CD4 + antigene specifico visualizzando cellule T con MHC di classe II tetrameri

Beh, ciò che rende davvero unico il test Teer è che ti permette di visualizzare direttamente le cellule T specifiche degli antigeni. Il te, il teer, è l'aspetto unico principale del nostro saggio. Questo è accompagnato da una fase di amplificazione che facciamo.

Sai, isolamo le cellule T e poi le coltiviamo in un ambiente che arricchisca il campione per le cellule T che ci interessano. Poi siamo in grado di etichettare specificamente solo quelle cellule e visualizzarle su un citometro a flusso. E quindi, con i precedenti saggi, come il CSFE o i saggi di proliferazione che esistono da decenni, quello che ottieni è una sorta di misurazione complessiva di ciò che accade con l'intera popolazione di cellule T.

Ma ci sono milioni di cellule T nel corpo che vedono un insieme completamente diverso di schemi. Se sei fortunato, forse una su due fino a 300.000 cellule del campione sarà quella che stai valutando. Ed è per questo che questo saggio fa quei passaggi di arricchimento.

E poi, con un numero di test, e poiché colori direttamente, puoi visualizzare lontano dal background una popolazione inferiore all'1% del totale delle cellule. E quindi puoi vedere differenze molto, molto piccole e puoi ottenere un conteggio abbastanza preciso del numero di cellule T presenti in quel campione di sangue, sai, che sono in quell'individuo che riconoscono il tuo modello di interesse. Ma non si ferma qui, perché i teters permettono anche non solo di etichettare quei leccini T, ma di isolarli per ulteriori analisi.

E i teters che usi sono effettivamente prodotti qui al BRI, è corretto? Sì. Siamo uno dei pochissimi laboratori nel paese che sono riusciti a raggiungere i teter di classe due. Il nostro intento è distribuire questi reagenti a costo a qualsiasi laboratorio interessato a importare questa tecnologia.

Quali diresti siano gli aspetti più difficili o impegnativi di questo saggio quando si tratta di replicarlo in altri laboratori? Beh, a pensarci bene, in realtà ce ne sono due, la crescita delle cellule T. È davvero qualcosa che è un po' un'arte.

Tu, hai quasi ogni giorno decisioni su come le cellule abbiano bisogno di nutrienti aggiuntivi o di spazio aggiuntivo per crescere. E poi la seconda parte, che penso sia probabilmente la più difficile per un inesperto da operare, è in realtà l'analisi dei dati. È un po' come capire quale parte del segnale è davvero una risposta positiva e quale parte è semplicemente insita a, sai, fisica e attrazione.

E il fatto che tutto abbia un certo grado di appiccicosità è qualcosa che, ancora una volta, richiede molta esperienza, soprattutto in un contesto dove la risposta complessiva sarà un po' debole. In che modo le informazioni che genererai con questo test hanno potenziale per beneficiare i pazienti a questo punto? Uno dei primi tratti distintivi che emergono in ogni paziente autoimmune è una sorta di costellazione di anticorpi specifici per quella malattia.

Sappiamo dai fondamenti fondamentali dell'immunologia che ovunque ci sia una risposta di anticorpi, c'è sempre prima una risposta delle cellule T. E quindi, se potessimo osservare negli individui a rischio e vedere quel salto nell'attività delle cellule T che precederebbe la formazione degli anticorpi, questo ci aiuterebbe a definire un nuovo livello di rischio o che gli individui si stanno avviando ad avere autoanticorpi, che si spera aprirebbero una finestra per terapie interventive. Questa procedura purificherà ed espanderà le cellule T CD quattro positive specifiche per antigene e le visualizzerà utilizzando reagenti teters e apparecchiature di classe due di biosicurezza a flusso laminare.

Questo sarà lo spazio di lavoro principale per la procedura. Tubo conico da 50 millilitri per isolamento PBMC, uno XPBS. Dovrebbe essere un pacchetto fol privo di calcio e magnesio più una carta di alluminio avvolta per proteggere da bombole leggere CoStar 10 mil con inserti da 50 mil, utilizzati per prevenire la contaminazione del sangue dalla centrifuga.

GS sei pipette di trasferimento centrifughe R, pipette Pasteur tamponi emolitico contenente 8,3 grammi per litro. Cloruro di ammonio 1,0 grammi per litro. Bicarbonato di sodio 0,04 grammi per litro DI EDTA sodio trian blu 0,2% in PBS emocitometro tubo conico da 15 millilitri con tampone contenente PBS integrato con due millimolari EDTA più cinque grammi per litro.

Kit di isolamento BSA max CD quattro due acquistato dal blocco magnete EP Milin biotech acquistato da stem cell technologies. Altre piattaforme di arricchimento a celle magnetiche potrebbero essere utilizzate con uguale efficacia. Tubo di polipropilene da cinque millilitri RPMI 1640 integrato con 25 millimolari hippie utilizzati per produrre siero umano aggregato per il mezzo T-cellulare, utilizzato per integrare la striscia di penna del mezzo T-cellulare usata per integrare il mezzo T-cellulare, 500 millilitri filtro a topo bottiglia da 0,22 micron sterile da 48 pozzi, impiccatura di espansione in vitro, incubatore CO2 di grado 37 gradi, soluzione di peptide sintetico da 20 milligrammi per millilitro contenente l'epitopo di interesse.

Tubo di fax da cinque millilitri in polistirene caricato con peptidi di classe due usata per visualizzare le cellule T specifiche per antigeni, anti-CD tre, anti-CD quattro e anti-CD 25 utilizzate per rivestire le cellule T specifiche per antigene. Invia un citometro a flusso di calibro o equivalente via fax prima di iniziare la procedura. Assembla tutti i materiali e le attrezzature nel tuo spazio di lavoro.

La dimostrazione seguente coprirà i passaggi seguenti. Isolamento PBMC, separazione positiva di cellule T CD quattro in coltura di espansione in vitro visualizzando le cellule T tramite teem o colorazione. Primo passo dell'isolamento PBMC.

Prendi un campione di sangue. Il sangue dovrebbe essere raccolto in siringhe o tubi e anticoagulato con eparina in un rapporto uno per 50 per prevenire la coagulazione; si prevede una resa di circa 1 milione di PBMC per millilitro di sangue. Circa il 40% di questi sarà costituito da cellule T CD quattro positive.

Aliquota il sangue in tubi conici da 50 millilitri. 25 millilitri di sangue per sondino. Mescola delicatamente il sangue prima della coagulazione dell'ALI per distribuire il plasma.

Aggiungere PBS portando il volume totale a 40 millilitri e sottoporre asciugando 11 millilitri di fial inserendoli nel tubo sanguigno e rimuovendo con cura l'ausilio della pipetta dalla pipetta. Il fial drenerà lentamente nel fondo del tubo. Una volta che il livello si è equilibrato, rimuovi lentamente la pipetta dal tubo di sangue e scarta il tappo dei tubi e sposti nell'aerosol dei contenitori.

Chiudi saldamente i contenitori e centrifuga a 900 volte G per 20 minuti senza interruzioni. È fondamentale che non venga applicata alcuna rottura alla fine di questa rotazione, poiché la forza di rottura disturberà lo strato di celle dopo la rotazione. Il PBMC dovrebbe formare uno strato bianco distinto tra il plasma giallo sopra e il fial trasparente sottostante.

Sfila delicatamente lo strato di globuli bianchi usando una pipetta di trasferimento e trasferisci su un nuovo tubo. Alcuni plasmi e fial possono essere disegnati con il PBMC, ma evita di risollevare qualsiasi parte dello strato di globuli rossi. Tipicamente due tubi sanguigni possono essere combinati in un unico tubo cellulare in questo passaggio.

Per aumentare la dimensione del pellet, aggiungi PBS portando il volume totale a 15 millilitri e centrifuga a 500 volte G per 15 minuti a rottura bassa e aspira il liquido in aerosol dei contenitori usando una pipetta a pasta, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Trattate con un tampone emolitico aggiungendo da cinque a sei millilitri a ciascun tubo e mescolando delicatamente per rimuovere i grumi. Incubare per non più di cinque minuti.

Aggiungi PBS portando il volume totale a 50 millilitri e centrifuga a 230 volte G per 10 minuti. Con la rotazione bassa non servono più i contenitori aerosol per queste rotazioni più lente. Lavare due volte il liquido aspirare usando un tubo riempito da pipetta da pascolo con PBS e centrifugare a 230 volte G per 10 minuti prima dell'ultimo passaggio di lavaggio, rimuovere un'aliquota di cellule sospese, diluire con trian blue e contare con un emicocitometro.

Questo conteggio delle celle determinerà i volumi di reagenti utilizzati nella separazione delle cellule T. Passo due, separazione positiva delle cellule T di CD quattro, aspirare il liquido e aggiungere un tampone in corso per portare il volume totale a 40 microlitri ogni 10 milioni di celle. Di solito questo richiede 30 microlitri di tampone più il volume residuo del pellet.

Trasferire questo volume in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungi un cocktail di anticorpi dai kit di isolamento CD 4, 10 microlitri ogni tubo di 10 milioni di cellule e mettilo sul ghiaccio per 10 minuti. Rimuovi il tubo dal ghiaccio, rimuovi il tappo e aggiungi 30 microlitri di tampone in funzione ogni 10 milioni di celle.

Aggiungi le perline magnetiche del kit di isolamento CD quattro. 20 microlitri per 10 milioni di cellule tappano il tubo e metti sul ghiaccio per 15 minuti. Aggiungi 10 volumi di tampone in corsa per lavare e centrifugare a 230 volte G per 10 minuti.

Durante la centrifuga, posiziona il magnete e il tubo di polipropilene da cinque millilitri nel tuo spazio di lavoro. Aspira liquido da pellet cellulare. Aggiungi due millilitri di buffer in movimento e rimuovi i grumi usando una pipetta di trasferimento.

Utilizzando la stessa pipetta di trasferimento, le cellule trasferiscono nel tubo da cinque millilitri e si incubano nel magnete per 15 minuti. Svuota con cura la frazione di cellule T positive CD quattro in un tubo marcato da 15 mil, invertendo il magnete e svuotando tutto tranne l'ultima goccia. Aggiungi altri due millilitri di buffer di corsa al tubo da cinque millilitri e rimuovi dal magnete.

Sciacqua delicatamente le quattro cellule negative CD dai lati del tubo e trasferisci su un tubo da 15 mil marchiato. Aggiungi due millilitri di mezzo a cellule T a ciascun tubo. Rimuovere le aliquote per il conteggio delle cellule e centrifugare a 230 volte G per 10 minuti.

Diluire le aliquote cellulari con blu di triano e contare usando un citometro emico. Questi conteggi cellulari determineranno il numero di pozzi utilizzati per la coltura di espansione. Passo tre.

In vitro la coltura di espansione aspira liquido dai pellet cellulari CD quattro positivi e CD quattro negativi in base al numero cellulare. Aggiungi substrato alle quattro celle positive del CD per regolare il volume a 3 milioni di celle per mil. Aggiungi un substrato alle quattro celle negative CD per regolare il volume a 10 milioni di celle per mil.

La coltura di espansione richiede 3 milioni di celle di CD quattro negative per pozzo e da due a 3 milioni di celle di CD quattro positive per pozzo. Tipicamente, le cellule CDquattro positive sono la popolazione limitante. Caliquota CD quattro celle negative nel numero appropriato di pozzi su una piastra da 48 pozzi.

Aggiungendo 300 microlitri a ciascuno, posiziona il piatto in un incubatore a 37 gradi per un'ora. Rimuovi la piastra e l'incubatrice, lava i pozzi aggiungendo 500 microlitri di substrato fresco e pipettando delicatamente su e giù 12-20 volte con una pipetta di trasferimento e rimuovendo tutto il liquido. Questo lavaggio lascerà uno strato di cellule aderenti presentanti antigeni.

Quando il lavaggio è finito, aggiungi appena abbastanza materiale per bagnare il fondo di ciascuno, beh, circa 100 microlitri. Altrimenti le cellule aderenti all'A si seccheranno. Aggiungi da due a 3 milioni di cellule di CD e quattro positive in ciascun pozzo se necessario.

Aggiungi altri mezzi per portare il volume totale in ogni pozzo a un millilitro. Aggiungi il peptide desiderato a ciascuno. Bene. La concentrazione tipica per la stimolazione è di 10 microgrammi per millilitro.

Placcare il posto finale in un incubatore a 37 gradi per sette giorni. Dopo sette giorni. Aggiungi 50 microlitri di emico-IL, due in ciascun pozzo ogni giorno successivo.

Monitorare la crescita cellulare usando un microscopio i pozzi di alimentazione non ancora confluenti rimuovendo metà del mezzo, aggiungendo nuovo substrato e 50 microlitri di IL due pozzi confluenti divisi sospendendo di nuovo le cellule e spostando metà delle cellule in un pozzo vuoto. Aggiungendo substrato fresco e 50 microlitri di cellule di ritorno IL due nell'incubatrice. Le cellule in espansione saranno pronte per la colorazione con il teer dopo 13-15 giorni di coltura.

Passo quarto, visualizzare le cellule T tramite colorazione teer, acquistare o assemblare i teter per corrispondere al peptide. Combinazioni MHC utilizzate per stimolare le cellule T CD quattro positive. Rimuovi la piastra dall'incubatrice.

Estrai con attenzione metà dei media da ciascuno. Trasferire un pozzetto di cellule da ciascun pozzo, tipicamente 75 microlitri o circa 50.000 cellule, in un tubo di polistirene da cinque millilitri, aggiungere un microlitro tipicamente di un microlitro ogni 50 microlitri di volume totale e posizionare in incubatore a 37 gradi per un'ora. È inoltre consigliabile colorare una seconda aliquota di ciascun pozzo con un teer disadattato come cellule di controllo negativa con anticorpi anti-CD 3, anti CD quattro e anti CD 25.

Possono essere utilizzati marcatori anticorpali aggiuntivi o alternativi. Tuttavia, non utilizzare anticorpi marcati con PE, poiché questo canale deve essere riservato ai teem in questo momento. Inoltre, etichetta qualsiasi controllo di colore o isotipo usando celle extra.

Incubare le cellule marcate dagli anticorpi per 15-30 minuti a quattro gradi. Lavare ogni tubo con 0,5-1 millilitro di tampone di funzionamento e centrifugare a 230 volte G per 10 minuti. Escantare con cura il liquido dai tubi fax, calibrare il citometro di flusso usando perle di riferimento, tubi di controllo a colore singolo, controlli isotype, ecc.

Analizza ogni tubo utilizzando il citometro di flusso. Le cellule tetra positive dovrebbero costituire una popolazione distinta tra le cellule T CD quattro positive ampliate. Le cellule tetra positive sono solitamente positive a CD 25 e spesso a CD 4 ad alto