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Articolo metodologico

Fabbricazione e caratterizzazione di organoidi di cancro del colon-retto da una linea cellulare SW1222 in una matrice peptidica autoassemblante ultracorta

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⸱

DOI:

10.3791/66060

⸱

3 maggio 2024

 ,  , 
1Laboratory for Nanomedicine, Biological & Environmental Science & Engineering, King Abdullah University of Science and Technology, 2Computational Bioscience Research Center, King Abdullah University of Science and Technology, 3Red Sea Research Center, King Abdullah University of Science and Technology

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo mira a valutare peptidi biofunzionali autoassemblanti per l'adesione cellulare, la morfologia degli organoidi e l'espressione genica mediante immunocolorazione. Utilizzeremo una linea cellulare di cancro del colon-retto per fornire un modo economico per ottenere organoidi per test intensivi.

Abstract

I peptidi autoassemblanti ultracorti (SAP) possono formare spontaneamente nanofibre che assomigliano alla matrice extracellulare. Queste fibre consentono la formazione di idrogel biocompatibili, biodegradabili e non immunogenici. Abbiamo precedentemente dimostrato che i SAP, quando biofunzionalizzati con motivi derivati da proteine, possono imitare le caratteristiche della matrice extracellulare che supportano la formazione di organoidi colorettali. Questi idrogel peptidici biofunzionali mantengono le proprietà meccaniche, la sintonizzabilità e la stampabilità del peptide genitore originale, incorporando segnali che consentono alle interazioni cellula-matrice di aumentare l'adesione cellulare. Questo articolo presenta i protocolli necessari per valutare e caratterizzare gli effetti di vari idrogel peptidici biofunzionali sull'adesione cellulare e sulla formazione del lume utilizzando una linea cellulare di adenocarcinoma tumorale in grado di formare organoidi di cancro del colon-retto in modo economico. Questi protocolli aiuteranno a valutare gli effetti biofunzionali dell'idrogel peptidico sull'adesione cellulare e sulla formazione di luminali utilizzando l'immunocolorazione e l'analisi delle immagini a fluorescenza. La linea cellulare utilizzata in questo studio è stata precedentemente utilizzata per la generazione di organoidi in matrici di origine animale.

Introduzione

Negli ultimi anni, i peptidi autoassemblanti (SAP) sono emersi come biomateriali promettenti per applicazioni di ingegneria tissutale. I SAPs possiedono proprietà uniche, tra cui la formazione spontanea di nanofibre, la biocompatibilità, la biodegradabilità e la non immunogenicità, che li rendono candidati interessanti per lo sviluppo di scaffold1. I SAP sono stati precedentemente utilizzati insieme a vari tipi di cellule e, in particolare, i SAP ultracorti hanno facilitato l'incapsulamento delle cellule staminali, mantenendo la loro pluripotenza per periodi prolungati che comprendono più di 30 passaggi e con un'incidenza minima di aberrazioni cromosomiche 2,3,4. Pertanto, l'adattamento dei SAP per il loro uso nella coltura di organoidi ha costituito un passo successivo razionale.

Gli organoidi sono strutture tridimensionali complesse che derivano da singole cellule pluripotenti. Queste strutture danno origine a vari tipi di cellule, che poi si auto-organizzano per replicare i processi di sviluppo della crescita embrionale e tissutale in vitro5. Questo quadro innovativo si è evoluto in uno strumento formidabile per le indagini in vitro, conservando in modo efficiente gli attributi genetici, fenotipici e comportamentali caratteristici degli organi in vivo 6. Tuttavia, uno dei principali ostacoli nella transizione dal laboratorio al letto del paziente dei risultati basati sugli organoidi è la necessità di riproducibilità7. Questa variazione nei risultati è principalmente attribuita alla difficoltà di differenziare completamente le cellule staminali pluripotenti umane in linee cellulari specializzate, aggravata dall'assenza di un'autentica architettura tissutale e dalla complessità intrinseca riscontrata nei modelli di organoidi. Data l'aumento della popolarità degli studi basati su cellule staminali e organoidi8, c'è stata un'escalation della domanda di biomateriali con proprietà meccaniche dinamiche e siti di adesione simili alle integrine o scaffold con degradabilità controllata 7,9. Questi attributi possono essere efficacemente regolati attraverso l'utilizzo strategico di SAPs biofunzionalizzati.

I SAPs sono brevi sequenze di amminoacidi con la capacità intrinseca di organizzarsi spontaneamente in strutture ben definite10. Questi peptidi contengono spesso residui idrofobici e idrofili alternati, che guidano il loro autoassemblaggio attraverso interazioni non covalenti, tra cui il legame idrogeno, le interazioni elettrostatiche e gli effetti idrofobici11,12. Il processo di autoassemblaggio di questi peptidi è guidato principalmente dalla necessità di ridurre al minimo l'energia libera del sistema. Quando si trovano in un ambiente acquoso, i residui idrofobi tendono ad aggregarsi per ridurre al minimo la loro esposizione all'acqua, mentre i residui idrofili interagiscono con le molecole d'acqua circostanti. Questo fenomeno porta alla formazione di varie nanostrutture. In questo caso, i peptidi autoassemblanti ultracorti formano nanofibre con caratteristiche che dipendono dalla sequenza peptidica e dalle condizioni ambientali 2,12,13,14,15,16. Questi peptidi adottano una conformazione a β giri, in cui i singoli filamenti peptidici si allineano parallelamente o antiparallelamente l'uno all'altro, stabilizzati da legami idrogeno (Figura 1). La presenza di ioni positivi accelera i processi di autoassemblaggio che portano alla formazione di nanofibre.

Le nanofibre peptidiche sono state identificate come dotate di una capacità innata di intrappolare volumi significativi di acqua. Questa caratteristica facilita la generazione di un idrogel, che successivamente si manifesta come uno spazio tridimensionale biocompatibile e biodegradabile favorevole alla proliferazione e alla crescita cellulare. Queste nanofibre peptidiche autoassemblanti emulano in modo intricato le caratteristiche topografiche inerenti all'ambiente della matrice extracellulare naturale (ECM)1. Questa somiglianza conferisce alle cellule un ambiente che imita il loro habitat fisiologico, promuovendo ulteriormente attività cellulari ottimali17. Inoltre, la versatilità intrinseca di questi peptidi consente un notevole grado di sintonizzabilità4. Tale adattabilità consente di modificare le proprietà della matrice, come la rigidità, la cinetica di gelificazione e la porosità. Questi adattamenti si ottengono attraverso modifiche alla sequenza peptidica. Di conseguenza, i peptidi autoassemblanti (SAP) sono emersi come componenti fondamentali nella scienza contemporanea dei biomateriali, ampiamente utilizzati come scaffold per la rigenerazione dei tessuti e la coltura cellulare13,17.

Uno dei vantaggi critici dei peptidi autoassemblanti è la loro capacità di essere facilmente sintetizzati e modificati a livello molecolare. Questo vantaggio consente l'incorporazione di specifici gruppi funzionali o motivi bioattivi nella sequenza peptidica, consentendo la progettazione di peptidi con proprietà e funzionalità su misura 18,19,20 (Figura 1B). Ad esempio, i SAP biofunzionalizzati possono essere progettati per imitare la MEC e promuovere la differenziazione utilizzando il peptide RGD 19,21. È stato anche riportato che il peptide Ben-IKVAV aumenta significativamente l'espressione di marcatori neuronali specifici a causa della sua motiety ligando-specifica22. Questi peptidi possono anche essere ingegnerizzati per mostrare molecole bioattive, come i peptidi leganti le integrine, per migliorare la sopravvivenza cellulare23. Infine, altri SAPs biofunzionalizzati sono stati sviluppati per promuovere l'angiogenesi includendo i motivi IKVAV e YIGSR nelle loro strutture24.

I SAP biofunzionalizzati riportati in una precedente pubblicazione mostrano che l'autoassemblaggio può essere ulteriormente modificato includendo il peptide naive da cui è derivato il SAP biofunzionalizzato25. Queste miscele SAP possono anche fornire un'ampia gamma di formulazioni SAP che variano nella loro attività biochimica e proprietà fisico-chimiche. Ad esempio, il peptide anfifilico IIFK è un SAP ultracorto in grado di resistere alla biofunzionalizzazione con vari motivi, esemplificati dall'incorporazione del motivo IKVAV (Figura 1B). Entrambi i peptidi possono formare nanofibre, sia da soli che combinati. Ogni formulazione si traduce in idrogel con proprietà fisiche variabili (Figura 2)

Tuttavia, a causa dell'ampia gamma di potenziali permutazioni e alternative ottenute dalla biofunzionalizzazione dei SAP, è necessario fornire un'opzione rapida ed economica per l'analisi degli organoidi. Un candidato per tale valutazione intensiva ed economica degli organoidi è la linea cellulare SW1222, derivata dall'adenocarcinoma colorettale umano 26,27. Le cellule SW1222 possiedono caratteristiche che ne consentono l'aggregazione in strutture 3D simili a organoidi, rendendole un modello ideale per lo studio dello sviluppo dei tessuti e delle applicazioni di medicina rigenerativa. Le cellule SW1222 sono state identificate come in grado di generare organoidi a causa della loro intrinseca sovraespressione del gene LGR5 27. La creazione di organoidi da singole cellule staminali LGR5+ è stata dimostrata in modo convincente in precedenza, così come la propensione delle cellule SW1222 a raggiungere le caratteristiche morfologiche di un organoide di cancro del colon-retto28.

In questo articolo sui metodi, presentiamo protocolli dettagliati per valutare e caratterizzare gli effetti di vari peptidi biofunzionali sull'adesione cellulare e sulla formazione del lume utilizzando cellule SW1222 (Figura 3). Fornendo procedure passo-passo e metodi di analisi dell'imaging, speriamo di offrire preziose informazioni sulla biofabbricazione di organoidi e sulla valutazione di matrici SAP semplicistiche per la coltura di organoidi.

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Protocollo

1. Preparazione del tampone e della soluzione

NOTA: Tutte le concentrazioni indicate sono concentrazioni finali.

  1. Aggiungere siero fetale bovino (FBS) e penicillina-streptomicina a una concentrazione finale rispettivamente del 10% e dell'1% per preparare il terreno di Dulbecco modificato (IMDM) completo di Iscove. Conservare al buio a 4 °C per un massimo di 1 mese.
  2. Mescolare MgCl2 (3 mM), saccarosio (300 mM) e Triton X-100 (0,5%) in soluzione salina tampone fosfato (PBS) per preparare il tampone di permeabilizzazione. Conservare questa soluzione a 4 °C per un massimo di 2 mesi.
  3. Combinare albumina sierica bovina (BSA, 1%), glicina (0,3 M) e Tween-20 (0,1%) in PBS per preparare un tampone bloccante. Conservare questa soluzione a 4 °C per un massimo di 2 mesi.
  4. Diluire da 10 a 2 PBS con acqua ultrapura in condizioni sterili. Conservare questa soluzione a temperatura ambiente per oltre 6 mesi.
  5. Sterilizzare 3 mg di polvere di peptidi sotto luce ultravioletta per 30 minuti. Aggiungere 500 μl di acqua ultrapura per sciogliere utilizzando un miscelatore a vortice.
    NOTA: La concentrazione finale deve essere il doppio della concentrazione target, ovvero 6 mg/mL, poiché la concentrazione 1x sarà di 3 mg/mL.

2. Fabbricazione di organoidi di cancro del colon-retto da SW1222 in peptide

  1. Scongelare un'aliquota per una notte a 4 °C e tenerla in ghiaccio fino a quando non sarà necessario per preparare il controllo della matrice basamentale.
  2. Posizionare una goccia da 10 μl di soluzione peptidica 2x al centro di ciascun pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Lasciare incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti. In alternativa, depositare 8-10 goccioline per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti.
    NOTA: I campioni destinati ad essere utilizzati in microscopia confocale ed elettronica sono più accessibili da manipolare se seminati sopra un vetrino coprioggetti sterile.
  3. Aggiungere 10 μl di 2x PBS. Mescolare delicatamente la soluzione PBS utilizzando la punta. Lasciare stabilizzare i gel per almeno 20 minuti, assicurandosi che le goccioline rimangano quasi intatte.
    NOTA: L'obiettivo dell'aggiunta di PBS e della miscelazione delicata è mantenere l'integrità della gocciolina ed evitare di diffondere l'idrogel in uno strato.
  4. Staccare le cellule SW1222 utilizzando una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,125% (5 mL). Incubare le cellule con tripsina a 37 °C per 5-10 minuti fino a quando non si staccano dal pallone. Astenersi dal picchiettare il pallone per evitare la formazione di grumi cellulari.
  5. Aggiungere 5 mL di terreno completo per inattivare la tripsina. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un filtro cellulare da 30 μm. In alternativa, utilizzare una siringa con un ago da 25 G per disgregare gli aggregati.
  6. Preparare una sospensione cellulare di 0,4 × 10-6 cellule/mL e iniettare 2 μL della sospensione cellulare in ciascuna gocciolina peptidica utilizzando una micropipetta da 10 μL.
  7. Incubare le goccioline per 30 minuti a 37 °C, 5% CO2. Aggiungere 0,5 mL di terreno integrato a ciascun pozzetto dopo l'incubazione.
  8. Nell'attesa, preparare il controllo della matrice della membrana basale diluendo lo stock principale (8-12 mg/mL, a seconda del lotto) a una concentrazione finale di 3 mg/mL utilizzando il terreno integrato. Aggiungere cellule a questa soluzione (800 cellule per 25 μl).
    NOTA: La manipolazione della membrana basale deve essere eseguita sempre sul ghiaccio. Le punte devono essere sciacquate con PBS ghiacciato prima di toccare l'idrogel. In caso contrario, la polimerizzazione avverrà all'interno delle punte.
  9. Piastra 20 μL di goccioline della soluzione della membrana basale in ciascun pozzetto. Lasciare gelificare le goccioline incubando per 20 minuti a 37 °C. Dopo che il materiale è gelificato, aggiungere 0,5 ml di terreno completo.
  10. Cambia il mezzo ogni 3-4 giorni. Osservare le cellule che si organizzano e mostrano segnali di formazione del lume già dal giorno 4.
  11. Immagine delle cellule in campo chiaro il giorno 1, il giorno 4 e il giorno 7 per valutare la crescita degli organoidi.

3. Vitalità e proliferazione

  1. Preparare tre piastre a pozzetti neri per il test di vitalità e tre piastre a pozzetti neri per il test di proliferazione. Aggiungere 25 μl di soluzione peptidica 2x per pozzetto e gelificare utilizzando lo stesso volume di 2x PBS. Semina le celle come descritto sopra.
  2. Preparare tre pozzetti per ogni formulazione di idrogel peptidico da utilizzare come spazi vuoti nella piastra di proliferazione. Non seminare cellule su questi.
  3. Rimuovere il terreno dalla piastra del pozzetto di vitalità e lavare con 1x PBS per 3 x 5 min.
  4. Diluire la calceina-AM e l'omodimero di etidio a 8 μM dal kit di vitalità/citotossicità per cellule di mammifero (vedere la tabella dei materiali) nella stessa provetta conica protetta dalla luce. Per preparare 2 mL di questa soluzione in 2 mL di PBS in una provetta conica protetta dalla luce, aggiungere 4 μL della soluzione madre Calcein-AM e 8 μL della soluzione madre dell'omodimero di etidio-1.
  5. Aggiungere la soluzione di omodimero calceina/etidio preparata al punto 3.4 alla piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 100 μl per pozzetto. Proteggere dalla luce e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  6. Lavare per 3 x 5 minuti con 1x PBS. Acquisire un minimo di tre campi (centro, alto, basso) quando si utilizza un obiettivo 4x o un minimo di cinque campi (centro, in alto a sinistra, in alto a destra, in basso a sinistra, in basso a destra) quando si utilizza un obiettivo 10x e 20x con un microscopio a fluorescenza.
  7. Rimuovere il terreno dalla piastra a pozzetti di proliferazione per garantire un volume finale di 90 μl.
  8. Aggiungere 10 μl di soluzione Alamar Blue (vedi Tabella dei materiali) per raggiungere una concentrazione finale del 10%.
  9. Proteggere dalla luce e incubare per 2-4 ore a 37 °C, 5% CO2
  10. Utilizzare un lettore di piastre a pozzetti per misurare la fluorescenza (Ex/Em = 530-560/590 nm/nm) o l'assorbanza (570 nm). Fare la media dei valori ottenuti per gli spazi vuoti e sottrarli dai valori di ciascun pozzetto che contiene celle.
  11. Calcola i valori di proliferazione facendo la media del segnale di ciascuna condizione e sottraendo la media dei rispettivi spazi vuoti. Crea grafici generando un box plot indicizzato del segnale di assorbanza/fluorescenza relativa rispetto al tempo.

4. Saggio di aderenza delle cellule alla matrice

  1. Preparare 100 μl di idrogel peptidici in due piastre indipendenti da 96 pozzetti.
  2. Seminare 20.000 cellule in ogni pozzetto e aggiungere 100 μL di terreno. Incubare le piastre per 90 minuti a 37 °C, 5% CO2.
  3. Dopo l'incubazione, prelevare una sola piastra e risospendere con cura il terreno utilizzando una micropipetta P200 per 20-30 s. Fare attenzione a non interrompere l'idrogel tenendo la punta lontana dal gel. In alternativa, se le proprietà meccaniche dell'idrogel lo consentono (G' > 8.000 Pa), picchiettare i quattro lati della piastra del pozzetto utilizzando un vortice mobile.
    NOTA: La risospensione del terreno (o il picchiettamento della piastra del pozzetto con il vortice) rimuoverà sia le cellule non attaccate che le cellule con tenue adesione alla superficie della matrice. L'attacco cellulare avverrà entro 90 minuti, anche se la forza di questo attacco varierà a seconda degli specifici idrogel peptidici e delle loro proprietà adesive e leganti. È noto che la crescita degli organoidi colorettali è favorita in matrici con valori di rigidità inferiori a 2.000 Pa. Quindi, poiché gli idrogel presentati in questo protocollo sono morbidi e fragili, ci impegniamo a utilizzare uno stress meccanico delicato.
  4. Rimuovere 100 μl di terreno da entrambe le piastre a pozzetti e aggiungere il lavaggio una volta con 1x PBS.
  5. Preparare una soluzione DAPI da 1 μg/mL. Aggiungere 100 μl della soluzione DAPI a tutti i pozzetti e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  6. Immagine di un numero rappresentativo di campi al microscopio a fluorescenza. Assicurati che tutte le immagini siano ottenute utilizzando lo stesso obiettivo per mantenere costante il rapporto pixel/distanza.
    NOTA: Immagine di nove campi per un obiettivo 10x o 15 campi con un obiettivo 20x.
  7. Caricare le immagini a fluorescenza sul software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ) e analizzare le particelle su tutte le immagini.
    1. Dal menu Immagine , selezionare Tipo e fare clic su 8 bit.
    2. Dal menu Immagine , selezionare Regola e fare clic su Luminosità/Contrasto. Fare clic sul pulsante Auto | Applicare.
    3. Dal menu Immagine , selezionare Regola e fare clic su Soglia. Fare clic sul pulsante Auto e chiudere la finestra.
    4. Dal menu Analizza, fare clic su Analizza particelle. Spuntare l'opzione per riassumere e fare clic su OK.
    5. Nella finestra Riepilogo , passare il mouse sul menu File e fare clic su Salva per salvare i valori di riepilogo.
  8. Esporta i risultati di tutte le immagini in un software di statistica standard.
  9. Calcola la percentuale di area coperta dalle celle prima e dopo lo stress. Crea un box plot indicizzato della percentuale di area rispetto a ciascuna condizione.

5. Immunocolorazione di organoidi in idrogel peptidico

  1. Seminare 800 cellule in goccioline da 20 μL di idrogel peptidico per 4 giorni, come descritto nei passaggi 2.1-2.10.
  2. Il giorno 4, rimuovere il terreno e lavare ogni pozzetto 2 volte usando 1 PBS.
  3. Aggiungere 400 μl di una soluzione di formaldeide al 4%. Incubare la piastra a pozzetti per 30 minuti a temperatura ambiente.
  4. Rimuovere la soluzione di formaldeide con un P1000 e lavare una volta con 1x PBS.
  5. Aggiungere 1 mL di tampone di permeabilizzazione e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  6. Rimuovere il tampone di permeabilizzazione con un P1000 e lavare una volta con 1x PBS.
  7. Aggiungere 0,5 mL di tampone bloccante e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
  8. Rimuovere il tampone di blocco con un P1000 e lavare con 1x PBS.
  9. Diluire l'anticorpo primario nel tampone bloccante secondo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali). Aggiungere 200 μl in due pozzetti.
  10. Incubare per una notte a 4 °C.
  11. Rimuovere la soluzione colorante con un P200 e lavare una volta con 1x PBS.
  12. Diluire l'anticorpo secondario nel tampone bloccante, secondo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei Materiali). Aggiungere il coniugato falloidina in un rapporto di 1:40 nella soluzione di anticorpi secondari.
  13. Proteggere dalla luce e incubare a temperatura ambiente per non più di 3 ore. Rimuovere la soluzione colorante con un P200 e lavare una volta con 1x PBS.
  14. Preparare una soluzione DAPI di 1 μg/mL nel tampone bloccante. Aggiungere 300 μl della soluzione DAPI a ciascun pozzetto.
  15. Proteggere dalla luce e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  16. Rimuovere la soluzione colorante con un P200 e lavare una volta con 1x PBS.
  17. Proteggere dalla luce e conservare a 4 °C per un massimo di 7 giorni.

6. Imaging e analisi di immagini di organoidi in matrice

  1. Visualizzare i campioni colorati utilizzando un microscopio a epifluorescenza a 10x. Utilizzare solo i canali falloidina e DAPI.
  2. Apri il software Cellopose e premi ctrl + L per caricare un'immagine. Poiché il software avrà accesso a tutti i file nella posizione dell'immagine selezionata, assicurati di salvare tutte le immagini a fluorescenza nella posizione esatta senza avere sottocartelle.
  3. Digitare il diametro medio delle colonie nel pannello Segmentazione e fare clic su INVIO.
  4. Seleziona un modello personalizzato per gli organoidi del colon e fai clic sul pulsante Esegui modello .
    NOTA: Qui, suggeriamo di utilizzare due modelli da zero in Cellpose2.029,30
  5. Premi ctrl + s per salvare le maschere come file .npy.
  6. Utilizzare le frecce della tastiera per spostarsi tra le immagini della cartella ed eseguire il modello per gli organoidi dei due punti su tutte le immagini nella cartella.
  7. Fare una copia della cartella e ripetere i passaggi 6.2-6.6 utilizzando un modello per il lume dell'organoide del colon.
  8. Apri ImageJ e fai clic su Plugin | Macro | Correre... per eseguire il file imagej_roi_converter.py disponibile dal sito Github di Cellpose e attendere che appaia una finestra.
  9. Seleziona il primo file dalla cartella dell'organoide dei due punti e fai clic su Apri.
  10. Selezionare il file seg.npy corrispondente al primo file e fare clic su Apri.
    NOTA: ImageJ convertirà le maschere in regioni di interesse e le sovrapporrà alle immagini a fluorescenza corrispondenti.
  11. Fai clic su Seleziona tutto nella finestra ROI Manager , quindi fai clic su Misura.
  12. Fare clic su File | Salva con nome... nella finestra Risultati e salvare i risultati.
    NOTA: Ciò si tradurrà in un file .csv contenente tutte le proprietà di forma di ciascuna colonia nel campo.
  13. Ripetere i passaggi 6.8-6.12 per la stessa immagine nella cartella per il lume dell'organoide del colon.
  14. Carica OriginPro e premi ctrl + 3 per aprire l'Importazione guidata. Fare clic sul pulsante con i tre punti e selezionare entrambi i file .csv corrispondenti alle proprietà dell'organoide e della forma del lume per la stessa immagine.
  15. Copia e incolla i risultati delle proprietà della forma del lume in una colonna accanto ai risultati della colonia per assicurarti che ogni misurazione del lumen sia abbinata alla rispettiva colonia.
  16. In una nuova colonna, dividere le aree del lume e della colonia per ottenere l'area del lume relativo della colonia che lo contiene.
  17. Selezionare la colonna corrispondente alla circolarità di ciascuna colonia e all'area del lumen. Clicca su Trama | Base 2D | Dispersione.
  18. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra del grafico e selezionare Dettagli grafico. Fare clic sulla scheda Centroide (PRO) e selezionare le opzioni che leggono Mostra punto centroide per sottoinsieme, Connetti a punti dati e Mostra ellisse.

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Risultati

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Discussione

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla King Abdullah University of Science and Technology. Gli autori riconoscono la sovvenzione del fondo di avviamento di KAUST e il fondo di innovazione di KAUST assegnati dall'innovazione e lo sviluppo economico di KAUST. Gli autori desiderano ringraziare i laboratori principali di bioscienze e imaging di KAUST per aver supportato la caratterizzazione biologica e le analisi microscopiche.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1x PBSGibco14190144
piastra a 6 pozzetti, trattata per coltura tissutaleCorning07-200-83
10x PBS, senza calcio, senza magnesioGibco70011044
16% formaldeide (p/v), senza metanoloThermo Scientific28906
piastra a 24 pozzetti, trattata per coltura tissutaleCorning09-761-146
Piastra nera a 96 pozzetti, trattata con coltura tissutaleCorning07-200-565
alamarBlue Cell Viability ReagentInvitrogenDAL1025
Anti-Ezrin, coniglio monoclonaleAbcamab40839Secondario utilizzato: anti-coniglio Dylight 633
Anti-pan Caderina, coniglio policlonaleAbcamab16505Secondario utilizzato: anti-coniglio Alexa 488
Anticorpo anti-ZO1 a giunzione stretta, policlonale di capraAbcamab190085Secondario utilizzato: anti-capra Alexa 488
BSASigma-AldrichA9418
Cellpose 2.0NANAOttenuto da https://github.com/MouseLand/cellpose
microscopio a scansione laser confocale con AiryscanZEISSLSM 880
DAPIInvitrogenD1306
Anticorpo secondario anti-IgG di capra (H+L) dell'asino, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11055
GlycineCytivaGE17-1323-01
Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-coniglio di capra, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11008
Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-coniglio di capra, DyLight 633Invitrogen35562
Siero fetale bovino inattivato termicamente (HI FBS)Gibco16140071
ImageJ 1.54fNIHNA
IMDMGibco12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, per cellule di mammiferoInvitrogenL3224
Cloruro di magnesio, esaidrato (MgCl2 6 H2O)Sigma-AldrichM2393
Matrigel per coltura di organoidi, senza rosso fenoloCorning356255indicato nel manoscritto come Matrigel o matrice di membrana basale.
Microscopio, campo
Microscopio, EVOSThermo ScientificEVOS M7000
OriginPro 2023 (64 bit) 10.0.0.154OriginLab CorpNA
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)Gibco15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)Lab-madeNA Può essere personalizzato da peptide produttori come Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)NA prodotto in laboratorioPuò essere realizzato su misura da produttori di peptidi come Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Ile, Lys, Val, Ala, Val, NH2)NAprodotto in laboratorioPuò essere realizzato su misura da produttori di peptidi come Bachem.
Rhodamine PhalloidinInvitrogenR415
diametro 10 mmVWR631-0170
Microscopio elettronicoa scansione Thermo Fisher - FEITENEO VS
Sterile 30 μ m filtroSysmex04-004-2326
saccarosioSigma-AldrichS1888
SW1222 linea cellulareECACC12022910
Triton x-100Thermo Scientific85111
Tripsina-EDTA 0,25%Gibco25200056
Tween 20Sigma-AldrichP1379
Acqua ultrapuraInvitrogen10977015
chiaroFoglietto di copertura rotondo ,

Riferimenti

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