Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Сборка липосом с октанолом на чипе для биоинженерии

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65032
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter, Wageningen University & Research
* These authors contributed equally

Summary

Настоящий протокол описывает октанол-ассистированную сборку липосом (OLA), микрофлюидный метод получения биосовместимых липосом. OLA производит монодисперсные липосомы микронного размера с эффективной инкапсуляцией, что позволяет немедленно проводить эксперименты на кристалле. Ожидается, что этот протокол будет особенно подходящим для синтетической биологии и исследований синтетических клеток.

Abstract

Микрофлюидика является широко используемым инструментом для получения капель и везикул различных видов контролируемым и высокопроизводительным способом. Липосомы представляют собой упрощенные клеточные имитаторы, состоящие из водной внутренней части, окруженной липидным бислоем; Они ценны для проектирования синтетических клеток и понимания основ биологических клеток in vitro и важны для прикладных наук, таких как доставка грузов для терапевтических применений. В этой статье подробно описывается рабочий протокол для микрофлюидного метода на кристалле, сборки липосом с помощью октанола (OLA), для получения монодисперсных биосовместимых липосом микронного размера. OLA функционирует аналогично выдуванию пузырьков, когда внутренняя водная (IA) фаза и окружающая липидосодержащая 1-октанольная фаза отщепляются внешними потоками жидкости, содержащими поверхностно-активное вещество. При этом легко образуются капли двойной эмульсии с выступающими октанольными карманами. Когда липидный бислой собирается на границе раздела капель, карман самопроизвольно отделяется, образуя однослойную липосому, готовую к дальнейшим манипуляциям и экспериментам. OLA обеспечивает ряд преимуществ, таких как стабильная генерация липосом (>10 Гц), эффективная инкапсуляция биоматериалов и монодисперсные популяции липосом и требует очень малых объемов образца (~ 50 мкл), что может иметь решающее значение при работе с драгоценными биологическими препаратами. Исследование включает в себя подробную информацию о микрообработке, мягкой литографии и пассивации поверхности, которые необходимы для внедрения технологии OLA в лаборатории. Доказательство принципа применения синтетической биологии также показано путем индуцирования образования биомолекулярных конденсатов внутри липосом посредством трансмембранного потока протонов. Ожидается, что этот сопроводительный видеопротокол облегчит читателям установку и устранение неполадок OLA в своих лабораториях.

Introduction

Все клетки имеют плазматическую мембрану в качестве своей физической границы, и эта мембрана по существу представляет собой каркас в виде липидного бислоя, образованного самосборкой амфифильных липидных молекул. Липосомы являются минимальными синтетическими аналогами биологических клеток; Они имеют водный просвет, окруженный фосфолипидами, которые образуют липидный бислой с гидрофильными головными группами, обращенными к водной фазе, и гидрофобными хвостами, заглубленными внутрь. Стабильность липосом определяется гидрофобным эффектом, а также гидрофильностью между полярными группами, силами Ван-дер-Ваальса между гидрофобными углеродными хвостами и водородной связью между молекулами воды и гидрофильными головками 1,2. В зависимости от количества липидных бислоев липосомы можно разделить на две основные категории, а именно: однослойные везикулы, содержащие один бислой, и многослойные везикулы, построенные из нескольких бислоев. Однопластинчатые везикулы дополнительно классифицируются в зависимости от их размеров. Обычно сферической формы, они могут быть изготовлены в различных размерах, включая небольшие однослойные везикулы (SUV, диаметр 30-100 нм), большие однослойные везикулы (LUV, диаметр 100-1000 нм) и, наконец, гигантские однослойные везикулы (GUV, диаметр >1,000 нм)3,4. Для получения липосом были разработаны различные методы, и их можно разделить на объемные методы5 и микрофлюидные методы6. Обычно практикуемые объемные методы включают регидратацию липидной пленки, электроформацию, перенос инвертированной эмульсии и экструзию 7,8,9,10. Эти методы относительно просты и эффективны, и это основные причины их широкого использования в сообществе синтетической биологии. Однако в то же время они страдают серьезными недостатками, связанными с полидисперсностью по размеру, отсутствием контроля над ламеллярностью и низкой эффективностью инкапсуляции 7,11. Такие методы, как инкапсуляция непрерывного пересечения интерфейса капель (cDICE)12 и капельная съемка и фильтрация по размеру (DSSF)13, в некоторой степени преодолевают эти ограничения.

За последнее десятилетие микрофлюидные подходы приобрели все большее значение. Микрофлюидная технология обеспечивает управляемую среду для управления потоками жидкости в заданных пользователем микроканалах благодаря характерному ламинарному течению и массообмену с преобладанием диффузии. Полученные в результате устройства «лаборатория-на-чипе» предлагают уникальные возможности для пространственно-временного контроля молекул со значительно уменьшенными объемами образцов и возможностями мультиплексирования14. Были разработаны многочисленные микрофлюидные методы получения липосом, в том числе импульсная струя15, двойная эмульсионная шаблонизация16, переходный мембранный выброс 17, перенос капельной эмульсии 18 и гидродинамическая фокусировка 19. Эти методы позволяют получить монодисперсные, одноламеллярные липосомы размером с клетку с высокой эффективностью инкапсуляции и высокой пропускной способностью.

В этой статье подробно описана процедура сборки липосом с помощью октанола (OLA), микрофлюидного метода на кристалле, основанного на гидродинамическом отщипывании и последующем механизме обезвоживания растворителем20 (рис. 1). Работу OLA можно связать с процессом выдувания пузырей. Шестистороннее соединение фокусирует внутреннюю водную (IA) фазу, два липидонесущих органических (LO) потока и два внешних водных потока (OA), содержащих поверхностно-активное вещество, в одном месте. Это приводит к образованию двойных капель эмульсии вода-в-(липиды + октанол) в воде. По мере того, как эти капли текут вниз по потоку, минимизация межфазной энергии, внешний сдвиговый поток и взаимодействие со стенками канала приводят к образованию липидного бислоя на границе раздела по мере того, как карман растворителя отделяется, образуя тем самым однослойные липосомы. В зависимости от размера октанольного кармана процесс обезвоживания может занять от десятков секунд до нескольких минут. В конце выходного канала менее плотные капли октанола всплывают на поверхность, тогда как более тяжелые липосомы (из-за более плотного инкапсулированного раствора) опускаются на дно камеры визуализации, готовые к экспериментам. В качестве репрезентативного эксперимента продемонстрирован процесс разделения жидкостной и жидкостной фаз (LLPS) внутри липосом. Для этого необходимые компоненты инкапсулируются внутри липосом при кислом рН, что предотвращает LLPS. При внешнем вызове изменения рН и, таким образом, трансмембранного потока протонов, внутри липосом образуются разделенные по фазам капли конденсата. Это подчеркивает эффективные возможности инкапсуляции и манипулирования системой OLA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Изготовление мастер-пластины

  1. Возьмите чистую кремниевую пластину диаметром 4 дюйма (10 см) (см. Таблицу материалов). Очистите его дополнительно с помощью сжатого воздуха, чтобы удалить частицы пыли.
  2. Установите пластину на спин-коутер и аккуратно распределите ~ 5 мл негативного фоторезиста (см. Таблицу материалов) в центр пластины. Старайтесь избегать пузырьков воздуха, так как они могут помешать процессу последующей печати пластины.
  3. Чтобы получить слой фоторезиста толщиной 10 мкм, нанесите на пластину спиновое покрытие при 500 об/мин в течение 30 с с ускорением 100 об/мин для начального растекания, а затем на 60 с вращением при 3000 об/мин с ускорением 500 об/мин. Если требуется другая толщина, измените параметры отжима в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Выпекайте на нагревательной плите в течение 2 минут при 65 ° C, а затем в течение 5 минут при 95 ° C.
  5. Как только пластина остынет, установите пластину в печатную камеру оптической литографической машины с прямой записью (см. Таблицу материалов) и загрузите конструкцию OLA (рис. 2A, файл дополнительного кодирования 1) в программное обеспечение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция OLA по существу состоит из двух каналов OA, двух каналов LO и одного канала IA, которые сливаются, образуя шестистороннее соединение, которое продолжается как канал пост-продакшн и заканчивается в экспериментальной скважине (EW).
  6. Распечатайте дизайн (рисунки) OLA на пластине с покрытием с помощью УФ-лазера (см. Таблицу материалов) с дозой 300 мДж/см2.
  7. После того, как дизайн будет напечатан, выпекайте при 65 ° C в течение 1 мин, а затем при 95 ° C в течение 3 мин.
  8. На этом этапе убедитесь, что контур печатного устройства отображается на пластине и виден невооруженным глазом. Чтобы смыть неотвержденный фоторезист, опустите пластину в стеклянный стакан с раствором проявителя (см. Таблицу материалов) до полного удаления неотвержденного фоторезиста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезмерная обработка проявителя может повлиять на разрешение проекта.
  9. Последовательно промойте пластину ацетоном, изопропанолом и деионизированной (DI) водой и, наконец, воздухом под давлением/N2 с помощью выдувного пистолета.
  10. Жестко выпекайте пластину при 150 °C в течение 30 минут, чтобы убедиться, что напечатанный дизайн надежно прикреплен к поверхности пластины и не отрывается в процессе последующего изготовления. После этого мастер-пластина готова к дальнейшему использованию (рис. 2B).

2. Подготовка микрофлюидного устройства

  1. Поместите мастер-пластину на квадратный кусок алюминия и оберните алюминиевую фольгу вокруг пластины, образуя хорошо похожую структуру (рис. 2C).
  2. Отмерьте 40 г полидиметилсилоксана (PDMS) и 4 г отвердителя (10:1, весовое соотношение, см. Таблицу материалов) в центрифужной пробирке объемом 50 мл и энергично перемешайте лопаткой или наконечником пипетки в течение 2-3 минут.
  3. Интенсивное смешивание PDMS и отвердителя задерживает пузырьки воздуха внутри смеси. Открутите пробирку при 100 x g в течение 2-3 минут, чтобы удалить большинство крупных пузырьков воздуха.
  4. Вылейте на мастер-пластину примерно 15-20 г смеси, приготовленной на шаге 2.3, и дегазируйте с помощью эксикатора. Сохраните излишки смеси, чтобы сделать предметные стекла с покрытием PDMS (шаг 3).
  5. Инкубируйте сборку в духовке при температуре 70 °C не менее 2 часов.
  6. Достаньте из духовки и дайте ей остыть. Чтобы снять затвердевший блок PDMS, снимите алюминиевую фольгу и осторожно снимите блок PDMS с края пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина хрупкая и может сломаться, поэтому важно выполнять этот процесс осторожно.
  7. После того, как блок PDMS будет удален, держите узорчатую структуру лицом вверх и с помощью острого лезвия или скальпеля разрежьте отдельные блоки PDMS, каждый из которых содержит одно микрофлюидное устройство.
  8. Поместите блок PDMS на темную поверхность, и отрегулируйте направление света (для этого пригодится настольная лампа) так, чтобы гравированные каналы были блестящими и, как следствие, видимыми. Проделайте отверстия во входных отверстиях и выходном канале с помощью пуансонов диаметром 0,5 мм и 3 мм (см. Таблицу материалов) соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте острый пуансон для биопсии, чтобы избежать трещин в PDMS, которые могут вызвать утечку в дальнейшем. Осторожно протолкните перфоратор биопсии через блок PDMS и убедитесь, что он полностью проходит через него. Чтобы удалить пуансон для биопсии, осторожно втяните его, вращая в разных направлениях. Блок PDMS с выгравированным рисунком OLA теперь готов к соединению с предметным стеклом с покрытием PDMS.

3. Изготовление предметного стекла с покрытием PDMS

  1. Возьмите прозрачное стеклянное покровное стекло, вылейте примерно 0,5 мл PDMS (приготовленного в избытке на шаге 2.4) в центр предметного стекла и распределите его по покровному стеклу, осторожно наклоняя предметное стекло, обеспечивая полное покрытие предметного стекла PDMS.
  2. Установите предметное стекло на отжим, убедитесь, что оно расположено по центру (так, чтобы середина предметного стекла перекрывалось центром напорного вала), и вращайте предметное стекло со скоростью 500 об/мин в течение 15 с (с шагом 100 об/мин), а затем со скоростью 1 000 об/мин в течение 30 с (с шагом 500 об/с).
  3. Поместите предметное стекло с покрытием PDMS (с покрытием стороной вверх) на приподнятую платформу, как блок PDMS (1 см x 1 см), в закрытую чашку Петри и запекайте его при температуре 70 °C в течение 2 часов.

4. Склеивание микрофлюидного устройства

  1. Очистите блок PDMS (подготовленный на шаге 2), дважды приклеив и удалив имеющийся в продаже скотч (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что очищенная сторона обращена вверх до использования.
  2. Очистите предметное стекло с покрытием PDMS воздухом под давлением/N2 с помощью выдувного пистолета и держите чистой стороной вверх.
  3. Поместите блок PDMS (гравированные каналы вверх) и предметное стекло с покрытием PDMS (с покрытием стороной вверх) в вакуумную камеру плазменного очистителя (см. Таблицу материалов).
  4. Включите вакуум и подвергните содержимое воздействию воздушной плазмы на радиочастоте 12 МГц (высокий радиочастотный режим) в течение 15 с, чтобы активировать поверхности. Кислородную плазму можно увидеть в виде розоватого оттенка.
  5. Сразу после плазменной обработки поместите предметное стекло с покрытием PDMS на чистую поверхность стороной PDMS вверх. Аккуратно поместите блок PDMS так, чтобы микрофлюидный узор теперь был обращен к предметному стеклу с покрытием PDMS, чтобы они сцепились (рис. 2D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление воздуха, попавшего в устройство, имеет решающее значение для обеспечения тщательного склеивания.
  6. Выпекайте склеенные устройства при температуре 70 °C в течение 2 часов.

5. Функционализация поверхности микрофлюидного устройства

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед функционализацией поверхности важно откалибровать нагнетательный насос в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов) и собрать трубку для подключения ее к микрофлюидному устройству.

  1. Подключение микрофлюидного устройства к нагнетательным насосам
    1. Подключите регулятор расхода с приводом от давления к внешнему источнику давления (до 6 бар). Требуется не менее четырех независимых каналов давления воздуха: три отдельных модуля с давлением 0-2 бар и один модуль с давлением −0,9-4 бар.
    2. Откалибруйте нагнетательный насос в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов).
    3. Разрежьте трубку (1/16 дюйма с наружным диаметром x 0,02 дюйма с внутренним диаметром) на четыре одинаковых куска длиной примерно 20 см.
    4. Вставьте изогнутые соединители из нержавеющей стали 23 G под углом 90° (см. Таблицу материалов) на один конец каждой детали. Затем этот конец вставляют в три входа (OA, LO и IA) микрофлюидного устройства, а четвертый используется для удаления избытка раствора (этап 5.2.5).
    5. Вставьте другой конец трубки в подставку микрофлюидного резервуара и герметизируйте ее с помощью микрофлюидных фитингов, убедившись, что трубка достаточно длинная, чтобы касаться дна резервуара (трубки объемом 1.5 мл, см. Таблицу материалов). Это предотвращает попадание нежелательных пузырьков воздуха в микрофлюидное устройство во время обработки ПВА / производства липосом.
  2. ПВА обработка выходного канала
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед образованием липосом крайне важно сделать устройство частично гидрофильным после производственного узла. Это делается путем обработки этих каналов 5% (мас./об.) раствором поливинилового спирта (ПВА). Раствор ПВА готовят путем растворения порошка ПВА (см. Таблицу материалов) в воде при 80 °С в течение 3 ч при постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки. Отфильтруйте раствор перед использованием его для обработки поверхности. Сразу после склеивания устройства микрофлюидные каналы становятся гидрофильными из-за плазменно-индуцированной поверхностной активации, и они постепенно снова становятся гидрофобными. Рекомендуется подождать 2 часа после выпечки (шаг 4.6), прежде чем начинать обработку ПВА.
    1. Распределите 200 мкл 5% раствора ПВА по массе в пробирку объемом 1,5 мл и подсоедините ее к подставке для микрофлюидного резервуара. Вставьте трубку (ту, которая указана на шаге 5.1.3) таким образом, чтобы один конец был погружен в раствор ПВА, а другой конец был соединен с входным отверстием канала ОА микрофлюидного устройства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более низкая концентрация ПВА может привести к некачественной функционализации поверхности.
    2. Повторите описанный выше шаг без ПВА (пустая пробирка 1,5 мл) и подключите его к каналам LO и IA.
    3. Увеличьте давление фазы ОА до 100 мбар, чтобы раствор ПВА протекал в каналах ОА. Увеличьте давление фаз IA и LO до 120 мбар, чтобы предотвратить обратный поток раствора PVA внутри этих каналов (рис. 2E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте давление в отдельных каналах, чтобы мениск оставался устойчивым в месте производственного соединения.
    4. Таким образом распределите раствор ПВА в течение примерно 5 минут, обеспечивая полную функционализацию выходного канала.
    5. Чтобы удалить раствор ПВА, отсоедините трубку от входа ОА и немедленно увеличьте давление в каналах LO и IA до 2 бар. Одновременно с помощью трубки, подключенной к каналу отрицательного давления (−900 мбар), удалите излишки ПВС сначала из выходного канала, а затем из входного отверстия ОА (рис. 2F).
    6. Выпекайте устройство при температуре 120 °C в течение 15 минут и дайте ему остыть перед использованием. Устройство можно хранить в условиях окружающей среды не менее 1 месяца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется подождать 1 день (при комнатной температуре), прежде чем приступать к OLA, чтобы убедиться, что необработанный PDMS восстанавливает свою гидрофобность после обработки плазмой.

6. Октанол-ассистированная сборка липосом (OLA)

  1. Подготовка липидного запаса
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь в качестве примера используется смесь липидов 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DOPC) и 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина-N- (лиссамин родамин B сульфонил) (Liss Rhod PE) (см. Таблицу материалов); Пользователи должны подготовить необходимый им липидный состав аналогичным образом.
    1. Распределите 76 мкл DOPC (25 мг/мл) и 16,6 мкл Liss Rhod PE (1 мг/мл) в колбу с круглым дном с помощью отдельных стеклянных шприцев.
    2. Держите колбу с круглым дном в вертикальном положении и используйте сжатый выдувной пистолет N2, чтобы дать мягкую струю азота для испарения хлороформа и образования высушенной липидной пленки на дне колбы.
    3. Поместите колбу в эксикатор не менее чем на 2 часа под непрерывным вакуумом, чтобы удалить оставшийся хлороформ.
    4. Добавьте 100 мкл этанола в колбу с круглым дном, а затем осторожно пипетируйте или встряхните, чтобы убедиться, что липиды растворены с образованием 10% (мас./об.) липидного запаса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если определенный липидный состав не полностью растворим в этаноле, используйте смесь этанола и хлороформа, сохраняя объем хлороформа как можно меньше.
    5. Наберите раствор пипеткой во флакон из темного стекла. Аккуратно промойте флакон азотом с помощью выдувного пистолета, чтобы заменить воздух инертной атмосферой. Закройте крышку парафиновой пленкой и храните при температуре -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стоковый раствор можно использовать до нескольких месяцев. Каждый раз, когда флакон открывается, аккуратно заменяйте воздух азотом и снова закрывайте крышкой парафиновой пленкой.
  2. Подготовка решений OLA
    1. Изготавливают исходные растворы незаменимых компонентов: декстрана 20 мМ (МВт 6 000); 60% (об./об.) глицерина; буфер выбора. В этом случае готовили 5-кратный фосфатно-буферный физиологический раствор (0,68 М NaCl, 13,5 мМ KCl, 50 мМ Na 2 HPO4, 9 мМ KH2PO 4; рН 7,4) (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку чистый глицерин очень вязкий, рекомендуется вырезать небольшой кусочек на конце наконечника пипетки наклонным образом для эффективного пипетирования.
    2. Приготовьте 100 мкл образцов IA, OA и выходного раствора (ES, желаемого раствора для заполнения EW). Для простоты визуализации в раствор ИА в данном конкретном случае добавляли желтый флуоресцентный белок (YFP). Проверьте осмотический баланс между IA и OA, рассчитав осмолярность инкапсулированных компонентов и добавив соответствующее количество сахара или соли в OA, если это необходимо. Это делается для того, чтобы предотвратить разрыв или сжатие липосом во время производства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные составы трех фаз следующие:
      IA: 15% глицерина, 5 мМ декстрана (6 000 МВт), 5,4 мкМ YFP, 1x PBS
      ОА: 15% глицерина, 5% поверхностно-активного вещества F68, 1x PBS
      ES: 15% глицерин, 1x PBS
      Более низкая концентрация поверхностно-активного вещества F68 отрицательно влияет на образование двойных эмульсий.
    3. Приготовьте 80 мкл фазы LO путем пипетки 4 мкл исходного липида в 76 мкл 1-октанола (см. Таблицу материалов). Конечная концентрация DOPC составляет 5 мг / мл.
    4. Центрифугируйте образцы при 700 x g в течение 60 с, чтобы удалить любые крупные агрегаты, прежде чем приступать к микрофлюидным экспериментам. Это предотвращает попадание каких-либо очевидных факторов засорения в микрофлюидный чип.
  3. Производство липосом
    1. Распределите растворы (IA, LO, OA) в три пробирки объемом 1,5 мл, соберите их (как указано на шаге 5.1) и подключите их к микрофлюидному чипу, обработанному ПВА (этап 5.2.6).
    2. Приложите положительное давление к трем каналам: ~100 мбар на каналах IA и LO и ~200 мбар на канале OA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку давление ОА выше, чем у других, раствор ОА первым поступит в РЭБ; Это настоятельно рекомендуется.
    3. Как только раствор ОА достигнет EW, уменьшите давление ОА до 100 мбар и увеличьте гетеродин до 200 мбар.  Раствор гетеродина, прибывающий на стык производства, скорее всего, приведет к образованию пузырьков воздуха из-за вытеснения воздуха из каналов гетеродина. После того, как пузырьки воздуха попадут в EW, отрегулируйте давление гетеродина до 100 мбар. Наконец, увеличьте давление IA до 200 мбар и подождите, пока весь воздух в канале IA не будет удален. Идеальной последовательностью прибытия на стык трех фаз является, таким образом, OA, LO и IA.
    4. После удаления воздуха из трех каналов отрегулируйте давление в канале до 50 мбар и введите 10 мкл ES в выходную камеру. После пипетки ES наденьте на выходное отверстие защитную крышку, чтобы избежать испарения. В случае, если гетеродин выталкивается назад, постепенно увеличивайте давление гетеродина с шагом 1 мбар, пока оно не начнет течь к спаю.
    5. Как только все три фазы начнут сотечь на стыке, убедитесь, что начинается производство двойной эмульсии, и отрегулируйте ее в соответствии с ее качеством (рис. 3A-C). Изменяйте давление постепенно (с шагом 0,1-1 мбар), а не резко, если давление не изменяется, чтобы устранить нежелательное засорение канала.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каналы, которые нужно настроить, зависят от того, что происходит на стыке. Например, IA необходимо уменьшить, если эмульсии слишком большие; ОА необходимо увеличить, если образуются двойные эмульсии, но они лопаются, а не отщипываются; и ЛО нужно уменьшить, если октанольный карман слишком большой.
    6. Убедитесь, что капли двойной эмульсии стекают вниз по потоку к EW. По мере того, как они текут, октанольные карманы становятся все более и более заметными и, наконец, защемляются, образуя липосомы (рис. 3D-F). Убедитесь, что канал постпродакшена достаточно длинный, а миграция двойных эмульсий достаточно медленная для обезвоживания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В течение нескольких минут после приличного производства липосомы и капли октанола выйдут из канала постпродакшна и попадут в РЭБ. В результате, будучи менее плотными, чем вода, капли октанола всплывают на поверхность ЭС. Из-за добавления декстрана в ИА липосомы тяжелее своего окружения и уходят на дно камеры, готовые к наблюдению и дальнейшим манипуляциям.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Это исследование демонстрирует образование безмембранных конденсатов в процессе разделения жидкой и жидкой фаз (LLPS) внутри липосом в качестве репрезентативного эксперимента.

Пробоподготовка
IA, OA, ES и кормовой раствор (FS) готовятся следующим образом:

IA: 12% глицерина, 5 мМ декстрана, 150 мМ KCl, 5 мг/мл поли-L-лизина (PLL), 0,05 мг/мл поли-L-лизина-FITC меченого (PLL-FITC), 8 мМ аденозинтрифосфата (АТФ), 15 мМ цитрат-HCl (рН 4)

ОА: 12% об./об. глицерина, 5% мас./об. F68, 150 мМ KCl, 15 мМ цитрат-HCl (рН 4)

ES: 12% глицерина, 150 мМ KCl, 15 мМ цитрат-HCl (рН 4)

FS: 12% глицерина, 150 мМ KCl, 75 мМ Tris-HCl (рН 9)

Образование конденсата внутри липосом
Для демонстрации феноменов LLPS в липосомах был выбран простой анализ pH-чувствительной комплексной коацервации положительно заряженного поли-L-лизина (ФАПЧ) и отрицательно заряженного поливалентного аденозинтрифосфата (АТФ). Для предотвращения фазового разделения полилизина и АТФ при инкапсуляции рН раствора поддерживали на уровне 4, при котором АТФ нейтрален. Увеличение рН ЭС путем добавления FS (буфер рН 9) в конечном итоге увеличивало рН внутри липосом из-за трансмембранного потока протонов, делая АТФ отрицательно заряженным и вызывая его фазовое разделение с положительно заряженным ФАПЧ21 (рис. 4А). Примерно через 2 ч после образования липосом давления IA и LO были отключены. Давление в канале ОА поддерживалось на уровне 100 мбар, чтобы оставшиеся липосомы медленно поступали в камеру наблюдения. После того, как все липосомы в канале были восстановлены в EW, давление было отключено, чтобы остановить поток и предотвратить движение липосом. Липосомы, полученные при более низком pH, показали гомогенную флуоресценцию (из инкапсулированного флуоресцентного PLL-FITC) в их просвете (рис. 4B, D). Капли октанола, плавающие на поверхности, удаляли путем осторожного пипетирования 5 мкл раствора сверху, чтобы предотвратить их влияние на дальнейшие этапы пипетирования. Впоследствии к РЭБ добавляли 10 мкл буфера FS, что вызывало фазовое разделение инкапсулированных ФАПЧ и АТФ. Однородная флуоресценция FITC из каждой липосомы постепенно трансформировалась в отдельные флуоресцентные капли конденсата. В конце концов, отдельные капли слились в одну большую каплю конденсата, которая свободно диффундировала внутри липосом (рис. 4C, E-G).

Figure 1
Рисунок 1: Схема, показывающая сборку и работу OLA. Регулятор давления подключен к резервуарам, содержащим внешние водные, липидно-октанольные и внутренние водные растворы. Трубки, вставленные в резервуары, подключаются к соответствующим входным отверстиям устройства OLA. Соответствующие потоки в трех каналах приводят к образованию двойных эмульсий вода-в-(липид-в-октаноле)-в-воде. Образовавшиеся двойные эмульсии мигрируют в выходную лунку, во время которой октанольные карманы отделяются, образуя липосомы. Сформированные липосомы собираются на дне скважины для визуализации и дальнейших экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Подготовка чипа OLA (фотолитография, микрообработка, обработка поверхности). (A) Цифровой дизайн, демонстрирующий ключевые особенности конструкции OLA, включая три входа, выход и шестисторонний производственный узел. (B) Схема мастер-пластины, показывающая несколько конструкций УПВ, изготовленных с использованием УФ-литографии. (C) Эластомер PDMS, отлитый на основной пластине, помещенный в лунку, изготовленную из алюминиевой фольги, и отвержденный путем выпечки при 70°С в течение 2 ч. (D) Микрофлюидное устройство, связанное с помощью кислородно-плазменной обработки, в котором блок PDMS, содержащий конструкцию OLA, прикреплен к предметному стеклу с покрытием PDMS. (E) Функционализация поверхности изготовленного чипа для придания устройству частичной гидрофильности. Это делается путем подачи 5% ПВС в течение 5 мин от внешнего водного канала к выходному каналу. Положительное давление воздуха в других каналах предотвращает попадание раствора ПВА в эти каналы. (F) ПВС удаляется путем применения вакуума в выходном канале. Устройство выпекается при 120 °C в течение 15 минут и готово к использованию. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Демонстрация эффективного производства OLA монодисперсных двойных эмульсий и, в конечном итоге, липосом с отличной инкапсуляцией. (A) Изображение в светлом поле, показывающее быстрое образование капель двойной эмульсии. (B) Флуоресцентный липидный канал показывает образование октанольного кармана из-за частичного обезвоживания. Липидно-октанольная фаза содержала смесь DOPC (5 мг / мл) и Lis Rhod PE в соотношении 1,000:1. (C) Внутренний водный канал, показывающий инкапсуляцию желтого флуоресцентного белка (YFP). Вставки в (A-C) показывают репрезентативные увеличенные виды соответствующих панелей (масштабные линейки = 10 мкм). (Д-Ж) Обезвоживание октанольного кармана в выходном канале, который образует липосому. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Фазовое разделение pLL/АТФ в липосомах, вызванное pH-инициируемым pLL/АТФ. (A) Схема рН-зависимого перехода гомогенного раствора pLL и АТФ, инкапсулированного внутри липосомы (слева), в фазоразделенные коацерваты pLL/АТФ (справа). Исходная кислая среда в липосоме делает молекулярный заряд АТФ нейтральным, ингибируя коацервацию. Когда рН внутри липосом уравновешивается с наружным повышением рН, АТФ получает отрицательный заряд, вызывая коацервацию. (Б-С) Линейные графики (соответствующие пунктирным линиям на панелях [D] и [G] соответственно), показывающие пространственное распределение pLL (зеленый канал) и мембраны (красный канал). (Д-Г) Покадровые изображения, показывающие образование коацерватов pLL/АТФ в липосомах. Внешнее добавление основного буфера повышает уровень pH внутри липосом в течение нескольких минут и инициирует коацервацию. t = 0 мин относится к времени непосредственно перед возникновением первого события коацервации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл кодирования 1: файл САПР проекта OLA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Клеточная сложность делает чрезвычайно трудным понимание живых клеток при изучении в целом. Снижение избыточности и взаимосвязанности клеток путем воссоздания ключевых компонентов in vitro необходимо для дальнейшего понимания биологических систем и создания искусственных клеточных имитаторов для биотехнологических применений22,23,24. Липосомы служат отличной минимальной системой для понимания клеточных явлений. Неполный список этих явлений включает динамику цитоскелета и результирующие деформациимембран 25,26, пространственно-временную регуляцию биомолекулярных конденсатов27,28 и их взаимодействие с мембраной 29, инкапсуляцию широкого спектра биомолекул, включая бесклеточные системы транскрипции-трансляции 30, бесклеточный синтезлипидов 31 и эволюцию белков32,С. 33,34. Липосомы также широко используются в качестве носителей для доставки лекарств и были одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA) для клинического использования11. Липосомы и наночастицы на основе липидов используются в качестве носителей для доставки лекарств, включая мРНК-вакцины, такие как недавняя вакцина против COVID-1935.

В этом исследовании описывается подробный протокол по фотолитографии, микрофлюидной сборке и функционализации поверхности для выполнения метода OLA для создания липосом на кристалле (рис. 1 и рис. 3). Липосомы, полученные с использованием OLA, являются монодисперсными (коэффициент вариации: 4-11% от среднего) и находятся в диапазоне размеров биологических клеток (обычно от 5 до 50 мкм в диаметре), и они могут быть настроены с использованием соответствующих скоростей потока внутреннего и внешнего водных каналов36. Например, популяция липосом, показанная на рисунке 1, имеет распределение по размерам 23,3 мкм ± 1,8 мкм (n = 50). При типичных скоростях продукции 10-30 Гц сформированные липосомы являются однослойными, что было ранее подтверждено введением в мембрану одного бислой-специфического трансмембранного белка альфа-гемолизина36, а также использованием дитионат-отбеливающего анализа37. OLA также совместим с широким спектром липидных композиций, предлагая пользователю гибкость в выборе липидов. Важно отметить, что первоначально использованная липидная композиция отражается в окончательной липосомальной композиции38.

Поскольку это относительно новая технология, существуют дополнительные возможности для улучшения OLA. Например, функционализация поверхности с использованием ПВС имеет решающее значение, но утомительна для выполнения. Более легкий и простой способ поверхностной функционализации устройства значительно сократит время изготовления чипа, а также вариативность от чипа к чипу. Поверхностно-активное вещество Pluronic F68 является важным компонентом во внешней водной фазе для первоначальной стабилизации двойных эмульсий; Тем не менее, его использование может быть ограничительным в определенных случаях. Замена Pluronic F68 на более биосовместимое поверхностно-активное вещество или полное удаление поверхностно-активного вещества может повысить универсальность системы. Во время миграции образующихся двойных эмульсий в выходном канале они могут лопнуть из-за сдвига. Таким образом, модернизация конструкции OLA для улучшения стабильности двойной эмульсии и разделения октанольных карманов может увеличить пропускную способность. Тем не менее, OLA имеет ряд преимуществ, которые в основном включают эффективную инкапсуляцию, монодисперсные и однослойные липосомы и контролируемые эксперименты на кристалле.

OLA была использована и адаптирована в различных исследованиях, включая рост и деление липосом39, изучение процесса разделенияфаз 27 жидкость-жидкость и его взаимодействие с мембраной21, а также понимание образования биопродукта роста бактерий в липосомах40. Высокопроизводительные анализы на основе OLA также используются для понимания транспорта ионов через мембрану 41 и проницаемости лекарственного средства через липидный бислой37, в качестве системы доставки лекарственного средства для терапевтических целей 42, для изучения воздействия противомикробных препаратов на мембрану43 и в качестве инструмента для инкапсуляции жидких кристаллов 44. В дополнение к широкому спектру применения технологии OLA разрабатываются модифицированные версии OLA, подходящие для конкретных целей 45,46,47,48,49,50. В целом, учитывая плюсы и минусы, мы твердо убеждены, что OLA является универсальной платформой для синтетической биологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Дольфа Вейерса, Веру Горелову и Марка Розена за любезно предоставленную нам YFP. S.D. благодарит за финансовую поддержку со стороны Голландского исследовательского совета (номер гранта: OCENW. KLEIN.465).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octanol Sigma-Aldrich No. 297887
1.5 mL tubes Fisher scientific 10451043 Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATP Sigma-Aldrich No. A2383
Biopsy punch Darwin microfluidics PT-T983-05 0.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-base Sigma-Aldrich No. 71405
Dextran Sigma-Aldrich No. 31388 Mr~6,000
Direct-write optical lithography machine Durham Magneto Optics Ltd MicroWriter ML3 Baby setup and software
DOPC lipid Avanti SKU:850375C
F68 Sigma-Aldrich No. 24040032
Glass cover slip Corning #1, 24 x 40 mm
Glycerol Sigma-Aldrich No. G2025
Hydrochloric acid Thermo Scientific Acros No. 124630010
Liss Rhod PE lipid Avanti SKU:810150C
Parafilm Sigma-Aldrich No. P7793
Photoresist Micro resist technology GmbH EpoCore 10
Photoresist developer micro resist technology GmbH mr-Dev 600
Plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G
Polydimethylsiloxane Dow Sylgard 184 PDMS and curing agent
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich No. P7890
Poly-L-lysine–FITC Labeled Sigma-Aldrich No. P3543
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich no. P8136 molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controller Elveflow  OBK1 Mk3+ Flow controller
Scotch tape Magic Tape Invisible Matt Tape
Silicon wafer Silicon Materials 0620R16002
Spin coater  Laurell Technologies Corporation Model WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers Darwin microfluidics PN-BEN-23G
Tris-base Sigma-Aldrich No. 252859
Tygon tubing Darwin microfluidics 1/16" OD x 0.02" ID
UV laser  365 nm wavelength

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frezard, F. Liposomes: From biophysics to the design of peptide vaccines. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 32 (2), 181-189 (1999).
  2. Monteiro, N., Martins, A., Reis, R. L., Neves, N. M. Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140459 (2014).
  3. Mishra, H., Chauhan, V., Kumar, K., Teotia, D. A comprehensive review on liposomes: A novel drug delivery system. Journal of Drug Delivery and Therapeutics. 8 (6), 400-404 (2018).
  4. Liu, W., et al. Research progress on liposomes: Application in food, digestion behavior and absorption mechanism. Trends in Food Science & Technology. 104, 177-189 (2020).
  5. Kamiya, K., Takeuchi, S. Giant liposome formation toward the synthesis of well-defined artificial cells. Journal of Materials Chemistry B. 5 (30), 5911-5923 (2017).
  6. van Swaay, D., DeMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  7. Lombardo, D., Kiselev, M. A. Methods of liposomes preparation: Formation and control factors of versatile nanocarriers for biomedical and nanomedicine application. Pharmaceutics. 14 (3), 543 (2022).
  8. Zhang, H. Thin-film hydration followed by extrusion method for liposome preparation. Liposomes: Methods and Protocols. D’Souza, G. G. M. , Humana. New York, NY. 17-22 (2017).
  9. Filipczak, N., Pan, J., Yalamarty, S. S. K., Torchilin, V. P. Recent advancements in liposome technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 156, 4-22 (2020).
  10. Has, C., Sunthar, P. A comprehensive review on recent preparation techniques of liposomes. Journal of Liposome Research. 30 (4), 336-365 (2020).
  11. Large, D. E., Abdelmessih, R. G., Fink, E. A., Auguste, D. T. Liposome composition in drug delivery design, synthesis, characterization, and clinical application. Advanced Drug Delivery Reviews. 176, 113851 (2021).
  12. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  13. Morita, M., et al. Droplet-shooting and size-filtration (DSSF) method for synthesis of cell-sized liposomes with controlled lipid compositions. ChemBioChem. 16 (14), 2029-2035 (2015).
  14. Convery, N., Gadegaard, N. 30 years of microfluidics. Micro and Nano Engineering. 2, 76-91 (2019).
  15. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  16. Chu, L. Y., Utada, A. S., Shah, R. K., Kim, J. W., Weitz, D. A. Controllable monodisperse multiple emulsions. Angewandte Chemie. 119 (47), 9128-9132 (2007).
  17. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  18. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  19. Carugo, D., Bottaro, E., Owen, J., Stride, E., Nastruzzi, C. Liposome production by microfluidics: Potential and limiting factors. Scientific Reports. 6, 25876 (2016).
  20. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  21. Last, M. G., Deshpande, S., Dekker, C. pH-controlled coacervate-membrane interactions within liposomes. ACS Nano. 14 (4), 4487-4498 (2020).
  22. Jia, H., Schwille, P. Bottom-up synthetic biology: reconstitution in space and time. Current Opinion in Biotechnology. 60, 179-187 (2019).
  23. Ganar, K. A., Leijten, L., Deshpande, S. Actinosomes: Condensate-Templated Containers for Engineering Synthetic Cells. ACE Synthetic Biology. 11 (8), 2869-2879 (2022).
  24. Gaut, N. T., Adamala, K. P. Reconstituting Natural Cell Elements in Synthetic Cells. Advanced Biology. 5 (3), 2000188 (2021).
  25. Ganar, K. A., Honaker, L. W., Deshpande, S. Shaping synthetic cells through cytoskeleton-condensate-membrane interactions. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 54, 101459 (2021).
  26. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  27. Deshpande, S., et al. Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes. Nature Communications. 10, 1800 (2019).
  28. Love, C., et al. Reversible pH-responsive coacervate formation in lipid vesicles activates dormant enzymatic reactions. Angewandte Chemie. 132 (15), 6006-6013 (2020).
  29. Lu, T., et al. Endocytosis of coacervates into liposomes. Journal of the American Chemical Society. 144 (30), 13451-13455 (2022).
  30. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  31. Blanken, D., Foschepoth, D., Serrão, A. C., Danelon, C. Genetically controlled membrane synthesis in liposomes. Nature Communications. 11, 4317 (2020).
  32. Bouzetos, E., Ganar, K. A., Mastrobattista, E., Deshpande, S., vander Oost, J. (R) evolution-on-a-chip. Trends in Biotechnology. 40 (1), 60-76 (2022).
  33. Kamalinia, G., Grindel, B. J., Takahashi, T. T., Millward, S. W., Roberts, R. W. Directing evolution of novel ligands by mRNA display. Chemical Society Reviews. 50 (16), 9055-9103 (2021).
  34. Godino, E., et al. De novo synthesized Min proteins drive oscillatory liposome deformation and regulate FtsA-FtsZ cytoskeletal patterns. Nature Communications. 10, 4969 (2019).
  35. Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─From liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
  36. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
  37. Schaich, M., et al. An integrated microfluidic platform for quantifying drug permeation across biomimetic vesicle membranes. Molecular Pharmaceutics. 16 (6), 2494-2501 (2019).
  38. Schaich, M., Sobota, D., Sleath, H., Cama, J., Keyser, U. F. Characterization of lipid composition and diffusivity in OLA generated vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1862 (9), 183359 (2020).
  39. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., Van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  40. Jusková, P., et al. 34;Basicles": Microbial growth and production monitoring in giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (38), 34698-34706 (2019).
  41. Fletcher, M., et al. DNA-based optical quantification of ion transport across giant vesicles. ACS Nano. 16 (10), 17128-17138 (2022).
  42. Vaezi, Z., et al. Investigation of the programmed cell death by encapsulated cytoskeleton drug liposomes using a microfluidic platform. Microfluidics and Nanofluidics. 24 (7), 48 (2020).
  43. Al Nahas, K., et al. A microfluidic platform for the characterisation of membrane active antimicrobials. Lab on a Chip. 19 (5), 837-844 (2019).
  44. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  45. Yandrapalli, N., Petit, J., Bäumchen, O., Robinson, T. Surfactant-free production of biomimetic giant unilamellar vesicles using PDMS-based microfluidics. Communications Chemistry. 4, 100 (2021).
  46. Cama, J., et al. An ultrasensitive microfluidic approach reveals correlations between the physico-chemical and biological activity of experimental peptide antibiotics. Scientific Reports. 12, 4005 (2022).
  47. Guerzoni, L. P., et al. High macromolecular crowding in liposomes from microfluidics. Advanced Science. 9 (27), 2201169 (2022).
  48. Gonzales, D. T., Yandrapalli, N., Robinson, T., Zechner, C., Tang, T. D. Cell-free gene expression dynamics in synthetic cell populations. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 205-215 (2022).
  49. Ushiyama, R., Koiwai, K., Suzuki, H. Plug-and-play microfluidic production of monodisperse giant unilamellar vesicles using droplet transfer across water-oil interface. Sensors and Actuators B: Chemical. 355, 131281 (2022).
  50. Banlaki, I., Lehr, F. -X., Niederholtmeyer, H. Microfluidic production of porous polymer cell-mimics capable of gene expression. Cell-Free Gene Expression. Karim, A. S., Jewett, M. C. , Humana. New York, NY. 237-255 (2022).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 193
Сборка липосом с октанолом на чипе для биоинженерии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C., Ganar, K. A., Deshpande,… More

Chen, C., Ganar, K. A., Deshpande, S. On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering. J. Vis. Exp. (193), e65032, doi:10.3791/65032 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter