hjælp af den frit tilgængelige software ImageJ. Vælg indstillingen Gennemsnitlige grå værdier ved hjælp af panelet Indstil målinger. Brug det ovale ikon til at måle den grå værdi ved hjælp af kommandoen Måling . Hvis de målte værdier er uden for området, skal du justere baggrundslyset ved mikroskopet i overensstemmelse hermed. Gentag disse trin, indtil baggrundsværdierne er korrekte.
      BEMÆRK: Disse baggrundsværdier skal være inden for det givne interval for alle billeder, der tages. Ellers er dataene ikke sammenlignelige.
    4. Til analyse af RBC-grå værdi skal du markere kanten af hver RBC ved hjælp af markeringsværktøjet Oval i ImageJ-softwaren. Bestem de grå værdier for individuelle RBC'er ved hjælp af kommandoen Måling . Mål de grå værdier for mindst 50 RBC'er fra testen og mindst 10 RBC'er fra kontrolområdet.
      BEMÆRK: Det samlede antal analyserede RBC'er kan justeres individuelt. Jo flere RBC'er analyseret, jo mere meningsfuldt er resultatet. Det samlede antal analyserede RBC'er skal dog være sammenligneligt for hver tilstand, emne osv. Inden for et givet eksperiment.
      1. Undgå analyse af RBC'er i nærheden af fedtblyanten, da farvning kan være ufuldstændig i dette område. Undgå analyse af overlappende RBC'er, da dette påvirker farvningsintensiteten. Brug kun RBC'er, der er adskilt fra andre RBC'er. Analysér mindst fem billeder fra testen og mindst to billeder fra kontrolområdet til evaluering af 50/10 RBC'er. Medtag RBC'er fra hvert billede i den endelige analyse.
    5. For at beregne farvningsintensiteten skal du beregne de endelige signaler som:
      (individuelt testområde RBC - gennemsnitlig testområdebaggrund) - (individuelt kontrolområde RBC - gennemsnitlig baggrund for kontrolområdet)

Figure 2
Figur 2: Skildring af fikseringsprocessen og blodudtværingsgenerering. (Skema oprettet med BioRender.com.) Fortyndede blodprøver fastgøres kemisk i paraformaldehyd, centrifugeres derefter og vaskes med fosfatbufret saltvand. Endelig smøres resuspenderet blod på et glasglas og fastgøres termisk ved at svæve over en bunsenbrænderflamme. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Forberedelses- og opbevaringsbetingelser for opløsninger, der er nødvendige til immunhistokemisk farvning. Opløsningen kan fremstilles inden protokollen. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Beskrivelse af antistofopløsninger til umiddelbar anvendelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: Komponenter og protokol til klargøring af DAB-opløsning til umiddelbar brug. Klik her for at downloade denne tabel.

2. Fluorescerende mærkning af RBC-proteiner

BEMÆRK: Det følgende afsnit skitserer en tilpasning af den immunhistokemiske protokol, udviklet med det formål at muliggøre anvendelse af antistoffer med fluorescerende konjugater (figur 1).

Forberedelse af blodprøver til immunfluorescensprotokollen er identisk med den, der er beskrevet i afsnit 1, så det følgende afsnit begynder fra farvning af prøver.

  1. Immunofluorescens farvning
    1. Der inkuberes med det sekundære, fluorescerende konjugerede antistof (for volumen, se trin 1.4.2) i 30 minutter ved RT beskyttet mod lys ved hjælp af enten et specialbygget inkubationskammer eller aluminiumsfolie.
    2. Hæld den sekundære antistofopløsning af, og vask prøverne 3x med TBS. Lad den endelige vask stå på prøverne for at forhindre, at de tørrer ud.
    3. Hæld TBS af, og fjern prøverne fra prøvestativet en ad gangen for at forhindre langvarig lyseksponering. For dehydrering af prøverne udsættes diasene for forskellige ethanolopløsninger i ~ 5 s hver, startende med 70%, efterfulgt af 90% og endelig 100%. Udsæt objektglassene for xylol/xylenopløsning i 5 sekunder.
    4. Forbered en dæksel med to eller tre dråber monteringsmedium, og monter derefter diaset med dæksel. Sørg for jævn fordeling af monteringsmediet ved at påføre let tryk med pincet eller et lignende, sterilt metalinstrument. Fjern luftbobler, som ellers kan forstyrre billeddannelsen, med det samme instrument. Lad prøverne tørre natten over i et mørkt og tørt rum.
  2. Mikroskopisk evaluering
    1. For visualisering og billeddannelse skal du placere diaset på mikroskopscenen med en samlet forstørrelse på mindst 400x. Tænd mikroskopets lyskilde og lysstofrørskilden, og sørg for, at lysstofrørskilden justeres til maksimal intensitet.
    2. Tænd for det mikroskopmonterede kamera, og start mikroskopstyringssoftwaren. Brug brightfieldmikroskopi til at bestemme det passende fokus ved at dreje de grove og fine fokusjusteringsknapper og finde fokusniveauet, hvor RBC'er er synlige.
      BEMÆRK: Overdreven udsættelse for lys kan forårsage fotoblegning af de fluorescerende konjugater. Man kan bruge et dias fra et tidligere eksperiment til dette formål for at minimere lyseksponeringen af de dias, der endnu ikke er analyseret.
    3. Bestem optimal laserintensitet ved at inspicere RBC'er i kontrolområdet. Sørg for, at intensiteten er høj nok til, at RBC'er er synlige, mens de ikke producerer et stort baggrundssignal. Hold intensiteten og eksponeringstiden konsistent mellem områder og prøver for at sikre sammenlignelighed.
    4. Tag brightfield- og fluorescerende billeder i mindst tre forskellige områder af testområdet på diaset, valgt tilfældigt. Hvis du vil markere et område, skal du panorere væk fra kanterne af diaset, der er markeret med lipidpennen, ved hjælp af mikroskopets trinknapper. Vælg et område, der udviser ensartet fordeling af et entydigt RBC-lag.
    5. Indstil eksponeringstiden til 1 s for fluorescerende billeder, og tag et billede ved hjælp af softwarekontrollerne i mikroskopstyringssoftwaren. Skift til brightfield-tilstand, indstil eksponeringstiden til 'Auto', og tag det tilsvarende brightfield-billede.
    6. Tag brightfield- og fluorescerende billeder i mindst to forskellige tilfældigt udvalgte områder af diasets kontrolområde ved at gentage trin 2.2.3.
    7. Gem billederne i .tif format for at bevare de oprindelige grå værdier for pixels, forhindre komprimering og bære metadata for anskaffelsen.
    8. Mål de grå værdier for de registrerede RBC'er. Åbn ImageJ (eller FIJI21; se Supplerende fil 1). Bestem de grå værdier for individuelle RBC'er. Til dette formål skal du markere hver enkelt celle med det ovale markeringsværktøj og analysere ved hjælp af kommandoen Måling .
      BEMÆRK: RBC'er bør ikke analyseres, hvis de overlapper med andre celler, da dette kan øge det resulterende signal.
    9. Fremhæv mellem tre og fem områder fri for RBC'er, og bestem de grå værdier for at give et mål for baggrundssignal. Analysér mindst 150 RBC'er fra mindst tre forskellige billeder for hvert testområde og mindst 50 RBC'er fra mindst to forskellige billeder for hvert kontrolområde.
      BEMÆRK: Analyse af flere celler / områder kan anbefales for at minimere variabiliteten. I betragtning af at RBC-populationen i sagens natur er heterogen, kan cellecellevariabilitet i signal være signifikant afhængigt af proteinet af interesse.
    10. Udfør alternativ dataanalyse af optagne billeder ved hjælp af makrokommando. Opret/installer en makrokommando via FIJI-udgivelsen af ImageJ til automatisk valg, baggrundskorrektion og analyse af grå værdier af et givet billede.
      BEMÆRK: Denne rutine bruger automatisk tærskelværdi til at registrere cellerne i et givet billede ved hjælp af en kopi af det originale billede, hvilket producerer et overlay, der pålægges det originale billede for at udtrække grå værdier af fluorescerende RBC'er. Makroen deponeres som en .ijm-fil som supplerende kodningsfil 1.
    11. Åbn billedfilen i .tif format, der er klar til analyse i FIJI. Åbn makroen RBC fluorescence.ijm (Supplementary Coding File 1), og klik på Kør.
      BEMÆRK: Makroen er konfigureret til billeder, der er taget med 600x forstørrelse og et stort signal-støj-forhold. Automatisk udvælgelse af celler bør gennemgås af investigator.
  3. Beregn de endelige signaler som:
    (testområde RBC - testområdebaggrund) - (kontrolområde RBC - kontrolområdebaggrund) til manuel analyse
    (testområde - kontrolområde) til automatiseret analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den præsenterede protokol, der beskriver metoder, der letter påvisning af akutte ændringer i RBC-proteiner, blev testet på en velkendt mekanisk følsom proteinændring: phosphorylering af RBC-NOS ved serin 1177-resten. Fuldblod blev opnået fra raske frivillige og efterfølgende opdelt i to separate alikvoter. En given blodprøve blev udsat for mekanisk forskydningsspænding af fysiologisk størrelse (5 Pa) i 300 s, hvilket tidligere viste sig at fremkalde RBC-NOS-phosphorylering ved serin 117714. Umiddelbart efter ophør af den mekaniske forskydningseksponering blev blodprøven fikseret i paraformaldehyd. Som kontrol blev en blodprøve eksponeret, lagt i skæreapparatet og efterladt til hvile i 300 s før fiksering i paraformaldehyd. Signalet af antistoffer rettet mod RBC-NOS phosphoryleret ved serin 1177-resten, i hvile og som reaktion på mekanisk krafteksponering, blev vurderet ved anvendelse af både immunhistokemi (figur 3A,B) og immunofluorescens (figur 3C,D). Klippede og ikke-klippede prøver producerede statistisk signifikant forskellige signaler [Friedman-test: χ2(3) = 18,71, p = 0,0003]. En sammenlignelig, ca. tredobbelt stigning i signalet fra antistoffer rettet mod RBC-NOS-phosphoryleret ved serin 1177-resterne blev påvist som reaktion på mekanisk krafteksponering af RBC'er sammenlignet med de respektive ikke-klippede celler (både p < 0,01), når de blev vurderet med enten immunhistokemisk protokol eller immunofluorescensprotokol (figur 3E).

Sammenligning af resultaterne opnået med begge metoder indikerer således fremragende overensstemmelse mellem de præsenterede protokoller, som også med succes og pålideligt detekterede øget RBC-NOS-phosphorylering som reaktion på mekanisk stimulering.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative samlede data fra immunohistokemisk (A,B) og immunofluorescerende (C,D) farvning af RBC-NOS serin 1177 phosphorylering efter mekanisk forskydning. Analyse af signalintensiteten fra disse prøver er præsenteret i (E), hvor hvide bjælker afspejler data opnået ved anvendelse af HRP-farvning, og sorte bjælker repræsenterer data opnået ved hjælp af fluorescerende metode. Blod blev enten forberedt i hvile eller umiddelbart efter udsættelse for mekanisk kraft (dvs. forskydning). N = 7 blodprøver blev taget fra forskellige donorer. Data vist som middelværdi ± standardfejl i middelværdien. **p < 0,01, bestemt ved hjælp af en ikke-parametrisk Friedman-test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Automatiseret semikvantitativ billedanalyse rå kode med trin-for-trin annoteringer til billeder af immunofluorescerende røde blodlegemer. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende kodningsfil 1: Kompileret kode, der er kompatibel med FIJI/ImageJ-software til at køre automatiseret billedanalyse af immunfluorescerende røde blodlegemer. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nyere litteratur tyder stærkt på, at RBC-NOS-proteinet er af afgørende betydning for reguleringen af RBC-deformerbarhed 15,22,23, hvilket igen letter deres passage gennem smalle kapillærer 24. Proteinaktivitet afhænger i høj grad af posttranslationelle proteinmodifikationer, især phosphoryleringen af visse restkoncentrationer18. Fokus af interesse ligger i fosforyleringsstedet 1177, der vedrører aktiveringen af RBC-NOS-proteinet23. Ændringer af dette protein er blevet vist i en række sygdomme 25,26,27,28,29, således at undersøgelse af disse ændringer kunne give værdifuld viden ikke kun til forståelse af visse sygdomme, men også til at udvikle og vejlede specifikke terapier30.

Flere stimuli er blevet identificeret for at øge RBC-NOS serin 1177 phosphorylering22, men mekaniske kræfter synes at være en vigtig ekstracellulær stimulus, der forårsager aktivering eller modulering af RBC-NOS-proteinet 13,18,31,32. Modulationer af RBC-NOS-aktivitet er imidlertid ret midlertidige33; Derfor skal analyse/konservering af forskydningsafhængige ændringer udføres straks. Immunohistokemiske og senere immunofluorescensprotokoller blev udviklet for at lette bevarelse og analyse af akutte, regulatoriske modifikationer af RBC-NOS.

Resultaterne præsenteret her, opnået via immunohistokemiske og immunofluorescensprotokoller, viser en høj grad af enighed om den øgede phosphorylering af RBC-NOS serin 1177 efter forskydningseksponering. Begge protokoller er således egnede til undersøgelse af forbigående posttranslationelle ændringer af RBC-proteiner, og den respektive eksperimentator kan beslutte, hvilken metode de kan bruge i deres respektive laboratorium i betragtning af de lokalt tilgængelige ressourcer og infrastruktur. I betragtning af den brede kommercielle tilgængelighed af antistoffer rettet mod proteiner, både i deres oprindelige tilstand eller efter posttranslationelle modifikationer, kan de nuværende assays tilpasses til en lang række mål. Således præsenterer de nyttige værktøjer til vurdering af RBC-signalering14,27,34.

Visse aspekter bør overvejes under proceduren. De nævnte antistoffer er ikke specifikt udviklet til at blive anvendt i RBC'er. I stedet er disse specifikke endotel-type NOS (eNOS) antistoffer. Da eNOS og RBC-NOS ser ud til at dele stor homologi22,23, er eNOS-specifikke antistoffer traditionelt blevet brugt til at visualisere RBC-NOS-aktivering. Det er vigtigt at bemærke, at antistoffer rettet mod de inducerbare (iNOS) eller neuronale (nNOS) isoformer ikke producerer signaler i RBC'er, hvilket understøtter, at RBC-NOS deler betydelig strukturel lighed med eNOS22. Den passende fortynding skal testes, før der anvendes antistof i forsøget, da de leverandøranbefalede data ikke kan anvendes på RBC-forsøg uden testning. Endvidere kræver et skift af distributionsselskaber overdreven test af forskellige fortyndinger inden brug. Vi anbefaler at følge en meget systemisk tilgang, når man tester nye antistoffer/kemikalier; Nye komponenter bør testes med dosis-respons-tilgange, hvor kun de specifikke trin, der introducerer den nye komponent, bør ændres. Positive kontroller (dvs. stimulering af RBC-NOS-aktivering) bør tilvejebringes ved at sammenligne klippet med ikke-klippet blod, som præsenteret her. Alternativt har farmakologisk stimulering af RBC-NOS-phosphorylering med 350 pM insulin vist sig at resultere i øget RBC-NOS-phosphorylering, svarende til den, der observeres ved mekanisk kraftapplikation7.

Begrænsningerne ved de præsenterede detektionsmetoder strækker sig til almindelige begrænsninger af metoder, der er afhængige af specificiteten af kommercielt opnåede primære antistoffer (f.eks. Western blot). For det første skal et primært antistof rettet mod antigenet af interesse være tilgængeligt. Hvis det er tilgængeligt, skal antistoffet være specifikt for målet, hvilket kan bekræftes ved funktionelle foranstaltninger (dvs. farmakologisk behandling med aktivatorer/hæmmere) eller ved anvendelse af western blotting. Desuden skal de data, der produceres via de beskrevne metoder, fortolkes omhyggeligt. Det vil sige, at de præsenterede metoder er semi-kvantitative og giver information om ændringer i proteinmodifikationer i forhold til passende kontrolprøver. Den semikvantitative evaluering, der præsenteres her, refererer altid til aktiveringen af enzymet og bør ikke forveksles med enzymaktiviteten. Målinger af enzymaktivitet kræver separate assays, såsom arginin-citrullin-assayet, der måler konverteringshastigheden (fmol/min) af [3 H] L-arginin til [3H] citrullin eller [14 C] L-arginin til [14 C] citrullin35,36. For at kontrollere, om en øget RBC-NOS-aktivering også ledsages af højere NO-niveauer og/eller øgede RBC-deformerbarhedsværdier, bør der f.eks. udføres yderligere analyse af NO-koncentrationen. For at udpege RBC-NOS som kilde til NO, bør NOS-hæmmere såsom L-NIO desuden anvendes15.

Det kan opsummeres, at de metoder, der præsenteres her, er veludviklede til at analysere ændringer i RBC-NOS-aktivering som reaktion på anvendte stimuli i forhold til ustimulerede kontrolceller. Disse metoder bidrager således til forståelsen af, hvordan mekanisk stress påvirker funktionerne af RBC-proteiner, som er kritiske for cellulær funktion og i sidste ende afgørende for tilstrækkelig perfusion af arbejdsvæv og gasudveksling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere har oplyst, at der ikke er nogen interessekonflikter.

Acknowledgments

LK anerkender støtten fra et australsk regeringsforskningsuddannelsesprogramstipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate Sigma/Merck D5637 DAB
Ammoniumchloride  Merck /Millipore 101145 NH4Cl
Centrifuge 5427 R  Eppendorf 5409000010
Coverslips VWR 631-0147 
di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate  Merck /Millipore 106580 Na2HPO4. 2 H2O
Disposable transfer pipettes VWR 612-6803
Entellan Merck /Millipore 107961 rapid mounting medium for microscopy
Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) Hofmann 642
Glucose-Oxidase Sigma/Merck G2133
Grease pencil  Dako S 2002
Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase Sigma/Merck E-2886 HRP
Hydrochloric acid  Merck /Millipore 109057 HCl
Hydrogen peroxide, 30% Merck /Millipore 107203 H2O2
ImageJ Software Freeware
Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) RR Mechatronics Ektacytometer instrument used for shearing
Methanol Merck /Millipore 106009
Microscope slides VWR 630-1985
Nickel(II)-sulfate Hexahydrate  Sigma/Merck N4882 NiSO4.6H2O
Normal Goat serum Agilent/DAKO X0907 NGS
Paraformaldehyde Merck /Millipore 818715 PFA
Pipettes Eppendorf Reference 2 VWR 613-5836/ 613-5839
Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) Merck/Millipore 07-428-I Primary Antibody
Reaction tubes, 2ml Eppendorf 30120094
Secondary Antibody goat anti rabbit Agilent/DAKO E0432 Secondary Antibody
Skim milk powder Bio-Rad 170-6404
Sodium chloride  Merck /Millipore 106404 NaCl
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate Merck /Millipore 106346 NaH2PO4.H2O
Sodium hydroxide, 1 M Merck /Millipore 150706 NaOH
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Merck /Millipore 108382 Tris
Trypsin Sigma/Merck T7409
Tween20  Merck /Millipore 822184
Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F Merck /Millipore WHA1825047
Xylol VWR Chemicals 2,89,73,465
ß-D-Glucose monohydrate Merck /Millipore 14431-43-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
  2. Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
  3. Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die? Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
  4. Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
  5. Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
  6. Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
  7. Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
  8. Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
  9. Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
  10. Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
  11. Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
  12. Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
  13. Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
  14. Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
  15. Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
  16. Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
  17. Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
  18. Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
  19. Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
  20. Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biology. 10 (1), 47 (2021).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
  23. Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
  24. McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
  25. Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
  26. Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
  27. Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
  28. Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
  29. Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
  30. Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
  31. Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
  32. Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
  33. Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
  34. Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
  35. Methods in Nitric Oxide Research. Feelisch, M. , Wiley. Chichester. (1998).
  36. Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).

Tags

Biokemi udgave 193 røde blodlegemer proteiner fra røde blodlegemer mekanotransduktion immunhistokemi immunofluorescens nitrogenoxidsyntase
Immunfarvningsbaseret påvisning af dynamiske ændringer i proteiner fra røde blodlegemer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grau, M., Kuck, L.… More

Grau, M., Kuck, L. Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins. J. Vis. Exp. (193), e64843, doi:10.3791/64843 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter