Name: CD4 + antigene specifico visualizzando cellule T con MHC di classe II tetrameri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 42 s
Description: Impara a purificare ed espandere cellule T CD4+ antigene-specifiche dal sangue periferico e a visualizzarle con tetrameri MHC di classe II. Questo metodo consente l'identificazione diretta delle cellule T specifiche.

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Ringraziamo Dick Foley e Leigh Kimball per il loro ruolo chiave nella ripresa e produzione video.

1. Cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) isolamento <ol><li> Ottenere un campione di sangue - sangue deve essere raccolti in siringhe o provette di sangue e anti-coagulato con eparina (1:50 ratio) per prevenire la coagulazione. Aspettatevi una resa di circa 1 × 10 6 PBMC per ml di sangue - circa il 40% dei quali sarà CD4 positivi (CD4 +) le cellule T. </li><li> Aliquota del sangue in 50 mL coniche, 25 ml per provetta. Se il sangue si è separata, mescolare delicatamente prima aliquoting per distribuire il plasma </li><li> Aggiungi PBS, portando il volume totale di 40 ml e alla base attraverso l'elaborazione di 11 ml di Ficoll, inserendo nel tubo di sangue, e con attenzione rimuovere il Aid pipetta dalla pipetta. Il Ficoll lentamente scarico nella parte inferiore del tubo. Una volta che il livello ha pareggiato, rimuovere lentamente la pipetta dal tubo di sangue e scartare. </li><li> Cap tube di sangue e spostare i contenitori in Aerosolve. Chiudere saldamente i contenitori e centrifugare a 900 × g per 20 minuti - senza freno. E 'fondamentale che nessun freno alla fine di questo giro, come la forza frenante sarà disturbare lo strato di cellule. </li><li> Dopo lo spin, il PBMC dovrebbero formare uno strato bianco distinta tra il plasma gialla (sopra) e Ficoll trasparente (sotto). Delicatamente sfiorano bianco sporco strato di cellule del sangue con una pipetta di trasferimento e trasferimento a nuovo tubo. Alcuni plasma e Ficoll può essere redatto con l'PBMC, ma evitare di elaborare una qualsiasi dello strato di globuli rossi. Tipicamente due tubi di sangue possono essere combinati in un unico tubo di cellule in questa fase per aumentare la dimensione delle pastiglie. </li><li> Aggiungi PBS, portando il volume totale di 50 ml e centrifugare a 500 × g per 15 minuti - freno a basso contenuto di contenitori aerosolve. </li><li> Aspirare il liquido con una pipetta Pasteur, facendo attenzione a non disturbare il pellet </li><li> Trattare con tampone emolitica con l'aggiunta di 5-6 ml per ogni provetta e mescolare delicatamente per eliminare grumi. Incubare per non più di 5 minuti. </li><li> Aggiungi PBS, portando il volume totale di 50 ml e centrifugare a 230 × g per 10 minuti - freni. Contenitori Aerosolve non sono più necessarie per questi giri più lento. </li><li> Lavare due volte: Aspirare il liquido con una pipetta Pasteur, riempire tubo con PBS e centrifugare a 230 × g per 10 minuti. </li><li> Prima della fase di lavaggio finale, rimuovere una aliquota di cellule risospese, diluire con trypan blu, e contare con un emocitometro. Questo conteggio delle cellule detterà i volumi di reagente utilizzato nella fase di separazione delle cellule T. </li></ol> 2. * Delle cellule CD4 + T separazione <ol><li> Aspirare il liquido e aggiungere tampone di corsa per portare il volume totale fino a 40 uL per 10 milioni di cellule. Di solito questo richiede 30 uL di tampone più il volume residuo di pellet. </li><li> Trasferire questo volume ad un tubo da 15 ml. </li><li> Aggiungi cocktail di anticorpi dal kit isolamento CD4 - 10 uL per 10 milioni di cellule, tubo tappo, e il luogo in ghiaccio per 10 minuti </li><li> Rimuovere la provetta dal ghiaccio, rimuovere il tappo, e aggiungere 30 uL di funzionamento del buffer per 10 milioni di cellule </li><li> Aggiungi sfere magnetiche dal kit isolamento CD4 - 20 uL per 10 milioni di cellule, tubo tappo, e il luogo in ghiaccio per 15 minuti </li><li> Aggiungi dieci volumi di correre tampone per lavare e centrifugare a 230 × g per 10 minuti. </li><li> Durante la rotazione, istituito il magnete e 5 ml in tubo di polipropilene di lavoro </li><li> Aspirare il liquido da pellet, aggiungere 2 mL di tampone di corsa e rimuovere i grumi con una pipetta di trasferimento </li><li> Utilizzando la pipetta stesso trasferimento, trasferire le cellule in provetta da 5 ml ed incubare nel magnete per 15 minuti </li><li> Con attenzione decantare il CD4 + frazione di cellule in una marcata 15 ml tubo invertendo il magnete e lo svuotamento tutte ma l'ultima goccia </li><li> Aggiungere altri 2 ml di esecuzione tampone nella provetta 5 ml e rimuovere dal magnete </li><li> Lavare delicatamente le cellule CD4 i lati della provetta e trasferire a una marcata tubo 15 ml </li><li> Aggiungere 2 ml di medium di cellule T ad ogni provetta, rimuovere aliquote per il conteggio delle cellule e centrifugare a 230 × g per 10 minuti. </li><li> Diluire aliquote cella con trypan blu e contare con un emocitometro. Queste conta delle cellule detterà il numero di pozzi utilizzati per la fase di espansione della cultura. </li></ol> * In alternativa, colonne e perline MACS (Miltenyi Biotec), il separatore cellulare AutoMACS (Miltenyi Biotec), o separatore cellulare Robosep (Stem Cell Technologies) può essere utilizzato in base alle istruzioni produce al posto di passi 2,2-2,11. 3. Nella cultura di espansione in vitro <ol><li> Aspirare il liquido dalla CD4 + e CD4-cell pellet e, in base alla conta delle cellule, aggiungere terreni di coltura (di solito 3 milioni CD4 + cellule per ml e 10 milioni di CD4-cellule per mL funziona bene per l'impostazione della cultura). La cultura di espansione richiede 3-5000000-CD4 cellule per pozzetto e 2-3000000 CD4 + cellule per pozzetto in un volume totale di media 1 ml la cultura in un piatto ben 48 cultura. Tipicamente, le cellule CD4 + sono la popolazione limitando </li><li> Se lo si desidera, irradiare le cellule CD4 (5000 Rad s). Aliquota di cellule CD4 in numero appropriato di pozzi su un piatto ben 48 con l'aggiunta di 300-500 microlitri a ciascuno. Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C per 1 ora. L'aderente cellule CD4-servirà come cellule presentanti l'antigene nella cultura di espansione. </li><li> Togliere la placca dal termostato. </li><li> Lavare i pozzetti aggiungendo 500 uL di mezzi freschi e pipettando gentilmente su e giù per 12-20 volte utilizzando una pipetta di trasferimento e la rimozione di tutto il liquido. Questo lavaggio si lascerà alle spalle uno strato di cellule che presentano l'antigene aderenti. </li><li> Quando il lavaggio è completo, aggiungere media appena sufficiente a bagnare il fondo di ciascun pozzetto (circa 100 uL) - altrimenti le cellule aderenti si asciughino </li><li> Aggiungi 2-3000000 cellule CD4 + in ciascun pozzetto. Se necessario, aggiungere ulteriori mezzi per portare il volume totale di ogni bene fino a 1 ml. </li><li> Aggiungere il peptide desiderato in ogni pozzetto. La concentrazione tipico per la stimolazione è di 10 ug / mL finale. </li><li> Mettere in una piastra di 37 ° C incubatore per 7 giorni. </li><li> Dopo 7 giorni, aggiungere 50 uL di Hemogen IL-2 (o equivalente, come ricombinante IL-2, 10 IU / mL) a ciascun pozzetto. </li><li> Nei giorni successivi, monitorare la crescita delle cellule utilizzando un microscopio. Avanzamento pozzi che non sono ancora confluenti rimuovendo la metà dei mezzi di comunicazione, l'aggiunta di mezzi freschi e 50 uL di IL-2. Split pozzi confluenti da risospendere le cellule, spostando la metà delle cellule di un pozzo vuoto, l'aggiunta di mezzi freschi e 50 uL di IL-2. Ritorno alle cellule di incubatrice. </li><li> Le cellule in espansione sarà pronto per tetramero dopo 13-15 giorni di coltura. </li></ol> 4. Visualizzare le cellule T dalla colorazione tetramero <ol><li> Acquisto o assemblare tetrameri per abbinare le combinazioni peptide / MHC che corrispondono ai CD4 + stimolato le cellule T (vedi la discussione per le fonti di reagenti tetramero). Tetrameri dovrebbe essere ~ 0,5 mg / ml soluzione. </li><li> Rimuovere la piastra da incubatore </li><li> Con attenzione erogare la metà dei mezzi di comunicazione di ogni bene </li><li> Trasferire un'aliquota di cellule da ogni pozzetto - tipicamente 75 microlitri o circa 50.000 cellule - in polistirolo 5 ml tubo FACS </li><li> Aggiungi tetramero - tipicamente 1 ml per 50 microlitri di volume totale - e il luogo in incubatore a 37 ° C per 1-2 ore. Si consiglia inoltre di macchiare un seconda aliquota di cellule di ogni bene con un tetramero non corrispondenti come controllo negativo. </li><li> Cellule etichetta con anti-CD3, anti-CD4, ed anticorpi anti-CD25 con l'aggiunta di 30-10 l di ogni anticorpo. Marcatori anticorpali aggiuntivi o alternativi possono essere utilizzati. Tuttavia, non utilizzare gli anticorpi PE etichettati dal momento che questo canale deve essere riservato al tetrameri. In questo momento, anche etichetta controlli singolo colore o isotipo utilizzando cellule in più. </li><li> Incubare cellule anticorpo marcato per 15-30 minuti in ghiaccio o a 4 ° C. </li><li> Lavare ciascuna provetta con 0,5 a 2 ml in esecuzione tampone e centrifugare a 230 × g per 10 minuti. </li><li> Con attenzione liquido decantare da tubi FACS. Conservare tutti i tubi in un recipiente coperto (preferibilmente su ghiaccio) per la successiva analisi FACS. </li></ol> 5. Flusso di acquisizione e analisi Citometro <ol><li> Calibrare il citofluorimetro utilizzando perline di riferimento. </li><li> Verificare le impostazioni dello strumento: <ol><li> Utilizzando cellule di controllo senza macchia o controlli isotipo, regolare la posizione del gate linfocitario vitale (FSC vs SSC). Rimuovere l'auto-fluorescenza da tutti i canali di centraggio della popolazione (modificando le impostazioni di guadagno) al di sotto del primo decennio su ogni asse. </li><li> Utilizzando solo i tubi di controllo del colore, gli eventi all'interno del centro quadranti corretta per ogni singolo colore (modificando le impostazioni di compensazione). </li><li> Fare una regolazione fine delle impostazioni dello strumento utilizzando un tubo colorato con un tetramero irrilevante. In particolare le impostazioni per il canale di PE può essere necessario regolare perché spesso tetrameri macchia più luminosa del controllo degli anticorpi. Il tetramero irrilevante dovrebbe macchia &lt;0,5% delle cellule CD4 +. </li></ol></li><li> Acquisire dati per ogni tubo <ol><li> Raccogliere eventi per ogni provetta e tubo controllo negativo </li><li> Acquisire e salvare almeno 20.000 eventi per Analysys </li></ol></li><li> Analizzare i dati <ol><li> Dati importare file in software di analisi FACS (ad esempio il software CellQuest, WinMDI o FlowJo). Inizia la tua analisi utilizzando un tubo colorato con un tetramero irrilevante. </li><li> Plot FSC vs SSC e disegnare un cancello intorno i linfociti dal vivo (Figura 1, pannello in alto a sinistra). </li><li> CD4 complotto contro CD3 (gated per mostrare linfociti vivere solo) e disegnare cancelli tutto il CD3 + e CD4 + popolazioni (Figura 1 pannello in alto a destra). </li><li> CD4 plot vs tetramero (gated per mostrare linfociti CD3 + solo) e impostare i confini quadrante in modo che i CD4 + tetramero + popolazione è inferiore allo 0,5% (Figura 1 pannello in basso a sinistra). </li><li> Plot CD25 vs tetramero (gated per mostrare linfociti CD4 + solo) e impostare i confini quadrante in modo che la popolazione tetramero + CD25 + è inferiore allo 0,5% (Figura 1 pannello in basso a destra). </li><li> Analizzare tutte le provette senza cambiare le porte. </li></ol></li></ol>1167/JOVE 20FIGURE%% "alt =" 201.png "width =" Figura 1 "height =" 600 342 "/&gt; Figura 1. Rappresentante di controllo negativo risultati della colorazione tetramero. Il pannello in alto a sinistra mostra in avanti side scatter versi dispersione e la dimensione del gate dei linfociti (R1). Il pannello in alto a destra è recintato per R1 e mostra formica-CD4 contro anti-CD3 e il CD3 + (R2) e CD4 + (R3) cancelli. Il pannello in basso a sinistra è recintato per R2 e mostra anti-CD4 rispetto al tetramero. Il pannello in basso a destra è recintato per R3 e mostra anti-CD25 contro tetramero. I quadranti di entrambe le trame tetramero sono stati fissati al 0,5%. 6. Rappresentante Risultati <ol><li> Le cellule tetramero positivo dovrebbe essere una popolazione distinta tra le cellule CD4 + espanse (Figura 2). </li><li> Cellule tetramero positivi sono di solito CD25 + CD4 e spesso elevata. </li><li> In alcuni casi, una combinazione MHC / peptide può dare la colorazione di fondo (spesso causati da un peptide con scarsa solubilità). Colorazione di fondo quali possono essere differenziati da un vero positivo perché il "falso positivo" le cellule non sono un unico popolo distinto sia sul CD4 rispetto tetramero o il CD25 vs trame tetramero (Figura 3). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%202.png" alt="" width="600" height="362"> Figura 2. Rappresentante positivi risultati della colorazione tetramero. Il layout del pannello e la strategia di gating sono identici alla figura 1. Le cellule tetramero positive appaiono come un popolo distinto CD4 alta sulla anti-CD4 rispetto al pannello di tetramero e una distinta popolazione CD25 + sul anti-CD25 contro pannello tetramero. <img src="/files/ftp_upload/1167/JOVE%20FIGURE%203.png" alt="Figura 3" width="600" height="336"> Figura 3. Rappresentante "falsi positivi" risultati della colorazione tetramero. Il layout del pannello e la strategia di gating sono identici alla figura 1. L'anti-CD4 rispetto al pannello tetramero mostra una colorazione indistinta "mounded". L'anti-CD25 contro tetramero mostra anche una colorazione "mounded", senza alcuna chiara tendenza verso l'essere CD25 +.

<ol><li>Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+Class+II+tetramers+permit+detection+and+characterization+of+peptide-specific+human+CD4%2B+T+cells+proliferating+to+influenza+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen.</a> J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).</li>
<li>Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetramer-guided+epitope+mapping%3A+rapid+identification+and+characterization+of+immunodominant+CD4%2B+T+cell+epitopes+from+complex+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tetramer-guided epitope mapping: rapid identification and characterization of immunodominant CD4+ T cell epitopes from complex antigens.</a> J. Immunol. 166, 6665-6670 (2001).</li>
</ol>

Comprendere il ruolo delle cellule T CD4 + nel immunità è di fondamentale importanza. Tuttavia, CD4 + antigene specifico le cellule T possono essere difficili da individuare e isolare con metodi tradizionali. Al contrario, tetrameri MHC di classe II permette la visualizzazione diretta delle cellule T CD4 + con la specificità antigene desiderato. Questo video dimostra l'isolamento, la purificazione e l'amplificazione in vitro di cellule T CD4 + e la loro successiva visualizzazione con tetrameri. Classe II sono tetrameri ...

<table><tbody><tr><td>Armadio di sicurezza biologica a flusso laminare di Classe 2</td><td>attrezzatura</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>1200</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Tubo conico da 50 mL</td><td>attrezzatura</td><td>VWR international</td><td>47747-182</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>PBS 1X (senza Ca/Mg)</td><td>reagente</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Ficoll-paque PLUS</td><td>reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>avvolto in alluminio per proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>Pipet Aid XP</td><td>attrezzatura</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-101</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Pipetta da 10 mL</td><td>attrezzatura</td><td>Corning</td><td>CLS4492</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Canister Aerosolve</td><td>attrezzatura</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>359481</td><td>con inserti da 50 mL</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>attrezzatura</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>GS-6R</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Pipette per trasferimento</td><td>attrezzatura</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>202-20S</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Pipette Pasteur</td><td>attrezzatura</td><td>VWR international</td><td>14672-200</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Buffer emolitico</td><td>reagente</td><td>N/D</td><td>N/D</td><td>8,3 g/L NH4Cl, 1,0 g/L NaHCO3, 0,04 g/L EDTA disodico</td></tr><tr><td>Blu di tripano</td><td>reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146</td><td>0,2% in PBS</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>attrezzatura</td><td>VWR international</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>Tubo conico da 15 mL</td><td>attrezzatura</td><td>VWR international</td><td>05-527-90</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Buffer di lavaggio</td><td>reagente</td><td>N/D</td><td>N/D</td><td>PBS + 2 mM EDTA + 5 g/L BSA</td></tr><tr><td>Kit di isolamento per cellule T CD4+ MACS II</td><td>reagente</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-155</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Magnete EasySep&amp;#174;</td><td>attrezzatura</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polipropilene da 5 mL</td><td>attrezzatura</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>reagente</td><td>Invitrogen</td><td>22400-089</td><td>con 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>Siero umano in pool</td><td>reagente</td><td>N/D</td><td>N/D</td><td>prelevato da donatori sani, inattivato termicamente e filtrato</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>reagente</td><td>Invitrogen</td><td>1570-063</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Filtro per bottiglia da 500 mL con pori da 0,22 micron</td><td>attrezzatura</td><td>Nalge Nunc international</td><td>595-3320</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Piastra a 48 pozzetti</td><td>attrezzatura</td><td>Costar</td><td>3548</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Incubatore a 37&amp;#x00B0;C con CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>attrezzatura</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Peptide sintetico da 20 mg/mL</td><td>reagente</td><td>N/D</td><td>N/D</td><td>Sintesi personalizzata da qualsiasi fornitore di peptidi</td></tr><tr><td>Tubo FACS da 5 mL</td><td>attrezzatura</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>In polistirene</td></tr><tr><td>Tetramero di classe II caricato con peptide (come descritto)</td><td>reagente</td><td>N/D</td><td>N/D</td><td>Preparato dal centro tetrameri del BRI</td></tr><tr><td>Anti-CD3</td><td>reagente</td><td>BD Biosciences</td><td>347344</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>reagente</td><td>eBioscience</td><td>17-0049-73</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Anti-CD25</td><td>reagente</td><td>eBioscience</td><td>11-0259-73</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Citometro a flusso Facs Calibur</td><td>attrezzatura</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>O equivalente</td></tr></tbody></table>

cd4 + antigene specifico visualizzando cellule t con mhc di classe ii tetrameri

Visualizing Antigen Specific CD4+ T Cells using MHC Class II Tetramers

Complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II tetrameri consentire la visualizzazione diretta dei CD4 + antigene specifico le cellule T mediante citometria di flusso. Questo metodo si basa sulla interazione altamente specifica tra peptide caricato MHC e il corrispondente delle cellule T del recettore. Mentre l&#39;affinità di un singolo MHC / peptide molecola è bassa, il cross-linking complessi MHC / peptide con streptavidina aumenta l&#39;avidità di interazione, consentendo il loro impiego come reagenti di colorazione. A causa delle frequenze relativamente basso di cellule CD4 + T (~ 1 in 300.000 per una specificità unica) questo saggio si avvale di una fase di amplificazione in vitro di aumentare la soglia di rilevazione. Cellule mononucleate sono purificati dal sangue periferico da sottofondo Ficoll. Cellule CD4 + sono poi separati da selezione negativa utilizzando cocktail biotinilato anticorpi e perle di anticorpi anti-biotina magnetico. Utilizzando cellule aderenti dalla frazione di cellule CD4 come cellule presentanti l&#39;antigene, cellule T CD4 + sono espanse in media con l&#39;aggiunta di un peptide antigenico e IL-2. Le cellule espanse sono colorati con la corrispondente classe II tetramero di incubazione a 37 ° C per un&#39;ora e successivamente colorati con anticorpi di superficie come anti-CD4, anti-CD3 e anti-CD25. Dopo l&#39;etichettatura, le cellule possono essere analizzati direttamente mediante citometria di flusso. Le cellule tetramero positivo tipicamente formano una popolazione distinta tra le cellule CD4 + espanse. Cellule tetramero positivi sono di solito CD25 + CD4 e spesso elevata. Perché il livello di colorazione di fondo tetramero possono variare, risultati colorazione positiva deve essere sempre rispetto alla colorazione delle stesse cellule con un tetramero irrilevante. Più varianti di questo test di base sono possibili. Cellule tetramero positivi possono essere ordinati per ulteriori analisi fenotipica, l&#39;inclusione in ELISPOT o saggi di proliferazione, o altre prove secondarie. Diversi gruppi hanno anche dimostrato di co-colorazione con tetrameri e uno anti-citochine o anti-FoxP3 anticorpi.

Questa procedura dimostra la purificazione e l&#39;espansione in vitro di cellule CD4 + antigene specifico le cellule T del sangue periferico da tutto e la loro visualizzazione utilizzando tetrameri MHC di classe II. Tetrameri consentire la visualizzazione diretta delle cellule T con una singola specificità antigenica e definito MHC di classe II restrizione.

CD4 + antigene specifico visualizzando cellule T con MHC di classe II tetrameri

I tetrameri del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe II consentono la visualizzazione diretta di cellule T CD4+ antigeno-specifiche tramite citometria a flusso. Questo metodo ...

Beh, ciò che è davvero unico del saggio Teer è che consente di visualizzare direttamente le cellule T specifiche per l'antigene. Il te, il teer è l'aspetto principale e unico del nostro saggio. Questo è abbinato a un passaggio di amplificazione che eseguiamo.Sai, isoliamo le cellule T e poi le coltiviamo in un ambiente che arricchisce il campione con le cellule T di nostro interesse. Successivamente, siamo in grado di etichettare specificamente solo quelle cellule e di visualizzarle mediante citometria a flusso. Con saggi precedenti, come quelli con CSFE o i saggi di proliferazione disponibili da decenni, ciò che si ottiene è una misurazione complessiva e globale di ciò che accade nell'intera popolazione di cellule T.Ma nel corpo sono presenti milioni di cellule T e queste riconoscono un'ampia varietà di pattern. Se si è fortunati, forse una cellula su due-trecentomila nel campione sarà quella che si sta cercando. Ecco perché questo saggio prevede passaggi di arricchimento.E poi, grazie a un numero di test, e poiché si esegue una colorazione diretta, è effettivamente possibile visualizzare, al di fuori del rumore di fondo, una popolazione inferiore all'1% del numero totale di cellule. In questo modo si riescono a vedere differenze minime e si può ottenere un conteggio piuttosto preciso del numero di cellule T presenti in quel campione di sangue, ovvero di quelle presenti in quell'individuo, che riconoscono il vostro modello di interesse. Ma non finisce qui, perché i tetrameri permettono anche di etichettare non soltanto tali cellule T, ma di isolarle per ulteriori analisi.E i tetrameri che utilizza sono effettivamente prodotti qui al BRI, è corretto? Sì. Siamo uno di un numero molto ristretto di laboratori nel paese che ha prodotto con successo tetrameri di classe due. Il nostro obiettivo è distribuire questi reagenti a costo ridotto a tutti i laboratori interessati ad adottare questa tecnologia.Quali sono, secondo lei, gli aspetti più difficili o complessi di questo saggio in relazione alla sua riproducibilità in altri laboratori? Beh, a pensarci bene, ce ne sono due: la coltura delle cellule T. È qualcosa che in realtà è un po' un'arte.Lei, ha quasi ogni giorno delle decisioni da prendere riguardo alla necessità di fornire ulteriori nutrienti o ulteriore spazio di crescita alle cellule. E poi la seconda parte, che ritengo probabilmente la più difficile per un operatore inesperto, è l'analisi dei dati. Capire quale parte del segnale rappresenti effettivamente una risposta positiva e quale parte sia invece semplicemente dovuta a fattori fisici o di attrazione.E il fatto che ogni cosa abbia un certo grado di adesività è qualcosa che, ancora una volta, richiede molta esperienza, specialmente in contesti in cui la risposta complessiva sarà leggermente debole. In che modo le informazioni che otterrete con questo saggio potrebbero beneficiare i pazienti in questa fase? Uno dei primi indicatori che emerge in qualsiasi paziente affetto da malattia autoimmune è una sorta di costellazione di anticorpi specifici per quella malattia.Sappiamo dai fondamenti fondamentali dell'immunologia che ogni volta che si verifica una risposta anticorpale, vi è sempre prima una risposta delle cellule T. Pertanto, se potessimo osservare in individui a rischio un aumento dell'attività delle cellule T che precede la formazione di anticorpi, ciò ci aiuterebbe a definire un nuovo livello di rischio o a identificare individui che stanno sviluppando autoanticorpi, aprendo così una finestra per terapie preventive. Questa procedura permetterà di purificare ed espandere cellule T CD4 positive specifiche per l'antigene e di visualizzarle mediante reagenti tetramerici e attrezzature come le cappe a flusso laminare di classe due.Questo sarà lo spazio di lavoro principale per la procedura. Tubi conici da 50 millilitri, tubo principale per l'isolamento dei PBMC, un XPBS. Deve essere privo di calcio e magnesio, confezionato in foglio di alluminio avvolto per proteggere dalla luce, pipetta automatica, pipette CoStar da 10 mil, contenitori aerosol con inserti da 50 mil utilizzati per prevenire la contaminazione del centrifugo con sangue.Pipette per centrifuga GS six R, pipette di Pasteur, tampone emolitico contenente 8,3 grammi per litro di cloruro di ammonio, 1,0 grammi per litro di bicarbonato di sodio, 0,04 grammi per litro di EDTA sodico trian blu, soluzione allo 0,2% in PBS, emocitometro, provetta conica da 15 millilitri, tampone di lavaggio contenente PBS integrato con due millimoli di EDTA più cinque grammi per litro.Kit di isolamento BSA max CD quattro due acquistato da Milin biotech EP, blocco magnetico acquistato da stem cell technologies. Altre piattaforme di arricchimento cellulare magnetiche potrebbero essere utilizzate con uguale efficacia. Tubo in polipropilene da cinque millilitri, RPMI 1640 integrato con 25 millimoli di hippies utilizzato per preparare il mezzo per linfociti T, siero umano pooled utilizzato per integrare il mezzo per linfociti T, pen strip utilizzato per integrare il mezzo per linfociti T, filtro sterile da 500 millilitri con membrana da 0,22 micron, piastra sterile a 48 pozzetti utilizzata per la coltura di espansione in vitro, passaggio in incubatrice a 37 gradi in atmosfera di CO2, soluzione da 20 milligrammi per millilitro di peptide sintetico contenente l'epitopo di interesse.Utilizzare un tubo in polistirene da 5 ml caricato con peptidi, appartenente alla classe due del sistema teer, per visualizzare le cellule T specifiche per l'antigene, insieme ad anticorpi anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD25 utilizzati per ricoprire le cellule T specifiche per l'antigene. Impiegare un citofluorimetro Fax Calibur o equivalente prima di iniziare la procedura. Assemblare tutti i materiali e le attrezzature nel proprio posto di lavoro.La seguente dimostrazione illustrerà i passaggi seguenti. Isolamento di PBMC, separazione di linfociti T CD4 positivi, coltura di espansione in vitro, visualizzazione dei linfociti T mediante teem o colorazione. Passaggio uno: isolamento di PBMC.Prelevare un campione di sangue. Il sangue deve essere raccolto in siringhe o provette per sangue e anticoagulato con eparina in un rapporto di uno a cinquanta per prevenire la coagulazione; si prevede un rendimento di circa 1 milione di PBMC per millilitro di sangue. Circa il 40% di questi saranno cellule T positive per CD4.Aliquotare il sangue in provette coniche da 50 millilitri, con 25 millilitri di sangue per provetta. Mescolare delicatamente il sangue prima che coaguli per distribuire uniformemente il plasma.Aggiungere PBS portando il volume totale a 40 millilitri e sottoporre a stratificazione lasciando defluire 11 millilitri di fial inserendolo nel tubo ematico e rimuovendo con attenzione l'ausilio della pipetta dalla pipetta. Il fial si svuoterà lentamente nella parte inferiore del tubo. Una volta che il livello si sarà equilibrato, rimuovere lentamente la pipetta dal tubo ematico, chiudere con tappo i tubi ematici e trasferirli nell'aerosol dei contenitori.Chiudere saldamente i contenitori e centrifugare a 900 volte G per 20 minuti senza frenata. È fondamentale non applicare alcuna frenata al termine della centrifugazione, poiché la forza di arresto potrebbe disturbare lo strato cellulare dopo la corsa. I PBMC dovrebbero formare uno strato bianco ben definito tra il plasma giallo soprastante e il fial trasparente sottostante.Rimuovere delicatamente lo strato di cellule bianche del sangue utilizzando una pipetta di trasferimento e trasferirlo in un nuovo tubo. Alcuni plasma e fial possono essere aspirati insieme ai PBMC, ma evitare di aspirare qualsiasi parte dello strato di globuli rossi. Tipicamente, in questo passaggio, due tubi di sangue possono essere combinati in un unico tubo cellulare.Per aumentare le dimensioni del pellet, aggiungere PBS fino a raggiungere un volume totale di 15 millilitri e centrifugare a 500 ×g per 15 minuti con freno basso; aspirare il liquido dai contenitori con un contagocce, avendo cura di non disturbare il pellet. Trattare con tampone emolitico aggiungendo da cinque a sei millilitri in ogni provetta e mescolando delicatamente per rimuovere i grumi. Incubare per non più di cinque minuti.Aggiungere PBS portando il volume totale a 50 millilitri e centrifugare a 230 ×g per 10 minuti. Per queste centrifugazioni più lente, i contenitori sotto pressione per aerosol non sono più necessari. Lavare due volte, aspirare il liquido utilizzando una pipetta di Pasteur, riempire il tubo con PBS e centrifugare a 230 ×g per 10 minuti prima del passaggio finale di lavaggio; prelevare un’aliquota di cellule risospese, diluire con tripan blu e contare utilizzando un emocitometro.Questo conteggio cellulare determinerà i volumi di reagente utilizzati nella separazione dei linfociti T. Passo due: separazione dei linfociti T positivi per CD4. Aspirare il liquido e aggiungere il buffer di lavaggio per portare il volume totale a 40 microlitri ogni 10 milioni di cellule. Di solito sono necessari 30 microlitri di buffer più il volume residuo del pellet.Trasferire questo volume in un tubo conico da 15 millilitri. Aggiungere il cocktail di anticorpi proveniente dai kit di isolamento CD4, 10 microlitri ogni 10 milioni di cellule per tubo, e porre sul ghiaccio per 10 minuti. Rimuovere il tubo dal ghiaccio, togliere il cappuccio e aggiungere 30 microlitri di buffer di lavaggio ogni 10 milioni di cellule.Aggiungere le perle magnetiche del kit di isolamento CD4. 20 microlitri ogni 10 milioni di cellule per provetta e mettere sul ghiaccio per 15 minuti. Aggiungere 10 volumi di buffer di lavaggio e centrifugare a 230 ×g per 10 minuti.Durante la centrifugazione, preparare il magnete e un tubo in polipropilene da cinque millilitri nel proprio posto di lavoro. Aspirare il liquido dal pellet cellulare. Aggiungere due millilitri di buffer di lavaggio e rimuovere i grumi utilizzando una pipetta di trasferimento.Utilizzando la stessa pipetta di trasferimento, trasferire le cellule nel tubo da cinque millilitri e incubare nel magnete per 15 minuti. Decantare con attenzione la frazione di linfociti T CD4 positivi in un tubo da 15 ml marcato, capovolgendo il magnete e svuotando tutto tranne l'ultima goccia. Aggiungere altri due millilitri di buffer di lavaggio al tubo da cinque millilitri e rimuoverlo dal magnete.Risciacquare delicatamente le cellule CD4 negative dalle pareti del tubo e trasferirle in un tubo da 15 ml marcato. Aggiungere due millilitri di mezzo per linfociti T in ogni tubo. Prelievarne aliquote per il conteggio cellulare e centrifugare a 230 ×g per 10 minuti.Diluire aliquote cellulari con trian blu e contare utilizzando un emocitometro. Questi conteggi cellulari determineranno il numero di pozzetti utilizzati per la coltura di espansione. Passo tre.Aspirare il liquido della coltura di espansione in vitro dai pellet cellulari CD4 positivi e CD4 negativi in base al numero di cellule. Aggiungere mezzo ai globuli CD4 positivi per aggiustare il volume a 3 milioni di cellule per ml. Aggiungere mezzo ai globuli CD4 negativi per aggiustare il volume a 10 milioni di cellule per ml.La coltura di espansione richiede 3 milioni di cellule CD4 negative per pozzetto e da due a tre milioni di cellule CD4 positive per pozzetto. In genere, le cellule CD4 positive rappresentano la popolazione limitante. Aliquotare le cellule CD4 negative nel numero appropriato di pozzetti di una piastra a 48 pozzetti.Aggiungendo 300 microlitri in ciascun pozzetto, posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi per un'ora. Rimuovere la piastra dall'incubatore, lavare i pozzetti aggiungendo 500 microlitri di mezzo fresco ed eseguendo 12-20 aspirazioni e dispense delicate utilizzando una pipetta transfer, quindi rimuovendo tutto il liquido. Questo lavaggio lascerà un strato di cellule presentatrici di antigene aderenti.Al termine del lavaggio, aggiungere una quantità sufficiente di mezzo per inumidire il fondo di ciascuna pozzetta, circa 100 microlitri. In caso contrario, le cellule aderenti si seccheranno. Se necessario, aggiungere da due a tre milioni di cellule CD4 positive a ciascuna pozzetta.Aggiungere ulteriore mezzo fino a raggiungere un volume totale di un millilitro in ogni pozzetto. Aggiungere il peptide desiderato a ciascun pozzetto. La concentrazione tipica per la stimolazione è di 10 microgrammi per millilitro.Posizionare infine la piastra in un incubatore a 37 gradi per sette giorni. Dopo sette giorni, aggiungere 50 microlitri di hemo IL due in ogni pozzetto ogni giorno successivo.Monitorare la crescita cellulare utilizzando un microscopio, alimentando le pozzette non ancora confluenti rimuovendo metà del mezzo, aggiungendo mezzo fresco e 50 microlitri di IL; dividere le pozzette confluenti sospendendo le cellule, spostando metà delle cellule in una pozzetta vuota, aggiungendo mezzo fresco e 50 microlitri di IL, quindi reinserire le cellule nell'incubatore. Le cellule in espansione saranno pronte per la colorazione teer dopo 13-15 giorni di coltura.Passaggio quattro, visualizzazione dei linfociti T mediante colorazione con tetramero, acquistare o assemblare tetrameri corrispondenti al peptide. Combinazioni peptidiche-MHC utilizzate per stimolare i linfociti T positivi per CD4. Rimuovere la piastra dall'incubatore.Aspirare con attenzione metà del mezzo da ciascun pozzetto. Trasferire un'aliquota di cellule da ogni pozzetto, tipicamente 75 microlitri o circa 50.000 cellule, in un tubo Fax in polistirene da cinque millilitri, aggiungere teer tipicamente un microlitro per ogni 50 microlitri di volume totale e incubare per un'ora a 37 gradi. È inoltre consigliabile colorare una seconda aliquota di ciascun pozzetto con un teer non abbinato come controllo negativo, etichettando le cellule con anticorpi anti CD tre, anti CD quattro e anti CD 25.È possibile utilizzare marcatori anticorpali aggiuntivi o alternativi. Tuttavia, non utilizzare anticorpi marcati con PE poiché questo canale deve essere riservato ai teems per il momento. Inoltre, etichettare eventuali controlli monocromatici o di isotipo utilizzando cellule extra.Incubare le cellule marcate con anticorpo da 15 a 30 minuti a quattro gradi. Lavare ogni provetta con da 0,5 a un millilitro di buffer di lavaggio e centrifugare a 230 ×g per 10 minuti. Rimuovere con attenzione il liquido dalle provette, calibrare il citofluorimetro utilizzando perline di riferimento, provette di controllo monocromatiche, controlli isotipici ed et cetera.Analizzare ogni provetta utilizzando il citometro a flusso. Le cellule tetra positive dovrebbero costituire una popolazione distinta all'interno delle cellule T CD4 positive espanse. Le cellule tetra positive sono solitamente CD25 positive e spesso CD4 high.

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