Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

On-chip oktanolassisterad liposommontering för bioteknik

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/65032
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter, Wageningen University & Research
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver oktanolassisterad liposommontering (OLA), en mikrofluidisk teknik för att generera biokompatibla liposomer. OLA producerar monodispergerade liposomer i mikronstorlek med effektiv inkapsling, vilket möjliggör omedelbar experiment på chipet. Detta protokoll förväntas vara särskilt lämpligt för syntetisk biologi och syntetisk cellforskning.

Abstract

Mikrofluidik är ett allmänt använt verktyg för att generera droppar och vesiklar av olika slag på ett kontrollerat och högt genomströmningssätt. Liposomer är förenklade cellulära efterlikningar som består av ett vattenhaltigt inre omgivet av ett lipid-dubbelskikt; De är värdefulla för att designa syntetiska celler och förstå grunden för biologiska celler på ett in vitro-sätt och är viktiga för tillämpad vetenskap, såsom lastleverans för terapeutiska tillämpningar. Den här artikeln beskriver ett detaljerat arbetsprotokoll för en mikrofluidisk teknik på chipet, oktanolassisterad liposommontering (OLA), för att producera monodispergerade, mikronstora, biokompatibla liposomer. OLA fungerar på samma sätt som bubbelblåsning, där en inre vattenhaltig (IA) fas och en omgivande lipidbärande 1-oktanolfas kläms av av ytaktiva yttre vätskeströmmar. Detta genererar lätt droppar med dubbel emulsion med utskjutande oktanolfickor. När lipid-dubbelskiktet monteras vid droppgränssnittet lossnar fickan spontant för att ge upphov till en unilamellär liposom som är redo för ytterligare manipulation och experiment. OLA ger flera fördelar, såsom stadig liposomgenerering (>10 Hz), effektiv inkapsling av biomaterial och monodisperserade liposompopulationer, och kräver mycket små provvolymer (~ 50 μL), vilket kan vara avgörande när man arbetar med värdefulla biologiska ämnen. Studien innehåller detaljer om mikrofabrikation, mjuklitografi och ytpassivering, som behövs för att etablera OLA-tekniken i labbet. En proof-of-principle syntetisk biologiapplikation visas också genom att inducera bildandet av biomolekylära kondensat inuti liposomerna via transmembranprotonflöde. Det förväntas att detta medföljande videoprotokoll kommer att underlätta läsarna att upprätta och felsöka OLA i sina laboratorier.

Introduction

Alla celler har ett plasmamembran som sin fysiska gräns, och detta membran är i huvudsak en byggnadsställning i form av ett lipid-dubbelskikt bildat genom självmontering av amfifila lipidmolekyler. Liposomer är de minimala syntetiska motsvarigheterna till biologiska celler; De har en vattenhaltig lumen omgiven av fosfolipider, som bildar ett lipid-dubbelskikt med de hydrofila huvudgrupperna vända mot vattenfasen och de hydrofoba svansarna begravda inåt. Liposomernas stabilitet styrs av den hydrofoba effekten, liksom hydrofiliciteten mellan de polära grupperna, van der Waals-krafterna mellan de hydrofoba kolsvansarna och vätebindningen mellan vattenmolekyler och de hydrofila huvudena 1,2. Beroende på antalet lipidbilager kan liposomer klassificeras i två huvudkategorier, nämligen unilamellära vesiklar innefattande ett enda dubbelskikt och multilamellära vesiklar konstruerade av flera dubbelskikt. Unilamellar vesiklar klassificeras vidare baserat på deras storlekar. De är vanligtvis sfäriska i form och kan tillverkas i olika storlekar, inklusive små unilamellära vesiklar (SUV, 30-100 nm diameter), stora unilamellar vesiklar (LUV, 100-1,000 nm diameter) och slutligen jätte unilamellar vesiklar (GUV, >1,000 nm diameter)3,4. Olika tekniker har utvecklats för att producera liposomer, och dessa kan kategoriseras brett i bulktekniker5 och mikrofluidiska tekniker6. Vanligen praktiserade bulktekniker inkluderar lipidfilmrehydrering, elektroformation, inverterad emulsionsöverföring och extrudering 7,8,9,10. Dessa tekniker är relativt enkla och effektiva, och dessa är de främsta orsakerna till deras utbredda användning i syntetisk biologi samhället. Samtidigt lider de emellertid av stora nackdelar med avseende på polydispersiteten i storlek, bristen på kontroll över lamellariteten och låg inkapslingseffektivitet 7,11. Tekniker som kontinuerlig droplet interface crossing encapsulation (cDICE)12 och droppskytte och storleksfiltrering (DSSF)13 övervinner dessa begränsningar i viss utsträckning.

Mikrofluidiska metoder har blivit allt mer framträdande under det senaste decenniet. Mikrofluidisk teknik ger en kontrollerbar miljö för att manipulera vätskeflöden inom användardefinierade mikrokanaler på grund av det karakteristiska laminära flödet och diffusionsdominerad massöverföring. De resulterande lab-on-a-chip-enheterna erbjuder unika möjligheter för spatiotemporal kontroll av molekyler, med avsevärt reducerade provvolymer och multiplexeringskapacitet14. Många mikrofluidiska metoder för att göra liposomer har utvecklats, inklusive pulsad jetting15, dubbel emulsionsmall 16, transient membranutkastning 17, droppemulsionsöverföring 18 och hydrodynamisk fokusering 19. Dessa tekniker producerar monodispergerade, unilamellära, cellstora liposomer med hög inkapslingseffektivitet och hög genomströmning.

Denna artikel beskriver proceduren för oktanolassisterad liposommontering (OLA), en mikrofluidisk metod på chip baserad på den hydrodynamiska avklämningen och efterföljande lösningsmedelsvätningsmekanism20 (figur 1). Man kan relatera OLA:s arbete till en bubbelblåsningsprocess. En sexvägskorsning fokuserar den inre vattenhaltiga (IA) fasen, två lipidbärande organiska (LO) strömmar och två ytaktiva innehållande yttre vattenhaltiga (OA) strömmar på en enda plats. Detta resulterar i vatten-i-(lipider + oktanol)-i-vatten dubbla emulsionsdroppar. När dessa droppar flyter nedströms leder minimering av gränssnittsenergi, externt skjuvflöde och interaktion med kanalväggarna till bildandet av ett lipid-dubbelskikt vid gränssnittet när lösningsmedelsfickan lossnar och därmed bildar unilamellär liposom. Beroende på storleken på oktanolfickan kan avfuktningsprocessen ta tiotals sekunder till ett par minuter. I slutet av utgångskanalen flyter de mindre täta oktanoldropparna till ytan, medan de tyngre liposomerna (på grund av en tätare inkapslad lösning) sjunker till botten av visualiseringskammaren redo för experiment. Som ett representativt experiment demonstreras processen för vätske-vätskefasseparation (LLPS) inuti liposomer. För detta är de nödvändiga komponenterna inkapslade inuti liposomer vid ett surt pH som förhindrar LLPS. Genom att externt utlösa en pH-förändring och därmed ett transmembranprotonflöde bildas fasseparerade kondensatdroppar inuti liposomerna. Detta belyser OLA-systemets effektiva inkapslings- och manipuleringsförmåga.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tillverka master wafer

  1. Ta en ren kiselskiva med en diameter på 4 tum (10 cm) (se materialförteckning). Rengör den ytterligare med tryckluft för att avlägsna eventuella dammpartiklar.
  2. Montera skivan på en spinnbeläggare och fördela försiktigt ~ 5 ml negativ fotoresist (se materialtabell) i mitten av skivan. Försök att undvika luftbubblor, eftersom de kan störa skivans nedströms utskriftsprocess.
  3. För att få ett 10 μm tjockt fotoresistskikt, spinnbelägg skivan vid 500 rpm i 30 s med en acceleration på 100 rpm/s för initial spridning, följt av en 60 s rotation vid 3 000 rpm med en acceleration på 500 rpm/s. Om en annan tjocklek önskas, ändra spinnparametrarna enligt tillverkarens instruktioner.
  4. Grädda rånet på en värmeplatta i 2 min vid 65 °C och sedan i 5 min vid 95 °C.
  5. När skivan har svalnat, montera skivan i tryckkammaren på den direktskrivna optiska litografimaskinen (se materialförteckning) och mata in OLA-designen (figur 2A, kompletterande kodningsfil 1) i programvaran.
    OBS: OLA-designen består i huvudsak av två OA-kanaler, två LO-kanaler och en IA-kanal, som smälter samman för att bilda en sexvägskorsning som fortsätter som en efterproduktionskanal och hamnar i experimentbrunnen (EW).
  6. Skriv ut OLA-designen/-designerna på den belagda skivan med en UV-laser (se Materialförteckning) med en dos på 300 mJ/cm2.
  7. När motivet är tryckt, grädda rånet vid 65 °C i 1 minut, följt av 95 °C i 3 minuter.
  8. Se nu till att konturen av den utskrivna enheten visas på skivan och är synlig för blotta ögat. För att tvätta bort den ohärdade fotoresisten, doppa skivan i en glasbägare som innehåller framkallningslösningen (se materialförteckning) tills den ohärdade fotoresisten är helt borttagen.
    Överdriven utvecklarbehandling kan påverka designupplösningen.
  9. Tvätta skivan med aceton, isopropanol och avjoniserat (DI) vatten i följd och slutligen med tryckluft / N2 med en blåspistol.
  10. Hårdbaka skivan vid 150 °C i 30 minuter för att säkerställa att den tryckta designen är ordentligt fastsatt på skivans yta och inte lossnar i tillverkningsprocessen nedströms. Masterskivan är sedan klar för vidare användning (figur 2B).

2. Förbereda mikrofluidanordningen

  1. Placera huvudskivan på en fyrkantig bit aluminium och linda aluminiumfolien runt skivan och bilda en välliknande struktur (figur 2C).
  2. Mät upp 40 g polydimetylsiloxan (PDMS) och 4 g härdningsmedel (10:1, viktförhållande, se materialtabell) i ett 50 ml centrifugrör och blanda kraftigt med en spatel eller pipettspets i 2-3 minuter.
  3. Den kraftiga blandningen av PDMS och härdningsmedlet fångar luftbubblor inuti blandningen. Snurra röret vid 100 x g i 2-3 minuter för att ta bort majoriteten av stora luftbubblor.
  4. Häll ca 15-20 g av blandningen beredd i steg 2.3 över huvudskivan och avgasa med exsickator. Spara överskottsblandningen för att göra PDMS-belagda glasskivor (steg 3).
  5. Inkubera hopsättningen i ugn vid 70 °C i minst 2 timmar.
  6. Ta ut huvudskivan ur ugnen och låt den svalna. För att ta bort det stelnade PDMS-blocket, ta bort aluminiumfolien och dra försiktigt bort PDMS-blocket från skivans kant.
    OBS: Skivan är ömtålig och kan gå sönder, så det är viktigt att göra denna process noggrant.
  7. När PDMS-blocket har tagits bort, håll den mönstrade strukturen uppåt och skär enskilda PDMS-block med ett skarpt blad eller en skalpell, var och en innehållande en enda mikrofluidisk enhet.
  8. Placera PDMS-blocket på en mörk yta och justera ljusriktningen (en bordslampa är till nytta för detta) så att de graverade kanalerna är blanka och som ett resultat synliga. Gör hål i inloppen och utgångskanalen med biopsistansar med 0,5 mm respektive 3 mm diameter (se materialtabell).
    OBS: Använd en skarp biopsistans för att undvika sprickor i PDMS, vilket kan orsaka läckage senare. Tryck försiktigt biopsistansen genom PDMS-blocket och se till att den passerar helt genom den. För att ta bort biopsistansen, dra försiktigt tillbaka den medan du roterar den i alternativa riktningar. PDMS-blocket med graverad OLA-design är nu redo att bindas till en PDMS-belagd glasskiva.

3. Gör den PDMS-belagda glasskivan

  1. Ta ett genomskinligt glasskydd, häll cirka 0,5 ml PDMS (beredd i överskott i steg 2.4) på mitten av glasskivan och sprid den över täckglaset genom att försiktigt luta glasskivan, vilket säkerställer total täckning av glasskivan med PDMS.
  2. Montera glasskivan på spinnlacken, se till att den är centralt placerad (så att mitten av glasskivan överlappar med mitten av tryckaxeln) och snurra glasskivan vid 500 rpm i 15 s (i steg om 100 rpm / s) och sedan vid 1,000 rpm i 30 s (vid en ökning av 500 rpm / s).
  3. Placera den PDMS-belagda glasskivan (belagd sida uppåt) på en upphöjd plattform som ett PDMS-block (1 cm x 1 cm) i en täckt petriskål och grädda den vid 70 ° C i 2 timmar.

4. Limning av den mikrofluidiska anordningen

  1. Rengör PDMS-blocket (förberett i steg 2) genom att fästa och ta bort kommersiellt tillgänglig tejp (se materialförteckning) två gånger. Se till att hålla den rengjorda sidan uppåt tills användning.
  2. Rengör den PDMS-belagda glasskivan med tryckluft/N2 med en blåspistol och håll den rena sidan uppåt.
  3. Placera PDMS-blocket (graverade kanaler uppåt) och den PDMS-belagda glasskivan (belagd sida uppåt) i plasmarenarens vakuumkammare (se Materialförteckning).
  4. Slå på vakuumet och exponera innehållet för luftplasma med en radiofrekvens på 12 MHz (RF-läge högt) i 15 s för att aktivera ytorna. Syreplasma kan ses i form av en rosa nyans.
  5. Omedelbart efter plasmabehandlingen, placera den PDMS-belagda glasskivan på en ren yta med PDMS-sidan uppåt. Placera försiktigt PDMS-blocket med det mikrofluidiska mönstret nu vänt mot den PDMS-belagda glasskivan, så att de kan binda (figur 2D).
    OBS: Att ta bort luften som fångas i enheten är avgörande för att säkerställa noggrann bindning.
  6. Grädda de bundna enheterna vid 70 ° C i 2 timmar.

5. Ytfunktionalisering av mikrofluidikanordningen

OBS: Före ytfunktionalisering är det viktigt att kalibrera tryckpumpen enligt tillverkarens protokoll (se materialförteckning) och montera slangen för att ansluta den till mikrofluidanordningen.

  1. Anslutning av mikrofluidikanordningen till tryckpumparna
    1. Anslut den tryckdrivna flödesregulatorn till en extern tryckkälla (upp till 6 bar). Minst fyra oberoende lufttryckskanaler krävs: tre individuella moduler på 0-2 bar och en modul på -0,9-4 bar.
    2. Kalibrera tryckpumpen enligt tillverkarens protokoll (se Materialförteckning).
    3. Skär slangen (1/16 i OD x 0,02 i ID) i fyra lika stora bitar som är cirka 20 cm långa.
    4. Sätt i 23 G 90° böjda kopplingar i rostfritt stål (se Materialförteckning) i ena änden av varje stycke. Denna ände sätts senare in i de tre inloppen (OA, LO och IA) i mikrofluidikanordningen och den fjärde används för att avlägsna överflödig lösning (steg 5.2.5).
    5. Sätt in den andra änden av slangen i mikrofluidikbehållarens stativ och försegla den med mikrofluidiska beslag, så att slangen är tillräckligt lång för att röra behållarens botten (1,5 ml rör, se materialtabell). Detta förhindrar att oönskade luftbubblor kommer in i mikrofluidikenheten under PVA-behandlingen / liposomproduktionen.
  2. PVA-behandling av utgångskanalen
    OBS: Före liposomgenerering är det viktigt att göra enheten delvis hydrofil nedströms produktionspunkten. Detta görs genom att behandla dessa kanaler med 5% (w / v) polyvinylalkohol (PVA) lösning. PVA-lösningen bereds genom upplösning av PVA-pulvret (se materialförteckning) i vatten vid 80 °C i 3 timmar under konstant omrörning med användning av en magnetomrörare. Filtrera lösningen innan du använder den för ytbehandling. Omedelbart efter bindningen av anordningen är de mikrofluidiska kanalerna hydrofila på grund av den plasmainducerade ytaktiveringen, och de kommer gradvis att bli hydrofoba igen. Det rekommenderas att vänta i 2 timmar efter bakningen (steg 4.6) innan PVA-behandlingen påbörjas.
    1. Fördela 200 μL 5% w/v PVA-lösning i ett 1,5 ml rör och anslut det till mikrofluidikbehållarens stativ. Sätt i slangen (den som nämns i steg 5.1.3) så att ena änden är nedsänkt i PVA-lösningen och den andra änden är ansluten till inloppet till OA-kanalen i mikrofluidanordningen.
      OBS: En lägre PVA-koncentration kan leda till undermålig ytfunktionalisering.
    2. Upprepa ovanstående steg utan PVA (tomt 1,5 ml rör) och anslut det till LO- och IA-kanalerna.
    3. Öka trycket i OA-fasen till 100 mbar för att flöda PVA-lösningen i OA-kanalerna. Öka trycket i IA- och LO-faserna till 120 mbar för att förhindra återflöde av PVA-lösning inuti dessa kanaler (figur 2E).
      OBS: Om det behövs, justera trycket på de enskilda kanalerna för att hålla menisken stabil vid produktionspunkten.
    4. Flöda PVA-lösningen på detta sätt i cirka 5 minuter, vilket säkerställer fullständig funktionalisering av utgångskanalen.
    5. För att ta bort PVA-lösningen, ta bort slangen från OA-inloppet och öka omedelbart trycket i LO- och IA-kanalerna till 2 bar. Använd samtidigt en slang ansluten till en undertryckskanal (−900 mbar) för att avlägsna överskott av PVA först från utgångskanalen och sedan från OA-inloppet (figur 2F).
    6. Grädda enheten vid 120 °C i 15 minuter och låt den svalna före användning. Enheten kan förvaras under omgivande förhållanden i minst 1 månad.
      OBS: Det rekommenderas att vänta i 1 dag (vid rumstemperatur) innan du fortsätter med OLA för att säkerställa att det obehandlade PDMS återfår sin hydrofobicitet efter plasmabehandlingen.

6. Oktanolassisterad liposommontering (OLA)

  1. Förbereda lipidstammen
    OBS: Här används en blandning av 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC) och 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-(lissamin, rhodamin, B-sulfonyl) (Liss Rhod PE) lipider (se materialförteckning) som exempel; Användare bör förbereda den lipidkomposition de behöver på ett liknande sätt.
    1. Fördela 76 μl DOPC (25 mg/ml) och 16,6 μl Liss Rhod PE (1 mg/ml) i en rundkolv med separata glassprutor.
    2. Håll rundkolven upprätt och använd en komprimerad N 2-blåspistol för att ge en mild ström av kväve för att avdunsta kloroformen och bilda en torkad lipidfilm i kolvens botten.
    3. Placera kolven i exsickatorn i minst 2 timmar under kontinuerligt vakuum för att avlägsna eventuell kvarvarande kloroform.
    4. Tillsätt 100 μl etanol i rundkolven, följt av försiktig pipettering eller skakning för att säkerställa att lipiderna löses upp till en lipidstam på 10 % (vikt/volym).
      OBS: Om en viss lipidkomposition inte är helt löslig i etanol, använd en etanol / kloroformblandning, håll volymen kloroform så liten som möjligt.
    5. Pipettera lösningen till en injektionsflaska av mörkt glas. Spola injektionsflaskan försiktigt med kväve med en blåspistol för att ersätta luften med en inert atmosfär. Förslut locket med paraffinfilm och förvara vid −20 °C.
      OBS: Stamlösningen kan användas i upp till några månader. Varje gång injektionsflaskan öppnas, byt försiktigt ut luften mot kväve och återförslut med lock med paraffinfilm.
  2. Förbereda OLA-lösningarna
    1. Gör stamlösningar av de oumbärliga komponenterna: 20 mM dextran (Mw 6 000); 60% (v/v) glycerol; en valfri buffert. I detta fall framställdes 5x fosfatbuffrad saltlösning (0,68 M NaCl, 13,5 mM KCl, 50 mMNa2HPO4, 9 mM KH2PO4; pH 7,4) (se materialtabell).
      OBS: Eftersom ren glycerol är mycket viskös rekommenderas att skära ut en liten bit i slutet av pipettspetsen på ett lutande sätt för effektiv pipettering.
    2. Bered 100 μL IA-, OA- och utgångslösning (ES, önskad lösning för att fylla EW) proverna. För att underlätta visualiseringen tillsattes gult fluorescerande protein (YFP) till IA-lösningen i detta speciella fall. Kontrollera den osmotiska balansen mellan IA och OA genom att beräkna osmolariteten hos de inkapslade komponenterna och tillsätta en lämplig mängd socker eller salt i OA om det behövs. Detta görs för att förhindra sprängning eller krympning av liposomerna under produktionen.
      OBS: De slutliga kompositionerna av de tre faserna är följande:
      IA: 15% glycerol, 5 mM dextran (Mw 6,000), 5,4 μM YFP, 1x PBS
      OA: 15% glycerol, 5% F68 ytaktivt medel, 1x PBS
      ES: 15% glycerol, 1x PBS
      En lägre koncentration av F68 ytaktivt medel påverkar negativt genereringen av dubbla emulsioner.
    3. Bered 80 μl av LO-fasen genom att pipettera 4 μL stamlipid till 76 μL 1-oktanol (se materialtabell). Den slutliga koncentrationen av DOPC är 5 mg/ml.
    4. Centrifugera proverna vid 700 x g i 60 s för att avlägsna eventuella stora aggregat innan du fortsätter med mikrofluidiska experiment. Detta förhindrar att några uppenbara igensättningsfaktorer kommer in i mikrofluidikchipet.
  3. Liposomproduktion
    1. Fördela lösningarna (IA, LO, OA) i tre 1,5 ml rör, montera dem (som nämns i steg 5.1) och anslut dem till det PVA-behandlade mikrofluidiska chipet (steg 5.2.6).
    2. Applicera ett positivt tryck på de tre kanalerna: ~ 100 mbar på IA- och LO-kanalerna och ~ 200 mbar på OA-kanalen.
      OBS: Eftersom OA-trycket är högre än de andra kommer OA-lösningen att vara den första som kommer fram till EW; Detta rekommenderas starkt.
    3. När OA-lösningen når EW, minska OA-trycket till 100 mbar och öka LO till 200 mbar.  LO-lösningen som anländer till produktionspunkten kommer sannolikt att resultera i luftbubblor på grund av att luft förskjuts från LO-kanalerna. När luftbubblorna har matats ut i EW justerar du LO-trycket till 100 mbar. Slutligen öka IA-trycket till 200 mbar och vänta tills all luft i IA-kanalen har tagits bort. Den ideala sekvensen för ankomst till korsningen av de tre faserna är således OA, LO och IA.
    4. När luften har avlägsnats från de tre kanalerna, justera alla kanaltryck till 50 mbar och pipettera 10 μL ES in i utgångskammaren. Efter pipettering av ES, sätt en täckglas på utgångshålet för att undvika avdunstning. Om LO trycks tillbaka, öka gradvis LO-trycket i steg om 1 mbar tills det börjar strömma till korsningen.
    5. När alla tre faserna börjar samflöda vid korsningen, se till att dubbel emulsionsproduktion börjar och justera efter dess kvalitet (figur 3A-C). Ändra trycket gradvis (steg på 0,1-1 mbar) snarare än plötsligt om inte trycket ändras för att eliminera en oönskad igensättning i kanalen.
      OBS: Kanalerna som ska justeras beror på vad som händer i korsningen. Till exempel måste IA minskas om emulsionerna är för stora; OA måste ökas om dubbla emulsioner bildas men spricker istället för att klämmas av; och LO måste minskas om oktanolfickan är för stor.
    6. Kontrollera att dropparna med dubbel emulsion flyter nedströms till EW. När de flyter blir oktanolfickor mer och mer framträdande och kläms slutligen av och bildar liposomer (figur 3D-F). Se till att efterproduktionskanalen är tillräckligt lång och att migreringen av de dubbla emulsionerna är tillräckligt långsam för avfuktning.
      OBS: Inom några minuter efter anständig produktion kommer liposomer och oktanoldroppar att lämna efterproduktionskanalen och gå in i EW. Som ett resultat, eftersom det är mindre tätt än vatten, flyter oktanoldropparna till ytan av ES. På grund av tillsatsen av dextran i IA är liposomerna tyngre än omgivningen och går till botten av kammaren redo för observation och ytterligare manipulation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna studie visar bildandet av membranlösa kondensat via processen med vätske-vätskefasseparation (LLPS) inuti liposomer som ett representativt experiment.

Provberedning
IA-, OA-, ES- och matningslösningen (FS) bereds enligt följande:

IA: 12% glycerol, 5 mM dextran, 150 mM KCl, 5 mg / ml poly-L-lysin (PLL), 0,05 mg / ml poly-L-lysin-FITC-märkt (PLL-FITC), 8 mM adenosintrifosfat (ATP), 15 mM citrat-HCl (pH 4)

OA: 12% v/v glycerol, 5% w/v F68, 150 mM KCl, 15 mM citrat-HCl (pH 4)

ES: 12% glycerol, 150 mM KCl, 15 mM citrat-HCl (pH 4)

FS: 12% glycerol, 150 mM KCl, 75 mM Tris-HCl (pH 9)

Kondensatbildning inuti liposomer
En enkel analys av pH-känsligt komplext koacervation av positivt laddad poly-L-lysin (PLL) och negativt laddat multivalent adenosintrifosfat (ATP) valdes för att demonstrera fenomenen LLPS i liposomer. För att förhindra fasseparation av polylysin och ATP under inkapsling hölls lösningens pH vid 4, vid vilket ATP är neutralt. Ökning av pH i ES genom tillsats av FS (en buffert av pH 9) ökade så småningom pH inuti liposomerna på grund av transmembranprotonflöde, vilket gjorde ATP negativt laddat och utlöste dess fasseparation med positivt laddad PLL21 (figur 4A). Efter ca 2 timmars liposomgenerering stängdes IA- och LO-trycket av. OA-kanaltrycket hölls vid 100 mbar för att långsamt strömma de återstående liposomerna in i observationskammaren. När alla liposomer i kanalen återfanns i EW stängdes trycket av för att stoppa flödet och förhindra att liposomerna rörde sig. Liposomerna genererade vid ett lägre pH visade en homogen fluorescens (från det inkapslade fluorescerande PLL-FITC) i deras lumen (figur 4B, D). Oktanoldroppar som flyter vid ytan avlägsnades genom att försiktigt pipettera ut 5 μL lösning från toppen för att förhindra att de påverkar ytterligare pipetteringsteg. Därefter tillsattes 10 μL FS-buffert till EW, vilket inducerade fasseparation av den inkapslade PLL och ATP. Den homogena FITC-fluorescensen från varje liposom omvandlades gradvis till distinkta fluorescerande kondensatdroppar. Så småningom slogs de enskilda dropparna samman till en större kondensatdroppe som fritt diffunderades i liposomerna (figur 4C, E-G).

Figure 1
Figur 1: Schema som visar montering och arbete av OLA. Tryckregulatorn är ansluten till behållarna innehållande yttre vattenhaltiga, lipid-i-oktanol och inre vattenhaltiga lösningar. Rören som sätts in i behållarna är anslutna till respektive inlopp på OLA-enheten. Lämpliga flöden i de tre kanalerna leder till bildandet av vatten-i-(lipid-i-oktanol)-i-vatten dubbelemulsioner. De bildade dubbla emulsionerna migrerar till utgångsbrunnen, under vilken oktanolfickorna lossnar för att bilda liposomer. De bildade liposomerna samlas i botten av brunnen för visualisering och ytterligare experiment. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Beredning av OLA-chipet (fotolitografi, mikrofabrikation, ytbehandling). (A) Digital design som visar de viktigaste funktionerna i OLA-designen, inklusive tre inlopp, ett utlopp och en sexvägs produktionskorsning. (B) En schematisk bild av masterskivan som visar flera OLA-konstruktioner framställda med UV-litografi. c) En PDMS-elastomer gjuten på masterskivan, placerad i en brunn skapad av aluminiumfolie och härdad genom bakning vid 70 °C i 2 timmar. D) En mikrofluidisk anordning som är bunden med syrgasplasmabehandling, där PDMS-blocket som innehåller OLA-konstruktionen är fäst vid en PDMS-belagd glasskiva. E) Ytfunktionalisering av det tillverkade chipet för att göra anordningen delvis hydrofil. Detta görs genom att flöda 5% w/v PVA i 5 minuter från den yttre vattenkanalen mot utgångskanalen. Positivt lufttryck i de andra kanalerna förhindrar att PVA-lösningen kommer in i dessa kanaler. (F) PVA avlägsnas genom att applicera ett vakuum i utgångskanalen. Enheten bakas vid 120 °C i 15 minuter och är sedan klar att användas. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Demonstration av OLA som effektivt producerar monodispergerade dubbelemulsioner och så småningom liposomer med utmärkt inkapsling. (A) En ljusfältsbild som visar snabb generering av dubbelemulsionsdroppar. (B) Den fluorescerande lipidkanalen visar bildandet av en oktanolficka på grund av partiell avfuktning. Lipid-i-oktanolfasen innehöll en blandning av DOPC (5 mg/ml) och Lis Rhod PE i förhållandet 1 000:1. C) Den inre vattenkanal som visar inkapsling av gulfluorescerande protein (YFP). Infällningarna i (A-C) visar representativa inzoomade vyer av respektive panel (skalstreck = 10 μm). (D-F) Dewetting av oktanolfickan i utgångskanalen, som bildar en liposom. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: pH-utlöst vätske-vätskefasseparation av pLL/ATP i liposomer. (A) Schematisk bild av den pH-beroende övergången av den homogena lösningen av pLL och ATP inkapslad i liposomen (vänster) till fasseparerade pLL/ATP-koacervater (höger). Den initiala sura miljön i liposomen gör att den molekylära laddningen av ATP är neutral, vilket hämmar koacervation. När pH inuti liposomerna balanserar med den externt applicerade pH-ökningen, får ATP en negativ laddning, vilket utlöser koacervation. (B-C) Linjediagram (motsvarande de streckade linjerna i panelerna [D] respektive [G]) som visar den rumsliga fördelningen av pLL (grön kanal) och membranet (röd kanal). (D-G) Timelapse-bilder som visar bildandet av pLL / ATP-koacervater i liposomerna. Den externa tillsatsen av en grundläggande buffert höjer pH-nivån inuti liposomerna under några minuter och initierar koacervation. t = 0 min avser tiden strax före förekomsten av den första coacervationshändelsen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande kodningsfil 1: CAD-fil för OLA-designen. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cellulär komplexitet gör det extremt svårt att förstå levande celler när de studeras som helhet. Att minska redundans och sammankoppling av celler genom att rekonstituera nyckelkomponenterna in vitro är nödvändigt för att öka vår förståelse av biologiska system och skapa artificiella cellulära efterlikningar för biotekniska tillämpningar22,23,24. Liposomer fungerar som ett utmärkt minimalt system för att förstå cellulära fenomen. En icke-uttömmande lista över dessa fenomen inkluderar cytoskelettdynamik och resulterande membrandeformationer 25,26, spatiotemporal reglering av biomolekylära kondensat 27,28 och deras interaktion med membranet 29, inkapsling av en mängd olika biomolekyler, inklusive cellfria transkriptionstranslationssystem 30, cellfri lipidsyntes 31 och evolution av proteiner 32,33,34. Liposomer har också använts i stor utsträckning som bärare för läkemedelsleverans och har godkänts av Food and Drug Administration (FDA) och Europeiska läkemedelsmyndigheten (EMA) för klinisk användning11. Liposomer och lipidbaserade nanopartiklar används som bärare för läkemedelsleverans, inklusive mRNA-vacciner som det senaste COVID-19-vaccinet35.

Denna studie beskriver ett detaljerat protokoll för fotolitografi, mikrofluidisk montering och ytfunktionalisering för att utföra OLA-tekniken för att generera liposomer på chip (figur 1 och figur 3). Liposomerna som produceras med användning av OLA är monodispergerade (variationskoefficient: 4% -11% av medelvärdet) och i det biologiska cellstorleksområdet (vanligtvis mellan 5-50 μm i diameter), och de kan ställas in med lämpliga flödeshastigheter för de inre och yttre vattenhaltiga kanalerna36. Till exempel har liposompopulationen som ses i figur 1 en storleksfördelning på 23,3 μm ± 1,8 μm (n = 50). Med typiska produktionshastigheter på 10-30 Hz är de bildade liposomerna unilamellära, vilket tidigare bekräftats genom att införa ett enda dubbelskiktsspecifikt transmembranprotein, alfa-hemolysin36, i membranet, samt genom att använda ditionatblekningsanalysen37. OLA är också kompatibel med en mängd olika lipidkompositioner, vilket ger användaren flexibilitet i valet av lipider. Viktigt är att den initialt använda lipidkompositionen återspeglas i den slutliga liposomkompositionen38.

Eftersom det är en relativt ny teknik finns det ytterligare utrymme för att förbättra OLA. Till exempel är ytfunktionalisering med PVA avgörande men tråkig att utföra. Ett enklare och enklare sätt att ytfunktionalisera enheten skulle avsevärt minska spåntillverkningstiden såväl som chip-till-chip-variabiliteten. Pluronic F68 ytaktivt medel är en viktig komponent i den yttre vattenfasen för att initialt stabilisera dubbelemulsionerna; Ändå kan dess användning vara restriktiv i vissa fall. Att ersätta Pluronic F68 med ett mer biokompatibelt ytaktivt medel eller fullständigt avlägsnande av ytaktivt medel kan förbättra systemets mångsidighet. Under migreringen av genererade dubbla emulsioner i utgångskanalen kan de brista på grund av skjuvning. Uppgradering av OLA-designen för att förbättra dubbelemulsionsstabiliteten och oktanolfickseparation kan därmed öka genomströmningen. Ändå har OLA flera fördelar, som huvudsakligen inkluderar effektiv inkapsling, monodispergerade och unilamellar liposomer och kontrollerade experiment på chip.

OLA har använts och anpassats i ett brett spektrum av studier, inklusive tillväxt och delning av liposomer39, studier av processen för vätske-vätskefasseparation27 och dess interaktion med membranet21 och förståelse av bakteriell tillväxtbioproduktbildning i liposomer40. OLA-baserade high-throughput-analyser används också för att förstå jontransport över membranet41 och läkemedelspermeabilitet över lipid-dubbelskiktet37, som ett läkemedelsleveranssystem för terapeutiska ändamål 42, för att studera effekten av antimikrobiella medel på membran 43 och som ett verktyg för att kapsla in flytande kristaller 44. Förutom det breda utbudet av tillämpningar av OLA-teknik utvecklas modifierade versioner av OLA som är lämpliga för särskilda ändamål 45,46,47,48,49,50. Sammantaget, med tanke på för- och nackdelar, tror vi starkt på att OLA är en mångsidig plattform för syntetisk biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna deklarerar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi vill tacka Dolf Weijers, Vera Gorelova och Mark Roosjen för vänligheten att förse oss med YFP. S.D. erkänner ekonomiskt stöd från det nederländska forskningsrådet (bidragsnummer: OCENW. KLEIN.465).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octanol Sigma-Aldrich No. 297887
1.5 mL tubes Fisher scientific 10451043 Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATP Sigma-Aldrich No. A2383
Biopsy punch Darwin microfluidics PT-T983-05 0.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-base Sigma-Aldrich No. 71405
Dextran Sigma-Aldrich No. 31388 Mr~6,000
Direct-write optical lithography machine Durham Magneto Optics Ltd MicroWriter ML3 Baby setup and software
DOPC lipid Avanti SKU:850375C
F68 Sigma-Aldrich No. 24040032
Glass cover slip Corning #1, 24 x 40 mm
Glycerol Sigma-Aldrich No. G2025
Hydrochloric acid Thermo Scientific Acros No. 124630010
Liss Rhod PE lipid Avanti SKU:810150C
Parafilm Sigma-Aldrich No. P7793
Photoresist Micro resist technology GmbH EpoCore 10
Photoresist developer micro resist technology GmbH mr-Dev 600
Plasma cleaner Harrick plasma PDC-32G
Polydimethylsiloxane Dow Sylgard 184 PDMS and curing agent
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich No. P7890
Poly-L-lysine–FITC Labeled Sigma-Aldrich No. P3543
Polyvinyl alcohol Sigma-Aldrich no. P8136 molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controller Elveflow  OBK1 Mk3+ Flow controller
Scotch tape Magic Tape Invisible Matt Tape
Silicon wafer Silicon Materials 0620R16002
Spin coater  Laurell Technologies Corporation Model WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS Couplers Darwin microfluidics PN-BEN-23G
Tris-base Sigma-Aldrich No. 252859
Tygon tubing Darwin microfluidics 1/16" OD x 0.02" ID
UV laser  365 nm wavelength

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frezard, F. Liposomes: From biophysics to the design of peptide vaccines. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 32 (2), 181-189 (1999).
  2. Monteiro, N., Martins, A., Reis, R. L., Neves, N. M. Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140459 (2014).
  3. Mishra, H., Chauhan, V., Kumar, K., Teotia, D. A comprehensive review on liposomes: A novel drug delivery system. Journal of Drug Delivery and Therapeutics. 8 (6), 400-404 (2018).
  4. Liu, W., et al. Research progress on liposomes: Application in food, digestion behavior and absorption mechanism. Trends in Food Science & Technology. 104, 177-189 (2020).
  5. Kamiya, K., Takeuchi, S. Giant liposome formation toward the synthesis of well-defined artificial cells. Journal of Materials Chemistry B. 5 (30), 5911-5923 (2017).
  6. van Swaay, D., DeMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  7. Lombardo, D., Kiselev, M. A. Methods of liposomes preparation: Formation and control factors of versatile nanocarriers for biomedical and nanomedicine application. Pharmaceutics. 14 (3), 543 (2022).
  8. Zhang, H. Thin-film hydration followed by extrusion method for liposome preparation. Liposomes: Methods and Protocols. D’Souza, G. G. M. , Humana. New York, NY. 17-22 (2017).
  9. Filipczak, N., Pan, J., Yalamarty, S. S. K., Torchilin, V. P. Recent advancements in liposome technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 156, 4-22 (2020).
  10. Has, C., Sunthar, P. A comprehensive review on recent preparation techniques of liposomes. Journal of Liposome Research. 30 (4), 336-365 (2020).
  11. Large, D. E., Abdelmessih, R. G., Fink, E. A., Auguste, D. T. Liposome composition in drug delivery design, synthesis, characterization, and clinical application. Advanced Drug Delivery Reviews. 176, 113851 (2021).
  12. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  13. Morita, M., et al. Droplet-shooting and size-filtration (DSSF) method for synthesis of cell-sized liposomes with controlled lipid compositions. ChemBioChem. 16 (14), 2029-2035 (2015).
  14. Convery, N., Gadegaard, N. 30 years of microfluidics. Micro and Nano Engineering. 2, 76-91 (2019).
  15. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  16. Chu, L. Y., Utada, A. S., Shah, R. K., Kim, J. W., Weitz, D. A. Controllable monodisperse multiple emulsions. Angewandte Chemie. 119 (47), 9128-9132 (2007).
  17. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  18. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  19. Carugo, D., Bottaro, E., Owen, J., Stride, E., Nastruzzi, C. Liposome production by microfluidics: Potential and limiting factors. Scientific Reports. 6, 25876 (2016).
  20. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  21. Last, M. G., Deshpande, S., Dekker, C. pH-controlled coacervate-membrane interactions within liposomes. ACS Nano. 14 (4), 4487-4498 (2020).
  22. Jia, H., Schwille, P. Bottom-up synthetic biology: reconstitution in space and time. Current Opinion in Biotechnology. 60, 179-187 (2019).
  23. Ganar, K. A., Leijten, L., Deshpande, S. Actinosomes: Condensate-Templated Containers for Engineering Synthetic Cells. ACE Synthetic Biology. 11 (8), 2869-2879 (2022).
  24. Gaut, N. T., Adamala, K. P. Reconstituting Natural Cell Elements in Synthetic Cells. Advanced Biology. 5 (3), 2000188 (2021).
  25. Ganar, K. A., Honaker, L. W., Deshpande, S. Shaping synthetic cells through cytoskeleton-condensate-membrane interactions. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 54, 101459 (2021).
  26. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  27. Deshpande, S., et al. Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes. Nature Communications. 10, 1800 (2019).
  28. Love, C., et al. Reversible pH-responsive coacervate formation in lipid vesicles activates dormant enzymatic reactions. Angewandte Chemie. 132 (15), 6006-6013 (2020).
  29. Lu, T., et al. Endocytosis of coacervates into liposomes. Journal of the American Chemical Society. 144 (30), 13451-13455 (2022).
  30. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  31. Blanken, D., Foschepoth, D., Serrão, A. C., Danelon, C. Genetically controlled membrane synthesis in liposomes. Nature Communications. 11, 4317 (2020).
  32. Bouzetos, E., Ganar, K. A., Mastrobattista, E., Deshpande, S., vander Oost, J. (R) evolution-on-a-chip. Trends in Biotechnology. 40 (1), 60-76 (2022).
  33. Kamalinia, G., Grindel, B. J., Takahashi, T. T., Millward, S. W., Roberts, R. W. Directing evolution of novel ligands by mRNA display. Chemical Society Reviews. 50 (16), 9055-9103 (2021).
  34. Godino, E., et al. De novo synthesized Min proteins drive oscillatory liposome deformation and regulate FtsA-FtsZ cytoskeletal patterns. Nature Communications. 10, 4969 (2019).
  35. Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─From liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
  36. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
  37. Schaich, M., et al. An integrated microfluidic platform for quantifying drug permeation across biomimetic vesicle membranes. Molecular Pharmaceutics. 16 (6), 2494-2501 (2019).
  38. Schaich, M., Sobota, D., Sleath, H., Cama, J., Keyser, U. F. Characterization of lipid composition and diffusivity in OLA generated vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1862 (9), 183359 (2020).
  39. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., Van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  40. Jusková, P., et al. 34;Basicles": Microbial growth and production monitoring in giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (38), 34698-34706 (2019).
  41. Fletcher, M., et al. DNA-based optical quantification of ion transport across giant vesicles. ACS Nano. 16 (10), 17128-17138 (2022).
  42. Vaezi, Z., et al. Investigation of the programmed cell death by encapsulated cytoskeleton drug liposomes using a microfluidic platform. Microfluidics and Nanofluidics. 24 (7), 48 (2020).
  43. Al Nahas, K., et al. A microfluidic platform for the characterisation of membrane active antimicrobials. Lab on a Chip. 19 (5), 837-844 (2019).
  44. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  45. Yandrapalli, N., Petit, J., Bäumchen, O., Robinson, T. Surfactant-free production of biomimetic giant unilamellar vesicles using PDMS-based microfluidics. Communications Chemistry. 4, 100 (2021).
  46. Cama, J., et al. An ultrasensitive microfluidic approach reveals correlations between the physico-chemical and biological activity of experimental peptide antibiotics. Scientific Reports. 12, 4005 (2022).
  47. Guerzoni, L. P., et al. High macromolecular crowding in liposomes from microfluidics. Advanced Science. 9 (27), 2201169 (2022).
  48. Gonzales, D. T., Yandrapalli, N., Robinson, T., Zechner, C., Tang, T. D. Cell-free gene expression dynamics in synthetic cell populations. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 205-215 (2022).
  49. Ushiyama, R., Koiwai, K., Suzuki, H. Plug-and-play microfluidic production of monodisperse giant unilamellar vesicles using droplet transfer across water-oil interface. Sensors and Actuators B: Chemical. 355, 131281 (2022).
  50. Banlaki, I., Lehr, F. -X., Niederholtmeyer, H. Microfluidic production of porous polymer cell-mimics capable of gene expression. Cell-Free Gene Expression. Karim, A. S., Jewett, M. C. , Humana. New York, NY. 237-255 (2022).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 193
On-chip oktanolassisterad liposommontering för bioteknik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, C., Ganar, K. A., Deshpande,… More

Chen, C., Ganar, K. A., Deshpande, S. On-Chip Octanol-Assisted Liposome Assembly for Bioengineering. J. Vis. Exp. (193), e65032, doi:10.3791/65032 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter