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Bioengineering

बायोइंजीनियरिंग के लिए ऑन-चिप ऑक्टानोल-असिस्टेड लिपोसोम असेंबली

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65032
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter, Wageningen University & Research
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल में ऑक्टानॉल-असिस्टेड लिपोसोम असेंबली (ओएलए) का वर्णन किया गया है, जो बायोकम्पैटिबल लिपोसोम उत्पन्न करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक है। ओला कुशल एनकैप्सुलेशन के साथ मोनोस्प्रेड, माइक्रोन-आकार के लिपोसोम का उत्पादन करता है, जिससे तत्काल ऑन-चिप प्रयोग की अनुमति मिलती है। यह प्रोटोकॉल सिंथेटिक जीव विज्ञान और सिंथेटिक सेल अनुसंधान के लिए विशेष रूप से उपयुक्त होने की उम्मीद है।

Abstract

माइक्रोफ्लुइडिक्स एक नियंत्रित और उच्च-थ्रूपुट तरीके से विभिन्न प्रकार की बूंदों और पुटिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला उपकरण है। लिपोसोम ्स एक लिपिड बाइलेयर से घिरे एक जलीय इंटीरियर से बने सरल सेलुलर मिमिक्स हैं; वे सिंथेटिक कोशिकाओं को डिजाइन करने और इन विट्रो फैशन में जैविक कोशिकाओं के मूल सिद्धांतों को समझने में मूल्यवान हैं और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए कार्गो डिलीवरी जैसे लागू विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण हैं। यह लेख एक ऑन-चिप माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक, ऑक्टानोल-असिस्टेड लिपोसोम असेंबली (ओएलए) के लिए एक विस्तृत कार्य प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, जो मोनोस्प्रेड, माइक्रोन-आकार, बायोकंपैटिबल लिपोसोम का उत्पादन करता है। ओला बबल ब्लोइंग के समान कार्य करता है, जहां एक आंतरिक जलीय (आईए) चरण और आसपास के लिपिड-ले जाने वाले 1-ऑक्टानॉल चरण को सर्फेक्टेंट युक्त बाहरी द्रव धाराओं द्वारा काट दिया जाता है। यह आसानी से उभरे हुए ऑक्टानॉल जेब के साथ डबल-इमल्शन बूंदें उत्पन्न करता है। जैसे ही लिपिड बाइलेयर ड्रॉपलेट इंटरफ़ेस पर इकट्ठा होता है, जेब अनायास एक यूनिलामेलर लिपोसोम को जन्म देने के लिए अलग हो जाती है जो आगे के हेरफेर और प्रयोग के लिए तैयार है। ओला कई फायदे प्रदान करता है, जैसे कि स्थिर लिपोसोम पीढ़ी (>10 हर्ट्ज), बायोमैटेरियल्स का कुशल एनकैप्सुलेशन, और मोनोस्प्रेटेड लिपोसोम आबादी, और बहुत छोटे नमूना वॉल्यूम (~ 50 μL) की आवश्यकता होती है, जो कीमती जैविकों के साथ काम करते समय महत्वपूर्ण हो सकता है। अध्ययन में माइक्रोफैब्रिकेशन, सॉफ्ट-लिथोग्राफी और सरफेस निष्क्रिय पर विवरण शामिल हैं, जो प्रयोगशाला में ओला प्रौद्योगिकी स्थापित करने के लिए आवश्यक हैं। ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटॉन फ्लक्स के माध्यम से लिपोसोम के अंदर बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट के गठन को प्रेरित करके एक प्रूफ-ऑफ-प्रिंसिपल सिंथेटिक बायोलॉजी एप्लिकेशन भी दिखाया गया है। यह अनुमान लगाया गया है कि यह वीडियो प्रोटोकॉल पाठकों को अपनी प्रयोगशालाओं में ओला स्थापित करने और समस्या निवारण करने की सुविधा प्रदान करेगा।

Introduction

सभी कोशिकाओं में उनकी भौतिक सीमा के रूप में एक प्लाज्मा झिल्ली होती है, और यह झिल्ली अनिवार्य रूप से एम्फीफिलिक लिपिड अणुओं के स्व-संयोजन द्वारा गठित लिपिड बाइलेयर के रूप में एक मचान होती है। लिपोसोम जैविक कोशिकाओं के न्यूनतम सिंथेटिक समकक्ष हैं; उनके पास फॉस्फोलिपिड्स से घिरा एक जलीय लुमेन होता है, जो जलीय चरण का सामना करने वाले हाइड्रोफिलिक सिर समूहों और हाइड्रोफोबिक पूंछ के साथ एक लिपिड बाइलेयर बनाता है। लिपोसोम की स्थिरता हाइड्रोफोबिक प्रभाव के साथ-साथ ध्रुवीय समूहों के बीच हाइड्रोफिलिसिटी, हाइड्रोफोबिक कार्बन पूंछ के बीच वैन डेर वाल्स बलों और पानी के अणुओं और हाइड्रोफिलिक हेड्स 1,2 के बीच हाइड्रोजन बॉन्डिंग द्वारा नियंत्रित होती है। लिपिड बाइलेयर की संख्या के आधार पर, लिपोसोम को दो मुख्य श्रेणियों में वर्गीकृत किया जा सकता है, अर्थात्, यूनिलामेलर पुटिकाओं में एक एकल बाईलेयर और मल्टीलैमेलर पुटिकाएं शामिल होती हैं जो कई बाइलेयर से निर्मित होती हैं। यूनिलामेलर पुटिकाओं को उनके आकार के आधार पर आगे वर्गीकृत किया जाता है। आमतौर पर आकार में गोलाकार, उन्हें विभिन्न आकारों में उत्पादित किया जा सकता है, जिसमें छोटे यूनिलामेलर पुटिकाएं (एसयूवी, 30-100 एनएम व्यास), बड़े यूनिलामेलर पुटिकाएं (एलयूवी, 100-1,000 एनएम व्यास), और अंत में, विशाल यूनिलामेलर पुटिकाएं (जीयूवी, >1,000 एनएम व्यास) 3,4 शामिल हैं। लिपोसोम का उत्पादन करने के लिए विभिन्न तकनीकों को विकसित किया गया है, और इन्हें मोटे तौर पर थोक तकनीक5 और माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक6 में वर्गीकृत किया जा सकता है। आमतौर पर प्रचलित थोक तकनीकों में लिपिड फिल्म पुनर्जलीकरण, इलेक्ट्रोफॉर्मेशन, उल्टे इमल्शन ट्रांसफर और एक्सट्रूज़न 7,8,9,10 शामिल हैं। ये तकनीकें अपेक्षाकृत सरल और प्रभावी हैं, और ये सिंथेटिक जीव विज्ञान समुदाय में उनके व्यापक उपयोग के प्रमुख कारण हैं। हालांकि, एक ही समय में, वे आकार में पॉलीडिस्पर्सिटी, लैमेलारिटी पर नियंत्रण की कमी और कम एनकैप्सुलेशन दक्षता 7,11 के संबंध में प्रमुख कमियों से पीड़ित हैं। निरंतर ड्रॉपलेट इंटरफेस क्रॉसिंग एनकैप्सुलेशन (सीडीआईसीई) 12 और ड्रॉपलेट शूटिंग और आकार निस्पंदन (डीएसएसएफ) 13 जैसी तकनीकें कुछ हद तक इन सीमाओं को दूर करती हैं।

माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण पिछले दशक में प्रमुखता से बढ़ रहे हैं। माइक्रोफ्लुइडिक तकनीक विशिष्ट लामिनर प्रवाह और प्रसार-प्रभुत्व वाले द्रव्यमान हस्तांतरण के कारण उपयोगकर्ता-परिभाषित माइक्रोचैनल्स के भीतर द्रव प्रवाह में हेरफेर करने के लिए एक नियंत्रणीय वातावरण प्रदान करती है। परिणामी लैब-ऑन-ए-चिप डिवाइस अणुओं के स्थानिक नियंत्रण के लिए अद्वितीय संभावनाएं प्रदान करते हैं, जिसमें नमूना मात्रा और मल्टीप्लेक्सिंगक्षमताओं में काफी कमी आती है। लिपोसोम बनाने के लिए कई माइक्रोफ्लुइडिक तरीके विकसित किए गए हैं, जिनमें स्पंदित जेटिंग 15, डबल इमल्शन टेमप्लेटिंग 16, क्षणिक झिल्ली इजेक्शन17, ड्रॉपलेट इमल्शन ट्रांसफर 18 और हाइड्रोडायनामिक फोकसिंग 19 शामिल हैं। ये तकनीकें उच्च एनकैप्सुलेशन दक्षता और उच्च थ्रूपुट के साथ मोनोस्प्रेड, यूनिलामेलर, सेल के आकार के लिपोसोम का उत्पादन करती हैं।

यह लेख ऑक्टानोल-असिस्टेड लिपोसोम असेंबली (ओएलए) के लिए प्रक्रिया का विवरण देता है, जो हाइड्रोडायनामिक पिंच-ऑफ और बाद में विलायक डीवेटिंग तंत्र20 (चित्रा 1) पर आधारित एक ऑन-चिप माइक्रोफ्लुइडिक विधि है। कोई भी ओला के कामकाज को बुलबुला उड़ाने की प्रक्रिया से जोड़ सकता है। एक छह-तरफा जंक्शन एक ही स्थान पर आंतरिक जलीय (आईए) चरण, दो लिपिड-ले जाने वाले कार्बनिक (एलओ) धाराओं और दो सर्फेक्टेंट-युक्त बाहरी जलीय (ओए) धाराओं को केंद्रित करता है। इसके परिणामस्वरूप पानी में (लिपिड + ऑक्टानॉल)-इन-वाटर डबल इमल्शन बूंदें होती हैं। चूंकि ये बूंदें नीचे की ओर बहती हैं, इंटरफेशियल ऊर्जा न्यूनीकरण, बाहरी कतरनी प्रवाह और चैनल की दीवारों के साथ बातचीत से इंटरफ़ेस पर एक लिपिड बाइलेयर का निर्माण होता है क्योंकि विलायक जेब अलग हो जाती है, इस प्रकार यूनिलामेलर लिपोसोम ्स बनते हैं। ऑक्टानोल जेब के आकार के आधार पर, डीवेटिंग प्रक्रिया में दसियों सेकंड से कुछ मिनट लग सकते हैं। निकास चैनल के अंत में, कम घनी ऑक्टानॉल बूंदें सतह पर तैरती हैं, जबकि भारी लिपोसोम (एक सघन एनकैप्सुलेटेड समाधान के कारण) प्रयोग के लिए तैयार विज़ुअलाइज़ेशन कक्ष के तल पर डूब जाते हैं। एक प्रतिनिधि प्रयोग के रूप में, लिपोसोम के अंदर तरल-तरल चरण पृथक्करण (एलएलपीएस) की प्रक्रिया का प्रदर्शन किया जाता है। इसके लिए, आवश्यक घटकों को एक अम्लीय पीएच पर लिपोसोम के अंदर समझाया जाता है जो एलएलपीएस को रोकता है। बाहरी रूप से पीएच परिवर्तन को ट्रिगर करके और इस प्रकार, एक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटॉन फ्लक्स, लिपोसोम के अंदर चरण-अलग कंडेनसेट बूंदें बनती हैं। यह ओला प्रणाली की प्रभावी एनकैप्सुलेशन और हेरफेर क्षमताओं पर प्रकाश डालता है।

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Protocol

1. मास्टर वेफर का निर्माण

  1. 4 इंच (10 सेमी) व्यास स्वच्छ सिलिकॉन वेफर लें ( सामग्री की तालिका देखें)। किसी भी धूल के कणों को हटाने के लिए दबाव वाली हवा का उपयोग करके इसे और साफ करें।
  2. वेफर को स्पिन कोटर पर माउंट करें, और धीरे से वेफर के केंद्र में ~ 5 एमएल नकारात्मक फोटोरेसिस्ट (सामग्री की तालिका देखें) वितरित करें। हवा के बुलबुले से बचने की कोशिश करें, क्योंकि वे वेफर की डाउनस्ट्रीम प्रिंटिंग प्रक्रिया में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
  3. 10 μm मोटी फोटोरेसिस्ट परत प्राप्त करने के लिए, प्रारंभिक प्रसार के लिए 100 rpm / s के त्वरण के साथ 30 सेकंड के लिए 500 rpm पर वेफर को स्पिन-कोट करें, इसके बाद 500 RPM / s के त्वरण के साथ 3,000 rpm पर 60 s स्पिन करें। यदि एक अलग मोटाई वांछित है, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार कताई मापदंडों को बदलें।
  4. वेफर को हीटिंग प्लेट पर 2 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर और फिर 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए बेक करें।
  5. एक बार वेफर ठंडा हो जाने के बाद, प्रत्यक्ष-लेखन ऑप्टिकल लिथोग्राफी मशीन ( सामग्री की तालिका देखें) के मुद्रण कक्ष में वेफर माउंट करें, और सॉफ्टवेयर में ओला डिजाइन (चित्रा 2 ए, पूरक कोडिंग फ़ाइल 1) को खिलाएं।
    नोट: ओला डिजाइन में अनिवार्य रूप से दो ओए चैनल, दो एलओ चैनल और एक आईए चैनल शामिल हैं, जो छह-तरफा जंक्शन बनाने के लिए विलय हो जाते हैं जो पोस्ट-प्रोडक्शन चैनल के रूप में जारी रहता है और प्रयोगात्मक कुएं (ईडब्ल्यू) में समाप्त होता है।
  6. 300 mJ/cm2 की खुराक के साथ एक यूवी लेजर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके लेपित वेफर पर ओला डिजाइन (ओं) को प्रिंट करें।
  7. एक बार डिजाइन मुद्रित होने के बाद, वेफर को 1 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें, इसके बाद 3 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस।
  8. इस बिंदु पर, सुनिश्चित करें कि मुद्रित डिवाइस की रूपरेखा वेफर पर दिखाई देती है और नग्न आंखों को दिखाई देती है। अशोधित फोटोरेसिस्ट को धोने के लिए, वेफर को डेवलपर समाधान वाले ग्लास बीकर में डुबोएं ( सामग्री की तालिका देखें) जब तक कि अस्वीकृत फोटोरेसिस्ट पूरी तरह से हटा न दिया जाए।
    नोट: अतिरिक्त डेवलपर उपचार डिजाइन संकल्प को प्रभावित कर सकता है।
  9. वेफर को अनुक्रम में एसीटोन, आइसोप्रोपेनोल और विआयनीकृत (डीआई) पानी से धोएं, और अंत में, ब्लो गन का उपयोग करके दबाव वाली हवा / एन2 के साथ।
  10. वेफर को 30 मिनट के लिए 150 डिग्री सेल्सियस पर हार्ड-बेक करें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि मुद्रित डिजाइन वेफर सतह से मजबूती से जुड़ा हुआ है और डाउनस्ट्रीम निर्माण प्रक्रिया में नहीं आता है। मास्टर वेफर तब आगे के उपयोग के लिए तैयार है (चित्रा 2 बी)।

2. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस तैयार करना

  1. एल्यूमीनियम के एक चौकोर टुकड़े पर मास्टर वेफर रखें, और एल्यूमीनियम पन्नी को वेफर के चारों ओर लपेटें, जिससे एक अच्छी तरह से संरचना बन जाए (चित्रा 2 सी)।
  2. 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 40 ग्राम पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) और 4 ग्राम इलाज एजेंट (10: 1, वजन अनुपात, सामग्री की तालिका देखें) को मापें, और 2-3 मिनट के लिए स्पैटुला या पिपेट टिप का उपयोग करके सख्ती से मिलाएं।
  3. पीडीएमएस और इलाज एजेंट का जोरदार मिश्रण मिश्रण के अंदर हवा के बुलबुले को फंसाता है। अधिकांश बड़े हवा के बुलबुले को हटाने के लिए ट्यूब को 2-3 मिनट के लिए 100 x g पर घुमाएं।
  4. मास्टर वेफर पर चरण 2.3 में तैयार मिश्रण के लगभग 15-20 ग्राम डालें, और एक डेसिकेटर का उपयोग करके डी-गैस डालें। पीडीएमएस-लेपित ग्लास स्लाइड (चरण 3) बनाने के लिए अतिरिक्त मिश्रण को सहेजें।
  5. असेंबली को कम से कम 2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में इनक्यूबेट करें।
  6. मास्टर वेफर को ओवन से बाहर निकालें और इसे ठंडा होने दें। ठोस पीडीएमएस ब्लॉक को हटाने के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी को हटा दें, और वेफर के किनारे से पीडीएमएस ब्लॉक को सावधानीपूर्वक छील लें।
    नोट: वेफर नाजुक है और टूट सकता है, इसलिए इस प्रक्रिया को सावधानी से करना महत्वपूर्ण है।
  7. एक बार पीडीएमएस ब्लॉक हटा दिए जाने के बाद, पैटर्न वाली संरचना को ऊपर की ओर रखें, और एक तेज ब्लेड या स्केलपेल का उपयोग करके, अलग-अलग पीडीएमएस ब्लॉक को काट लें, जिनमें से प्रत्येक में एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस होता है।
  8. पीडीएमएस ब्लॉक को एक अंधेरी सतह पर रखें, और प्रकाश दिशा को समायोजित करें (एक टेबल लैंप इसके लिए काम में आता है) ताकि उत्कीर्ण चैनल चमकदार हों और परिणामस्वरूप, दिखाई दें। क्रमशः 0.5 मिमी और 3 मिमी व्यास के बायोप्सी पंच का उपयोग करके इनलेट और निकास चैनल में छेद करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: पीडीएमएस में दरारें से बचने के लिए एक तेज बायोप्सी पंच का उपयोग करें, जो बाद में रिसाव का कारण बन सकता है। धीरे से पीडीएमएस ब्लॉक के माध्यम से बायोप्सी पंच को धक्का दें, और सुनिश्चित करें कि यह पूरी तरह से इसके माध्यम से गुजरता है। बायोप्सी पंच को हटाने के लिए, इसे वैकल्पिक दिशाओं में घुमाते हुए धीरे से पीछे हटा दें। उत्कीर्ण ओला डिजाइन के साथ पीडीएमएस ब्लॉक अब पीडीएमएस-लेपित ग्लास स्लाइड से बांधने के लिए तैयार है।

3. पीडीएमएस-लेपित ग्लास स्लाइड बनाना

  1. एक पारदर्शी ग्लास कवरस्लिप लें, ग्लास स्लाइड के केंद्र पर लगभग 0.5 एमएल पीडीएमएस (चरण 2.4 में अधिक मात्रा में तैयार) डालें, और इसे ग्लास स्लाइड को धीरे से झुकाकर कवरस्लिप में फैलाएं, जिससे पीडीएमएस के साथ ग्लास स्लाइड का कुल कवरेज सुनिश्चित हो।
  2. स्पिन कोटर पर ग्लास स्लाइड माउंट करें, इसे केंद्रीय रूप से रखना सुनिश्चित करें (ताकि स्लाइड का मध्य दबाव शाफ्ट के केंद्र के साथ ओवरलैप हो), और ग्लास स्लाइड को 500 आरपीएम पर 15 सेकंड (100 आरपीएम / सेकंड की वृद्धि पर) और फिर 1,000 आरपीएम पर 30 सेकंड के लिए (500 आरपीएम / सेकंड की वृद्धि पर) घुमाएं।
  3. पीडीएमएस-लेपित ग्लास स्लाइड (ऊपर की ओर लेपित पक्ष) को एक कवर पेट्री डिश में पीडीएमएस (1 सेमी x 1 सेमी) के ब्लॉक की तरह एक उभरे हुए मंच पर रखें, और इसे 2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।

4. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का संबंध

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्कॉच टेप ( सामग्री की तालिका देखें) को दो बार चिपकाकर और हटाकर पीडीएमएस ब्लॉक (चरण 2 में तैयार) को साफ करें। उपयोग तक साफ किए गए पक्ष को सामने रखना सुनिश्चित करें।
  2. पीडीएमएस-लेपित ग्लास स्लाइड को ब्लो गन का उपयोग करके दबाव वाली हवा / एन2 के साथ साफ करें, और साफ पक्ष को ऊपर रखें।
  3. प्लाज्मा क्लीनर के वैक्यूम कक्ष में पीडीएमएस ब्लॉक (उत्कीर्ण चैनल ऊपर की ओर) और पीडीएमएस-लेपित ग्लास स्लाइड (लेपित साइड सामने) रखें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  4. वैक्यूम पर स्विच करें, और सतहों को सक्रिय करने के लिए 15 सेकंड के लिए 12 मेगाहर्ट्ज (आरएफ मोड उच्च) की रेडियो आवृत्ति पर सामग्री को वायु प्लाज्मा में उजागर करें। ऑक्सीजन प्लाज्मा को गुलाबी रंग के रूप में देखा जा सकता है।
  5. प्लाज्मा उपचार के तुरंत बाद, पीडीएमएस-लेपित ग्लास स्लाइड को एक साफ सतह पर रखें जिसमें पीडीएमएस साइड ऊपर की ओर हो। धीरे से पीडीएमएस ब्लॉक को माइक्रोफ्लुइडिक पैटर्न के साथ रखें जो अब पीडीएमएस-लेपित ग्लास स्लाइड की ओर है, जिससे उन्हें बंधन करने की अनुमति मिलती है (चित्रा 2 डी)।
    नोट: पूरी तरह से संबंध सुनिश्चित करने के लिए डिवाइस में फंसी हवा को हटाना महत्वपूर्ण है।
  6. बंधे हुए उपकरणों को 2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें।

5. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की सतह कार्यात्मकता

नोट: सतह कार्यात्मकता से पहले, निर्माता के प्रोटोकॉल ( सामग्री की तालिका देखें) के अनुसार दबाव पंप को कैलिब्रेट करना और माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस से कनेक्ट करने के लिए टयूबिंग को इकट्ठा करना महत्वपूर्ण है।

  1. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को दबाव पंप से जोड़ना
    1. दबाव-चालित प्रवाह नियंत्रक को बाहरी दबाव स्रोत (6 सलाखों तक) से कनेक्ट करें। कम से कम चार स्वतंत्र वायु दबाव चैनलों की आवश्यकता होती है: 0-2 बार के तीन अलग-अलग मॉड्यूल, और -0.9-4 बार का एक मॉड्यूल।
    2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार दबाव पंप को कैलिब्रेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. टयूबिंग (ओडी में 1/16 x आईडी में 0.02) को चार समान आकार के टुकड़ों में काटें, लंबाई में लगभग 20 सेमी।
    4. प्रत्येक टुकड़े के एक छोर पर 23 ग्राम स्टेनलेस स्टील 90 ° बेंट कनेक्टर ( सामग्री की तालिका देखें) डालें। इस छोर को बाद में माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के तीन इनलेट्स (ओए, एलओ और आईए) में डाला जाता है और चौथे का उपयोग अतिरिक्त समाधान (चरण 5.2.5) को हटाने के लिए किया जाता है।
    5. ट्यूबिंग के दूसरे छोर को माइक्रोफ्लुइडिक जलाशय स्टैंड में डालें, और माइक्रोफ्लुइडिक फिटिंग का उपयोग करके इसे सील करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि ट्यूबिंग जलाशय के तल को छूने के लिए पर्याप्त है (1.5 एमएल ट्यूब, सामग्री की तालिका देखें)। लिपोसोम उत्पादन के दौरान अवांछित हवा के बुलबुले को माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में प्रवेश करने से रोकता है।
  2. निकास चैनल का पीवीए उपचार
    नोट: लिपोसोम पीढ़ी से पहले, डिवाइस को उत्पादन जंक्शन के आंशिक रूप से हाइड्रोफिलिक डाउनस्ट्रीम में प्रस्तुत करना महत्वपूर्ण है। यह इन चैनलों को 5% (डब्ल्यू / वी) पॉलीविनाइल अल्कोहल (पीवीए) समाधान के साथ इलाज करके किया जाता है। पीवीए समाधान एक चुंबकीय हलचल का उपयोग करके लगातार हिलाने के साथ 3 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर पानी में पीवीए पाउडर ( सामग्री की तालिका देखें) को घोलकर तैयार किया जाता है। सतह उपचार के लिए उपयोग करने से पहले समाधान को फ़िल्टर करें। डिवाइस के बंधन के तुरंत बाद, माइक्रोफ्लुइडिक चैनल प्लाज्मा-प्रेरित सतह सक्रियण के कारण हाइड्रोफिलिक होते हैं, और वे धीरे-धीरे फिर से हाइड्रोफोबिक बन जाएंगे। पीवीए उपचार शुरू करने से पहले बेकिंग (चरण 4.6) के बाद 2 घंटे तक इंतजार करने की सिफारिश की जाती है।
    1. 5% डब्ल्यू / वी पीवीए समाधान के 200 μL को 1.5 एमएल ट्यूब में वितरित करें, और इसे माइक्रोफ्लुइडिक जलाशय स्टैंड से कनेक्ट करें। टयूबिंग (चरण 5.1.3 में उल्लिखित) को इस तरह डालें कि एक छोर पीवीए समाधान में डूबा हुआ है और दूसरा छोर माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के ओए चैनल के इनलेट से जुड़ा हुआ है।
      नोट: कम पीवीए एकाग्रता से उप-मानक सतह कार्यात्मकता हो सकती है।
    2. पीवीए (खाली 1.5 एमएल ट्यूब) के बिना उपरोक्त चरण दोहराएं, और इसे एलओ और आईए चैनलों से कनेक्ट करें।
    3. ओए चैनलों में पीवीए समाधान को प्रवाहित करने के लिए ओए चरण के दबाव को 100 मिलीबार तक बढ़ाएं। इन चैनलों के अंदर पीवीए समाधान के बैकफ्लो को रोकने के लिए आईए और एलओ चरणों के दबाव को 120 मिलीबार तक बढ़ाएं (चित्रा 2 ई)।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो उत्पादन जंक्शन पर मेनिस्कस को स्थिर रखने के लिए व्यक्तिगत चैनलों के दबाव को समायोजित करें।
    4. पीवीए समाधान को लगभग 5 मिनट के लिए इस तरह से प्रवाहित करें, जिससे निकास चैनल का पूर्ण कार्यात्मककरण सुनिश्चित हो सके।
    5. पीवीए समाधान को हटाने के लिए, ओए इनलेट से टयूबिंग को अलग करें, और तुरंत एलओ और आईए चैनलों में दबाव को 2 बार तक बढ़ाएं। इसके साथ ही, एक नकारात्मक दबाव चैनल (−900 mbar) से जुड़े टयूबिंग का उपयोग करें, पहले निकास चैनल से और फिर OA इनलेट (चित्रा 2F) से अतिरिक्त पीवीए को हटा दें।
    6. डिवाइस को 15 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर बेक करें, और उपयोग करने से पहले इसे ठंडा होने दें। डिवाइस को कम से कम 1 महीने के लिए परिवेश की स्थिति में संग्रहीत किया जा सकता है।
      नोट: ओला के साथ आगे बढ़ने से पहले 1 दिन (कमरे के तापमान पर) इंतजार करने की सिफारिश की जाती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्लाज्मा उपचार के बाद अनुपचारित पीडीएमएस अपनी हाइड्रोफोबिसिटी हासिल कर ले।

6. ऑक्टानोल-असिस्टेड लिपोसोम असेंबली (ओला)

  1. लिपिड स्टॉक तैयार करना
    नोट: यहां, 1,2-डायोल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलाइन (डीओपीसी) और 1,2-डायोलोइल-एसएन-ग्लिसरो-3-फॉस्फोएथेनॉलमाइन-एन-(लिसामाइन रोडामाइन बी सल्फोनिल) (लिस रोड पीई) लिपिड (सामग्री की तालिका देखें) का मिश्रण एक उदाहरण के रूप में उपयोग किया जाता है; उपयोगकर्ताओं को लिपिड संरचना को उसी तरह से तैयार करना चाहिए जिसकी उन्हें आवश्यकता है।
    1. डीओपीसी के 76 μL (25 मिलीग्राम / एमएल) और 16.6 μL लिस रोड पीई (1 मिलीग्राम / एमएल) को अलग-अलग ग्लास सिरिंज का उपयोग करके गोल-नीचे फ्लास्क में वितरित करें।
    2. गोल-तल फ्लास्क को सीधा रखें, और क्लोरोफॉर्म को वाष्पित करने और फ्लास्क के तल पर एक सूखे लिपिड फिल्म बनाने के लिए नाइट्रोजन की एक कोमल धारा देने के लिए संपीड़ित एन2 ब्लो गन का उपयोग करें।
    3. किसी भी शेष क्लोरोफॉर्म को हटाने के लिए फ्लास्क को एक निरंतर वैक्यूम के तहत कम से कम 2 घंटे के लिए डेसिकेटर में रखें।
    4. गोल-तल फ्लास्क में इथेनॉल के 100 μL जोड़ें, इसके बाद सौम्य पाइपिंग या हिलाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि लिपिड 10% (डब्ल्यू / वी) लिपिड स्टॉक बनाने के लिए भंग हो गए हैं।
      नोट: यदि कोई विशेष लिपिड संरचना इथेनॉल में पूरी तरह से घुलनशील नहीं है, तो इथेनॉल / क्लोरोफॉर्म मिश्रण का उपयोग करें, क्लोरोफॉर्म की मात्रा को यथासंभव छोटा रखें।
    5. घोल को एक गहरे कांच की शीशी में पिपेट करें। हवा को निष्क्रिय वातावरण से बदलने के लिए ब्लो गन का उपयोग करके शीशी को नाइट्रोजन के साथ धीरे से फ्लश करें। पैराफिन फिल्म के साथ ढक्कन को सील करें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: स्टॉक समाधान का उपयोग कुछ महीनों तक किया जा सकता है। हर बार जब शीशी खोली जाती है, तो धीरे से नाइट्रोजन के साथ हवा को बदलें, और पैराफिन फिल्म के साथ ढक्कन के साथ फिर से सील करें।
  2. ओला समाधान तैयार करना
    1. अपरिहार्य घटकों के स्टॉक समाधान बनाएं: 20 एमएम डेक्सट्रान (एमडब्ल्यू 6,000); 60% (वी / वी) ग्लिसरॉल; विकल्प का एक बफर। इस मामले में, 5x फॉस्फेट-बफर्ड खारा (0.68 M NaCl, 13.5 mM KCl, 50 mM Na 2 HPO 4, 9 mM KH2PO 4; pH7.4) तैयार किया गया था (सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: चूंकि शुद्ध ग्लिसरॉल अत्यधिक चिपचिपा होता है, इसलिए प्रभावी पाइपिंग के लिए तिरछे तरीके से पिपेट टिप के अंत में एक छोटा टुकड़ा काटने की सिफारिश की जाती है।
    2. आईए, ओए और निकास समाधान (ईएस, ईडब्ल्यू को भरने के लिए वांछित समाधान) नमूने के 100 μL तैयार करें। विज़ुअलाइज़ेशन में आसानी के लिए, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) को इस विशेष मामले में आईए समाधान में जोड़ा गया था। इनकैप्सुलेटेड घटकों की परासरणता की गणना करके और यदि आवश्यक हो तो ओए में उचित मात्रा में चीनी या नमक जोड़कर आईए और ओए के बीच आसमाटिक संतुलन की जांच करें। यह उत्पादन के दौरान लिपोसोम के फटने या सिकुड़ने को रोकने के लिए किया जाता है।
      नोट: तीन चरणों की अंतिम रचनाएँ इस प्रकार हैं:
      आईए: 15% ग्लिसरॉल, 5 एमएम डेक्सट्रान (एमडब्ल्यू 6,000), 5.4 μM YFP, 1x PBS
      ओए: 15% ग्लिसरॉल, 5% एफ 68 सर्फेक्टेंट, 1 x पीबीएस
      ईएस: 15% ग्लिसरॉल, 1 x पीबीएस
      एफ 68 सर्फेक्टेंट की कम सांद्रता दोहरे इमल्शन की पीढ़ी को नकारात्मक रूप से प्रभावित करती है।
    3. 4 μL स्टॉक लिपिड को 1-ऑक्टानोल के 76 μL में पाइप करके एलओ चरण के 80 μL तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)। डीओपीसी की अंतिम सांद्रता 5 मिलीग्राम /
    4. माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोगों के साथ आगे बढ़ने से पहले किसी भी बड़े समुच्चय को हटाने के लिए 60 सेकंड के लिए 700 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। यह किसी भी स्पष्ट क्लॉगिंग कारकों को माइक्रोफ्लुइडिक चिप में प्रवेश करने से रोकता है।
  3. लिपोसोम उत्पादन
    1. समाधान (आईए, एलओ, ओए) को तीन 1.5 एमएल ट्यूबों में वितरित करें, उन्हें इकट्ठा करें (जैसा कि चरण 5.1 में उल्लेख किया गया है), और उन्हें पीवीए-उपचारित माइक्रोफ्लुइडिक चिप (चरण 5.2.6) से कनेक्ट करें।
    2. तीन चैनलों पर सकारात्मक दबाव लागू करें: आईए और एलओ चैनलों पर ~ 100 एमबार और ओए चैनल पर ~ 200 एमबार।
      नोट: चूंकि ओए दबाव दूसरों की तुलना में अधिक है, इसलिए ओए समाधान ईडब्ल्यू पर पहुंचने वाला पहला होगा; यह अत्यधिक अनुशंसित है।
    3. एक बार ओए समाधान ईडब्ल्यू तक पहुंचने के बाद, ओए दबाव को 100 मिलीबार तक कम करें और एलओ को 200 मिलीबार तक बढ़ाएं।  उत्पादन जंक्शन पर पहुंचने वाले एलओ समाधान के परिणामस्वरूप एलओ चैनलों से हवा के विस्थापित होने के कारण हवा के बुलबुले होने की संभावना होगी। एक बार जब हवा के बुलबुले ईडब्ल्यू में वितरित हो जाते हैं, तो एलओ दबाव को 100 मिलीबार तक समायोजित करें। अंत में, आईए दबाव को 200 मिलीबार तक बढ़ाएं, और आईए चैनल में सभी हवा को हटाने तक प्रतीक्षा करें। तीन चरणों के जंक्शन पर आगमन का आदर्श अनुक्रम है, इस प्रकार, ओए, एलओ और आईए।
    4. तीन चैनलों से हवा को हटाने के बाद, सभी चैनल दबाव को 50 मिलीबार तक समायोजित करें और निकास कक्ष में ईएस के 10 μL पिपेट करें। ईएस को पाइप करने के बाद, वाष्पीकरण से बचने के लिए निकास छेद पर एक कवर स्लाइड डालें। यदि एलओ को पीछे धकेल दिया जाता है, तो धीरे-धीरे 1 मिलीबार वृद्धि में एलओ दबाव बढ़ाएं जब तक कि यह जंक्शन पर प्रवाहित न हो।
    5. एक बार जब सभी तीन चरण जंक्शन पर सह-प्रवाह शुरू करते हैं, तो सुनिश्चित करें कि डबल इमल्शन उत्पादन शुरू होता है, और इसकी गुणवत्ता के अनुसार समायोजित करें (चित्रा 3 ए-सी)। दबाव को धीरे-धीरे बदलें (0.1-1 मिलीबार के चरण) बजाय अचानक जब तक कि चैनल में अवांछित क्लॉग को खत्म करने के लिए दबाव को बदला नहीं जा रहा हो।
      नोट: समायोजित करने के लिए चैनल इस बात पर निर्भर करता है कि जंक्शन पर क्या हो रहा है। उदाहरण के लिए, यदि इमल्शन बहुत बड़े हैं तो आईए को कम करने की आवश्यकता है; यदि डबल इमल्शन बनते हैं लेकिन पिन होने के बजाय फट जाते हैं तो ओए को बढ़ाने की आवश्यकता होती है; और यदि ऑक्टानॉल जेब बहुत बड़ी है तो एलओ को कम करने की आवश्यकता है।
    6. जांचें कि डबल-इमल्शन बूंदें ईडब्ल्यू में नीचे की ओर बहती हैं। जैसे-जैसे वे बहते हैं, ऑक्टानॉल जेब अधिक से अधिक प्रमुख हो जाते हैं और अंत में लिपोसोम (चित्रा 3 डी-एफ) बनाते हैं। सुनिश्चित करें कि पोस्ट-प्रोडक्शन चैनल काफी लंबा है और डबल इमल्शन का माइग्रेशन डीवेटिंग के लिए काफी धीमा है।
      नोट: सभ्य उत्पादन के कुछ ही मिनटों के भीतर, लिपोसोम और ऑक्टानॉल बूंदें पोस्ट-प्रोडक्शन चैनल से बाहर निकल जाएंगी और ईडब्ल्यू में चली जाएंगी। नतीजतन, पानी की तुलना में कम घना होने के कारण, ऑक्टानॉल बूंदें ईएस की सतह पर तैरती हैं। आईए में डेक्सट्रान के अलावा, लिपोसोम अपने परिवेश की तुलना में भारी होते हैं और अवलोकन और आगे के हेरफेर के लिए तैयार कक्ष के तल पर जाते हैं।

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Representative Results

यह अध्ययन एक प्रतिनिधि प्रयोग के रूप में लिपोसोम के अंदर तरल-तरल चरण पृथक्करण (एलएलपीएस) की प्रक्रिया के माध्यम से झिल्ली रहित कंडेनसेट के गठन को प्रदर्शित करता है।

नमूना तैयार करना
आईए, ओए, ईएस, और फ़ीड समाधान (एफएस) निम्नानुसार तैयार किए जाते हैं:

आईए: 12% ग्लिसरॉल, 5 एमएम डेक्सट्रान, 150 एमएम केसीएल, 5 मिलीग्राम / एमएल पॉली-एल-लाइसिन (पीएलएल), 0.05 मिलीग्राम / एमएल पॉली-एल-लाइसिन-एफआईटीसी लेबल (पीएलएल-एफआईटीसी), 8 एमएम एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी), 15 एमएम साइट्रेट-एचसीएल (पीएच 4)

OA: 12% v / v ग्लिसरॉल, 5% w / v F68, 150 mM KCl, 15 mM साइट्रेट-HCl (pH 4)

ईएस: 12% ग्लिसरॉल, 150 एमएम केसीएल, 15 एमएम साइट्रेट-एचसीएल (पीएच 4)

एफएस: 12% ग्लिसरॉल, 150 एमएम केसीएल, 75 एमएम ट्रिस-एचसीएल (पीएच 9)

लिपोसोम के अंदर कंडेनसेट गठन।
लिपोसोम ्स में एलएलपीएस की घटना को प्रदर्शित करने के लिए सकारात्मक चार्ज पॉली-एल-लाइसिन (पीएलएल) और नकारात्मक रूप से चार्ज मल्टीवेलेंट एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) के पीएच-संवेदनशील जटिल संयोजन की एक सरल परख का चयन किया गया था। एनकैप्सुलेशन के दौरान पॉलीलाइसिन और एटीपी के चरण पृथक्करण को रोकने के लिए, समाधान का पीएच 4 पर बनाए रखा गया था, जिस पर एटीपी तटस्थ है। एफएस (पीएच 9 का एक बफर) जोड़कर ईएस के पीएच को बढ़ाने से अंततः ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटॉन फ्लक्स के कारण लिपोसोम के अंदर पीएच बढ़ गया, जिससे एटीपी नकारात्मक रूप से चार्ज हो गया और सकारात्मक चार्ज पीएलएल21 (चित्रा 4 ए) के साथ इसके चरण पृथक्करण को ट्रिगर किया गया। लिपोसोम उत्पादन के लगभग 2 घंटे के बाद, आईए और एलओ दबाव बंद कर दिए गए थे। शेष लिपोसोम को धीरे-धीरे अवलोकन कक्ष में प्रवाहित करने के लिए ओए चैनल दबाव 100 मिलीबार पर रखा गया था। एक बार जब चैनल में सभी लिपोसोम ईडब्ल्यू में बरामद हो गए, तो प्रवाह को रोकने और लिपोसोम को स्थानांतरित करने से रोकने के लिए दबाव बंद कर दिया गया। कम पीएच पर उत्पन्न लिपोसोम ने अपने लुमेन (चित्रा 4 बी, डी) में एक सजातीय प्रतिदीप्ति (एनकैप्सुलेटेड फ्लोरोसेंट पीएलएल-एफआईटीसी से) दिखाया। सतह पर तैरने वाली ऑक्टानोल बूंदों को शीर्ष से 5 μL घोल को सावधानीपूर्वक पाइप करके हटा दिया गया था ताकि उन्हें आगे के पाइपिंग चरणों को प्रभावित करने से रोका जा सके। इसके बाद, एफएस बफर के 10 μL को ईडब्ल्यू में जोड़ा गया, जिसने एनकैप्सुलेटेड पीएलएल और एटीपी के चरण पृथक्करण को प्रेरित किया। प्रत्येक लिपोसोम से सजातीय एफआईटीसी प्रतिदीप्ति धीरे-धीरे अलग-अलग फ्लोरोसेंट कंडेनसेट बूंदों में बदल गई। आखिरकार, व्यक्तिगत बूंदें एक बड़ी घनीभूत बूंद में विलय हो गईं जो लिपोसोम (चित्रा 4 सी, ई-जी) के भीतर स्वतंत्र रूप से फैल गईं।

Figure 1
चित्र 1: ओला की असेंबली और कामकाज को दर्शाने वाला योजनाबद्ध। दबाव नियंत्रक बाहरी जलीय, लिपिड-इन-ऑक्टानोल और आंतरिक जलीय घोल वाले जलाशयों से जुड़ा होता है। जलाशयों में डाली गई ट्यूबों को ओला डिवाइस के संबंधित इनलेट्स से जोड़ा जाता है। तीन चैनलों में उचित प्रवाह से वाटर-इन-(लिपिड-इन-ऑक्टानॉल)-इन-वाटर डबल इमल्शन का निर्माण होता है। गठित डबल इमल्शन निकास कुएं में चले जाते हैं, जिसके दौरान ऑक्टानॉल पॉकेट लिपोसोम बनाने के लिए अलग हो जाते हैं। गठित लिपोसोम को विज़ुअलाइज़ेशन और आगे के प्रयोग के लिए कुएं के तल पर एकत्र किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ओला चिप की तैयारी (फोटोलिथोग्राफी, माइक्रोफैब्रिकेशन, सतह उपचार)। (ए) ओला डिजाइन की प्रमुख विशेषताओं को दिखाने वाला डिजिटल डिज़ाइन, जिसमें तीन इनलेट, एक आउटलेट और एक छह-तरफ़ा उत्पादन जंक्शन शामिल हैं। (बी) यूवी लिथोग्राफी का उपयोग करके उत्पादित कई ओला डिजाइनों को दिखाने वाले मास्टर वेफर का एक योजनाबद्ध। (C) मास्टर वेफर पर डाला गया एक PDMS इलास्टोमेर, एल्यूमीनियम पन्नी से बने कुएं में रखा जाता है, और 2 घंटे के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर बेक करके ठीक किया जाता है। (D) ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार का उपयोग करके बंधा एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस, जहां ओला डिज़ाइन युक्त PDMS ब्लॉक PDMS-लेपित ग्लास स्लाइड से जुड़ा होता है। (ई) डिवाइस को आंशिक रूप से हाइड्रोफिलिक बनाने के लिए निर्मित चिप की सतह कार्यात्मकता। यह बाहरी जलीय चैनल से निकास चैनल की ओर 5 मिनट के लिए 5% डब्ल्यू / वी पीवीए बहकर किया जाता है। अन्य चैनलों में सकारात्मक हवा का दबाव पीवीए समाधान को इन चैनलों में प्रवेश करने से रोकता है। (एफ) निकास चैनल में वैक्यूम लगाकर पीवीए को हटा दिया जाता है। डिवाइस को 15 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर बेक किया जाता है और फिर उपयोग करने के लिए तैयार होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: उत्कृष्ट एनकैप्सुलेशन के साथ मोनोस्प्रेटेड डबल इमल्शन और अंततः लिपोसोम का कुशलतापूर्वक उत्पादन करने वाले ओला का प्रदर्शन। (ए) एक उज्ज्वल-क्षेत्र छवि जो डबल-इमल्शन बूंदों की तेजी से पीढ़ी दिखाती है। (बी) फ्लोरोसेंट लिपिड चैनल आंशिक डीवेटिंग के कारण एक ऑक्टानोल जेब के गठन को दर्शाता है। लिपिड-इन-ऑक्टानॉल चरण में 1,000: 1 अनुपात में डीओपीसी (5 मिलीग्राम / एमएल) और लिस रोड पीई का मिश्रण था। (सी) पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) के एनकैप्सुलेशन को दिखाने वाला आंतरिक जलीय चैनल। (ए-सी) में इनसेट संबंधित पैनलों (स्केल बार = 10 μm) के प्रतिनिधि ज़ूम-इन दृश्य दिखाते हैं। (D-F) निकास चैनल में ऑक्टानॉल जेब को गीला करना, जो एक लिपोसोम बनाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: लिपोसोम के भीतर पीएलएल / एटीपी का पीएच-ट्रिगर तरल-तरल चरण पृथक्करण। (ए) पीएलएल और एटीपी के समरूप समाधान के पीएच-निर्भर संक्रमण का योजनाबद्ध लिपोसोम (बाएं) से चरण-अलग पीएलएल / एटीपी कोसरवेट (दाएं) के भीतर समझाया गया है। लिपोसोम में प्रारंभिक अम्लीय वातावरण एटीपी के आणविक चार्ज को तटस्थ बनाता है, जिससे कोसरवेशन बाधित होता है। जब लिपोसोम के अंदर पीएच बाहरी रूप से लागू पीएच वृद्धि के साथ मेल खाता है, तो एटीपी एक नकारात्मक चार्ज प्राप्त करता है, जिससे कोसरवेशन शुरू होता है। (B-C) लाइन ग्राफ (क्रमशः पैनलों [डी] और [जी] में बिंदीदार रेखाओं के अनुरूप) पीएलएल (ग्रीन चैनल) और झिल्ली (लाल चैनल) के स्थानिक वितरण को दर्शाते हैं। (D-G) लिपोसोम के भीतर पीएलएल / एटीपी कोसरवेट के गठन को दिखाने वाली टाइम-लैप्स छवियां। एक बुनियादी बफर का बाहरी जोड़ मिनटों के दौरान लिपोसोम के अंदर पीएच स्तर को बढ़ाता है और कोसरवेशन शुरू करता है। टी = 0 मिनट पहले की घटना की घटना से ठीक पहले के समय को संदर्भित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: ओला डिजाइन की सीएडी फ़ाइल। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सेलुलर जटिलता एक पूरे के रूप में अध्ययन किए जाने पर जीवित कोशिकाओं को समझना बेहद मुश्किल बनाती है। विट्रो में प्रमुख घटकों को पुनर्गठित करके कोशिकाओं के अतिरेक और इंटरकनेक्टिविटी को कम करना जैविक प्रणालियों की हमारी समझ को आगे बढ़ाने और जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों22,23,24 के लिए कृत्रिम सेलुलर मिमिक्स बनाने के लिए आवश्यक है। लिपोसोम सेलुलर घटनाओं को समझने के लिए एक उत्कृष्ट न्यूनतम प्रणाली के रूप में काम करते हैं। इन घटनाओं की एक गैर-संपूर्ण सूची में साइटोस्केलेटन गतिशीलता और परिणामस्वरूप झिल्ली विरूपण25,26, बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट 27,28 का स्थानिक विनियमन और झिल्ली29 के साथ उनकी बातचीत, सेल-मुक्त प्रतिलेखन-अनुवाद प्रणाली 30, सेल-मुक्त लिपिड संश्लेषण 31, और प्रोटीन 32 के विकास सहित विभिन्न प्रकार के बायोमोलेक्यूल्स का एनकैप्सुलेशन शामिल है।33,34. लिपोसोम ्स का व्यापक रूप से दवा वितरण के लिए वाहक के रूप में भी उपयोग किया गया है औरनैदानिक उपयोग के लिए खाद्य और औषधि प्रशासन (एफडीए) और यूरोपीय मेडिसिन एजेंसी (ईएमए) द्वारा अनुमोदित किया गया है। लिपोसोम ्स और लिपिड-आधारित नैनोकणों का उपयोग दवा वितरण के लिए वाहक के रूप में किया जाता है, जिसमें हाल ही में कोविड-19 वैक्सीन35 जैसे एमआरएनए टीके शामिल हैं।

यह अध्ययन ऑन-चिप लिपोसोम (चित्रा 1 और चित्रा 3) उत्पन्न करने के लिए ओला तकनीक करने के लिए फोटोलिथोग्राफी, माइक्रोफ्लुइडिक असेंबली और सतह कार्यात्मकता पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। ओला का उपयोग करके उत्पादित लिपोसोम मोनोस्प्रेटेड (भिन्नता का गुणांक: औसत का 4% -11%) और जैविक सेल के आकार की सीमा (आमतौर पर व्यास में 5-50 μm के बीच) में हैं, और उन्हें आंतरिक और बाहरीजलीय चैनलों के उचित प्रवाह वेगों का उपयोग करके ट्यून किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चित्र 1 में देखी गई लिपोसोम आबादी का आकार वितरण 23.3 μm ± 1.8 μm (n = 50) है। 10-30 हर्ट्ज की विशिष्ट उत्पादन दर के साथ, गठित लिपोसोम यूनिलामेलर होते हैं, जैसा कि पहले झिल्ली में एकल बाइलेयर-विशिष्ट ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन, अल्फा-हेमोलिसिन36 को सम्मिलित करके पुष्टि की गई थी, साथ ही साथ डिथियोनेट-ब्लीचिंग परख37 का उपयोग करके। ओला लिपिड रचनाओं की एक विस्तृत विविधता के साथ भी संगत है, जो उपयोगकर्ता को लिपिड की पसंद में लचीलापन प्रदान करता है। महत्वपूर्ण रूप से, शुरू में इस्तेमाल की जाने वाली लिपिड संरचना अंतिम लिपोसोम संरचना38 में परिलक्षित होती है।

अपेक्षाकृत नई तकनीक होने के नाते, ओला में सुधार की और गुंजाइश है। उदाहरण के लिए, पीवीए का उपयोग करके सतह कार्यात्मकता महत्वपूर्ण है लेकिन प्रदर्शन करने के लिए थकाऊ है। डिवाइस को सतह-कार्यात्मक बनाने का एक आसान और सरल तरीका चिप निर्माण समय के साथ-साथ चिप-टू-चिप परिवर्तनशीलता को काफी कम कर देगा। प्लूरोनिक एफ 68 सर्फेक्टेंट बाहरी जलीय चरण में एक महत्वपूर्ण घटक है जो शुरू में डबल इमल्शन को स्थिर करता है; बहरहाल, इसका उपयोग कुछ मामलों में प्रतिबंधात्मक हो सकता है। प्लूरोनिक एफ 68 को अधिक जैव-संगत सर्फेक्टेंट या पूर्ण सर्फेक्टेंट हटाने के साथ बदलने से सिस्टम की बहुमुखी प्रतिभा में सुधार हो सकता है। निकास चैनल में उत्पन्न डबल इमल्शन के प्रवास के दौरान, वे कतरनी के कारण फट सकते हैं। डबल इमल्शन स्थिरता और ऑक्टानॉल पॉकेट पृथक्करण में सुधार के लिए ओला डिजाइन को अपग्रेड करने से थ्रूपुट में वृद्धि हो सकती है। बहरहाल, ओला के कई फायदे हैं, जिनमें मुख्य रूप से कुशल एनकैप्सुलेशन, मोनोस्प्रेटेड और यूनिलामेलर लिपोसोम और नियंत्रित ऑन-चिप प्रयोग शामिल हैं।

ओला को लिपोसोम्स 39 के विकास और विभाजन, तरल-तरल चरण पृथक्करण27 की प्रक्रिया का अध्ययन करने और झिल्ली21 के साथ इसकी बातचीत और लिपोसोम40 में जीवाणु विकास जैव उत्पाद गठन को समझने सहित विभिन्न प्रकार के अध्ययनों में नियोजित और अनुकूलित किया गया है। ओला आधारित उच्च-थ्रूपुट परख का उपयोग झिल्ली41 में आयन परिवहन और लिपिड बाइलेयर37 में दवा पारगम्यता को समझने के लिए भी किया जा रहा है, चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए दवा वितरण प्रणाली के रूप में, झिल्ली 43 पर रोगाणुरोधी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, और तरल क्रिस्टल44 को समाहित करने के लिए एक उपकरण के रूप में। ओला प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोगों की विस्तृत श्रृंखला के अलावा, विशेष उद्देश्यों के लिए उपयुक्त ओला के संशोधित संस्करण 45,46,47,48,49,50 विकसित किए जा रहे हैं। कुल मिलाकर, पेशेवरों और विपक्षों को ध्यान में रखते हुए, हम दृढ़ता से मानते हैं कि ओला सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक बहुमुखी मंच है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम हमें वाईएफपी प्रदान करने के लिए डॉल्फ वीजर्स, वेरा गोरेलोवा और मार्क रूसजेन को धन्यवाद देना चाहते हैं। एसडी डच रिसर्च काउंसिल (अनुदान संख्या: OCENW) से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है। क्लेन.465)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octanol Sigma-Aldrich No. 297887
1.5 mL tubes Fisher scientific 10451043 Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATP Sigma-Aldrich No. A2383
Biopsy punch Darwin microfluidics PT-T983-05 0.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-base Sigma-Aldrich No. 71405
Dextran Sigma-Aldrich No. 31388 Mr~6,000
Direct-write optical lithography machine Durham Magneto Optics Ltd MicroWriter ML3 Baby setup and software
DOPC lipid Avanti SKU:850375C
F68 Sigma-Aldrich No. 24040032
Glass cover slip Corning #1, 24 x 40 mm
Glycerol Sigma-Aldrich No. G2025
Hydrochloric acid Thermo Scientific Acros No. 124630010
Liss Rhod PE lipid Avanti SKU:810150C
Parafilm Sigma-Aldrich No. P7793
Photoresist Micro resist technology GmbH EpoCore 10
Photoresist developer micro resist technology GmbH mr-Dev 600
Plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G
Polydimethylsiloxane Dow Sylgard 184 PDMS and curing agent
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich No. P7890
Poly-L-lysine–FITC Labeled Sigma-Aldrich No. P3543
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich no. P8136 molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controller Elveflow  OBK1 Mk3+ Flow controller
Scotch tape Magic Tape Invisible Matt Tape
Silicon wafer Silicon Materials 0620R16002
Spin coater  Laurell Technologies Corporation Model WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers Darwin microfluidics PN-BEN-23G
Tris-base Sigma-Aldrich No. 252859
Tygon tubing Darwin microfluidics 1/16" OD x 0.02" ID
UV laser  365 nm wavelength

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References

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Chen, C., Ganar, K. A., Deshpande, S. On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering. J. Vis. Exp. (193), e65032, doi:10.3791/65032 (2023).

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