Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att extrahera endogent tubulin från däggdjursceller, som kan sakna eller innehålla specifika mikrotubulimodifierande enzymer, för att erhålla mikrotubuli anrikade för en specifik modifiering. Vi beskriver sedan hur de extraherade mikrotubuli kan dekoreras med renade mikrotubulibindande proteiner för att förbereda galler för kryoelektronmikroskopi.
Abstract
Mikrotubuli är en viktig del av cytoskelettet och är involverade i intracellulär organisation, celldelning och migration. Beroende på posttranslationella modifieringar kan mikrotubuli bilda komplex med olika interagerande proteiner. Dessa mikrotubuli-proteinkomplex är ofta inblandade i mänskliga sjukdomar. Att förstå strukturen hos sådana komplex är användbart för att belysa deras verkningsmekanismer och kan studeras med kryoelektronmikroskopi (kryo-EM). För att erhålla sådana komplex för strukturella studier är det viktigt att extrahera mikrotubuli som innehåller eller saknar specifika posttranslationella modifieringar. Här beskriver vi ett förenklat protokoll för att extrahera endogent tubulin från genetiskt modifierade däggdjursceller, vilket involverar mikrotubulipolymerisation, följt av sedimentering med ultracentrifugering. Det extraherade tubulinet kan sedan användas för att förbereda kryoelektronmikroskopgaller med mikrotubuli som är bundna till ett renat mikrotubulibindande protein av intresse. Som ett exempel demonstrerar vi extraktion av helt tyrosinerade mikrotubuli från cellinjer konstruerade för att sakna de tre kända tubulin-detyrosinerande enzymerna. Dessa mikrotubuli används sedan för att göra ett proteinkomplex med enzymatiskt inaktivt mikrotubuliassocierat tubulindetyrosinas på kryo-EM-galler.
Introduction
Mikrotubuli är en viktig del av cytoskeletten; De är involverade i olika funktioner som cellmigration och delning men bidrar också till intracellulär organisation. För att anpassa sig till olika funktionella öden interagerar mikrotubuli med en mängd olika mikrotubuliassocierade proteiner (MAP), enzymer och andra proteiner, som vi kollektivt kommer att referera till som "mikrotubuli-interagerande proteiner". Mikrotubulibindningen av dessa proteiner kan styras av olika tubulinmodifieringar, vanligen kallad "tubulinkoden"1. Exempel på denna preferens är det mitotiska centromerassocierade kinesin (MCAK)2 och dynein-dynaktinet CAP-Gly-domänen av p1503, som företrädesvis associeras med tyrosinerat tubulin, medan kinesinmotorernas centromerassocierade protein E (CENP-E)4 och kinesin-25 föredrar tubulin som saknar C-terminaltyrosin.
Medan en mängd olika metoder kan användas för att studera mikrotubuli-proteininteraktioner, används kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) ofta för att studera dessa interaktioner vid nästan atomär upplösning 6,7. Under de senaste åren har kryo-EM-strukturer avslöjat hur stora motorproteiner som dynein 8,9,10 och kinesin 11, +TIP-proteiner såsom EB312,13 och MCAK14, andra proteiner såsom Tau 15,16, och till och med små molekyler såsom paklitaxel, pelorusid och zampanolid 17 interagera med mikrotubuli. För att studera mikrotubuli-proteininteraktioner extraheras mikrotubuli typiskt från svinhjärnan18. Efter detta utförs de flesta in vitro-studier, inklusive kryo-EM-mikrotubulistrukturer, med användning av svinhjärntubulin. Resultaten av dessa studier döljer därför betydelsen av den heterogena karaktären av tubulinmodifieringar19 mellan vävnader och celltyper. Detta skapar ett särskilt problem när man undersöker ett protein som kräver eller föredrar en specifik modifiering för att binda till mikrotubuli. Detta kan illustreras med tyrosinerat tubulin, substratet för mikrotubulidetyrosinas MATCAP.
Detyrosination är en tubulinmodifiering där C-terminala aminosyratyrosin av α-tubulin saknas, vilket är associerat med mitotisk, hjärt- och neuronfunktion20. Medan helt tyrosinerade mikrotubuli är det perfekta substratet för MATCAP, saknas detta i stort sett i kommersiellt tillgängliga mikrotubuli från svinhjärnan på grund av funktionen av vasohibinerna 21,22 och MATCAP 23 detyrosinaser i denna vävnad 22,23,24,25,26. Även om kommersiellt tillgängligt HeLa-tubulin mestadels innehåller tyrosinerade mikrotubuli, kan detyrosination inträffa, och denna tubulinkälla är därför mindre lämplig för att skapa ett enhetligt prov för kryo-EM-analys.
För att stimulera bindningen av MATCAP till mikrotubuli och skapa ett homogent prov för strukturell analys sökte vi en källa till mikrotubuli som är helt tyrosinerad. För detta ändamål skapades en MATCAP och vasohibin-bristfällig cellinje, som användes för att extrahera helt tyrosinerade mikrotubuli. Extraktionsproceduren baserades på väletablerade protokoll som använder upprepade cykler av polymerisation och depolymerisation av mikrotubuli för att extrahera tubulin från hjärnvävnad eller celler 18,27,28,29,30, med endast ett enda polymerisationssteg och centrifugering över en glycerolkudde. Med MATCAP som exempel demonstrerar vi sedan hur dessa mikrotubuli kan användas för kryo-EM-studier. För att förbereda kryo-EM-nät beskrivs ett tvåstegs applikationsprotokoll vid låg saltkoncentration. Metoderna i detta dokument beskriver extraktionen av anpassningsbara mikrotubuli i tillräckliga mängder och renhet för att utföra kryo-EM-analys och ger ett detaljerat protokoll om hur man använder dessa mikrotubuli för att skapa protein-mikrotubulikomplex på kryo-EM-nät.
Protocol
OBS: Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material och utrustning som används i detta protokoll.
1. Cellodling
OBS: All cellodling ska göras i en steril laminär flödeshuv.
- För att följa detta protokoll, tina först en injektionsflaska med frysta celler i ett 37 °C vattenbad. Här använder vi en genetiskt modifierad HCT116-cellinje som saknar de tre kända detyrosinerande enzymerna, VASH1, VASH2 och MATCAP, för att skapa tyrosinerat tubulin.
- Bered en Ø 10 cm platta innehållande 10 ml av lämpligt cellodlingsmedium.
OBS: I detta protokoll användes DMEM (Dulbeccos modifierade Eagle-medium) kompletterat med 10% v / v FCS (fetalt kalvserum) och penicillin / streptomycinantibiotikum (odlingsmedium) för den genetiskt modifierade HCT116-cellinjen. - Räkna cellerna och frö ~ 2,5 × 106 livskraftiga celler (~ 20% sammanflöde) i den förberedda 10 cm plattan. Skaka plattan försiktigt för att jämnt fördela cellerna. Inkubera skålen i en 37 °C cellodlingsinkubator gasad med 5% (v/v) CO2 tills cellerna når 80%-90% sammanflöde.
OBS: Vanligtvis tar detta 3 dagar för HCT116-celler, men tiden kan bero på den specifika sådddensiteten och cellinjen som används. - Kassera cellodlingsmediet med en pipett eller vakuumsugare och tvätta skålen 2 x 5 ml PBS.
OBS: Var försiktig så att du inte doserar PBS för kraftigt på cellmonolagret eftersom detta kan lossna cellerna från plattan. - Tillsätt 1-2 ml trypsin och inkubera cellerna i inkubatorn i 2-5 minuter för att lossa cellerna.
- Tillsätt 2 ml av odlingsmediet till plattan för att släcka trypsinet.
- Dela cellsuspensionen i tre till fem lika delar och sätt tillbaka dem för att expandera cellerna i odlingsmedium tills 6-12 sammanflytande 15 cm plattor erhålls.
2. Skörd
- Tvätta cellerna försiktigt med 10 ml PBS (1x) för att avlägsna eventuellt cellodlingsmedium.
- Lossa cellerna från plattorna genom att inkubera cellerna i 5 minuter vid rumstemperatur med 3 ml iskall PBS kompletterat med 5 mM EDTA (steril/filtrerad) och därefter använda en cellskrapa.
- Samla cellerna i ett 50 ml rör på is och snurra ner (10 min, 250 × g).
- Notera volymen av de skördade cellerna med den volymetriska skalan på 50 ml röret.
OBS: Den förväntade volymen kan vara var som helst mellan ~ 0,5 ml och 4 ml. PAUSE STEP: Frys cellpelleten i LN2 och förvara vid −20 °C tills den används. Observera att cellpelleten endast kan lagras i några veckor eller månader. Om pelleten hålls längre kan det resultera i ett minskat utbyte eller inga mikrotubuli alls.
- Notera volymen av de skördade cellerna med den volymetriska skalan på 50 ml röret.
3. Extraktion av mikrotubuli
OBS: Håll allt för steg 3.1-3.5 på is; allt från steg 3.6 och framåt ska hållas varmt (30-37 °C).
- Bered 10 ml iskall lysbuffert innehållande 100 mM RÖR/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH, 1 mMMgCl2, 1 mM PMSF och en proteashämmaretablett (mini).
- Återsuspendera den skördade cellpelleten i 1: 1 v / v lysbuffert (om du är osäker på den exakta volymen, ta mindre lysbuffert snarare än mer).
- Lyse cellerna genom ultraljudsbehandling: 15 s på, 45 s av, amp 30, fyra cykler (bestämma villkoren experimentellt, och ändra enligt sonicator).
- Efter ultraljudsbehandling, samla ett prov för SDS-PAGE analys: 2 μL lysat + 18 μL vatten + 5 μL 5x SDS-provbuffert.
OBS: Kontrollera under ett vanligt ljusmikroskop om cellerna verkligen har lyserats helt.
- Efter ultraljudsbehandling, samla ett prov för SDS-PAGE analys: 2 μL lysat + 18 μL vatten + 5 μL 5x SDS-provbuffert.
- Pipettera de lyserade cellerna till ett centrifugalrör. Snurra i 1 timme vid 100 000 × g vid 4 °C i en ultracentrifugrotor för att rensa lysatet.
OBS: Se till att alla fickor i rotorn är torra och rena för att säkerställa korrekt balansering av centrifugen. - Använd en spruta för att ta ut det rensade lysatet. Var noga med att inte störa pelletsen såväl som det flytande lagret ovanpå.
- Samla upp ett prov av det rensade lysatet: 2 μl lysat + 18 μl vatten + 5 μl 5x SDS-provbuffert.
- Skölj försiktigt pelleten och skopa upp lite av pelleten genom att virvla en P10-pipettspets genom pelleten; tillsätt 200 μL vatten och 50 μL SDS-buffert.
- Komplettera supernatanten från föregående steg med 1 mM GTP och 20 μM paklitaxel för att polymerisera mikrotubuli; För en volym på 1 ml tillsätts 10 μl 2 mM paklitaxel och 10 μl 100 mM GTP.
VARNING: Paklitaxel kan orsaka hudirritation, allvarlig ögonskada, irritation i luftvägarna, genetiska defekter, skador på ett ofött barn och skador på organ. Långvarig eller upprepad exponering orsakar skador på organ. Andas, spraya eller damma inte ämnet på något sätt. Använd nitrilhandskar av gummi för att förhindra hudkontakt. - Inkubera GTP/paklitaxel-kompletterad supernatant i 30 minuter vid 37 °C så att mikrotubuli kan samlas.
- Låt rotorn och ultracentrifugen värmas upp till 30 °C under detta inkubationssteg.
- Förbered kuddbufferten: Tillsätt 0,6 ml glycerol till 0,4 ml lysbuffert och komplettera blandningen med 20 μM paklitaxel. Förvärm bufferten till 37 °C.
- Tillsätt 800 μL kuddbuffert till ett ultracentrifugrör. Pipettera det GTP/paklitaxel-kompletterade lysatet försiktigt ovanpå kuddbufferten.
OBS: Förhindra blandning av kuddebufferten och lysatet genom pipettering mycket försiktigt. - Snurra i 30 minuter vid 100 000 × g vid 30 °C i en ultracentrifugrotor. Markera centrifugeringsrörets utåtvända kant för att enkelt känna igen var mikrotubulipelletsen ska bildas.
- Ta försiktigt bort kuddebufferten med en pipett, var försiktig så att du inte stör mikrotubulipelletsen.
- Samla ett prov av bufferten: 2 μL + 18 μL vatten + 5 μL 5x SDS-provbuffert.
- Tvätta pelleten försiktigt 3x med varm lysbuffert för att ta bort glycerolen. Fördela försiktigt den varma bufferten bredvid pelleten (spola inte vätskan direkt över pelleten), rotera röret några gånger för att ta bort så mycket glycerol som möjligt från pelleten och rörets väggar och aspirera sedan och upprepa.
OBS: Om glycerolen inte tvättas ordentligt smälter gallret mycket snabbt under elektronbelysningen. Detta kan bevisas av hög partikelrörelse, vilket skapar suddiga bilder. - Bered resuspensionsbuffert med följande ingredienser: 100 mM RÖR/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH och 1 mM MgCl2 och värm bufferten till 37 °C.
- Återsuspendera den tvättade pelleten försiktigt med en skuren spets i ~ 50 μL förvärmd resuspensionsbuffert och håll röret vid 37 °C.
- Samla upp ett prov av den återsuspenderade pelletfraktionen: 2 μL + 18 μL vatten + 5 μL 5x SDS-provbuffert.
TIPS: Den skurna spetsen förhindrar att mikrotubuli bryts. Förbered ett metallvärmeblock till 37 °C och förvara detta i en polystyrenlåda så att provrören enkelt kan transporteras utan att kyla ner dem till rumstemperatur.
- Samla upp ett prov av den återsuspenderade pelletfraktionen: 2 μL + 18 μL vatten + 5 μL 5x SDS-provbuffert.
4. Förberedelse av kryo-EM-nät
- Förbered dykfrysanordningen genom att installera blottpapperet. Värm dykfrysen upp till 30 °C och ställ in befuktningen på 100 %. Låt ~ 30 min balansera temperaturen och luftfuktigheten.
- Förbered inställningarna för frysen till två applikationer och kör igenom hela programmet en gång för att vara säker på att inställningarna är korrekt inställda. Se till att den första applikationen har en kraft på 10, 2 s blottningstid och 0 s väntetid och att den andra applikationen har en kraft på 10, 6,5 s blottningstid och 10 s väntetid.
- Glödurladdning av kryo-EM-gallren vid 30 mA i 60 sekunder.
- Kyl ner polystyrenbehållaren med LN2 och förbered flytande etan i en metallkopp genom att kondensera etangas till en kall metallkopp.
- Bered en utspädningsbuffert med följande komponenter: 100 mM RÖR/KOH (pH 6,9), 2 mM EGTA/KOH och 1 mMMgCl2 och värm den till 37 °C.
- Späd det mikrotubuli-interagerande proteinet 1: 1 v / v med utspädningsbuffert strax innan det appliceras på gallret för att säkerställa att saltkoncentrationen sänks (vi använde en slutlig saltkoncentration på 50 mM NaCl). Håll blandningen vid 37 °C.
- Ta ett glödurladdat galler med pincett och klicka in dem i frysen.
- Placera polystyrenbehållaren med flytande etan i dykfrysen och kör igenom det förberedda programmet: applicera först 3,5 μL mikrotubulilösning på gallret, låt doppfrysen blotta gallret, applicera sedan omedelbart 3,5 μL nyutspätt protein och låt slutligen kolven torka och frysa gallret i flytande etan.
- Överför näten till en nätförvaringslåda och lagra dem i en LN2-dewar tills avbildning.
Representative Results
Vi undersökte tubulindetyrosinas MATCAP bundet till tyrosinerade mikrotubuli av kryo-EM. För att göra det extraherade vi helt tyrosinerade mikrotubuli från en genetiskt modifierad HCT116-cellinje som saknar alla tre kända detyrosinerande enzymer, VASH1/2 och MATCAP. Vi använde 6-12 konfluenta 15 cm rätter för att extrahera mikrotubuli från cirka 0,5-4 ml cellpellet (figur 1). Efter det andra centrifugeringssteget (steg 3.11) ger detta en synlig men liten och transparent pellet (figur 1I). Mikrotubuliutbytet är typiskt ~ 75 μg. Om pelleten inte är synlig kan detta indikera ett problem i ett av de föregående stegen, såsom en felaktig mikrotubulipolymerisationstemperatur, problem med kvaliteten på den använda GTP eller paklitaxel eller tillsats av för mycket lysbuffert, vilket resulterar i en tubulinkoncentration som är för låg för polymerisation. För att bedöma kvaliteten och koncentrationen av de extraherade mikrotubuli analyserade vi prover på en Coomassie-färgad SDS-gel (figur 2A). Dessa analyser indikerade att de extraherade mikrotubuli var relativt rena. Den interpolerade mikrotubulikoncentrationen härledd från BSA-kvantifiering var ~1,4 mg/ml. Detta överensstämmer väl med antalet uppmätt med en spektrofotometer (figur 2B, C).
De nyligen extraherade mikrotubuli kan direkt användas för att göra prover för kryo-EM. Mikrotubuli ska se intakt och riklig ut på mikrograferna. För ytterligare kryo-EM-analys är det viktigt att ha en låg mikrotubulidensitet per mikrografi för att undvika att mikrotubuli passerar över varandra (figur 3A). Brutna mikrotubuli eller de som inte är synliga kan indikera att mikrotubuli depolymeriserats (t.ex. på grund av låg temperatur eller GTP-hydrolys) eller att parametrarna för blottning och djupfrysning inte var korrekt inställda. Bakgrunden runt mikrotubuli är tät, förmodligen med opolymeriserat tubulin.
Molekylvikten för MATCAP är 53 kDa, och den har en globulär katalytisk domän strax under storleken på en tubulinmonomer. Dekorationen av MATCAP på mikrotubuli kunde därför detekteras visuellt. Mikrotubuli som inte binder MATCAP visade "släta" kanter, medan mikrotubuli som band MATCAP hade "grova" kanter, kännetecknade av elektrontäta prickar på mikrotubuliytan (figur 3B). MATCAP-bundna och MATCAP-obundna mikrotubuli kunde också urskiljas i de beräknade 2D-klasserna, även om detta på grund av form och storlek kan skilja sig åt för andra mikrotubuli-interagerande proteiner (figur 3C). För att bekräfta att densiteten verkligen tillhör proteinet av intresse kan man dra nytta av experimentellt bestämda eller förutsagda strukturer. Vi föreslår också att du gör ett kontrollnät som innehåller mikrotubuli endast för jämförelse. Detta indikerar om mikrotubuli polymeriserades och extraherades intakt vid en tillräckligt hög koncentration och att doppfrysningsprocessen utfördes korrekt. Vi märkte att mikrotubuliöverflödet minskade i galler med en andra MATCAP-applikation.
Figur 1: Visuell vägledning av de experimentella stegen . a) Cellpellet före lys. (B) sonicated celler i ett ultracentrifugrör före centrifugering; (C) ultraljudsbaserade celler i ett ultracentrifugrör efter centrifugering; d) spruta med den klarerade supernatanten, E) Kvarvarande pellet efter avlägsnande av supernatant, inklusive ett "vitt flytande skikt". (F) P10-spets med en cellskräppellet för SDS Coomassie-gelen; g) GTP/paklitaxelkompletterad supernatant före inkubation. H) GTP/paklitaxelinkuberad supernatant ovanpå en glycerolkudde i ett ultracentrifugrör. i) Rengör mikrotubulipelleten efter det andra centrifugeringssteget. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mikrotubulis renhet och koncentrationsbestämning . (A) Coomassie-färgad SDS-sidgel som visar de prover som tagits under extraktionsprotokollet och en BSA-koncentrationsjämförelse. S1 och P1 motsvarar supernatanten respektive pelleten efter det första centrifugeringssteget. S2 och P2 motsvarar på samma sätt det andra centrifugeringssteget. (B) En icke-linjär regressionslinje för de relativa BSA-storheterna härledda från A. Interpoleringen av mikrotubulibandet runt 50 kDa i P2-banan (mikrotubuli) indikerar en slutlig koncentration på 1,42 mg/ml. (C) Den spektrofotometriska analysen av de återsuspenderade mikrotubuli (P2) uppmätt av två personer och korrigerad för den kombinerade extinktionskoefficienten för TUBA1A och TUBB3 (0,971) indikerar en genomsnittlig och standardavvikelsekoncentration på 1,46 mg/ml ± 0,14 mg/ml. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Exempel på mikrografer. (A) Exempel på mikrografer som visar mikrotubuli bundna till MATCAP. Mikrotubuli som indikeras av en grön låda är intakta, dekorerade och kan användas för kryo-EM-analysen. Mikrotubuli som indikeras av den orange lådan är en intakt och dekorerad mikrotubuli men är placerad nära mikrotubuli kvar av den; därför är det mindre lämpligt att inkludera i kryo-EM-analysen. Mikrotubuli i den röda lådan korsar över och bryts. Dessa bör uteslutas från kryo-EM-analysen. (B) En inzoomad vy av den vänstra panelens gröna inringade mikrotubuli. De röda pilspetsarna indikerar de svarta prickarna som bara syntes på mikrotubuli i mikrograferna som hade en tillämpning av MATCAP och därmed sannolikt motsvarar MATCAP bunden till mikrotubuli. (C) Exempel 2D-klasser av mikrotubulipartiklar plockade från A som visade hög och låg dekoration och en 2D-klass från ett annat dataset för vilket vi inte observerade någon dekoration av MATCAP (panelen längst till höger). Skalstänger = (A) 50 nm, (B) 25 nm, (C) 10 nm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Immunoblotanalys av mikrotubuli härrörande från MATCAP-brist och VASH1/2-brist trippelknockout (TKO) HCT116-celler, kommersiell svinhjärna och HeLa-tubulin. Förkortningar: TKO = trippel knockout; mAb = monoklonal antikropp; pAb = polyklonal antikropp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Denna metod beskriver hur man snabbt extraherar endogent tubulin från cellinjer och därefter dekorerar dessa mikrotubuli på kryo-EM-galler. Mikrotubuli är temperaturkänsliga. De depolymeriseras i en kall miljö och polymeriseras i en varm miljö31. Det är därför viktigt att utföra ultraljudsbehandling och clearance spinn (steg 1.1-1.5) vid 4 ° C för att solubilisera tubulin. Om några faktorer stabiliserade mikrotubuli så bra att de inte skulle depolymerisera i detta steg, skulle dessa mikrotubuli och de stabiliserande faktorerna kasseras i pelleten efter det första spelningsspinnet. Efter (åter)polymerisering av mikrotubuli är det viktigt att hålla lösningen som innehåller de polymeriserade mikrotubuli varm hela tiden. Vi extraherade mikrotubuli från HCT116-celler, som är bristfälliga i VASH1-, VASH2- och MATCAP-proteinerna. Andra cellinjer, såväl som vävnader, kan användas för att extrahera mikrotubuli29, även om föroreningarna, tubulinisotyperna och utbytet kan skilja sig mycket från vad som beskrivs här. Överuttryckande plasmider som innehåller modifierande enzymer kan också användas för att införa specifika tubulinmodifieringar.
Andra protokoll 18,27,28,29,30 använder flera cykler av polymerisation och depolymerisation av mikrotubuli för att erhålla mikrotubuli utan andra interagerande proteiner. Här har vi förenklat dessa protokoll och polymeriserar bara mikrotubuli en gång. Det är möjligt att på grund av denna enda polymerisation kan dessa mikrotubuli samsedimentera med andra mikrotubuli-interagerande proteiner. Vi har dock funnit att detta protokoll ger tillräckligt rena mikrotubuli för kryo-EM-ändamål. Om ett renare prov behövs för specifika analyser kan ytterligare cykler av polymerisation och depolymerisation ge ett renare prov, även om detta kan vara på bekostnad av mikrotubuliutbytet. I detta protokoll använde vi paklitaxel för att polymerisera mikrotubuli. Paklitaxel kan emellertid förvrida mikrotubuligitteret mot en viss vridning och höjning, vilket kan störa mikrotubuliaffiniteten hos proteinet av intresse. Andra mikrotubulistabiliserande reagens kan användas om paklitaxel är olämpligt. Exempel på dessa reagens är icke-taxanmolekyler såsom pelorusid eller icke-hydrolyserbara GTP-varianter såsom GMPCPP17,32.
För att strukturellt undersöka proteiner som binder till mikrotubuli på kryo-EM-galler måste man binda en tillräcklig mängd av proteinet av intresse för mikrotubuli. Ett vanligt förekommande problem är att proteinkomplex som är stabila i lösning faller sönder på gallret. För att bilda proteinkomplexet på gallret var det avgörande att först skikta mikrotubuli och sedan applicera det mikrotubulibindande proteinet med låg saltkoncentration på det mikrotubulibelagda gallret och därmed montera proteinkomplexet direkt på gallret. Andra har på liknande sätt rapporterat ett 33,34-protokoll med låg salthalt och ett tvåstegsprotokoll 34,35,36 för framgångsrik mikrotubulidekoration. Det är troligt att en lägre saltkoncentration förspänder proteinkomplexet mot en mer stabil interaktion på grund av de minskade elektrostatiska laddningarna. På grund av den låga saltkoncentrationen riskerar emellertid proteinet av intresse för utfällning. Därför rekommenderas det starkt att hålla proteinet vid eller runt fysiologiskt relevanta saltkoncentrationer tills strax innan gallret förglasas. Detta tvåstegsapplikationsprotokoll förhindrar sannolikt att proteinkomplexet faller sönder under blottnings- eller doppfrysningsstegen. I detta protokoll använde vi Vitrobot. Snabbare vitrifieringsmetoder (VitroJet) eller användning av fläckfria galler (Puffalot) eller enheter som har båda egenskaperna (kameleont) kan dock potentiellt övervinna tvåstegsapplikationen, men dessa är för närvarande inte allmänt tillgängliga för testning.
Den slutliga upplösningen av den rekonstruerade kryo-EM-densiteten kan påverkas av ett antal faktorer, inklusive rörelsen av det mikrotubulibindande proteinet i förhållande till mikrotubuli och den dekorationsnivå som kan uppnås. Högre mikrotubulär dekoration är sannolikt fördelaktig för den slutliga upplösningen som erhållits i 3D-densitetsrekonstruktionen. Detta kan begränsas av några faktorer, såsom den högsta proteinkoncentrationen som erhålls under reningen av det mikrotubulibindande proteinet, den lägsta saltkoncentrationen som det mikrotubuli-interagerande proteinet kan motstå utan att aggregera och bindningsläget för det mikrotubuli-interagerande proteinet (t.ex. proteinet kan spänna över mer än en tubulindimer, vilket hindrar ett bindningsförhållande 1: 1). Även om upplösningen av kryo-EM-rekonstruktionen kan äventyras av glest dekorerade mikrotubuli, kan beräkningsanalys kringgå många problem, vilket exemplifieras av en nyligen rapporterad mikrotubuli-proteinkomplex struktur som var extremt glest dekorerad8.
Protokollet vi beskriver här presenterar en snabb, billig metod för att erhålla mikrotubuli lämpliga för kryo-EM-ändamål. I motsats till kommersiellt tillgängligt hjärntubuli hos svin är mikrotubuli härrörande från MATCAP-bristfälliga och vasohibinbristfälliga HCT116-celler helt tyrosinerade (figur 4). Kommersiellt HeLa-tubulin, ett dyrt reagens, är i princip relativt enhetligt tyrosinerat och innehåller lite andra modifieringar4 såsom glutamylering, men satser kan variera och modifiering kan endast uppnås in vitro. En fördel med att extrahera mikrotubuli från skräddarsydda cellinjer är flexibiliteten man har att överuttrycka eller ta bort tubulinmodifierande enzymer, såsom tubulindetyrosinaser, för att skapa en mer homogen pool av mikrotubuli. Detta kan gynna dekorationen och enhetligheten hos kryo-EM-provet och kommer i slutändan att gynna enkelheten och kvaliteten på kryo-EM-densitetskartorna och molekylstrukturerna härledda från detta prov.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar alla medlemmar i Sixma-, Brummelkamp- och Perrakis-grupperna för deras givande vetenskapliga diskussioner och för att ge en trevlig arbetsmiljö, och särskilt tackar vi Jan Sakoltchik ("person 2") för att hjälpa till att bestämma proteinkoncentrationen som visas i figur 3C. Vi vill också tacka NKI cryo-EM-anläggningen och Netherlands Centre for Electron Nanoscopy (NeCEN) vid Leiden University för deras stöd. Detta arbete stöddes av NWO Vici-bidrag 016.Vici.170.033 som tilldelades T.R.B.. AP och T.R.B. är Oncode-utredare och får finansiering från NWO ENW (OCENW. M20.324). L.L. fick finansiering från den österrikiska vetenskapsfonden (FWF JB4448-B). Denna forskning stöddes av ett institutionellt bidrag från det nederländska cancerförbundet och det nederländska ministeriet för hälsa, välfärd och idrott.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Cell culture |
| 10 cm plate | Falcon | 353003 | Cell culture |
| 15 cm plate | Thermo FisherScientific | 168381 | Cell culture |
| 50 mL tubes | Sarstedt | 62.547255 | Cell culture |
| 300 mesh quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3 | Quantifoil Micro Tools | N1-C14nCu30-01 | Cryo-EM grid preparation |
| Cell scrapers | Falcon | 353085 | Cell culture |
| DMEM | Gibco | 41966-029 | Cell culture |
| EDTA | Merck | 108418 | Cell culture |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3899 | Microtubule extraction |
| Ethane gas | Cryo-EM grid preparation | ||
| FCS | Serana | s-FBS-EU-015 | Cell culture |
| Glycerol | VWR | 24.397.296 | Microtubule extraction |
| GTP | Fisher Scientific | G8877-1G | Microtubule extraction |
| HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO cells | self made | Wild type HCT116 cells RRID: CVCL_0291 | Cell culture |
| KOH | Merck | 1.05033 | Microtubule extraction |
| MgCl2 | Merck | 105833 | Microtubule extraction |
| Microtubule binding protein | self made | Cryo-EM grid preparation | |
| Needle | BD microlance | 300600 | Microtubule extraction |
| Paclitaxel | Santa Cruz Biotechnology | sc-212517 | caution toxic, microtubule extraction |
| PBS | Fisher Scientific | BP399 | Cell culture |
| Penicillin and streptomycin | Sigma Aldrich | P0781-100mL | Cell culture |
| PIPES | Merck | P8203 | Microtubule extraction |
| PMSF (in EtOH) | Roche | 16837091001 | Microtubule extraction |
| SDS sample buffer | self made | Quality assessment | |
| Syringe | BD plastipak | 309658 | Microtubule extraction |
| Ultra protease tables mini | Fisher Scientific | NC0975224 | Microtubule extraction |
| Whatman blotting paper | Whatman | 47000-100 | Cryo-EM grid preparation |
| Equipment | |||
| Flow hood | cell culture | ||
| GloQube | Quorum | Cryo-EM grid preparation | |
| Grid storage box | SWISSCI | 41018 | Cryo-EM grid storage |
| Heating block, electric or metal | to warm the buffers | ||
| Incubator, cell culture | NUAIR | cell culture | |
| LN2 dewar | Cryo-EM grid storage | ||
| Plunge-tweezers | Electron Microscopy Sciences | 0508-L5-PS | Cryo-EM grid preparation, hole drilled in top to fit the vitrobot |
| Polystyrene box | to keep the buffers warm | ||
| Sonicator | Qsonica | Q700 | Microtubule extraction |
| Standard light microscope | Olympus | CKX 41 | Quality assessment |
| TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | Microtubule extraction | |
| Tubes for TLA 100.3 rotor | Beckman Coulter | 326819 | Microtubule extraction |
| Tubes for TLA 120.2 rotor | Beckman Coulter | 347356 | Microtubule extraction |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Microtubule extraction |
| Vitrobot | FEI, ThermoFischer Scientific | mark IV | Cryo-EM grid preparation |
| Vitrobot polystyrene container assembly with metal ethane cup | ThermoFisher Scientific | 200703 | Cryo-EM grid preparation |
| Water bath | cell culture |
References
- Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
- Peris, L., et al. Motor-dependent microtubule disassembly driven by tubulin tyrosination. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1159-1166 (2009).
- McKenney, R. J., Huynh, W., Tanenbaum, M. E., Bhabha, G., Vale, R. D. Activation of cytoplasmic dynein motility by dynactin-cargo adapter complexes. Science. 345 (6194), 337-341 (2014).
- Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
- Sirajuddin, M., Rice, L. M., Vale, R. D. Regulation of microtubule motors by tubulin isotypes and post-translational modifications. Nature Cell Biology. 16 (4), 335-344 (2014).
- Nogales, E., Kellogg, E. H. Challenges and opportunities in the high-resolution cryo-EM visualization of microtubules and their binding partners. Current Opinion in Structural Biology. 46, 65-70 (2017).
- Manka, S. W., Moores, C. A. Microtubule structure by cryo-EM: Snapshots of dynamic instability. Essays in Biochemistry. 62 (6), 737-751 (2018).
- Chaaban, S., Carter, A. P. Structure of dynein-dynactin on microtubules shows tandem adaptor binding. Nature. 610 (7930), 212-216 (2022).
- Lacey, S. E., He, S., Scheres, S. H., Carter, A. P. Cryo-EM of dynein microtubule-binding domains shows how an axonemal dynein distorts the microtubule. eLife. 8, 47145 (2019).
- Walton, T., Wu, H., Brown, A. Structure of a microtubule-bound axonemal dynein. Nature Communications. 12, 477 (2021).
- Sindelar, C. V., Downing, K. H. An atomic-level mechanism for activation of the kinesin molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4111-4116 (2010).
- Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
- Maurer, S. P., Fourniol, F. J., Bohner, G., Moores, C. A., Surrey, T. EBs Recognize a nucleotide-dependent structural cap at growing microtubule ends. Cell. 149 (2), 371-382 (2012).
- Benoit, M. P. M. H., Asenjo, A. B., Sosa, H. Cryo-EM reveals the structural basis of microtubule depolymerization by kinesin-13s. Nature Communications. 9, 1662 (2018).
- Kellogg, E. H., et al.
- Brotzakis, Z. F., et al. A structural ensemble of a Tau-microtubule complex reveals regulatory Tau phosphorylation and acetylation mechanisms. ACS Central Science. 7 (12), 1986-1995 (2021).
- Kellogg, E. H., et al. Insights into the distinct mechanisms of action of taxane and non-taxane microtubule stabilizers from cryo-EM structures. Journal of Molecular Biology. 429 (5), 633-646 (2017).
- Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
- Wloga, D., Joachimiak, E., Louka, P., Gaertig, J.
- Nieuwenhuis, J., Brummelkamp, T. R. The tubulin detyrosination cycle: Function and enzymes. Trends in Cell Biology. 29 (1), 80-92 (2019).
- Nieuwenhuis, J., et al.
- Aillaud, C., et al. Vasohibins/SVBP are tubulin carboxypeptidases (TCPs) that regulate neuron differentiation. Science. 358 (6369), 1448-1453 (2017).
- Landskron, L., et al. Posttranslational modification of microtubules by the MATCAP detyrosinase. Science. 376 (6595), (2022).
- Erck, C., et al. A vital role of tubulin-tyrosine-ligase for neuronal organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (22), 7853-7858 (2005).
- Pagnamenta, A. T., et al. Defective tubulin detyrosination causes structural brain abnormalities with cognitive deficiency in humans and mice. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3391-3405 (2019).
- Peris, L., et al. Tubulin tyrosination regulates synaptic function and is disrupted in Alzheimer's disease. Brain. 145 (7), 2486-2506 (2022).
- Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14 (5), 1634-1660 (2019).
- Gell, C., et al.
- Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of tubulin with controlled posttranslational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles. Journal of Visualized Experiments. (165), e61826 (2020).
- Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
- Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
- Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue. GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
- Sindelar, C. V., Downing, K. H. The beginning of kinesin's force-generating cycle visualized at 9-Å resolution. Journal of Cell Biology. 177 (3), 377-385 (2007).
- Kellogg, E. H., et al. Near-atomic cryo-EM structure of PRC1 bound to the microtubule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9430-9439 (2016).
- Maurer, S. P., Bieling, P., Cope, J., Hoenger, A., Surrey, T. GTPγS microtubules mimic the growing microtubule end structure recognized by end-binding proteins (EBs). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (10), 3988-3993 (2011).
- Manka, S. W., Moores, C. A. Pseudo-repeats in doublecortin make distinct mechanistic contributions to microtubule regulation. EMBO Reports. 21 (12), 51534 (2020).
