Fabbricazione e caratterizzazione di organoidi di cancro del colon-retto da una linea cellulare SW1222 in una matrice peptidica autoassemblante ultracorta

Negli ultimi anni, i peptidi autoassemblanti (SAP) sono emersi come biomateriali promettenti per applicazioni di ingegneria tissutale. I SAPs possiedono proprietà uniche, tra cui la formazione spontanea di nanofibre, la biocompatibilità, la biodegradabilità e la non immunogenicità, che li rendono candidati interessanti per lo sviluppo di scaffold¹. I SAP sono stati precedentemente utilizzati insieme a vari tipi di cellule e, in particolare, i SAP ultracorti hanno facilitato l'incapsulamento delle cellule staminali, mantenendo la loro pluripotenza per periodi prolungati che comprendono più di 30 passaggi e con un'incidenza minima di aberrazioni cromosomiche ^2,3,4. Pertanto, l'adattamento dei SAP per il loro uso nella coltura di organoidi ha costituito un passo successivo razionale.

Gli organoidi sono strutture tridimensionali complesse che derivano da singole cellule pluripotenti. Queste strutture danno origine a vari tipi di cellule, che poi si auto-organizzano per replicare i processi di sviluppo della crescita embrionale e tissutale in vitro⁵. Questo quadro innovativo si è evoluto in uno strumento formidabile per le indagini in vitro, conservando in modo efficiente gli attributi genetici, fenotipici e comportamentali caratteristici degli organi in vivo ⁶. Tuttavia, uno dei principali ostacoli nella transizione dal laboratorio al letto del paziente dei risultati basati sugli organoidi è la necessità di riproducibilità⁷. Questa variazione nei risultati è principalmente attribuita alla difficoltà di differenziare completamente le cellule staminali pluripotenti umane in linee cellulari specializzate, aggravata dall'assenza di un'autentica architettura tissutale e dalla complessità intrinseca riscontrata nei modelli di organoidi. Data l'aumento della popolarità degli studi basati su cellule staminali e organoidi⁸, c'è stata un'escalation della domanda di biomateriali con proprietà meccaniche dinamiche e siti di adesione simili alle integrine o scaffold con degradabilità controllata ^7,9. Questi attributi possono essere efficacemente regolati attraverso l'utilizzo strategico di SAPs biofunzionalizzati.

I SAPs sono brevi sequenze di amminoacidi con la capacità intrinseca di organizzarsi spontaneamente in strutture ben definite¹⁰. Questi peptidi contengono spesso residui idrofobici e idrofili alternati, che guidano il loro autoassemblaggio attraverso interazioni non covalenti, tra cui il legame idrogeno, le interazioni elettrostatiche e gli effetti idrofobici^11,12. Il processo di autoassemblaggio di questi peptidi è guidato principalmente dalla necessità di ridurre al minimo l'energia libera del sistema. Quando si trovano in un ambiente acquoso, i residui idrofobi tendono ad aggregarsi per ridurre al minimo la loro esposizione all'acqua, mentre i residui idrofili interagiscono con le molecole d'acqua circostanti. Questo fenomeno porta alla formazione di varie nanostrutture. In questo caso, i peptidi autoassemblanti ultracorti formano nanofibre con caratteristiche che dipendono dalla sequenza peptidica e dalle condizioni ambientali 2,12,13,14,15,16. Questi peptidi adottano una conformazione a β giri, in cui i singoli filamenti peptidici si allineano parallelamente o antiparallelamente l'uno all'altro, stabilizzati da legami idrogeno (Figura 1). La presenza di ioni positivi accelera i processi di autoassemblaggio che portano alla formazione di nanofibre.

Le nanofibre peptidiche sono state identificate come dotate di una capacità innata di intrappolare volumi significativi di acqua. Questa caratteristica facilita la generazione di un idrogel, che successivamente si manifesta come uno spazio tridimensionale biocompatibile e biodegradabile favorevole alla proliferazione e alla crescita cellulare. Queste nanofibre peptidiche autoassemblanti emulano in modo intricato le caratteristiche topografiche inerenti all'ambiente della matrice extracellulare naturale (ECM)¹. Questa somiglianza conferisce alle cellule un ambiente che imita il loro habitat fisiologico, promuovendo ulteriormente attività cellulari ottimali¹⁷. Inoltre, la versatilità intrinseca di questi peptidi consente un notevole grado di sintonizzabilità⁴. Tale adattabilità consente di modificare le proprietà della matrice, come la rigidità, la cinetica di gelificazione e la porosità. Questi adattamenti si ottengono attraverso modifiche alla sequenza peptidica. Di conseguenza, i peptidi autoassemblanti (SAP) sono emersi come componenti fondamentali nella scienza contemporanea dei biomateriali, ampiamente utilizzati come scaffold per la rigenerazione dei tessuti e la coltura cellulare^13,17.

Uno dei vantaggi critici dei peptidi autoassemblanti è la loro capacità di essere facilmente sintetizzati e modificati a livello molecolare. Questo vantaggio consente l'incorporazione di specifici gruppi funzionali o motivi bioattivi nella sequenza peptidica, consentendo la progettazione di peptidi con proprietà e funzionalità su misura 18,19,20 (Figura 1B). Ad esempio, i SAP biofunzionalizzati possono essere progettati per imitare la MEC e promuovere la differenziazione utilizzando il peptide RGD ^19,21. È stato anche riportato che il peptide Ben-IKVAV aumenta significativamente l'espressione di marcatori neuronali specifici a causa della sua motiety ligando-specifica²². Questi peptidi possono anche essere ingegnerizzati per mostrare molecole bioattive, come i peptidi leganti le integrine, per migliorare la sopravvivenza cellulare²³. Infine, altri SAPs biofunzionalizzati sono stati sviluppati per promuovere l'angiogenesi includendo i motivi IKVAV e YIGSR nelle loro strutture²⁴.

I SAP biofunzionalizzati riportati in una precedente pubblicazione mostrano che l'autoassemblaggio può essere ulteriormente modificato includendo il peptide naive da cui è derivato il SAP biofunzionalizzato²⁵. Queste miscele SAP possono anche fornire un'ampia gamma di formulazioni SAP che variano nella loro attività biochimica e proprietà fisico-chimiche. Ad esempio, il peptide anfifilico IIFK è un SAP ultracorto in grado di resistere alla biofunzionalizzazione con vari motivi, esemplificati dall'incorporazione del motivo IKVAV (Figura 1B). Entrambi i peptidi possono formare nanofibre, sia da soli che combinati. Ogni formulazione si traduce in idrogel con proprietà fisiche variabili (Figura 2)

Tuttavia, a causa dell'ampia gamma di potenziali permutazioni e alternative ottenute dalla biofunzionalizzazione dei SAP, è necessario fornire un'opzione rapida ed economica per l'analisi degli organoidi. Un candidato per tale valutazione intensiva ed economica degli organoidi è la linea cellulare SW1222, derivata dall'adenocarcinoma colorettale umano ^26,27. Le cellule SW1222 possiedono caratteristiche che ne consentono l'aggregazione in strutture 3D simili a organoidi, rendendole un modello ideale per lo studio dello sviluppo dei tessuti e delle applicazioni di medicina rigenerativa. Le cellule SW1222 sono state identificate come in grado di generare organoidi a causa della loro intrinseca sovraespressione del gene LGR5 ²⁷. La creazione di organoidi da singole cellule staminali LGR5⁺ è stata dimostrata in modo convincente in precedenza, così come la propensione delle cellule SW1222 a raggiungere le caratteristiche morfologiche di un organoide di cancro del colon-retto²⁸.

In questo articolo sui metodi, presentiamo protocolli dettagliati per valutare e caratterizzare gli effetti di vari peptidi biofunzionali sull'adesione cellulare e sulla formazione del lume utilizzando cellule SW1222 (Figura 3). Fornendo procedure passo-passo e metodi di analisi dell'imaging, speriamo di offrire preziose informazioni sulla biofabbricazione di organoidi e sulla valutazione di matrici SAP semplicistiche per la coltura di organoidi.

1. Preparazione del tampone e della soluzione

NOTA: Tutte le concentrazioni indicate sono concentrazioni finali.

1. Aggiungere siero fetale bovino (FBS) e penicillina-streptomicina a una concentrazione finale rispettivamente del 10% e dell'1% per preparare il terreno di Dulbecco modificato (IMDM) completo di Iscove. Conservare al buio a 4 °C per un massimo di 1 mese.
2. Mescolare MgCl₂ (3 mM), saccarosio (300 mM) e Triton X-100 (0,5%) in soluzione salina tampone fosfato (PBS) per preparare il tampone di permeabilizzazione. Conservare questa soluzione a 4 °C per un massimo di 2 mesi.
3. Combinare albumina sierica bovina (BSA, 1%), glicina (0,3 M) e Tween-20 (0,1%) in PBS per preparare un tampone bloccante. Conservare questa soluzione a 4 °C per un massimo di 2 mesi.
4. Diluire da 10 a 2 PBS con acqua ultrapura in condizioni sterili. Conservare questa soluzione a temperatura ambiente per oltre 6 mesi.
5. Sterilizzare 3 mg di polvere di peptidi sotto luce ultravioletta per 30 minuti. Aggiungere 500 μl di acqua ultrapura per sciogliere utilizzando un miscelatore a vortice.
   NOTA: La concentrazione finale deve essere il doppio della concentrazione target, ovvero 6 mg/mL, poiché la concentrazione 1x sarà di 3 mg/mL.

2. Fabbricazione di organoidi di cancro del colon-retto da SW1222 in peptide

1. Scongelare un'aliquota per una notte a 4 °C e tenerla in ghiaccio fino a quando non sarà necessario per preparare il controllo della matrice basamentale.
2. Posizionare una goccia da 10 μl di soluzione peptidica 2x al centro di ciascun pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Lasciare incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti. In alternativa, depositare 8-10 goccioline per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti.
   NOTA: I campioni destinati ad essere utilizzati in microscopia confocale ed elettronica sono più accessibili da manipolare se seminati sopra un vetrino coprioggetti sterile.
3. Aggiungere 10 μl di 2x PBS. Mescolare delicatamente la soluzione PBS utilizzando la punta. Lasciare stabilizzare i gel per almeno 20 minuti, assicurandosi che le goccioline rimangano quasi intatte.
   NOTA: L'obiettivo dell'aggiunta di PBS e della miscelazione delicata è mantenere l'integrità della gocciolina ed evitare di diffondere l'idrogel in uno strato.
4. Staccare le cellule SW1222 utilizzando una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,125% (5 mL). Incubare le cellule con tripsina a 37 °C per 5-10 minuti fino a quando non si staccano dal pallone. Astenersi dal picchiettare il pallone per evitare la formazione di grumi cellulari.
5. Aggiungere 5 mL di terreno completo per inattivare la tripsina. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro cellulare da 30 μm. In alternativa, utilizzare una siringa con un ago da 25 G per disgregare gli aggregati.
6. Preparare una sospensione cellulare di 0,4 × 10-6 cellule/mL e iniettare 2 μL della sospensione cellulare in ciascuna gocciolina peptidica utilizzando una micropipetta da 10 μL.
7. Incubare le goccioline per 30 minuti a 37 °C, 5% CO_2. Aggiungere 0,5 mL di terreno integrato a ciascun pozzetto dopo l'incubazione.
8. Nell'attesa, preparare il controllo della matrice della membrana basale diluendo lo stock principale (8-12 mg/mL, a seconda del lotto) a una concentrazione finale di 3 mg/mL utilizzando il terreno integrato. Aggiungere cellule a questa soluzione (800 cellule per 25 μl).
   NOTA: La manipolazione della membrana basale deve essere eseguita sempre sul ghiaccio. Le punte devono essere sciacquate con PBS ghiacciato prima di toccare l'idrogel. In caso contrario, la polimerizzazione avverrà all'interno delle punte.
9. Piastra 20 μL di goccioline della soluzione della membrana basale in ciascun pozzetto. Lasciare gelificare le goccioline incubando per 20 minuti a 37 °C. Dopo che il materiale è gelificato, aggiungere 0,5 ml di terreno completo.
10. Cambia il mezzo ogni 3-4 giorni. Osservare le cellule che si organizzano e mostrano segnali di formazione del lume già dal giorno 4.
11. Immagine delle cellule in campo chiaro il giorno 1, il giorno 4 e il giorno 7 per valutare la crescita degli organoidi.

3. Vitalità e proliferazione

1. Preparare tre piastre a pozzetti neri per il test di vitalità e tre piastre a pozzetti neri per il test di proliferazione. Aggiungere 25 μl di soluzione peptidica 2x per pozzetto e gelificare utilizzando lo stesso volume di 2x PBS. Semina le celle come descritto sopra.
2. Preparare tre pozzetti per ogni formulazione di idrogel peptidico da utilizzare come spazi vuoti nella piastra di proliferazione. Non seminare cellule su questi.
3. Rimuovere il terreno dalla piastra del pozzetto di vitalità e lavare con 1x PBS per 3 x 5 min.
4. Diluire la calceina-AM e l'omodimero di etidio a 8 μM dal kit di vitalità/citotossicità per cellule di mammifero (vedere la tabella dei materiali) nella stessa provetta conica protetta dalla luce. Per preparare 2 mL di questa soluzione in 2 mL di PBS in una provetta conica protetta dalla luce, aggiungere 4 μL della soluzione madre Calcein-AM e 8 μL della soluzione madre dell'omodimero di etidio-1.
5. Aggiungere la soluzione di omodimero calceina/etidio preparata al punto 3.4 alla piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 100 μl per pozzetto. Proteggere dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
6. Lavare per 3 x 5 minuti con 1x PBS. Acquisire un minimo di tre campi (centro, alto, basso) quando si utilizza un obiettivo 4x o un minimo di cinque campi (centro, in alto a sinistra, in alto a destra, in basso a sinistra, in basso a destra) quando si utilizza un obiettivo 10x e 20x con un microscopio a fluorescenza.
7. Rimuovere il terreno dalla piastra a pozzetti di proliferazione per garantire un volume finale di 90 μl.
8. Aggiungere 10 μl di soluzione Alamar Blue (vedi Tabella dei materiali) per raggiungere una concentrazione finale del 10%.
9. Proteggere dalla luce e incubare per 2-4 ore a 37 °C, 5% CO₂
10. Utilizzare un lettore di piastre a pozzetti per misurare la fluorescenza (Ex/Em = 530-560/590 nm/nm) o l'assorbanza (570 nm). Fare la media dei valori ottenuti per gli spazi vuoti e sottrarli dai valori di ciascun pozzetto che contiene celle.
11. Calcola i valori di proliferazione facendo la media del segnale di ciascuna condizione e sottraendo la media dei rispettivi spazi vuoti. Crea grafici generando un box plot indicizzato del segnale di assorbanza/fluorescenza relativa rispetto al tempo.

4. Saggio di aderenza delle cellule alla matrice

1. Preparare 100 μl di idrogel peptidici in due piastre indipendenti da 96 pozzetti.
2. Seminare 20.000 cellule in ogni pozzetto e aggiungere 100 μL di terreno. Incubare le piastre per 90 minuti a 37 °C, 5% CO₂.
3. Dopo l'incubazione, prelevare una sola piastra e risospendere con cura il terreno utilizzando una micropipetta P200 per 20-30 s. Fare attenzione a non interrompere l'idrogel tenendo la punta lontana dal gel. In alternativa, se le proprietà meccaniche dell'idrogel lo consentono (G' > 8.000 Pa), picchiettare i quattro lati della piastra del pozzetto utilizzando un vortice mobile.
   NOTA: La risospensione del terreno (o il picchiettamento della piastra del pozzetto con il vortice) rimuoverà sia le cellule non attaccate che le cellule con tenue adesione alla superficie della matrice. L'attacco cellulare avverrà entro 90 minuti, anche se la forza di questo attacco varierà a seconda degli specifici idrogel peptidici e delle loro proprietà adesive e leganti. È noto che la crescita degli organoidi colorettali è favorita in matrici con valori di rigidità inferiori a 2.000 Pa. Quindi, poiché gli idrogel presentati in questo protocollo sono morbidi e fragili, ci impegniamo a utilizzare uno stress meccanico delicato.
4. Rimuovere 100 μl di terreno da entrambe le piastre a pozzetti e aggiungere il lavaggio una volta con 1x PBS.
5. Preparare una soluzione DAPI da 1 μg/mL. Aggiungere 100 μl della soluzione DAPI a tutti i pozzetti e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
6. Immagine di un numero rappresentativo di campi al microscopio a fluorescenza. Assicurati che tutte le immagini siano ottenute utilizzando lo stesso obiettivo per mantenere costante il rapporto pixel/distanza.
   NOTA: Immagine di nove campi per un obiettivo 10x o 15 campi con un obiettivo 20x.
7. Caricare le immagini a fluorescenza sul software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ) e analizzare le particelle su tutte le immagini.
   1. Dal menu Immagine , selezionare Tipo e fare clic su 8 bit.
   2. Dal menu Immagine , selezionare Regola e fare clic su Luminosità/Contrasto. Fare clic sul pulsante Auto | Applicare.
   3. Dal menu Immagine , selezionare Regola e fare clic su Soglia. Fare clic sul pulsante Auto e chiudere la finestra.
   4. Dal menu Analizza, fare clic su Analizza particelle. Spuntare l'opzione per riassumere e fare clic su OK.
   5. Nella finestra Riepilogo , passare il mouse sul menu File e fare clic su Salva per salvare i valori di riepilogo.
8. Esporta i risultati di tutte le immagini in un software di statistica standard.
9. Calcola la percentuale di area coperta dalle celle prima e dopo lo stress. Crea un box plot indicizzato della percentuale di area rispetto a ciascuna condizione.

5. Immunocolorazione di organoidi in idrogel peptidico

1. Seminare 800 cellule in goccioline da 20 μL di idrogel peptidico per 4 giorni, come descritto nei passaggi 2.1-2.10.
2. Il giorno 4, rimuovere il terreno e lavare ogni pozzetto 2 volte usando 1 PBS.
3. Aggiungere 400 μl di una soluzione di formaldeide al 4%. Incubare la piastra a pozzetti per 30 minuti a temperatura ambiente.
4. Rimuovere la soluzione di formaldeide con un P1000 e lavare una volta con 1x PBS.
5. Aggiungere 1 mL di tampone di permeabilizzazione e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
6. Rimuovere il tampone di permeabilizzazione con un P1000 e lavare una volta con 1x PBS.
7. Aggiungere 0,5 mL di tampone bloccante e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
8. Rimuovere il tampone di blocco con un P1000 e lavare con 1x PBS.
9. Diluire l'anticorpo primario nel tampone bloccante secondo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali). Aggiungere 200 μl in due pozzetti.
10. Incubare per una notte a 4 °C.
11. Rimuovere la soluzione colorante con un P200 e lavare una volta con 1x PBS.
12. Diluire l'anticorpo secondario nel tampone bloccante, secondo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei Materiali). Aggiungere il coniugato falloidina in un rapporto di 1:40 nella soluzione di anticorpi secondari.
13. Proteggere dalla luce e incubare a temperatura ambiente per non più di 3 ore. Rimuovere la soluzione colorante con un P200 e lavare una volta con 1x PBS.
14. Preparare una soluzione DAPI di 1 μg/mL nel tampone bloccante. Aggiungere 300 μl della soluzione DAPI a ciascun pozzetto.
15. Proteggere dalla luce e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
16. Rimuovere la soluzione colorante con un P200 e lavare una volta con 1x PBS.
17. Proteggere dalla luce e conservare a 4 °C per un massimo di 7 giorni.

6. Imaging e analisi di immagini di organoidi in matrice

1. Visualizzare i campioni colorati utilizzando un microscopio a epifluorescenza a 10x. Utilizzare solo i canali falloidina e DAPI.
2. Apri il software Cellopose e premi ctrl + L per caricare un'immagine. Poiché il software avrà accesso a tutti i file nella posizione dell'immagine selezionata, assicurati di salvare tutte le immagini a fluorescenza nella posizione esatta senza avere sottocartelle.
3. Digitare il diametro medio delle colonie nel pannello Segmentazione e fare clic su INVIO.
4. Seleziona un modello personalizzato per gli organoidi del colon e fai clic sul pulsante Esegui modello .
   NOTA: Qui, suggeriamo di utilizzare due modelli da zero in Cellpose2.0^29,30
5. Premi ctrl + s per salvare le maschere come file .npy.
6. Utilizzare le frecce della tastiera per spostarsi tra le immagini della cartella ed eseguire il modello per gli organoidi dei due punti su tutte le immagini nella cartella.
7. Fare una copia della cartella e ripetere i passaggi 6.2-6.6 utilizzando un modello per il lume dell'organoide del colon.
8. Apri ImageJ e fai clic su Plugin | Macro | Correre... per eseguire il file imagej_roi_converter.py disponibile dal sito Github di Cellpose e attendere che appaia una finestra.
9. Seleziona il primo file dalla cartella dell'organoide dei due punti e fai clic su Apri.
10. Selezionare il file seg.npy corrispondente al primo file e fare clic su Apri.
    NOTA: ImageJ convertirà le maschere in regioni di interesse e le sovrapporrà alle immagini a fluorescenza corrispondenti.
11. Fai clic su Seleziona tutto nella finestra ROI Manager , quindi fai clic su Misura.
12. Fare clic su File | Salva con nome... nella finestra Risultati e salvare i risultati.
    NOTA: Ciò si tradurrà in un file .csv contenente tutte le proprietà di forma di ciascuna colonia nel campo.
13. Ripetere i passaggi 6.8-6.12 per la stessa immagine nella cartella per il lume dell'organoide del colon.
14. Carica OriginPro e premi ctrl + 3 per aprire l'Importazione guidata. Fare clic sul pulsante con i tre punti e selezionare entrambi i file .csv corrispondenti alle proprietà dell'organoide e della forma del lume per la stessa immagine.
15. Copia e incolla i risultati delle proprietà della forma del lume in una colonna accanto ai risultati della colonia per assicurarti che ogni misurazione del lumen sia abbinata alla rispettiva colonia.
16. In una nuova colonna, dividere le aree del lume e della colonia per ottenere l'area del lume relativo della colonia che lo contiene.
17. Selezionare la colonna corrispondente alla circolarità di ciascuna colonia e all'area del lumen. Clicca su Trama | Base 2D | Dispersione.
18. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra del grafico e selezionare Dettagli grafico. Fare clic sulla scheda Centroide (PRO) e selezionare le opzioni che leggono Mostra punto centroide per sottoinsieme, Connetti a punti dati e Mostra ellisse.

In primo luogo, abbiamo valutato le cellule cresciute in una piastra a 24 pozzetti per 7 giorni utilizzando l'imaging in campo chiaro. Abbiamo identificato piccoli gruppi di cellule che si assemblano in organoidi durante la settimana, come si vede nella Figura 4. Un metodo di scansione controllata può seguire la mobilità delle cellule e degli organoidi tra i diversi giorni. In generale, abbiamo osservato l'evoluzione della morfologia delle cellule durante l'intera settimana. Gli organoidi derivati da SW1222 dovrebbero avere una morfologia rotonda e un aspetto leggero. Un aspetto più scuro indica una densità cellulare indesiderata più elevata, come si vede in alcune delle colonie coltivate nel peptide P, giorno 7 (Figura 4).

La Figura 5 mostra i risultati dei saggi di vitalità cellulare (Figura 5A) e di proliferazione (Figura 5B), che indicano rispettivamente la quantità di cellule morte e vive e l'attività metabolica. Qui, abbiamo utilizzato un saggio di vitalità basato su calceina ed etidio omodimero e abbiamo notato che queste cellule mostravano una piccola popolazione di cellule morte entro il giorno 7 quando coltivate in Matrigel. Questo fenomeno era presente anche in tutti gli idrogel a base di peptidi ma non nella coltura 2D. I risultati della proliferazione hanno mostrato un aumento totale dell'attività metabolica tra il giorno 1 e il giorno 7. Inoltre, abbiamo riscontrato lievi diminuzioni dell'attività tra il giorno 4 e il giorno 7 per diverse condizioni. Questa osservazione è correlata all'aumento della popolazione di cellule morte osservato nel test di vitalità (Figura 5A).

Per una valutazione preliminare dell'interazione tra le cellule e della biofunzionalizzazione degli idrogel peptidici, abbiamo eseguito un saggio di adesione basato sullo stress meccanico per indurre il distacco cellulare. Come si può osservare in Figura 6, l'uso di diverse concentrazioni del peptide biofunzionale P2 ha influenzato significativamente il numero di cellule trattenute prima e dopo il processo di distacco. Qui, abbiamo usato un peptide che contiene solo il motivo biofunzionale del peptide P2 come controllo positivo. Abbiamo anche usato il peptide non biofunzionale P come controllo negativo. Come si può osservare nel grafico, le cellule seminate nel peptide P avevano un'adesione iniziale relativamente bassa e un basso valore di ritenzione. Inoltre, la variazione del rapporto del peptide biofunzionale P2 era correlata alla quantità di cellule trattenute dopo lo stress. Quindi, utilizzando questo saggio, possiamo concludere che il peptide P2 ha influenzato l'adesione cellulare che può o non può essere guidata dal motivo biofunzionale, ma è stata correlata con la quantità di peptide biofunzionale presente nella miscela.

Quindi, abbiamo studiato l'effetto delle matrici negli organoidi fabbricati. Abbiamo valutato la circolarità della colonia e la dimensione relativa del lume rispetto alla dimensione della colonia eseguendo analisi di forma di campioni colorati con citoscheletro coltivati per 4 giorni. I punti dati avevano una particolare distribuzione lungo gli assi x e y e ogni condizione aveva un baricentro con un valore particolare per la circolarità e l'area relativa del lume. La Figura 7 mostra che le cellule coltivate in 2D avevano una variazione molto elevata nella circolarità delle colonie. Al contrario, le cellule coltivate in Matrigel avevano una distribuzione più estesa per la dimensione relativa del lume.

È interessante notare che i valori del centroide per tutti gli idrogel contenenti peptidi avevano una posizione molto simile. Tuttavia, la distanza tra i punti dati mostrava profili di distribuzione diversi. Ad esempio, il peptide P3 aveva una distribuzione più piccola tra i tre idrogel peptidici, mentre i punti dati del peptide P non biofunzionale sembravano avere una distribuzione più ampia. Questi dati suggeriscono che entrambi gli idrogel con P1 e P3 hanno il potenziale per essere ottimizzati per la coltura di organoidi.

Infine, abbiamo valutato l'espressione di marcatori specifici utilizzando l'immunocitochimica su un campione colorato per i marcatori apicali ZO-1 ed ezrin. Questi marcatori hanno permesso di valutare la polarizzazione delle cellule all'interno di ciascun organoide. Abbiamo anche valutato i marcatori di pan caderina per visualizzare le giunzioni cellula-cellula e un marcatore specifico del citoscheletro (falloidina) per visualizzare il lume. La Figura 8A mostra gli organoidi trovati nel peptide P, nel peptide P1 biofunzionalizzato e nel Matrigel il giorno 4 e il giorno 7. I marcatori ZO-1 ed ezrin devono essere localizzati all'interno delle membrane apicali e basolaterali dell'organoide; Una corretta polarizzazione cellulare ci permetterà di osservare l'espressione di entrambe le molecole entro il giorno 4 vicino all'area del lume, altrimenti invisibile. Infatti, come si vede in Figura 8, i marcatori ZO-1 e ezrin erano localizzati nelle membrane apicali degli organoidi coltivati in Matrigel. È interessante notare che i marcatori ezrin erano appena visibili nel peptide non biofunzionale P. Da ciò, deduciamo che l'inefficiente polarizzazione delle cellule ha portato a una bassa espressione di queste molecole nel peptide P.

Inoltre, la dispersione dei nuclei tendeva ad essere irregolare negli idrogel peptidici, mentre gli organoidi incorporati in Matrigel formavano un unico strato asimmetrico di nuclei. Questa descrizione corrisponde alla morfologia ideale per un organoide colorettale; tuttavia, sebbene l'orientamento dei nuclei non fosse completamente asimmetrico negli idrogel peptidici, colonie più dense con multistrati di nuclei sono state trovate principalmente nel peptide non biofunzionale P. Al contrario, le giunzioni cellula-cellula devono essere localizzate perpendicolarmente alle membrane apicali e basolaterali (Figura 8B). Questo marcatore ci ha permesso di osservare i bordi di tutte le cellule situate all'interno della colonia. Quando sono cresciute a Matrigel, le cellule avevano una distribuzione quasi perfettamente radiale di pan-caderina (giunzioni cellula-cellula) entro il giorno 7. Al contrario, le colonie non polarizzate, come quelle del peptide P, presentavano una disposizione disordinata delle cellule e l'espressione di giunzioni cellula-cellula vicino alla membrana basale e apicale.

Figura 1: Peptidi autoassemblanti ultracorti che formano nanofibre. (A) Rappresentazione del processo di autoassemblaggio per peptidi ultracorti alifatici. (B) Struttura chimica di SAP IIFK ultrashort biofunzionalizzato con il ligando IKVAV. Questa cifra è stata modificata da Loo et al.4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Struttura e proprietà dei peptidi. (A) Vengono illustrate le strutture chimiche del peptide genitore IIFK e del peptide biofunzionale P2. (B) I risultati del test della fiala invertita rivelano differenze critiche nella concentrazione di gelificazione e nel tempo di gelificazione. P2 forma un gel traslucido con un CGC più alto rispetto al peptide genitore IIFK. In particolare, la miscela IIFK:P2 (1:1) mostra un CGC ancora più elevato e un tempo di gelificazione più lungo rispetto a entrambi i peptidi da soli. (C) Le micrografie elettroniche a scansione forniscono informazioni visive sulle caratteristiche strutturali di IIFK, P2 e della miscela IIFK:P2 (1:1). (D) Le immagini topografiche dell'altezza della microscopia a forza atomica raffigurano i peptidi gelati a una concentrazione di 8 mM, offrendo una visione dettagliata delle loro caratteristiche superficiali. (E) La spettroscopia circolare di dicroismo rivela i cambiamenti conformazionali della miscela IIFK:P2 a varie concentrazioni, facendo luce sulle loro alterazioni di struttura secondaria. (F) Le analisi reologiche misurano la rigidità dei peptidi gelati a diverse concentrazioni, fornendo preziose informazioni sulle loro proprietà meccaniche. Questa figura è riprodotta da Perez-Pedroza et al.25. Barre di scala = 1 μm (C), 200 nm (D). Abbreviazione: CGC = concentrazione critica di gelificazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Diagramma che illustra la preparazione dei peptidi e la semina cellulare per la fabbricazione e la caratterizzazione degli organoidi in base alla vitalità, all'adesione, alla capacità di formazione degli organoidi e all'immunocolorazione negli idrogel peptidici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Immagini di microscopia in campo chiaro acquisite da cellule SW1222 coltivate all'interno di idrogel peptidici marcati come P e P1 rispetto al controllo Matrigel. È interessante notare che gli organoidi coltivati negli idrogel peptidici manifestano una morfologia prevalentemente sferica entro il settimo giorno. Al contrario, quelli situati all'interno del Matrigel sembrano mostrare una densità cellulare inferiore, che può essere identificata dal loro corpo luminoso, rispetto al corpo scurito della coltura di organoidi in SAP (punte di freccia nere). Tuttavia, mostrano un apparente raggruppamento tra colonie adiacenti. Inoltre, diventa evidente che la capacità migratoria delle cellule all'interno dell'ambiente Matrigel è relativamente diminuita. Barre di scala = 650 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Saggi di vitalità e proliferazione di cellule SW1222 in SAP biofunzionalizzato a varie concentrazioni. (A) Valutazione della vitalità di cellule coltivate in peptidi biofunzionali P1 e P2, rispetto a Matrigel e 2D. (B) Valutazione della proliferazione di colture cellulari in peptide non biofunzionale P1 e peptide biofunzionale P2, rispetto a Matrigel e controlli 2D. Qui, vediamo un comportamento simile a quello delle cellule che crescono in Matrigel per il saggio vivo/morto. Un leggero aumento delle cellule morte (punte di freccia gialle) si riscontra in diverse condizioni, principalmente Matrigel. Per la proliferazione, le tendenze variano a seconda del tipo e della concentrazione del peptide, ma in generale c'è una tendenza positiva. Barre di scala = 250 μm. Questa figura è stata adattata da Perez-Pedroza et al.25. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Effetti del peptide sul numero di cellule staccate. (A) Immagini a fluorescenza di cellule colorate con DAPI prima e dopo lo stress meccanico. Qui usiamo il peptide P, il peptide modificato P2 e il motivo IKVAV. (B) La variazione dell'adesione cellulare è stata determinata misurando l'area coperta in ImageJ. L'analisi comparativa ha rivelato che il peptide biofunzionalizzato P2 aveva una capacità di ritenzione maggiore rispetto al peptide non biofunzionale P. Barre di scala = 100 μm. Questa figura è stata adattata da Perez-Pedroza, et al.25. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Valutazione della capacità di formazione degli organoidi mediante calcolo del centroide dell'area relativa del lume rispetto alla circolarità. Il centroide e la dispersione dei dati variavano tra i trattamenti. Come previsto, la condizione peggiore è stata quella delle misurazioni 2D, che si sono espanse in un ampio intervallo di valori di circolarità e avevano l'area relativa più bassa del lume. Matrigel aveva non solo la circolarità più alta, ma anche il lume più grande. Le condizioni peptidiche variavano leggermente in entrambi i valori, ma la condizione P3 presentava la variazione più trascurabile dei dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Immagini al microscopio confocale di organoidi al giorno 4 e al giorno 7 per vari marcatori. (A) I marcatori ZO-1 (verde), ezrin (rosso) e DAPI (blu) vengono utilizzati per trovare la distribuzione apicale delle cellule all'interno degli organoidi. Come visto nel controllo di Matrigel, queste molecole sono tipicamente localizzate nelle membrane apicali e basolaterali. Il peptide non biofunzionale P mostra l'espressione di queste molecole solo entro il giorno 7. (B) I marcatori di giunzione cellula-cellula colorati con anticorpi pan-caderina (verde) devono essere perpendicolari alle membrane basolaterali e apicali degli organoidi. I nuclei cellulari (blu) e il citoscheletro (rosso) sono usati come controcolorazione. Il peptide P non biofunzionale induce l'espressione della giunzione cellula-cellula nella membrana basolaterale, contrariamente agli altri due trattamenti (P3 e Matrigel). Barre di scala = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.