Summary
적출된 적혈구의 단백질 활성화의 동적 변화를 포착하는 것은 추후 평가를 위해 급성 자극에 대한 동적 변화를 보존하는 것과 같은 방법론적 문제를 제기합니다. 제시된 프로토콜은 관련 단백질 변화의 보존 및 분석과 후속 검출을 가능하게 하는 샘플 준비 및 염색 기술을 설명합니다.
Abstract
적혈구(RBC) 단백질의 항체 표지는 전체 단백질 함량의 변화 또는 단백질 활성화 상태의 급격한 변화를 감지하기 위해 일반적으로 사용되는 반정량적 방법입니다. 적혈구 치료의 평가, 특정 질병 상태의 차이 특성화 및 세포 일관성 설명을 용이하게 합니다. 급격하게 변형된 단백질 활성화(예: 기계 형질도입을 통해)를 검출하려면 일시적인 단백질 변형을 보존하기 위해 적절한 샘플 준비가 필요합니다. 기본 원리는 특정 1차 항체의 초기 결합을 가능하게 하기 위해 원하는 RBC 단백질의 표적 결합 부위를 고정화하는 것을 포함한다. 샘플은 상응하는 1차 항체에 대한 2차 항체의 결합을 위한 최적 조건을 보장하기 위해 추가 처리됩니다. 비형광 2차 항체를 선택하려면 비오틴-아비딘 커플링과 염색을 위한 3,3-디아미노벤지딘-테트라히드로클로라이드(DAB)의 적용을 포함한 추가 처리가 필요하며, 이는 산화를 멈추고 염색 강도를 적시에 제어하기 위해 현미경으로 실시간으로 제어해야 합니다. 염색 강도 검출을 위해 표준 광학 현미경을 사용하여 이미지를 촬영합니다. 이 프로토콜의 변형에서, 플루오레세인-접합된 2차 항체가 대신 적용될 수 있으며, 이는 추가 개발 단계가 필요하지 않다는 이점을 갖는다. 그러나 이 절차에서는 염색 검출을 위해 현미경에 부착된 형광 대물렌즈가 필요합니다. 이러한 방법의 반정량적 특성을 감안할 때, 비특이적 항체 반응 및 배경 신호를 설명하기 위해 몇 가지 대조 염색을 제공하는 것이 필수적입니다. 여기에서는 염색 프로토콜과 해당 분석 프로세스를 모두 제시하여 다양한 염색 기술의 각 결과와 장점을 비교하고 논의합니다.
Introduction
적혈구(RBC)는 70일에서 140일 동안 심혈관계를 통과하며, 평균 적혈구 연령은 약 115일이다 1,2. 노화 또는 손상된 적혈구는 대식세포에 의해 구동되는 효율적인 제거 과정인 적혈구증가증에 의해 순환계에서 제거된다3. 이러한 세포의 미리 결정된 수명은 분화와 성숙 과정에서 핵, 미토콘드리아, 리보솜을 포함한 세포 소기관을 포기한 결과 중 하나이다4. 따라서 순환하는 적혈구에는 새로운 단백질의 합성을 방해하는 번역 기계가 없다3. 따라서 기존 단백질에 대한 동적 번역 후 변형은 적혈구에 작용하는 세포외 및 세포내 스트레스 요인에 대한 반응으로 급성, 생화학적 조절의 유일한 실행 가능한 메커니즘을 나타냅니다5.
기계적 힘은 적혈구 내에서 생화학적 경로의 활성화 또는 조절을 유발하는 주요 세포외 신호인 것으로 보입니다. RBC 막에서 기계 감응성 단백질인 Piezo1의 발견은 6 이 세포에서 기계적으로 활성화된 신호 전달을 조사하는 여러 연구 라인에 영감을 주었습니다 7. 예를 들어, 최근의 발전은 적혈구의 물리적 특성이 번역 후 인산화 및 유비퀴틴화(ubiquitination)9를 포함하는 단백질8의 급성 및 동적 변화에 의해 능동적으로 조절된다는 것을 보여주었다. 이러한 정상적인 변형은 특정 질병 9,10,11에서 다르기 때문에 특히 기계 생물학적 과정과 관련하여 RBC 단백질의 활성화 상태를 결정하는 것이 과학적이고 임상적으로 중요한 것으로 보입니다.
RBC 단백질 활성화 상태의 급격한 변화를 결정하는 것은 몇 가지 방법론적 문제를 제기합니다. 예를 들어, 추후 분석을 위해 RBC 샘플을 보관하려면 번역 후 변형이 내구성이 없기 때문에 변형된 RBC 단백질의 보존이 필요합니다. 또한, 전통적인 단백질 검출 방법(예: 웨스턴 블로팅)은 적혈구에서 표준화하기가 매우 어려운데, 이는 헤모글로빈에 비해 단백질 함량이 낮기 때문이며, 헤모글로빈은 이러한 세포에서 단백질 함량의 ~98%를 차지한다12. 따라서 화학적으로 보존된 적혈구의 항체 기반 염색은 산화질소 합성효소(RBC-NOS)의 적혈구 특이적 동형과 같은 중요한 적혈구 단백질의 급성 변형을 조사할 때 선택되는 방법이었습니다13,14. RBC-NOS는 효소적으로 산화질소(NO)를 생성하는 것으로 나타났으며, 이는 RBC 변형성을 포함한 필수 RBC 특성에 필수적인 것으로 보인다15,16,17. RBC-NOS의 번역 후 변형은 촉매 효소 활성을 조절하며, 세린 1177 잔기의 인산화는 효소 활성을 증가시키는 것으로 설명되는 반면, 잔기 세린 114 또는 트레오닌 495의 인산화는 RBC-NOS 활성 감소와 관련이 있습니다18,19.
총체적으로, RBC 단백질의 일시적인 변형은 중요한 세포 기능에 기여하며, 이러한 변형된 단백질의 검출을 가능하게 하는 표준화된 프로토콜은 높은 가치가 있습니다. 여기에서는 RBC-NOS 단백질 활성화의 검출을 용이하게 하기 위해 특정 항체를 활용하는 두 가지 별개의 프로토콜을 제시하고 데이터 분석 및 해석을 위한 권장 사항에 대해 논의합니다.
기술된 프로토콜의 성능은 인간 맥관 구조(5 Pa) 내에서 발생하는 것을 반영하는 기계적 힘에 대한 반응으로 세린 1177 잔기에서 RBC-NOS의 인산화 증가의 잘 보고된 증가를 측정함으로써 평가되었습니다.
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Protocol
여기에 설명된 프로토콜은 헬싱키 선언과 일치하며 독일 쾰른 스포츠 대학(2013년 9월 16일) 및 그리피스 대학(2019/808)의 윤리 위원회에서 승인했습니다. 자원 봉사자들은 관련 병리가 없는지 확인하기 위해 선별 검사를 받았고 서면 동의서를 제공했습니다.
1. 면역조직화학 프로토콜을 이용한 RBC 단백질 염색
알림: 필요한 화학 물질 및 재료의 자세한 목록은 재료 표에 나와 있습니다. 다음 섹션에서는 필요한 용액의 준비에 대해 설명하고 면역조직화학 프로토콜에 대한 자세한 설명을 제공합니다(그림 1).
그림 1: 인산화 부위 1177에서 RBC-NOS의 면역조직화학 및 면역형광 염색에 필요한 개별 단계의 개략도. 용액 준비 및 혈액 샘플링에서 항체 기반 검출 및 시각화에 이르기까지 제시된 프로토콜의 일반적인 워크플로가 제시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 혈액 샘플 수집
- 7명의 건강한 남성으로부터 혈액 샘플(전혈 10mL)을 채취합니다. 지원자는 심혈관, 혈액학, 신경계, 내분비 또는 대사 질환이 없는 것으로 보고된 건강한 개인이었습니다. 자원 봉사자들도 비 흡연자였습니다.
- 팔뚝의 전주복 부위의 두드러진 정맥에서 멸균 바늘과 주사기를 사용하여 혈액을 채취하고 즉시 항응고제 중 하나 인 나트륨 헤파린 (면역 조직 화학 용) 또는 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA, 형광 표지 용) 중 하나로 코팅 된 튜브로 옮깁니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 항응고된 혈액 샘플을 쿠엣형 전단 시스템을 사용하여 정밀하게 제어된 기계적 힘에 노출시킵니다.
- 전단 장치는 300 μm 간격으로 분리된 회전 가능한 컵과 고정식 밥을 포함한다. 혈액 샘플을 틈새로 옮기면 컵의 정밀하게 제어 가능한 회전 속도가 잘 제어된 기계적 힘을 샘플에 가합니다. 여기에 제시된 대표적인 데이터는 연장된 기간(300초) 동안 인간 혈관 구조(5Pa) 내에서 발생하는 것을 반영하는 기계적 힘을 적용하여 생성되었습니다.
- 면역염색에 필요한 용액 준비
- 표 1과 같이 용액을 준비한다. 용액은 면역염색 절차를 수행하기 전에 제조될 수 있고, 필요할 때까지 주어진 온도에서 저장될 수 있다.
알림: 보관 기간은 화학 물질에 따라 다를 수 있습니다. 물질안전보건자료(MSDS)를 확인하십시오.
- 표 1과 같이 용액을 준비한다. 용액은 면역염색 절차를 수행하기 전에 제조될 수 있고, 필요할 때까지 주어진 온도에서 저장될 수 있다.
- 시료 전처리
- 예를 들어 전단 응력 적용, 운동, 단기 저산소증 노출 후 등 단명 효과를 감지할 수 있도록 철수 또는 실험적 치료(해당되는 경우, 샘플의 기계적 자극, 1.1.3단계 참조) 직후 전혈을 처리합니다.
- 다음과 같이 포름알데히드를 사용하여 RBC 단백질 고정을 수행합니다: 실온(RT)에서 20분 동안 4% 파라포름알데히드 용액에 전혈을 1:2의 비율로 희석합니다. RT에서 3분 동안 132 x g 에서 샘플을 원심분리하고 피펫팅으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
- RBC 펠릿을 0.1 mol/L 인산염 완충 식염수(PBS) 2개 부피(1:3 희석)로 다시 현탁하고 RT에서 5분 동안 배양합니다. 위에서 설명한 대로 원심분리를 반복하고 피펫팅으로 투명해야 하는 상층액을 제거합니다. RBC 펠릿을 0.1 mol/L PBS(1:2 희석)의 한 부피로 다시 현탁합니다.
- 다음과 같이 혈액 도말 검사를 준비합니다 : 알코올 내성 펜 (예 : 연필)을 사용하여 샘플 ID, 항체 적용 등으로 현미경 슬라이드에 라벨을 붙입니다. 그런 다음 준비된 RBC 용액 10μL를 라벨 필드 바로 위에 추가합니다.
- 약 45° 각도로 s에 두 번째 슬라이드를 배치하고 amp슬라이드를 따라 고르게 분산시킵니다. 샘플을 5-7초 동안 지속적으로 움직여 버너 위로 가져가서 분젠 버너 위에 슬라이드를 열 고정합니다.
알림: 열 고정 전에 샘플을 자연 건조하는 것이 좋습니다. 샘플은 염색될 때까지 RT에서 보관할 수 있습니다(그림 2).
- 면역조직화학 염색
- 각 슬라이드에 적혈구가 각각의 1차 및 2차 항체와 함께 배양되는 테스트 영역과 1차 항체가 대조 용액으로 대체되는 대조군 영역의 두 영역을 표시합니다. 이 영역은 적혈구의 배경 신호를 결정하기 위한 분석 내 제어 역할을 합니다.
- 표 2에 따라 절차 전이나 도중에 용액을 준비합니다. 테스트 영역당 300 μL, 제어 영역당 200 μL의 부피가 필요합니다.
참고: 이러한 항체 기반 염색 절차는 정량적 데이터가 아닌 반정량적 데이터를 산출한다는 점에 유의해야 합니다. 따라서, 생성된 데이터로부터 의미 있는 결론이 도출될 수 있도록 하기 위해, 적절한 대조 샘플(즉, 단백질 활성화의 평가된 상대적 변화에 대한 기준점을 제공하기 위해)이 절대적으로 요구된다. - 트립신 소화를 위해, 0.1% 트립신을 녹이고 RT에 평형을 이룹니다. 그리스 연필을 사용하여 각 슬라이드의 두 영역을 표시합니다: 테스트 영역(슬라이드의 2/3)과 제어 영역(슬라이드의 1/3). 이송 피펫을 사용하여 트리스 완충 식염수(TBS)를 조심스럽게 도포하여 샘플 영역을 세척합니다. TBS를 30초 동안 그대로 두었다가 붓습니다. 세척 단계를 반복하십시오.
알림: 달리 설명되지 않는 한 제어 영역과 테스트 영역 모두에 다음 솔루션을 추가합니다. 영역은 해당 솔루션으로 충분히 덮을 필요가 있습니다. 일회용 이송 파이펫을 사용하여 용액을 적용하고 각 용액 후에 피펫을 전환합니다. - 0.1% 트립신을 첨가하고 뚜껑 또는 알루미늄 호일이 있는 특수 제작된 배양 챔버를 사용하여 슬라이드를 덮고 인큐베이터에서 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 수돗물을 첨가하여 효소 반응을 중지합니다. 용액을 붓는다. 위에서 설명한대로 TBS로 두 영역을 3 번 씻으십시오.
- 과산화효소 활성화를 차단하기 위해 메탄올 용액을 첨가하고 RT에서 30분 동안 배양합니다. 그 시간 동안 슬라이드를 덮으십시오. 용액을 붓는다.
참고: 면역형광 검출(섹션 2)의 경우, 내인성 과산화효소의 차단이 양 고추 냉이 과산화효소(HRP) 및 3,3'-디아미노벤지딘 수화물(DAB)을 사용한 검출로 인한 인공물 신호를 방지하는 역할을 한다는 점을 감안할 때 이 단계를 생략할 수 있습니다. - 3단계에서 설명한 대로 TBS로 두 영역을 모두 1.4.3번 세척합니다. 3% 탈지유 용액을 넣고 RT에서 30분 동안 배양하여 차단합니다. 용액을 붓는다. 이후에는 세탁하지 마십시오.
- 1차 항체(AB)는 검사 부위에만 첨가합니다. AB 대조 용액( 표 2 참조)을 제어 영역에 추가합니다. 샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 건조를 방지하기 위해 그 시간 동안 슬라이드를 덮으십시오.
알림: 테스트에서 제어 영역으로 용액을 옮기면 제어 값에 영향을 미치므로 피하십시오. - 항체 용액을 붓습니다. 3단계에서 설명한 대로 TBS로 두 영역을 모두 1.4.3번 세척합니다.
- 불특정 바인딩을 방지하기 위해 차단 단계를 수행합니다. 3 % 정상 염소 혈청을 넣고 RT에서 30 분 동안 배양합니다.
- 2차 항체 용액을 첨가하고 RT에서 30분 동안 배양한다. 3단계에서 설명한 대로 TBS로 해당 부위를 1.4.3번 씻습니다.
- 염색 및 커버 개발
- 희석된 아비딘-퍼옥시다제 용액을 첨가하고 RT에서 30분 동안 인큐베이션하여 아비딘-결합 HRP 반응( 표 2의 희석 참조)을 수행한다.
- 표 3에 따라 사용 전에 면역염색을 진행하기 위해 DAB 혼합물을 준비한다.
주의 : DAB는 위험합니다. 위험 문구 H341(유전적 결함을 유발하는 것으로 의심됨) 및 H350(암을 유발할 수 있음)을 고려하십시오. P201, P202, P280, P308+P313, P405 및 P501과 같은 예방 조치를 고려하십시오. - 다음과 같이 DAB 대조군 염색을 수행합니다: 슬라이드에서 단계 1.5.1의 HRP 용액을 수집하고 염색 전에 별도의 원심분리 튜브에서 준비된 DAB 용액의 소량(예: 1mL)과 혼합합니다. 혼합물은 갈색/회색을 띠어야 합니다.
- 슬라이드를 현미경(최소 200배 배율)으로 놓고 두 영역 모두에 DAB 용액을 추가합니다. 적혈구의 염색을 지속적으로 모니터링하고 배경이 착색되기 전에 일회용 피펫으로 DAB 용액을 제거하여 염색을 중지합니다. RBC-NOS 세린 1177 염색의 경우, DAB 배양 시간은 약 17분이다.
- 샘플 탈수를 수행합니다. 슬라이드를 유리 랙에 놓고 70 %, 96 %, 100 %, 마지막으로 자일롤에 이르기까지 다양한 희석액의 에탄올 용액에 각각 5 초 동안 담근다. 랙에서 슬라이드를 제거하고 상단에 RBC가 있는 티슈 위에 올려 과도한 액체를 흡수합니다.
- 슬라이드 전체에 장착 매체를 두세 방울 떨어뜨립니다. 커버슬립을 사용하여 슬라이드를 덮습니다. 기포를 포함하면 현미경 평가를 방해하므로 피하십시오. 흄 후드에서 적어도 밤새 샘플을 건조시킵니다.
- 현미경 평가 수행
- 시각화 및 이미징을 위해 슬라이드를 최소 200x 배율의 투과광 현미경에 배치합니다. 현미경이 카메라에 연결되어 염색된 적혈구의 사진을 찍는지 확인합니다.
- 현미경 광원을 켭니다. 현미경 부착 카메라를 켜고 현미경 제어 소프트웨어를 시작합니다. 명시야 현미경을 사용하여 거친 초점 조정 노브와 미세 초점 조정 노브를 돌리고 적혈구가 보이는 초점 수준을 찾아 적절한 초점을 결정합니다.
- 그림의 배경 값을 220 ± 5 회색 값으로 설정하고, 슬라이드의 셀이 없는 세 영역에서 측정합니다. 이렇게 하려면 무료로 사용할 수 있는 소프트웨어 ImageJ를 사용하여 첫 번째 사진을 엽니다. Set measurements(측정 설정) 패널을 사용하여 Mean gray values 옵션을 선택합니다. 타원형 아이콘을 사용하면 측정 명령을 사용하여 회색 값을 측정할 수 있습니다. 측정값이 범위를 벗어나면 그에 따라 현미경의 배경광을 조정하십시오. 배경 값이 정확해질 때까지 이 단계를 반복합니다.
참고: 이 배경 값은 촬영한 모든 이미지에 대해 지정된 범위 내에 있어야 합니다. 그렇지 않으면 데이터를 비교할 수 없습니다. - RBC 회색 값을 분석하려면 ImageJ 소프트웨어 내의 타원형 선택 도구를 사용하여 각 RBC의 가장자리를 표시합니다. 측정 명령을 사용하여 개별 RBC의 회색 값을 결정합니다. 테스트에서 최소 50 RBC의 회색 값과 제어 영역에서 최소 10 RBC의 회색 값을 측정합니다.
참고: 분석된 적혈구의 총 수는 개별적으로 조정할 수 있습니다. 분석된 적혈구가 많을수록 더 의미 있는 결과가 나왔습니다. 그러나, 분석된 적혈구의 총 수는 주어진 실험 내에서 각 조건, 피험자 등에 대해 비교할 수 있어야 한다.- 이 영역에서 얼룩이 불완전할 수 있으므로 그리스 연필 근처의 적혈구 분석을 피하십시오. 겹치는 적혈구의 분석은 염색 강도에 영향을 미치므로 피하십시오. 다른 적혈구와 분리된 적혈구만 사용하십시오. 50/10 적혈구를 평가하기 위해 테스트에서 최소 5개의 이미지와 제어 영역에서 최소 2개의 이미지를 분석합니다. 최종 분석에 모든 그림의 적혈구를 포함합니다.
- 염색 강도를 계산하려면 최종 신호를 다음과 같이 계산하십시오.
(개별 테스트 영역 RBC - 평균 테스트 영역 배경) - (개별 제어 영역 RBC - 평균 제어 영역 배경)
그림 2: 고정 과정과 혈액 도말 생성의 묘사. (BioRender.com 로 만든 구성표.) 희석 된 혈액 샘플을 파라 포름 알데히드에 화학적으로 고정 한 다음 원심 분리하고 인산염 완충 식염수로 세척합니다. 마지막으로, 재현 된 혈액은 유리 슬라이드에 번지고 분젠 버너 불꽃 위에 호버링 하여 열적으로 고정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 면역조직화학적 염색에 필요한 용액의 준비 및 보관 조건. 용액은 프로토콜 전에 준비될 수 있다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 즉시 사용할 수 있는 항체 용액에 대한 설명. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 즉시 사용할 수 있도록 DAB 솔루션을 준비하기 위한 구성 요소 및 프로토콜. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
2. RBC 단백질의 형광 표지
참고: 다음 섹션에서는 형광 접합체와 함께 항체를 사용할 수 있도록 하기 위해 개발된 면역조직화학적 프로토콜의 적응을 간략하게 설명합니다(그림 1).
면역형광 프로토콜을 위한 혈액 샘플 준비는 섹션 1에 설명된 것과 동일하므로 다음 섹션은 샘플 염색에서 시작됩니다.
- 면역형광 염색
- 특수 제작된 배양 챔버 또는 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호되는 RT에서 30분 동안 2차 형광 접합 항체(부피는 1.4.2단계 참조)와 함께 배양합니다.
- 2차 항체 용액을 붓고 TBS로 샘플을 3배 세척합니다. 샘플이 마르지 않도록 최종 세척을 그대로 두십시오.
- TBS를 붓고 s를 제거합니다.amp장시간 빛에 노출되는 것을 방지하기 위해 한 번에 하나씩 샘플 랙에서. 샘플을 탈수하기 위해 슬라이드를 각각 ~5초 동안 서로 다른 에탄올 용액에 노출시킵니다(70%, 90%, 마지막으로 100%). 슬라이드를 자일롤/크실렌 용액에 5초 동안 노출시킵니다.
- 장착 매체 두세 방울로 커버슬립을 준비한 다음 커버슬립으로 슬라이드를 장착합니다. 핀셋 또는 이와 유사한 멸균 금속 기구로 가벼운 압력을 가하여 장착 매체의 균일한 분포를 보장합니다. 이미징을 방해할 수 있는 기포를 동일한 기기로 제거하십시오. 샘플을 어둡고 건조한 공간에서 밤새 건조시키십시오.
- 현미경 평가
- 시각화 및 이미징을 위해 슬라이드를 현미경 스테이지에 올려 놓으십시오.tage 최소 400x의 총 배율로. 현미경 광원과 형광등을 켜서 형광 광원이 최대 강도로 조정되었는지 확인합니다.
- 현미경 부착 카메라를 켜고 현미경 제어 소프트웨어를 시작합니다. 명시야 현미경을 사용하여 거친 초점 조정 손잡이와 미세 초점 조정 손잡이를 돌리고 적혈구가 보이는 초점 수준을 찾아 적절한 초점을 결정합니다.
알림: 빛에 과도하게 노출되면 형광 접합체의 광표백이 발생할 수 있습니다. 이 목적을 위해 이전 실험의 슬라이드를 사용하여 아직 분석되지 않은 슬라이드의 빛 노출을 최소화 할 수 있습니다. - 제어 영역에서 적혈구를 검사하여 최적의 레이저 강도를 결정합니다. 강도가 적혈구를 볼 수 있을 만큼 충분히 높으면서도 큰 배경 신호를 생성하지 않는지 확인합니다. 비교 가능성을 보장하기 위해 영역과 샘플 간에 강도와 노출 시간을 일관되게 유지하십시오.
- 슬라이드 테스트 영역의 최소 3개 영역에서 명시야 및 형광 이미지를 무작위로 선택하여 캡처합니다. 영역을 선택하려면 현미경 스테이지 컨트롤을 사용하여 지질 펜으로 표시된 슬라이드 가장자리에서 멀리 이동합니다. 단일 RBC 레이어의 균일한 분포를 나타내는 영역을 선택합니다.
- 형광 이미지의 노출 시간을 1초로 설정하고 현미경 제어 소프트웨어의 소프트웨어 컨트롤을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 명시야 모드로 전환하고 노출 시간을 '자동'으로 설정한 후 해당 명시야 이미지를 캡처합니다.
- 2.2.3단계를 반복하여 슬라이드의 제어 영역에서 임의로 선택된 최소 2개의 별개의 영역에서 명시야 및 형광 이미지를 캡처합니다.
- 이미지를 .tif 형식으로 저장하여 픽셀의 원래 회색 값을 유지하고, 압축을 방지하고, 획득의 메타데이터를 전달합니다.
- 캡처된 적혈구의 회색 값을 측정합니다. ImageJ(또는 FIJI21, 보충 파일 1 참조)를 엽니다. 개별 적혈구의 회색 값을 결정합니다. 이를 위해 타원형 선택 도구로 각 개별 셀을 표시하고 측정 명령을 사용하여 분석합니다.
참고: 적혈구가 다른 셀과 겹치면 결과 신호가 증가할 수 있으므로 분석해서는 안 됩니다. - 적혈구가 없는 3개에서 5개 사이의 영역을 강조 표시하고 회색 값을 결정하여 배경 신호의 측정값을 제공합니다. 각 테스트 영역에 대해 최소 3개의 개별 이미지에서 최소 150개의 적혈구를 분석하고, 각 제어 영역에 대해 최소 2개의 개별 이미지에서 최소 50개의 적혈구를 분석합니다.
참고: 변동성을 최소화하기 위해 더 많은 세포/영역을 분석하는 것이 좋습니다. RBC 집단이 본질적으로 이질적이라는 점을 감안할 때, 신호의 세포-세포 가변성은 관심 단백질에 따라 중요할 수 있습니다. - 매크로 명령을 사용하여 캡처된 이미지의 대체 데이터 분석을 수행합니다. ImageJ의 FIJI 릴리스를 통해 매크로 명령을 생성/설치하여 지정된 이미지의 자동 선택, 배경 보정 및 회색 값 분석을 수행합니다.
참고: 이 루틴은 자동 임계값을 사용하여 원본 이미지의 복사본을 사용하여 주어진 이미지에 있는 셀을 감지하여 형광 적혈구의 회색 값을 추출하기 위해 원본 이미지에 적용되는 오버레이를 생성합니다. 매크로는 보충 코딩 파일 1과 같은 .ijm 파일로 저장됩니다. - FIJI에서 분석할 수 .tif 형식의 이미지 파일을 엽니다. RBC fluorescence.ijm(Supplementary Coding File 1) 매크로를 열고 실행을 클릭합니다.
참고: 매크로는 600x 배율과 큰 신호 대 잡음비로 얻은 이미지에 대해 설정됩니다. 세포의 자동 선택은 조사자가 검토해야 합니다.
- 최종 신호를 다음과 같이 계산합니다.
(테스트 영역 RBC - 테스트 영역 배경) - (제어 영역 RBC - 제어 영역 배경) 수동 분석;
(테스트 영역 - 제어 영역) 자동 분석.
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Representative Results
RBC 단백질의 급성 변이의 검출을 용이하게 하는 방법을 설명하는 제시된 프로토콜은 잘 알려진 기계적으로 민감한 단백질 변이인 세린 1177 잔기에서 RBC-NOS의 인산화에 대해 테스트되었습니다. 건강한 지원자로부터 전혈을 얻은 후 두 개의 개별 분취량으로 분할했습니다. 주어진 혈액 샘플을 300초 동안 생리학적 크기(5Pa)의 기계적 전단 응력에 노출시켰으며, 이는 이전에 세린 1177에서 RBC-NOS 인산화를 유도하는 것으로 나타났습니다14. 기계적 전단 노출의 중단 직후, 혈액 샘플을 파라포름알데히드로 고정시켰다. 대조군으로서 혈액 샘플을 노출시키고 전단 장치에 로드하고 파라포름알데히드에 고정하기 전에 300초 동안 그대로 두었습니다. 휴식 시 세린 1177 잔기에서 인산화된 RBC-NOS에 대한 항체의 신호와 기계적 힘 노출에 대한 반응은 면역조직화학(그림 3A,B)과 면역형광(그림 3C,D)을 모두 사용하여 평가되었습니다. 전단 샘플과 전단되지 않은 샘플은 통계적으로 유의하게 다른 신호를 생성했습니다[Friedman 테스트: χ2(3) = 18.71, p = 0.0003]. 면역조직화학적 또는 면역형광 프로토콜로 평가했을 때 각각의 전단되지 않은 세포(둘 다 p < 0.01)와 비교하여 RBC의 기계적 힘 노출에 대한 반응으로 세린 1177 잔기에서 인산화된 RBC-NOS에 대해 표적화된 항체의 신호의 약 3배 증가가 검출되었습니다(그림 3E).
따라서, 두 방법으로 얻어진 결과의 비교는 제시된 프로토콜 간의 우수한 일치를 나타내며, 이는 또한 기계적 자극에 대한 반응으로 증가된 RBC-NOS 인산화를 성공적이고 안정적으로 검출하였다.
그림 3: 기계적 전단 후 RBC-NOS 세린 1177 인산화의 면역조직화학(A,B) 및 면역형광(C,D) 염색의 대표적인 통합 데이터. 이러한 샘플의 신호 강도 분석은 (E)에 나와 있으며, 여기서 흰색 막대는 HRP 염색을 사용하여 얻은 데이터를 나타내고 검은색 막대는 형광 방법을 사용하여 얻은 데이터를 나타냅니다. 혈액은 정지 상태에서 또는 기계적 힘(즉, 전단)에 노출된 직후에 준비되었습니다. N = 7개의 혈액 샘플을 별개의 기증자로부터 얻었습니다. 평균의 표준 오차± 평균으로 표시된 데이터입니다. **p < 0.01, 비모수 Friedman 검정을 사용하여 결정됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
최근 문헌은 RBC-NOS 단백질 이 RBC 변형성 15,22,23의 조절에 결정적으로 중요하다는 것을 강력히 시사하며, 이는 차례로 좁은 모세혈관을 통한 통과를 용이하게 한다 24. 단백질 활성은 번역 후 단백질 변형, 특히 특정 잔기의 인산화에 크게 의존한다18. 관심의 초점은 RBC-NOS 단백질23의 활성화와 관련된 인산화 부위 1177에 있습니다. 이 단백질의 변화는 다양한 질병(25,26,27,28,29)에서 나타났 으며, 따라서 이러한 변화에 대한 조사는 특정 질병의 이해뿐만 아니라 특정 치료법을 개발하고 안내하는 데 귀중한 지식을 제공할 수 있다30.
RBC-NOS 세린 1177 인산화를 증가시키는 몇 가지 자극이 확인되었지만(22), 기계적 힘은 RBC-NOS 단백질 13,18,31,32의 활성화 또는 조절을 유발하는 주요 세포외 자극인 것으로 보인다. 그러나, RBC-NOS 활성의 조절은 다소 일시적이다33; 따라서 전단 의존적 변경의 분석/보존이 즉시 수행되어야 합니다. 면역조직화학적, 그리고 이후의 면역형광 프로토콜은 RBC-NOS의 급성, 조절 변형의 보존 및 분석을 용이하게 하기 위해 개발되었습니다.
면역조직화학 및 면역형광 프로토콜을 통해 얻은 여기에 제시된 결과는 전단 노출 후 RBC-NOS 세린 1177의 인산화 증가와 관련하여 높은 수준의 일치를 보여줍니다. 따라서 두 프로토콜 모두 RBC 단백질의 일시적인 번역 후 변화를 조사하는 데 적합하며, 각 실험자는 현지에서 사용 가능한 자원과 인프라를 고려하여 해당 실험실에서 사용할 수 있는 방법을 결정할 수 있습니다. 단백질을 표적으로 하는 항체의 광범위한 상업적 이용 가능성을 감안할 때, 본래 상태 또는 번역 후 변형 후, 본 분석은 상당한 범위의 표적에 적용할 수 있습니다. 따라서, 이들은 RBC 신호(14,27,34)를 평가하기 위한 유용한 도구들을 제시한다.
절차 중에 특정 측면을 고려해야 합니다. 언급된 항체는 적혈구에 적용되도록 특별히 개발되지 않았다. 대신, 이들은 특정 내피형 NOS(eNOS) 항체입니다. eNOS와 RBC-NOS는 큰 상동성을 공유하는 것으로 보이기 때문에22,23, eNOS 특이적 항체는 전통적으로 RBC-NOS 활성화를 시각화하는 데 사용되었습니다. 유도성(iNOS) 또는 뉴런(nNOS) 동형에 대한 항체는 적혈구에서 신호를 생성하지 않으며, 이는 RBC-NOS가 eNOS22와 상당한 구조적 유사성을 공유한다는 것을 뒷받침한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 공급업체가 권장하는 데이터는 테스트 없이 RBC 실험에 적용할 수 없기 때문에 실험에 항체를 사용하기 전에 적절한 희석을 테스트해야 합니다. 또한, 유통 회사의 전환은 사용 전에 다양한 희석액에 대한 과도한 테스트가 필요합니다. 새로 공급된 항체/화학 물질을 테스트할 때 매우 체계적인 접근 방식을 따르는 것이 좋습니다. 새로운 성분은 용량-반응 접근법으로 테스트해야 하며, 여기서 새로운 성분을 도입하는 특정 단계만 변경해야 합니다. 양성 대조군(즉, RBC-NOS 활성화 자극)은 여기에 제시된 바와 같이 전단된 혈액과 전단되지 않은 혈액을 비교하여 제공되어야 합니다. 대안적으로, 350 pM 인슐린을 사용한 RBC-NOS 인산화의 약리학적 자극은 기계적 힘 적용에서 관찰된 것과 유사하게 증가된 RBC-NOS 인산화를 초래하는 것으로 나타났다7.
제시된 검출 방법의 한계는 상업적으로 수득된 1차 항체(예: 웨스턴 블롯)의 특이성에 의존하는 방법의 일반적인 한계로 확장됩니다. 첫째, 관심 항원을 표적으로 하는 1차 항체를 사용할 수 있어야 합니다. 가능한 경우, 항체는 표적에 대해 특이적이어야 하며, 이는 기능적 측정(즉, 활성제/억제제를 사용한 약리학적 치료) 또는 웨스턴 블로팅을 사용하여 확인할 수 있습니다. 또한 설명된 방법을 통해 생성된 데이터를 신중하게 해석해야 합니다. 즉, 제시된 방법은 적절한 대조 샘플과 관련된 단백질 변형의 변화에 대한 정보를 제공하는 반정량적입니다. 여기에 제시된 반정량적 평가는 항상 효소의 활성화를 의미하며 효소 활성과 혼동되어서는 안 됩니다. 효소 활성의 측정은 [3 H] L-아르기닌에서 [3H] 시트룰린으로의 전환율 (fmol/min) 또는 [14 C] L-아르기닌에서 [14C] 시트룰린35,36으로의 전환율(fmol/min)을 측정하는 아르기닌-시트룰린 분석과 같은 별도의 분석이 필요합니다. 증가된 RBC-NOS 활성화가 또한 더 높은 NO 수준 및/또는 증가된 RBC 변형성 값을 동반하는지 여부를 확인하기 위해, 예를 들어 NO 농도에 대한 추가 분석이 수행되어야 한다. 또한, RBC-NOS를 NO의 공급원으로 꼽기 위해서는 L-NIO와 같은 NOS 억제제를 사용해야 한다15.
여기에 제시된 방법은 자극되지 않은 대조군 세포에 비해 적용된 자극에 대한 반응으로 RBC-NOS 활성화의 변화를 분석하기 위해 잘 개발되었다고 요약할 수 있습니다. 따라서 이러한 방법은 기계적 스트레스가 세포 기능에 중요하고 궁극적으로 작업 조직의 적절한 관류 및 가스 교환에 필수적인 RBC 단백질의 기능에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 데 기여합니다.
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Disclosures
모든 저자는 이해 상충이 없다고 밝혔습니다.
Acknowledgments
LK는 호주 정부 연구 훈련 프로그램 장학금의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
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