Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

חילוץ מיקרוטובולים מהונדסים מתאי יונקים לחקר קומפלקסים של מיקרוטובולים-חלבונים באמצעות מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/65126
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Oncode Institute and Division of Biochemistry, Netherlands Cancer Institute

Summary

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול להפקת טובולין אנדוגני מתאי יונקים, שיכולים להיעדר או להכיל אנזימים ספציפיים לשינוי מיקרוטובולים, כדי להשיג מיקרוטובולים מועשרים לשינוי מסוים. לאחר מכן אנו מתארים כיצד ניתן לקשט את המיקרוטובולים שחולצו בחלבונים קושרי מיקרוטובולים מטוהרים כדי להכין רשתות למיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים.

Abstract

מיקרוטובולים הם חלק חשוב בשלד הציטו-תאי והם מעורבים בארגון תוך-תאי, חלוקת תאים ונדידה. בהתאם לשינויים שלאחר התרגום, microtubules יכול ליצור קומפלקסים עם חלבונים שונים אינטראקציה. קומפלקסים אלה של חלבון מיקרוטובול מעורבים לעתים קרובות במחלות אנושיות. הבנת המבנה של קומפלקסים כאלה שימושית להבהרת מנגנוני הפעולה שלהם וניתן ללמוד אותה במיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים (cryo-EM). כדי להשיג קומפלקסים כאלה למחקרים מבניים, חשוב לחלץ מיקרוטובולים המכילים או חסרים שינויים ספציפיים לאחר התרגום. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט להפקת טובולין אנדוגני מתאי יונקים מהונדסים גנטית, הכולל פילמור מיקרוטובולי, ואחריו שקיעה באמצעות אולטרה-צנטריפוגה. לאחר מכן ניתן להשתמש בטובולין המופק להכנת רשתות מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים עם מיקרוטובולים הקשורים לחלבון קושר מיקרוטובולים מטוהר של עניין. לדוגמה, אנו מדגימים מיצוי של מיקרוטובולים עם טירוזינה מלאה מקווי תאים שהונדסו כך שיחסרו את שלושת האנזימים הידועים לנטרול טובולין. מיקרוטובולים אלה משמשים לאחר מכן ליצירת קומפלקס חלבונים עם טובולין detyrosinase הקשור למיקרוטובולים בלתי פעילים אנזימטית על רשתות cryo-EM.

Introduction

מיקרוטובולים הם חלק מכריע של השלד הציטולוגי; הם מעורבים בתפקודים שונים כגון נדידת תאים וחלוקתם, אך גם תורמים לארגון תוך תאי. כדי להסתגל לגורלות פונקציונליים שונים, מיקרוטובולים מתקשרים עם מגוון חלבונים הקשורים למיקרוטובולים (MAPs), אנזימים וחלבונים אחרים, שאנו מכנים ביחד "חלבונים המקיימים אינטראקציה עם מיקרוטובול". קשירת המיקרוטובולים של חלבונים אלה יכולה להיות מונחית על ידי שינויים שונים בטובולין, המכונים בדרך כלל "קוד טובולין"1. דוגמאות להעדפה זו הן קינזין הקשור לצנטרומרים מיטוטי (MCAK)2 ותחום CAP-Gly של dynein-dynactin של p1503, אשר רצוי לשייך עם טובולין טירוזין, בעוד שמנועי קינזין הקשורים לצנטרומר חלבון E (CENP-E)4 וקינזין-25 מעדיפים טובולין חסר טירוזין C-terminal.

בעוד שניתן להשתמש במגוון שיטות כדי לחקור אינטראקציות מיקרוטובול-חלבון, מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים (cryo-EM) משמש לעתים קרובות לחקר אינטראקציות אלה ברזולוציה כמעט אטומית 6,7. בשנים האחרונות, מבני cryo-EM גילו כיצד חלבונים מוטוריים גדולים כגון dynein 8,9,10 ו kinesin 11, +TIP חלבונים כגון EB3 12,13 ו MCAK14, חלבונים אחרים כגון Tau15,16, ואפילו מולקולות קטנות כגון paclitaxel, peloruside, ו zampanolide 17 אינטראקציה עם microtubules. כדי לחקור אינטראקציות מיקרוטובול-חלבון, מיקרוטובולים מופקים בדרך כלל מהמוח החזירי18. בעקבות זאת, רוב מחקרי המבחנה, כולל מבני מיקרוטובולים cryo-EM, מתבצעים באמצעות טובולין מוח חזירי. תוצאות מחקרים אלה, אם כן, מטשטשות את חשיבות האופי ההטרוגני של שינויים טובולין19 בין רקמות וסוגי תאים. זה יוצר בעיה מסוימת בעת חקירת חלבון הדורש או מעדיף שינוי מסוים כדי להיקשר microtubules. ניתן להמחיש זאת באמצעות טובולין טירוזינאט, המצע למיקרוטובול דטירוסינאז MATCAP.

Detyrosination הוא שינוי טובולין שבו חומצת האמינו C-terminal טירוזין של α-tubulin חסר, אשר קשורה לתפקוד מיטוטי, לבבי, ועצבי20. בעוד שמיקרוטובולים עם טירוזינה מלאה הם המצע האידיאלי עבור MATCAP, זה נעדר במידה רבה במיקרוטובולים הזמינים מסחרית מהמוח החזירי בשל תפקודם של כלי הדם21,22 ו-MATCAP 23 detyrosinases ברקמה זו 22,23,24,25,26. למרות ש- HeLa tubulin זמין מסחרית מכיל בעיקר מיקרוטובולים טירוסינציה, detyrosination יכול להתרחש, ומקור זה של tubulin הוא, לכן, פחות מתאים ליצירת מדגם אחיד עבור ניתוח cryo-EM.

כדי לעורר את הקישור של MATCAP למיקרוטובולים וליצור מדגם הומוגני לניתוח מבני, חיפשנו מקור למיקרוטובולים שעבר טירוזיזציה מלאה. לשם כך נוצר קו תאים חסר MATCAP ווזוהיבין, ששימש לחילוץ מיקרוטובולים עם טירוזין מלא. הליך המיצוי התבסס על פרוטוקולים מבוססים היטב המשתמשים במחזורים חוזרים ונשנים של פילמור ודה-פולימריזציה של המיקרוטובולים כדי לחלץ טובולין מרקמת המוח או מתאים 18,27,28,29,30, עם שלב פילמור אחד בלבד וצנטריפוגה מעל כרית גליצרול. באמצעות שימוש ב-MATCAP כדוגמה, אנו מדגימים כיצד מיקרוטובולים אלה יכולים לשמש למחקרי cryo-EM. כדי להכין רשתות cryo-EM, מתואר פרוטוקול יישום דו-שלבי בריכוז מלח נמוך. השיטות במאמר זה מתארות מיצוי של מיקרוטובולים הניתנים להתאמה אישית בכמויות וטוהר מספיקים לביצוע ניתוח cryo-EM ומספקות פרוטוקול מפורט כיצד להשתמש במיקרוטובולים אלה ליצירת קומפלקסים של חלבון-מיקרוטובולים ברשתות cryo-EM.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה.

1. תרבית תאים

הערה: כל תרבית התאים צריכה להיעשות במכסה מנוע סטרילי של זרימה למינרית.

  1. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, תחילה הפשיר בקבוקון של תאים קפואים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. כאן, אנו משתמשים בקו תאים HCT116 מהונדס גנטית שחסר את שלושת האנזימים הידועים לנטרול טירוזינאט, VASH1, VASH2 ו-MATCAP, כדי ליצור טובולין שעבר טירוזיזציה.
  2. הכינו צלחת Ø בקוטר 10 ס"מ המכילה 10 מ"ל של מדיום תרבית התאים המתאים.
    הערה: בפרוטוקול זה, DMEM (מדיום הנשר המעובד של Dulbecco) בתוספת 10% v/v FCS (נסיוב עגל עובר) ואנטיביוטיקה פניצילין/סטרפטומיצין (מדיום תרבית) שימש לקו התאים HCT116 המהונדס גנטית.
  3. לספור את התאים, זרע ~ 2.5 × 106 תאים קיימא (~ 20% מפגש) בצלחת מוכן 10 ס"מ. נערו את הצלחת בעדינות כדי לפזר את התאים באופן שווה. דוגרים על הצלחת באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C עם 5% (v/v)CO2 עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%-90%.
    הערה: בדרך כלל, פעולה זו נמשכת 3 ימים עבור תאי HCT116, אך הזמן עשוי להיות תלוי בצפיפות הזריעה הספציפית ובקו התאים שבהם נעשה שימוש.
  4. השליכו את מדיום תרבית התאים באמצעות פיפטה או שואב ואקום ושטפו את הצלחת 2 x 5 מ"ל של PBS.
    הערה: היזהר לא לחלק את PBS בכוח רב מדי על monolayer התא כמו זה יכול לנתק את התאים מן הצלחת.
  5. מוסיפים 1-2 מ"ל טריפסין, ודגרים על התאים באינקובטור למשך 2-5 דקות כדי לנתק את התאים.
  6. מוסיפים 2 מ"ל של מדיום התרבית לצלחת כדי להרוות את טריפסין.
  7. מפצלים את תרחיף התא לשלושה עד חמישה חלקים שווים וזורעים אותם מחדש כדי להרחיב את התאים בתווך תרבית עד לקבלת 6-12 לוחות 15 ס"מ מתמזגים.

2. קציר

  1. שטפו את התאים בעדינות עם 10 מ"ל PBS (1x) כדי להסיר כל מדיום תרבית תאים.
  2. נתקו את התאים מהלוחות על ידי דגירה של התאים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם 3 מ"ל של PBS קר כקרח בתוספת 5 mM EDTA (סטרילי/מסונן), ולאחר מכן, באמצעות מגרד תאים.
  3. לאסוף את התאים בצינור 50 מ"ל על קרח, ולסובב למטה (10 דקות, 250 × גרם).
    1. שים לב לנפח התאים שנקטפו עם קנה המידה הנפחי על צינור 50 מ"ל.
      הערה: אמצעי האחסון הצפוי יכול להיות בכל מקום בין ~0.5 מ"ל ל- 4 מ"ל. שלב השהיה: יש להקפיא במהירות הבזק את כדורית התא ב-LN2, ולאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש. שים לב כי גלולת התא ניתן לאחסן רק במשך כמה שבועות או חודשים. אם הגלולה נשמרת זמן רב יותר, אז זה יכול לגרום לירידה ביבול או ללא מיקרוטובולים בכלל.

3. מיצוי מיקרוטובול

הערה: שמור הכל עבור שלבים 3.1-3.5 על קרח; כל דבר משלב 3.6 ואילך צריך להישמר חם (30-37 מעלות צלזיוס).

  1. הכינו 10 מ"ל של חיץ ליזה קר כקרח המכיל צינורות 100 mM/KOH (pH 6.9), 2 mM EGTA/KOH, 1 mM MgCl2, 1 mM PMSF וטבליה מעכבת פרוטאז אחת (mini).
  2. השהה מחדש את גלולת התא שנקטפה במאגר ליזיס ביחס של 1:1 v/v (אם יש ספק לגבי הנפח המדויק, קח פחות חיץ ליזיס במקום יותר).
  3. ליז את התאים על ידי סוניקציה: 15 שניות על, 45 שניות כבוי, אמפר 30, ארבעה מחזורים (לקבוע את התנאים בניסוי, ולשנות בהתאם הסוניקטור).
    1. לאחר סוניקציה, לאסוף דגימה עבור ניתוח SDS-PAGE: 2 μL של lysate + 18 μL של מים + 5 μL של 5x SDS מאגר דגימה.
      הערה: בדוק תחת מיקרוסקופ אור סטנדרטי אם התאים אכן ליזה במלואה.
  4. פיפטה את התאים lysed לתוך צינור צנטריפוגלי. סחרור במשך שעה אחת ב- 100,000 × גרם ב- 4 ° C ברוטור אולטרה-צנטריפוגה כדי לנקות את הליזט.
    הערה: ודא שכל הכיסים ברוטור יבשים ונקיים כדי להבטיח איזון נכון של הצנטריפוגה.
  5. השתמש מזרק כדי להוציא את lysate מנוקה החוצה. יש להקפיד לא להפריע לגלולה כמו גם לשכבה הצפה מלמעלה.
    1. אסוף דגימה של הליזט שפונה: 2 μL של ליזט + 18 μL של מים + 5 μL של 5x SDS מאגר דגימה.
    2. שטפו בזהירות את הכדור, וגרפו מעט מהגלולה על ידי ערבול קצה פיפטה P10 דרך הכדור; הוסף 200 μL מים ו 50 μL של חיץ SDS.
  6. להשלים את supernatant מן השלב הקודם עם 1 mM GTP ו 20 μM paclitaxel כדי פולימריזציה microtubules; לקבלת נפח של 1 מ"ל, הוסף 10 μL של 2 mM paclitaxel ו- 10 μL של 100 mM GTP.
    אזהרה: Paclitaxel עלול לגרום לגירוי בעור, נזק חמור לעיניים, גירוי נשימתי, פגמים גנטיים, נזק לילד שטרם נולד ונזק לאיברים. חשיפה ממושכת או חוזרת גורמת נזק לאיברים. אין לנשום, לרסס או לאבק את החומר בכל דרך שהיא. יש ללבוש כפפות גומי ניטריל כדי למנוע מגע עם העור.
  7. דגרו על סופרנאטנט עם תוספת GTP/פקליטקסל למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C כדי לאפשר למיקרוטובולים להתכנס.
  8. במהלך שלב הדגירה הזה, לאפשר את הרוטור ואת ultracentrifuge להתחמם עד 30 °C (75 °F).
  9. הכינו את מאגר הכרית: הוסיפו 0.6 מ"ל גליצרול ל-0.4 מ"ל של חיץ ליזיס, והשלימו את התערובת עם 20 מיקרומטר פקליטקסל. מחממים מראש את כרית כרית ל 37 ° C.
  10. הוסף 800 μL של חיץ כרית לצינור אולטרה-צנטריפוגה. פיפטה הליזט בתוספת GTP/פקליטקסל בזהירות על גבי מאגר הכרית.
    הערה: יש למנוע ערבוב של חיץ הכרית והליזט על-ידי פיפטינג עדין מאוד.
  11. סחרור במשך 30 דקות ב- 100,000 × גרם ב- 30 ° C ברוטור אולטרה-צנטריפוגה. סמן את הקצה הפונה כלפי חוץ של צינור הצנטריפוגה כדי לזהות בקלות היכן אמורה להיווצר גלולת המיקרוטובול.
  12. הסר את חיץ הכרית בזהירות באמצעות פיפטה, נזהר לא להפריע גלולת microtubule.
    1. אסוף דגימה של מאגר הכרית: 2 μL + 18 μL מים + 5 μL של מאגר דגימה 5x SDS.
  13. שטפו את הגלולה בזהירות 3x עם חיץ ליזה חם כדי להסיר את הגליצרול. מוציאים בעדינות את החיץ החם ליד הגלולה (לא שוטפים את הנוזל ישירות על הכדור), מסובבים את הצינור כמה פעמים כדי להסיר כמה שיותר גליצרול מהגלולה ומדפנות הצינור, ואז שואפים וחוזרים.
    הערה: אם הגליצרול לא נשטף כראוי, הרשת תימס מהר מאוד תחת תאורת האלקטרונים. עדות לכך עשויה להיות תנועת חלקיקים גבוהה, היוצרת תמונות מטושטשות.
  14. הכינו חיץ השעיה עם המרכיבים הבאים: צינורות 100 mM/KOH (PH 6.9), 2 mM EGTA/KOH ו-1 mM MgCl2, וחממו את החיץ ל-37°C.
  15. השהה מחדש את הגלולה שטופה בעדינות עם קצה חתוך ב~ 50 μL של חיץ השעיה שחומם מראש, ושמור על הצינור ב 37 ° C.
    1. אסוף דגימה של חלק הגלולה המושעה: 2 μL + 18 μL מים + 5 μL של מאגר דגימה 5x SDS.
      טיפ: קצה החיתוך מונע את שבירת המיקרוטובולים. הכינו גוש חימום מתכתי לטמפרטורה של 37°C, ושמרו אותו בקופסת פוליסטירן, כך שניתן יהיה להעביר את צינורות הדגימה בקלות מבלי לקרר אותם לטמפרטורת החדר.

4. הכנת רשת Cryo-EM

  1. הכינו את מכשיר המקפיא על ידי התקנת נייר הניקוי. מחממים את המקפיא עד 30 מעלות צלזיוס, ומכוונים את הלחות ל -100%. אפשר ~ 30 דקות כדי לאזן את הטמפרטורה והלחות.
  2. הכינו את ההגדרות של המקפיא לשני יישומים, ועברו על התוכנית כולה פעם אחת כדי לוודא שההגדרות מוגדרות כראוי. ודא שליישום הראשון יש כוח של 10, זמן כתם של 2 שניות וזמן המתנה של 0 שניות ושליישום השני יש כוח של זמן המתנה של 10, 6.5 שניות וזמן המתנה של 10 שניות.
  3. זוהר-לפרוק את רשתות cryo-EM ב 30 mA במשך 60 שניות.
  4. קררו את מכלול מיכל הפוליסטירן עם LN2, והכינו אתאן נוזלי בכוס מתכת על ידי עיבוי גז אתאן לכוס מתכת קרה.
  5. הכינו חיץ דילול עם הרכיבים הבאים: צינורות 100 mM/KOH (pH 6.9), 2 mM EGTA/KOH ו-1 mM MgCl2, וחממו אותו ל-37°C.
  6. דללו את החלבון באינטראקציה מיקרוטובולית 1:1 v/v עם חיץ דילול ממש לפני החלתו על הרשתות, כדי להבטיח שריכוז המלח יורד (השתמשנו בריכוז מלח סופי של 50 mM NaCl). שמור את התערובת על 37 מעלות צלזיוס.
  7. תפוס רשת משוחררת זוהרת עם פינצטה צלולה ולחץ אותם לתוך המקפיא.
  8. מקמו את מיכל הפוליסטירן עם אתאן נוזלי במקפיא הצלילה, ועברו על התוכנית המוכנה: ראשית מרחו 3.5 מיקרוליטר של תמיסת מיקרוטובול על הרשת, תנו למקפיא לצלול לכתם את הרשת, ואז מרחו מיד 3.5 מיקרוליטר של חלבון מדולל טרי, ולבסוף, תנו לבוכנה לכתם ולצלול-להקפיא את הרשת באתאן נוזלי.
  9. העבירו את הרשתות לקופסת אחסון רשת, ואחסנו אותן בדיואר LN2 עד להדמיה.

Representative Results

חקרנו את טובולין detyrosinase MATCAP קשור microtubules tyrosinated על ידי cryo-EM. כדי לעשות זאת, חילצנו מיקרוטובולים שטורוזינים במלואם מקו תאים HCT116 מהונדסים גנטית החסרים את כל שלושת האנזימים הידועים לנטרול טירוזינאט, VASH1/2 ו-MATCAP. השתמשנו ב-6-12 צלחות בקוטר 15 ס"מ כדי לחלץ את המיקרוטובולים מכ-0.5-4 מ"ל של כדורי תאים (איור 1). לאחר שלב הצנטריפוגה השני (שלב 3.11), זה מניב גלולה גלויה אך קטנה ושקופה (איור 1I). תפוקת המיקרוטובול היא בדרך כלל ~ 75 מיקרוגרם. אם הגלולה אינה נראית לעין, הדבר עשוי להצביע על בעיה באחד השלבים הקודמים, כגון טמפרטורת פילמור מיקרוטובולית שגויה, בעיות באיכות ה- GTP או הפקליטקסל המשומשים, או תוספת של יותר מדי חיץ ליזיס, וכתוצאה מכך ריכוז טובולין נמוך מדי לפילמור. כדי להעריך את האיכות והריכוז של המיקרוטובולים שחולצו, ניתחנו דגימות על ג'ל SDS מוכתם בקומסי (איור 2A). ניתוחים אלה הצביעו על כך שהמיקרוטובולים שחולצו היו טהורים יחסית. ריכוז המיקרוטובול באינטרפולציה שנגזר מכימות BSA היה ~ 1.4 מ"ג / מ"ל. זה תואם היטב את המספר שנמדד באמצעות ספקטרופוטומטר (איור 2B,C).

ניתן להשתמש ישירות במיקרוטובולים המופקים טריים להכנת דגימות עבור cryo-EM. המיקרוטובולים צריכים להיראות שלמים ושופעים על המיקרוגרפים. לניתוח קריו-EM נוסף, חשוב שתהיה צפיפות מיקרוטובולים נמוכה לכל מיקרוגרף כדי למנוע מהמיקרוטובולים לחצות זה את זה (איור 3A). מיקרוטובולים שבורים או כאלה שאינם נראים לעין עשויים להצביע על כך שהמיקרוטובולים עברו דה-פולימריזציה (למשל, עקב טמפרטורה נמוכה או הידרוליזה GTP) או שהפרמטרים של הקפאת כתמים וצניחה לא הוגדרו כראוי. הרקע סביב המיקרוטובולים צפוף, ככל הנראה עם טובולין לא פולימרי.

המשקל המולקולרי של MATCAP הוא 53 kDa, ויש לו תחום קטליטי כדורי ממש מתחת לגודל של מונומר טובולין. העיטור של MATCAP על microtubule יכול, אם כן, להיות מזוהה חזותית. מיקרוטובולים שלא קשרו את MATCAP הראו קצוות "חלקים", בעוד שלמיקרוטובולים שקשרו את MATCAP היו קצוות "גסים", שהתאפיינו בנקודות צפופות אלקטרונים על פני השטח של המיקרוטובולים (איור 3B). ניתן להבחין בין מיקרוטובולים הקשורים ל-MATCAP לבין מיקרוטובולים שאינם קשורים ל-MATCAP גם במחלקות הדו-ממדיות המחושבות, אף על פי שבשל הצורה והגודל, הדבר עשוי להיות שונה עבור חלבונים אחרים שמתקשרים עם מיקרוטובולים (איור 3C). כדי לאשר שהצפיפות אכן שייכת לחלבון המעניין, ניתן לנצל מבנים שנקבעו או נחזו בניסוי. אנו מציעים גם ליצור רשת בקרה המכילה מיקרוטובולים רק לשם השוואה. זה מצביע על כך שהמיקרוטובולים עברו פולימריזציה והוצאו שלמים בריכוז גבוה מספיק וכי תהליך הקפאת הצניחה בוצע כראוי. שמנו לב ששפע המיקרוטובולים ירד ברשתות עם יישום MATCAP שני.

Figure 1
איור 1: הנחיה חזותית של שלבי הניסוי. (A) גלולת תא לפני ליזיס; (B) תאים סוניים בצינור אולטרה-צנטריפוגה לפני צנטריפוגה; (C) תאים סוניים בצינור אולטרה-צנטריפוגה לאחר צנטריפוגה; (ד) מזרק עם המפקח המנוקה; (ה) גלולה שיורית לאחר הסרת סופרנטנט, לרבות "שכבה לבנה צפה"; (F) קצה P10 עם כדורית פסולת תאים עבור ג'ל SDS Coomassie; (G) סופרנאטנט בתוספת GTP/פקליטקסל לפני הדגירה; (H) סופרנאטנט מודגר GTP/פקליטקסל על גבי כרית גליצרול בצינור אולטרה-צנטריפוגה; (I) כדורי מיקרוטובול נקיים לאחר שלב הצנטריפוגה השני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: טוהר מיקרוטובולים וקביעת ריכוז. (A) ג'ל דף SDS מוכתם בקומסי המציג את הדגימות שנלקחו במהלך פרוטוקול המיצוי והשוואת ריכוז BSA. S1 ו-P1 מקבילים לסופרנאטנט ולגלולה לאחר שלב הצנטריפוגה הראשון, בהתאמה. S2 ו-P2 מקבילים באופן דומה לשלב הצנטריפוגה השני. (B) קו רגרסיה לא ליניארי של כמויות BSA יחסיות הנגזרות מ-A. האינטרפולציה של רצועת המיקרוטובולים סביב 50 kDa בנתיב P2 (מיקרוטובולים) מצביעה על ריכוז סופי של 1.42 מ"ג/מ"ל. (C) הניתוח הספקטרופוטומטרי של המיקרוטובולים המרחפים (P2) שנמדד על ידי שני אנשים ותוקן עבור מקדם ההכחדה המשולב של TUBA1A ו-TUBB3 (0.971) מצביע על ריכוז ממוצע וסטיית תקן של 1.46 מ"ג/מ"ל ± 0.14 מ"ג/מ"ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מיקרוגרפים לדוגמה. (A) מיקרוגרפים לדוגמה המציגים מיקרוטובולים הקשורים ל-MATCAP. המיקרוטובולים המצוינים על ידי קופסה ירוקה שלמים, מעוטרים, וניתן להשתמש בהם לניתוח cryo-EM. המיקרוטובול המסומן על ידי הקופסה הכתומה הוא מיקרוטובול שלם ומעוטר אך ממוקם קרוב למיקרוטובולים שנותרו ממנו; לכן, זה פחות מתאים לכלול בניתוח cryo-EM. המיקרוטובולים בקופסה האדומה עוברים ושבורים. אלה צריכים להיות מחוץ לניתוח cryo-EM. (B) תצוגה מוגדלת של המיקרוטובול הירוק המוקף של הפאנל השמאלי. ראשי החץ האדומים מציינים את הנקודות השחורות שהופיעו רק על המיקרוטובולים במיקרוגרפים שהיו בעלי יישום של MATCAP, ולכן ככל הנראה מתאימות ל-MATCAP הקשור למיקרוטובול. (C) דוגמה למחלקות דו-ממדיות של חלקיקי מיקרוטובולים שנבחרו מ-A שהראו עיטור גבוה ונמוך, ומחלקה דו-ממדית ממערך נתונים אחר שעבורו לא ראינו קישוט על ידי MATCAP (הפאנל הימני ביותר). פסי קנה מידה = (A) 50 ננומטר, (B) 25 ננומטר, (C) 10 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח אימונובלוט של מיקרוטובולים שמקורם בתאי HCT116 HCT116 עם מחסור ב-MATCAP ו-VASH1/2, מוח חזירי מסחרי ו-HeLa tubulin. קיצורים: TKO = נוקאאוט משולש; mAb = נוגדן חד שבטי; pAb = נוגדן רב שבטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

שיטה זו מתארת כיצד לחלץ במהירות טובולין אנדוגני משורות תאים ולאחר מכן לקשט מיקרוטובולים אלה על רשתות cryo-EM. מיקרוטובולים רגישים לטמפרטורה. הם מתפרקים בסביבה קרה ומתפלמרים בסביבה חמה31. לכן, קריטי לבצע את סחרור הסוניקציה והפינוי (שלבים 1.1-1.5) בטמפרטורה של 4°C כדי להמיס את הטובולין. אם גורמים כלשהם היו מייצבים את המיקרוטובולים כל כך טוב שהם לא היו מתפרקים בשלב זה, מיקרוטובולים אלה והגורמים המייצבים היו מושלכים בכדורייה לאחר סיבוב הסילוק הראשוני. לאחר פילמור (מחדש) של המיקרוטובולים, חשוב לשמור על התמיסה המכילה את המיקרוטובולים הפולימריים חמה בכל עת. חילצנו את המיקרוטובולים מתאי HCT116, אשר חסרים בחלבונים VASH1, VASH2 ו-MATCAP. קווי תאים אחרים, כמו גם רקמות, יכולים לשמש כדי לחלץ microtubules29, אם כי מזהמים, איזוטיפים tubulin, ואת התשואה יכול להיות שונה מאוד ממה שמתואר כאן. ביטוי יתר של פלסמידים המכילים אנזימים משתנים יכול לשמש גם כדי להציג שינויים ספציפיים tubulin.

פרוטוקולים אחרים 18,27,28,29,30 משתמשים במחזורים מרובים של פילמור ודה-פולימריזציה של המיקרוטובולים כדי לקבל מיקרוטובולים נטולי חלבונים אחרים המקיימים אינטראקציה. כאן, פישטנו את הפרוטוקולים האלה ופילמרנו את המיקרוטובולים רק פעם אחת. ייתכן שבגלל פילמור יחיד זה, מיקרוטובולים אלה עשויים לשקע יחד עם חלבונים אחרים המקיימים אינטראקציה עם מיקרוטובולים. עם זאת, מצאנו כי פרוטוקול זה נותן מיקרוטובולים טהורים מספיק למטרות cryo-EM. אם יש צורך בדגימה טהורה יותר עבור בדיקות ספציפיות, מחזורים נוספים של פילמור ודה-פולימריזציה יכולים להניב דגימה טהורה יותר, אם כי זה עשוי להיות על חשבון תפוקת המיקרוטובול. בפרוטוקול הזה השתמשנו בפקליטקסל כדי לפלמר את המיקרוטובולים. עם זאת, פקליטקסל יכול להטות את סריג המיקרוטובול לכיוון פיתול ועלייה מסוימים, מה שעלול להפריע לזיקה המיקרוטובולית של החלבון המעניין. ריאגנטים מייצבים מיקרוטובולים אחרים יכולים לשמש אם paclitaxel אינו מתאים; דוגמאות לריאגנטים אלה הן מולקולות שאינן טקסניות כגון פלורוזיד או גרסאות GTP שאינן ניתנות להידרוליזה כגון GMPCPP17,32.

כדי לחקור באופן מבני חלבונים הנקשרים למיקרוטובולים ברשתות cryo-EM, יש לקשור כמות מספקת של החלבון המעניין את המיקרוטובולים. בעיה נפוצה היא שקומפלקסים חלבוניים יציבים בתמיסה מתפרקים ברשת. כדי ליצור את קומפלקס החלבון על הרשת, היה חיוני תחילה לשכב את המיקרוטובולים ולאחר מכן ליישם את החלבון קושר המיקרוטובולים עם ריכוז מלח נמוך על הרשת המצופה במיקרוטובול, ובכך להרכיב את קומפלקס החלבון ישירות על הרשת. אחרים דיווחו באופן דומה על פרוטוקול33,34 דל מלח ופרוטוקול יישום דו-שלבי34,35,36 לקישוט מוצלח של מיקרוטובול. סביר להניח כי ריכוז מלח נמוך יותר מטה את קומפלקס החלבון לעבר אינטראקציה יציבה יותר בשל המטען האלקטרוסטטי המופחת. עם זאת, בשל ריכוז המלח הנמוך, החלבון המעניין נמצא בסיכון לזרז. לכן, מומלץ מאוד לשמור את החלבון בריכוזי מלח רלוונטיים פיזיולוגית או סביבם עד זמן קצר לפני ויטריפיקציה של הרשתות. פרוטוקול יישום דו-שלבי זה ככל הנראה מונע מקומפלקס החלבונים להתפרק במהלך שלבי הכתמים או הקפאת הצלילה. בפרוטוקול זה השתמשנו בוויטרובוט. עם זאת, שיטות ויטריפיקציה מהירות יותר (VitroJet) או שימוש ברשתות נטולות כתמים (Puffalot) או התקנים בעלי שתי התכונות (זיקית) עשויים להתגבר על היישום הדו-שלבי, אך אלה אינם זמינים כרגע באופן נרחב לבדיקה.

הרזולוציה הסופית של צפיפות cryo-EM המשוחזרת יכולה להיות מושפעת ממספר גורמים, כולל התנועה של החלבון קושר המיקרוטובול ביחס למיקרוטובול ורמת הקישוט שניתן להשיג. קישוט מיקרוטובול גבוה יותר מועיל ככל הנראה לרזולוציה הסופית המתקבלת בשחזור צפיפות תלת מימדית. זה יכול להיות מוגבל על ידי מספר גורמים, כגון ריכוז החלבון הגבוה ביותר המתקבל במהלך הטיהור של החלבון קושר המיקרוטובול, ריכוז המלח הנמוך ביותר שהחלבון המקיים אינטראקציה עם מיקרוטובולים יכול לעמוד בו ללא צבירה, ומצב הקישור של החלבון המקיים אינטראקציה עם מיקרוטובולים (למשל, החלבון יכול להשתרע על פני יותר מדימר טובולין אחד, ובכך לעכב יחס קישור של 1:1). למרות שהרזולוציה של שחזור cryo-EM עלולה להיפגע על ידי מיקרוטובולים מעוטרים בדלילות, ניתוח חישובי יכול לעקוף בעיות רבות, כפי שמודגם על ידי מבנה מורכב של מיקרוטובול-חלבון שדווח לאחרונה שהיה מעוטר בדלילות רבה8.

הפרוטוקול שאנו מתארים כאן מציג שיטה מהירה וזולה להשגת מיקרוטובולים המתאימים למטרות cryo-EM. בניגוד לטובולין מוח חזירי הזמין מסחרית, המיקרוטובולים שמקורם בתאי HCT116 חסרי MATCAP וחסרי וזוהבין סובלים מטירוזין מלא (איור 4). HeLa tubulin מסחרי, מגיב יקר, באופן עקרוני, הוא טירוזין אחיד יחסית ומכיל מעט שינויים אחרים4 כגון גלוטמילציה, אבל אצוות עשויות להשתנות, ושינוי יכול להיות מושג רק במבחנה. יתרון של חילוץ מיקרוטובולים מקווי תאים בהתאמה אישית הוא הגמישות שיש לאדם לבטא יתר על המידה או למחוק אנזימים משנים טובולין, כגון tubulin detyrosinases, כדי ליצור מאגר הומוגני יותר של מיקרוטובולים. זה יכול להועיל לקישוט ולאחידות של דגימת cryo-EM ובסופו של דבר יועיל לקלות ולאיכות של מפות צפיפות cryo-EM ומבנים מולקולריים הנגזרים מדגימה זו.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים לכל החברים בקבוצות Sixma, Brummelkamp ו-Perrakis על הדיונים המדעיים הפוריים שלהם ועל כך שהם מספקים סביבת עבודה נעימה, ובאופן ספציפי, אנו מודים ליאן סאקולטצ'יק ("אדם 2") על שעזר לקבוע את ריכוז החלבון המתואר באיור 3C. ברצוננו גם להודות למתקן הקריו-EM של NKI ולמרכז ההולנדי לננווסקופיית אלקטרונים (NeCEN) באוניברסיטת ליידן על תמיכתם. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NWO Vici 016.Vici.170.033 שהוענק ל- T.R.B. A.P. ו-T.R.B. הם חוקרי Oncode ומקבלים מימון מ-NWO ENW (OCENW. M20.324). L.L. קיבלה מימון מקרן המדע האוסטרית (FWF JB4448-B). מחקר זה נתמך על ידי מענק מוסדי של האגודה ההולנדית לסרטן ושל משרד הבריאות, הרווחה והספורט ההולנדי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
0.05% trypsin-EDTA Gibco 25300-054 Cell culture
10 cm plate Falcon 353003 Cell culture
15 cm plate Thermo FisherScientific 168381 Cell culture
50 mL tubes Sarstedt 62.547255 Cell culture
300 mesh quantifoil holey carbon copper grid R1.2/1.3 Quantifoil Micro Tools N1-C14nCu30-01 Cryo-EM grid preparation
Cell scrapers Falcon 353085 Cell culture
DMEM Gibco 41966-029 Cell culture
EDTA Merck 108418 Cell culture
EGTA Sigma Aldrich E3899 Microtubule extraction
Ethane gas Cryo-EM grid preparation
FCS Serana s-FBS-EU-015 Cell culture
Glycerol VWR 24.397.296 Microtubule extraction
GTP Fisher Scientific G8877-1G Microtubule extraction
HCT116 VASH1 VASH2 MATCAP KO cells self made Wild type HCT116 cells RRID: CVCL_0291 Cell culture
KOH Merck 1.05033 Microtubule extraction
MgCl2 Merck 105833 Microtubule extraction
Microtubule binding protein self made Cryo-EM grid preparation
Needle BD microlance 300600 Microtubule extraction
Paclitaxel Santa Cruz Biotechnology sc-212517 caution toxic, microtubule extraction
PBS Fisher Scientific BP399 Cell culture
Penicillin and streptomycin Sigma Aldrich P0781-100mL Cell culture
PIPES Merck P8203 Microtubule extraction
PMSF (in EtOH) Roche 16837091001 Microtubule extraction
SDS sample buffer self made Quality assessment
Syringe BD plastipak 309658 Microtubule extraction
Ultra protease tables mini Fisher Scientific NC0975224 Microtubule extraction
Whatman blotting paper Whatman 47000-100 Cryo-EM grid preparation
Equipment
Flow hood cell culture
GloQube Quorum Cryo-EM grid preparation
Grid storage box SWISSCI 41018 Cryo-EM grid storage
Heating block, electric or metal to warm the buffers
Incubator, cell culture NUAIR cell culture
LN2 dewar Cryo-EM grid storage
Plunge-tweezers Electron Microscopy Sciences 0508-L5-PS Cryo-EM grid preparation, hole drilled in top to fit the vitrobot
Polystyrene box  to keep the buffers warm
Sonicator Qsonica Q700 Microtubule extraction
Standard light microscope Olympus CKX 41 Quality assessment
TLA 100.3 rotor Beckman Coulter Microtubule extraction
TLA 120.2 rotor Beckman Coulter Microtubule extraction
Tubes for TLA 100.3 rotor Beckman Coulter 326819 Microtubule extraction
Tubes for TLA 120.2 rotor Beckman Coulter 347356 Microtubule extraction
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima MAX-XP Microtubule extraction
Vitrobot FEI, ThermoFischer Scientific mark IV Cryo-EM grid preparation
Vitrobot polystyrene container assembly with metal ethane cup ThermoFisher Scientific 200703 Cryo-EM grid preparation
Water bath cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  2. Peris, L., et al. Motor-dependent microtubule disassembly driven by tubulin tyrosination. Journal of Cell Biology. 185 (7), 1159-1166 (2009).
  3. McKenney, R. J., Huynh, W., Tanenbaum, M. E., Bhabha, G., Vale, R. D. Activation of cytoplasmic dynein motility by dynactin-cargo adapter complexes. Science. 345 (6194), 337-341 (2014).
  4. Barisic, M., et al. Microtubule detyrosination guides chromosomes during mitosis. Science. 348 (6236), 799-803 (2015).
  5. Sirajuddin, M., Rice, L. M., Vale, R. D. Regulation of microtubule motors by tubulin isotypes and post-translational modifications. Nature Cell Biology. 16 (4), 335-344 (2014).
  6. Nogales, E., Kellogg, E. H. Challenges and opportunities in the high-resolution cryo-EM visualization of microtubules and their binding partners. Current Opinion in Structural Biology. 46, 65-70 (2017).
  7. Manka, S. W., Moores, C. A. Microtubule structure by cryo-EM: Snapshots of dynamic instability. Essays in Biochemistry. 62 (6), 737-751 (2018).
  8. Chaaban, S., Carter, A. P. Structure of dynein-dynactin on microtubules shows tandem adaptor binding. Nature. 610 (7930), 212-216 (2022).
  9. Lacey, S. E., He, S., Scheres, S. H., Carter, A. P. Cryo-EM of dynein microtubule-binding domains shows how an axonemal dynein distorts the microtubule. eLife. 8, 47145 (2019).
  10. Walton, T., Wu, H., Brown, A. Structure of a microtubule-bound axonemal dynein. Nature Communications. 12, 477 (2021).
  11. Sindelar, C. V., Downing, K. H. An atomic-level mechanism for activation of the kinesin molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4111-4116 (2010).
  12. Zhang, R., Alushin, G. M., Brown, A., Nogales, E. Mechanistic origin of microtubule dynamic instability and its modulation by EB proteins. Cell. 162 (4), 849-859 (2015).
  13. Maurer, S. P., Fourniol, F. J., Bohner, G., Moores, C. A., Surrey, T. EBs Recognize a nucleotide-dependent structural cap at growing microtubule ends. Cell. 149 (2), 371-382 (2012).
  14. Benoit, M. P. M. H., Asenjo, A. B., Sosa, H. Cryo-EM reveals the structural basis of microtubule depolymerization by kinesin-13s. Nature Communications. 9, 1662 (2018).
  15. Kellogg, E. H., et al. Near-atomic model of microtubule-tau interactions. Science. 360 (6394), 1242-1246 (2018).
  16. Brotzakis, Z. F., et al. A structural ensemble of a Tau-microtubule complex reveals regulatory Tau phosphorylation and acetylation mechanisms. ACS Central Science. 7 (12), 1986-1995 (2021).
  17. Kellogg, E. H., et al. Insights into the distinct mechanisms of action of taxane and non-taxane microtubule stabilizers from cryo-EM structures. Journal of Molecular Biology. 429 (5), 633-646 (2017).
  18. Vallee, R. B. Reversible assembly purification of microtubules without assembly-promoting agents and further purification of tubulin, microtubule-associated proteins, and MAP fragments. Methods in Enzymology. 134, 89-104 (1986).
  19. Wloga, D., Joachimiak, E., Louka, P., Gaertig, J. Posttranslational modifications of tubulin and cilia. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), 028159 (2017).
  20. Nieuwenhuis, J., Brummelkamp, T. R. The tubulin detyrosination cycle: Function and enzymes. Trends in Cell Biology. 29 (1), 80-92 (2019).
  21. Nieuwenhuis, J., et al. Vasohibins encode tubulin detyrosinating activity. Science. 358 (6369), 1453-1456 (2017).
  22. Aillaud, C., et al. Vasohibins/SVBP are tubulin carboxypeptidases (TCPs) that regulate neuron differentiation. Science. 358 (6369), 1448-1453 (2017).
  23. Landskron, L., et al. Posttranslational modification of microtubules by the MATCAP detyrosinase. Science. 376 (6595), (2022).
  24. Erck, C., et al. A vital role of tubulin-tyrosine-ligase for neuronal organization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (22), 7853-7858 (2005).
  25. Pagnamenta, A. T., et al. Defective tubulin detyrosination causes structural brain abnormalities with cognitive deficiency in humans and mice. Human Molecular Genetics. 28 (20), 3391-3405 (2019).
  26. Peris, L., et al. Tubulin tyrosination regulates synaptic function and is disrupted in Alzheimer's disease. Brain. 145 (7), 2486-2506 (2022).
  27. Souphron, J., et al. Purification of tubulin with controlled post-translational modifications by polymerization-depolymerization cycles. Nature Protocols. 14 (5), 1634-1660 (2019).
  28. Gell, C., et al. Purification of tubulin from porcine brain. Methods in Molecular Biology. 777, 15-28 (2011).
  29. Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Janke, C., Magiera, M. M. Purification of tubulin with controlled posttranslational modifications and isotypes from limited sources by polymerization-depolymerization cycles. Journal of Visualized Experiments. (165), e61826 (2020).
  30. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  31. Li, G., Moore, J. K. Microtubule dynamics at low temperature: evidence that tubulin recycling limits assembly. Molecular Biology of the Cell. 31 (11), 1154-1166 (2020).
  32. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D. N., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue. GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  33. Sindelar, C. V., Downing, K. H. The beginning of kinesin's force-generating cycle visualized at 9-Å resolution. Journal of Cell Biology. 177 (3), 377-385 (2007).
  34. Kellogg, E. H., et al. Near-atomic cryo-EM structure of PRC1 bound to the microtubule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9430-9439 (2016).
  35. Maurer, S. P., Bieling, P., Cope, J., Hoenger, A., Surrey, T. GTPγS microtubules mimic the growing microtubule end structure recognized by end-binding proteins (EBs). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (10), 3988-3993 (2011).
  36. Manka, S. W., Moores, C. A. Pseudo-repeats in doublecortin make distinct mechanistic contributions to microtubule regulation. EMBO Reports. 21 (12), 51534 (2020).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 193
חילוץ מיקרוטובולים מהונדסים מתאי יונקים לחקר קומפלקסים של מיקרוטובולים-חלבונים באמצעות מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bak, J., Landskron, L., Brummelkamp, … More

Bak, J., Landskron, L., Brummelkamp, T. R., Perrakis, A. Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (193), e65126, doi:10.3791/65126 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter