Approccio unico per l'isolamento di neutrofili del midollo osseo di ratto con capacità comparabili

I neutrofili costituiscono un sottogruppo critico di leucociti che svolgono un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria innata. Sono caratterizzati da nuclei e granuli multilobati contenenti varie proteasi e peptidi antimicrobici¹. I neutrofili funzionano principalmente attraverso la degranulazione, la fagocitosi e la formazione di NET. L'osservazione dei NET è stata fatta per la prima volta da Takei et al. nel 1996 durante un esperimento in cui i neutrofili sono stati stimolati con acetato di miristato di forbolo (PMA)². Successivamente, il processo di formazione di NET è stato coniato "NETosis" da Brinkmann et ^al.3 nel 2004. La loro ricerca ha ulteriormente messo in luce il ruolo cruciale dei NET nelle risposte antimicrobiche mediate dai neutrofili. I NET sono strutture simili a ragnatele composte da cromatina, istoni e proteine antimicrobiche che vengono rilasciate dai neutrofili attivati in risposta a stimoli infettivi e infiammatori. I NET possono immobilizzare e uccidere gli agenti patogeni invasori intrappolandoli ed esponendoli a un'alta concentrazione di peptidi e proteasi antimicrobiche ^1,3. Inoltre, i NET contribuiscono alla clearance delle cellule apoptotiche e partecipano alla risoluzione dell'infiammazione. Studi recenti indicano anche che un'eccessiva formazione di NET o una degradazione compromessa di NET possono portare a danni tissutali, malattie autoimmuni, trombogenesi e compromissione della rivascolarizzazione 4,5,6,7,8,9,10.

Il ruolo patogenetico dei NET nella fibrosi incontrollata a seguito di infarto miocardico e formazione di aneurismi ventricolari è stato dimostrato attraverso l'espansione della fibrosi perivascolare ^4,11. Il modello dell'infarto del miocardio e l'isolamento dei neutrofili dal midollo osseo nei topi sono entrambi ben consolidati. I leucociti polimorfonucleati (PMN), un tipo di globuli bianchi abbondanti nel sangue umano, sono un'ottima fonte per isolare i neutrofili umani. Questo metodo elimina la necessità di prelevare il midollo osseo, migliorando così la sicurezza e l'efficienza.

I NET svolgono anche un ruolo nella fibrillazione atriale associata al rimodellamento cardiaco. Tuttavia, animali di grandi dimensioni come cani e maiali sono stati utilizzati per modellare la fibrillazione atriale, poiché i topi non hanno un atrio abbastanza grande da stabilire un ciclo di rientro o il modello AF, a meno che specifici canali ionici o vie di segnalazione non vengano abbattuti o eliminati¹². Mentre è possibile indurre la fibrillazione atriale nei ratti e isolare i neutrofili dal sangue periferico del ratto come descritto in precedenza, i ricercatori hanno riscontrato una limitazione per cui solo 2 x 10^5-5 x 10⁵ neutrofili potevano essere isolati dal sangue periferico (10 mL per ratto). L'estrazione di un numero sufficiente di NET in ogni punto temporale ha richiesto circa 10-25 ratti (5 x 10⁶ neutrofili in totale), con il risultato di un processo dispendioso in termini di tempo, costoso e spesso a basso rendimento¹³. A questo proposito, Li He e colleghi presentano una strategia orientata al midollo osseo per ottenere NET adeguati dai ratti¹⁴. Nel loro articolo, forniscono una descrizione completa dell'isolamento dei neutrofili dal midollo osseo di ratto e confrontano le capacità di secrezione NET dei neutrofili periferici e del midollo osseo di ratto. I due metodi delineati si rivolgono a obiettivi sperimentali distinti, entrambi risultando in quantità sufficienti di neutrofili del midollo osseo di ratto e riducendo il numero di ratti necessari. Il metodo di isolamento in due fasi ha dimostrato una purificazione dei neutrofili superiore, mentre il metodo in una fase si è dimostrato efficiente in termini di tempo con livelli di purificazione accettabili. Inoltre, i ricercatori hanno confrontato la NETosis e la formazione di NET tra i neutrofili del midollo osseo di ratto e le loro controparti periferiche, trovando la stessa potenza con PMN. Questi risultati contribuiscono in modo significativo agli studi sulla fibrillazione atriale relativi ai neutrofili e sottolineano l'importanza di selezionare in modo flessibile diverse fonti per l'isolamento dei neutrofili in vari animali da esperimento con diverse distribuzioni di neutrofili.

Lo studio è stato condotto nell'ambito di una licenza di progetto (n. 20211404A) concessa dal Comitato Etico Animale dell'Ospedale della Cina Occidentale, Università del Sichuan, in conformità con le linee guida del Comitato Etico degli Animali dell'Ospedale della Cina Occidentale, Università del Sichuan per la cura e l'uso degli animali. In conformità con le linee guida etiche, i ratti utilizzati in questo studio sono stati mantenuti in un ambiente controllato con un ciclo luce/buio di 12 ore, temperatura a 22-24 °C e umidità del 50%-60%. Ai ratti è stato dato accesso a cibo e acqua ad libitum. Gli animali utilizzati in questo studio erano ratti maschi Sprague Dawley (SD) di 6-8 settimane, del peso di circa 250 g e privi di agenti patogeni specifici. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Isolamento dei neutrofili di ratto

1. Prelievo di midollo osseo
   1. Mettere il ratto in un contenitore appropriato per l'anestesia (vedi Tabella dei materiali). Somministrare isoflurano al 3% al ratto fino a quando l'animale non è incosciente. Verificare l'assenza di una risposta a un pizzicamento delle dita dei piedi o della coda per garantire la profondità dell'anestesia.
   2. Una volta che il ratto è stato anestetizzato profondamente, eseguire la lussazione cervicale posizionando il ratto sulla schiena e tenendogli la coda con una mano mentre afferra la testa con l'altra mano. Lussare il collo in modo rapido e deciso applicando un'improvvisa e forte forza verso l'alto sulla coda mentre si tira la testa verso il basso fino a quando il rachide cervicale non viene reciso. Attendere la conferma del decesso, come la cessazione della respirazione e la mancanza di battito cardiaco, prima di procedere con la raccolta o lo smaltimento dei tessuti.
   3. Immergi il ratto in etanolo al 75% e lascialo riposare per alcuni minuti per sterilizzare il pelo e la pelle. Appoggia il ratto sulla schiena e recisci gli arti inferiori all'altezza dell'anca per proteggere la testa del femore. Usa le forbici da dissezione per tagliare il legamento all'articolazione del garretto e piega l'articolazione del ginocchio all'indietro per esporre il femore e la tibia.
   4. Usando pinze e forbici, rimuovi con cura muscoli, tendini e altri tessuti collegati alle ossa. Sciacquare le ossa con la soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) per rimuovere eventuali residui di tessuto e sangue. Ripetere l'operazione altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Mettere le ossa pulite in un contenitore sterile.
   5. Utilizzare una siringa da 5 o 10 ml con un ago per infilare il midollo attraverso entrambe le estremità dell'osso per allentare la matrice midollare. Sciacquare il midollo osseo con 10-15 mL di terreno di cura del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con un'altra siringa, fino a quando non è possibile eliminare il midollo osseo visibile.
   6. Centrifugare le cellule del midollo osseo a 300 x g per 10 minuti a 20 °C. Aggiungere 5-10 mL di tampone per lisi dei globuli rossi (vedere la tabella dei materiali) per risospendere le cellule e incubare a temperatura ambiente per 3 minuti. Aggiungere 4 volte il volume di HBSS alla miscela. Centrifugare le cellule a 600 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, scartare il surnatante con una pipetta e utilizzare il pellet risultante per un ulteriore utilizzo.
2. Isolamento di neutrofili dal midollo osseo
   1. Per il metodo in due passaggi, eseguire i seguenti passaggi aggiuntivi:
      1. Isolare le cellule del midollo osseo utilizzando il kit di isolamento dei neutrofili di ratto commercializzato seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
      2. Preparare un gradiente di densità stratificando 2 mL di reagente percoll al 55% (vedere Tabella dei materiali), 2 mL del reagente al 65%, 2 mL di reagente al 70% e 2 mL di reagente all'80% in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL. Centrifugare la provetta a 800 x g per 40 minuti a 20 °C, con l'accelerazione impostata su 5 e la decelerazione impostata su 0 o 1.
      3. Raccogliere lo strato di gradiente al 70%, compresi gli strati cellulari al confine tra il reagente di gradiente al 65% e il 70%, utilizzando una pipetta sterile. Trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL. Aggiungere 15 mL di HBSS nella provetta e capovolgere delicatamente la provetta più volte per lavare le cellule. Centrifugare la provetta a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule.
   2. Per il metodo in un solo passaggio, eseguire i seguenti passaggi aggiuntivi:
      1. Sottoporre le cellule del midollo osseo ai gradienti senza utilizzare il kit di isolamento dei neutrofili di ratto.
      2. Raccogliere lo strato di gradiente del 70%, compresi gli strati di cellule al confine tra il 65% e il 70% di gradiente, utilizzando una pipetta sterile. Trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga da 50 mL e lavare le cellule con HBSS. Centrifugare la provetta a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule.
      3. Contare i neutrofili isolati utilizzando un emocitometro e valutare la vitalità utilizzando la colorazione con blu di tripano.
         NOTA: Il protocollo può essere modificato a seconda del numero di ratti e del numero desiderato di neutrofili isolati. Una quantità accettabile di ossa è ottenuta da tre ratti quando questo metodo viene utilizzato per la prima volta in un nuovo ambiente sperimentale. Tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili. L'isolamento dei neutrofili dal midollo osseo deve essere eseguito il più rapidamente possibile per ridurre al minimo il danno cellulare e la perdita di vitalità.

2. Acquisizione di NET per ratti

1. Risospendere 0,5 x 10^8-1 x 10⁸ neutrofili isolati in terreni RPMI da 4 mL (integrati con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina) in una capsula di Petri sterile da 10 cm.
2. Aggiungere 500 nM di PMA (vedi Tabella dei Materiali) alla sospensione dei neutrofili per indurre NETosis. Incubare per 3 ore a 37 °C e 5% di CO₂ .
3. Per il controllo negativo, aggiungere DNasi I (10 U/mL) nella sospensione dei neutrofili per degradare i NET secreti.
4. Per raccogliere i NET, rimuovere il terreno e lavare delicatamente i NET attaccati alla capsula di Petri con HBSS. Quindi, utilizzare un lavaggio intenso con 4 ml di terreno fresco per ciascuna piastra per staccare i NET dalla piastra.
5. Raccogliere frequentemente il mezzo di lavaggio e la pipetta per una risospensione completa dei NET.
6. Centrifugare la sospensione a 300 × g per 10 minuti a 20 °C per rimuovere eventuali cellule galleggianti.
7. Trasferire la sospensione contenente i NET in una provetta sterile e conservare a -20 °C per un ulteriore utilizzo entro 2 settimane.
   NOTA: I NET sono sensibili alla degradazione, quindi si consiglia di utilizzare materiale appena raccolto per ottenere i migliori risultati.

3. Verifica della presenza di NET

1. Fissare le cellule (dal punto 2.4) su vetrini coprioggetti con paraformaldeide al 4% per 15 minuti e NET (dal punto 2.7) per 30 minuti a 1 ora.
2. Capovolgere il vetrino coprioggetto su una gocciolina PBS/PBST su un supporto per provette ricoperto di film di paraffina e ripetere il processo di lavaggio tre volte per 5 minuti ciascuna.
3. Permeabilizzare le cellule con Triton-X-100 allo 0,5% per 10 minuti a temperatura ambiente e lavare tre volte in PBS/PBST per 1 minuto ciascuna. Sigillare le celle con il siero d'asina normale al 10% (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente per 1 ora.
4. Incubare le cellule con l'anticorpo anti-elastasi neutrofila di ratto e l'anticorpo anti-mieloperossidasi di ratto (vedere Tabella dei materiali) per una notte a 4 °C. Quindi, lavare il vetrino coprioggetti in PBS/PBST tre volte per 5 minuti ciascuna.
5. Incubare le cellule con l'anticorpo secondario A488-coniugato asino anti-coniglio IgG (H + L), A594-coniugato asino anti-topo IgG (H + L) e A594-coniugato capra anti-topo IgG1 (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente per 1 ora al buio. Quindi, lavare il vetrino coprioggetti in PBS/PBST tre volte per 5 minuti ciascuna.
6. Colorare i nuclei cellulari e gli scheletri NET con 10 mg/mL di DAPI. Quindi, lavare il vetrino coprioggetti in PBS/PBST tre volte per 5 minuti ciascuna.
7. Posizionare una goccia di mezzo di montaggio su un vetrino e capovolgere il vetrino coprioggetto con le celle su di esso. Lasciare asciugare per 1 h per l'analisi microscopica con lenti ad immersione; in caso contrario, è pronto per l'ispezione.
   NOTA: È necessario prestare molta attenzione quando si manipolano i NET, anche dopo il fissaggio, poiché sono estremamente fragili e possono essere facilmente persi durante la preparazione.

4. Quantificazione delle NET

1. Preparare il tampone Tris-EDTA (TE) e la soluzione di lavoro PicoGreen (reagente del saggio dsDNA) secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
2. Preparare gli standard diluendo il DNA madre a concentrazioni di 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL e 1 μg/mL.
   NOTA: Per quantificare la concentrazione di NET, è stato utilizzato il kit per il test del dsDNA (vedere la tabella dei materiali), aderendo alle linee guida del produttore. I reagenti del tampone Tris-EDTA (TE) e del dsDNA sono stati preparati utilizzando rispettivamente un volume di 19 volte di acqua bidistillata o un volume di 199 volte di tampone TE. Successivamente, sono state preparate soluzioni standard (1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL e 1 μg/mL) e ogni 50 μL del campione è stato combinato con 450 μL di tampone TE.
3. Aggiungere 50 μL di ciascun campione al tampone TE da 450 μL.
4. Aggiungere 100 μL di standard o campioni insieme a un volume uguale di soluzione di lavoro del reagente del saggio a ciascun pozzetto in una piastra a 96 pozzetti, inclusi standard e campioni.
5. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 2-5 minuti, evitando la luce diretta.
6. Leggere i campioni utilizzando un lettore di micropiastre a fluorescenza con uno spettro di emissione di circa 530 nm e uno spettro di assorbanza di circa 480 nm.
7. Calcolare la concentrazione di NET in ciascun campione utilizzando la curva standard generata dagli standard.

5. Analisi della secrezione di NET mediante citometria cellulare

1. Aggiungere la colorazione del nucleo (vedere la tabella dei materiali) alle cellule incubate nella piastra a 96 pozzetti per raggiungere una concentrazione finale di 10 ng/mL e incubare per 30 minuti.
2. Aggiungere alle cellule il colorante di DNA privo di cellule (cfDNA, vedere la tabella dei materiali) per raggiungere una concentrazione finale di 300 nM e incubare per 10 minuti.
3. Miscelare i coloranti fluorescenti mediante pipettaggio delicato. Non gettare il surnatante o lavare il pellet.
4. Caricare la piastra del campione nello strumento citometrico.
5. Impostare i parametri per la messa a fuoco e il tempo di esposizione per i diversi canali: blu (es: 377/50 nm, em: 470/22 nm), di solito con l'esposizione di 30.000 ms, verde (es: 483/32 nm, eM: 536/40 nm) di solito con l'esposizione di 5.000 ms.
6. Cattura immagini altamente uniformi dell'intera piastra su diversi canali.
7. Analizza il numero di coloranti del nucleo per diversi gruppi. Se sono simili, la secrezione di NET può essere determinata dal conteggio delle colorazioni di cfDNA.

Il protocollo qui delineato delinea due metodi distinti, ciascuno caratterizzato da una migliore purificazione o da passaggi semplificati. Entrambi i metodi hanno prodotto circa 0,5 x 108-1 x 108 neutrofili per ratto. L'analisi della citometria a flusso, utilizzando il kit di rilevamento dell'apoptosi dell'annessina V-FITC/PI, ha mostrato una vitalità cellulare superiore al 90%, paragonabile alle controparti murine e umane (Figura 1). Mentre la contaminazione dei linfociti sembrava inevitabile durante l'isolamento dei neutrofili dal midollo osseo, il metodo in due fasi ha dimostrato un livello di purezza superiore del 90% rispetto al 50% ottenuto dal metodo in una sola fase (Figura 2).

Risposte comparabili nella secrezione NET sono state distinguibili tra neutrofili periferici e del midollo osseo, indipendentemente dalla stimolazione della PMA (Figura 3). Inoltre, i NET di ratto hanno mostrato limitate capacità di reticolazione tra loro (Figura 4). Nel tentativo di approfondire il processo di NETosi dei ratti, il PMA è stato impiegato come induttore. I NET sono stati rilevati tramite colorazione del cfDNA e le immagini complete sono state acquisite utilizzando un analizzatore di imaging cellulare. In particolare, i neutrofili di ratto hanno mostrato una maggiore propensione alla NETosi spontanea rispetto ai neutrofili di topo e umani, anche senza stimolazione esterna. L'incubazione con PMA ha portato a un aumento del 10% del contenuto di cfDNA dopo 4 ore (Figura 5). Quando esposto a 500 nM di PMA, il midollo osseo di ciascun ratto ha prodotto una concentrazione finale di 8-12 μg/mL NET-DNA. È interessante notare che il contenuto intracellulare è stato estruso in modo incompleto nei neutrofili di ratto durante NETosis, con conseguente osservazione di numerosi componenti intracellulari. Inoltre, i NET di ratto hanno mostrato un'inclinazione a formare una pellicola simile a una garza a causa di una maggiore tendenza all'adesione, presentando un distinto aspetto simile a una nuvola.

Figura 1: Valutazione della vitalità dei neutrofili dall'isolamento del midollo osseo. La fonte ottimale per l'isolamento dei neutrofili di ratto è il midollo osseo, che facilita la successiva acquisizione della trappola extracellulare dei neutrofili. Questa figura è adattata da He et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Purificazione dei neutrofili dal sangue periferico e dal midollo osseo tramite colorazione di Wright-Giemsa. (A) Origine del sangue periferico. (B) Origine del midollo osseo attraverso il metodo one-step. (C) Origine del midollo osseo attraverso il metodo in due fasi. L'estrazione del midollo osseo è l'approccio preferenziale per l'isolamento dei neutrofili di ratto e la conseguente acquisizione di trappole extracellulari per neutrofili. Barra graduata = 20 μm. Ingrandimento = 400x. Questa figura è adattata da He et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Secrezione netta dopo incubazione con PMA o PMA + DNasi I. L'estrazione del midollo osseo rappresenta la via preferenziale per l'isolamento dei neutrofili di ratto e la successiva raccolta di trappole extracellulari per neutrofili. Questa figura è adattata da He et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi in immunofluorescenza. Colorazione immunofluorescente del nucleo (blu, A), MPO (verde, B) e immagine di unione (C). NET: Trappola extracellulare dei neutrofili; MPO: mieloperossidasi. L'estrazione del midollo osseo è il metodo preferito per l'isolamento dei neutrofili di ratto e la successiva raccolta di trappole extracellulari per neutrofili. Barra della scala = 50 μm. Ingrandimento = 200x. Questa figura è adattata da He et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Analisi completa del cfDNA tramite analizzatore di imaging cellulare in varie condizioni. Colorazione fluorescente del cfDNA (verde) e del nucleo (blu). L'estrazione del midollo osseo è l'approccio principale per l'isolamento dei neutrofili di ratto e la conseguente raccolta di trappole extracellulari per neutrofili. Barra della scala = 500 μm. Questa figura è adattata da He et al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.