Name: Lelaborazione del Pino Loblolly PtGen2 cDNA Microarray (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Scopri le tecniche di lavaggio e gestione del microarray PtGen2 per studi di espressione genica nel pino loblolly. Questo metodo standardizzato migliora la consistenza del segnale e riduce il rumore di fondo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

L&#39;etichettatura, ibridazione, e protocolli di lavaggio nel presente documento contiene alcune modifiche a quelli sviluppati in precedenza dal Dr. J. Quackenbush mentre presso l&#39;Institute for Genomic Research (TIGR), il dottor Shawn Levy al Microarray Vanderbilt Shared Resource (VMSR), e il Dr. Rob Alba mentre al Boyce Thompson Institute, (ITV) Cornell University.

(Nota sezioni 1 - 4 Non dimostrato in video) Preparazione Cy-etichetta target cDNA Quello che segue è il protocollo che usiamo per la sintesi di cDNA da RNA pino loblolly totale e indiretta etichettatura cDNA microarray prima di ibridazioni. Anche se pochi, non banali sono state apportate modifiche, il protocollo sottostante è simile a quello nel manuale di istruzioni fornito con il kit SuperScript Invitrogen indiretta Etichettatura cDNA. Parte 1: Prima Strand reazione di sintesi del DNA <ol><li> Mescolare e girare brevemente ogni componente del kit prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare le reazioni come segue: <ul><li> Xμl DEPC-H 2 O </li><li> Xμl RNA totale, 20 mcg / reazione (pretrattati con Ambion Turbo DNasi) </li><li> 2μl Ancorato Oligo (dT) 20 Primer (2.5μg/μl) </li><li> 1ml Primer esamero casuale </li><li style="list-style:none;"> Volume totale = 18μl </li></ul></li><li> Incubare le provette a 70 ° C per 5 minuti, e poi posto in ghiaccio per 1-2 minuti. </li><li> Aggiungere quanto segue ogni tubo di reazione sul ghiaccio: <ul><li> 6μl 5X First-Strand tampone </li><li> 1.5μl 0.1M DTT </li><li> 1.5μl 10mM dNTP mix </li><li> 1ml RNaseOUT (40U/μl) </li><li> 2μl SuperScript III RT (400U/μl) </li></ul></li><li> Mescolare delicatamente e centrifugare brevemente. Incubare la provetta in una notte a 45 ° C. </li><li> Aggiungere 15μl di NaOH 1M per ogni tubo di reazione e mescolare accuratamente. </li><li> Incubare la provetta a 70 ° C per 10 minuti. </li><li> Aggiungere 15μl di HCl 1M, mescolare delicatamente. </li><li> Aggiungere 20μl acetato di sodio 3M (pH 5.2); mescolare delicatamente. </li></ol> Parte 2: Purificante First-Strand cDNA. <ol><li> Aggiungere 500μl di tampone di caricamento per il cDNA (dal punto 1.9) e mescolare bene. </li><li> Inserire una colonna di purificazione SNAP (fornito con il kit etichettatura indiretta) su un tubo di raccolta e caricare i vostri cDNA sulla colonna. </li><li> Spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto; scartare il flow-through. </li><li> Posizionare la colonna SNAP sul tubo stessa collezione e aggiungere 500μl di tampone di lavaggio. </li><li> Spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto; scartare il flow-through. </li><li> Ripetere i punti 2.4 e 2.5 per tre volte, per un totale di tre lavaggi 500μl. </li><li> Spin ancora una volta a 14.000 g a temperatura ambiente per minuto sec 1; scartare il flow-through. </li><li> Posizionare la colonna SNAP su un nuovo tubo 1,5 ml. </li><li> Aggiungere 50μl di caldo DEPC-acqua (50 ° C) alla colonna e colonna SNAP incubare a temperatura ambiente per 1 minuto. Eluire il cDNA tramite uno spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto. </li><li> Ripetere il punto 2.9, con 100μl di caldo DEPC acqua e il tubo stesso 1,5 ml per l&#39;eluente. </li><li> Aggiungere 20μl di acetato di sodio 3M (pH 5.2) per l&#39;eluente passi da 2.9 e 2.10. </li><li> Aggiungi 3μl di glicogeno (20mg/ml) per il tubo e mescolare. </li><li> Aggiungere 500μl di ghiaccio freddo EtOH 100%, mescolare bene e incubare la provetta per 1 ora a -80 ° C. </li><li> Rotazione del tubo a 14.000 g a 4 ° C per 20 minuti. Rimuovere con attenzione il sopranatante. </li><li> Aggiungere 500μl di ghiacciata EtOH 70% e ruotare il tubo a 14.000 g a 4 ° C per 5 minuti. Rimuovere con attenzione il sopranatante. </li><li> Far asciugare il campione per 5 minuti; garantire che tutte le EtOH viene rimosso. </li><li> Scaldare il buffer 2X accoppiamento a 37 ° C per 5 minuti e risospendere il campione in cDNA 5μl di caldo Buffer accoppiamento 2X. </li><li> Riscaldare il cDNA / buffer di accoppiamento a 50 ° C per 10 minuti e vortice bene. Assicurarsi che il cDNA pellet è completamente risospeso nel tampone di accoppiamento 2X. </li></ol> Parte 3: Etichettatura con colorante fluorescente Nel preparare la reazione, fare attenzione a minimizzare l&#39;esposizione della soluzione colorante alla luce. Inoltre, DMSO è igroscopico e assorbe l&#39;umidità dall&#39;aria, che reagisce con l&#39;estere NHS del colorante e ridurre significativamente l&#39;efficienza di reazione di accoppiamento. Tenere il DMSO fornito nel kit in un tappo a vite ambra fiala a -20 ° C, e lasciare che il flacone a temperatura ambiente prima di aprire per evitare la condensa. Usare solo il DMSO fornito con questo kit. <ol><li> Aprire un pacchetto di Cy-3 o Cy-5 Dye e aggiungere 75μl di DMSO direttamente nel flacone colorante. </li><li> Aggiungere 5μl della soluzione di DMSO / colorante per il tubo dal punto 2.18. </li><li> Mescolare bene e incubare il tubo a temperatura ambiente al buio per 1 ora. </li><li> Aggiungere 20μl di acetato di sodio 3M (pH 5.2) per la soluzione colorante accoppiata cDNA. </li><li> Aggiungere 500μl di tampone di caricamento per la soluzione di cDNA. Mescolare bene nel vortex. </li><li> Inserire una colonna SNAP su un tubo di raccolta chiara e caricare la soluzione di cDNA / tampone. </li><li> Spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto; scartare il flow-through. </li><li> Posizionare la colonna SNAP sulla stessa collezionetubo, aggiungere 500μl di soluzione di lavaggio colonna. </li><li> Spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto; scartare il flow-through. </li><li> Ripetere i passaggi 3. 8-3,9 tre volte, per un totale di tre lavaggi 500μl. </li><li> Spin ancora una volta a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto; scartare il flow-through. </li><li> Posizionare la colonna SNAP su un nuovo tubo di raccolta ambra. </li><li> Aggiungere 65μl di caldo DEPC-acqua (50 ° C) per la colonna SNAP e incubare a temperatura ambiente per 1 minuto. </li><li> Spin a 14.000 g a temperatura ambiente per 1 minuto e raccogliere il deflusso. Il flusso attraverso dovrebbe contenere 60μl del vostro purificato dye-accoppiato cDNA. </li></ol> Parte 4: Valutazione della procedura di etichettatura. <ol><li> Condurre un test spettrofotometro per valutare ogni Cy-cDNA etichettatura. Calcolare il numero totale di pmol di cDNA sintetizzato: [OD 260 x vol. x 37ng/μl x 10 3 ng / pg] / 324,5 pg / pmol. Calcolare il totale di pmol incorporato Cy-Dye per ogni reazione di marcatura: pmol Cy3 = [OD 550 X vol.] / 0,15; pmol Cy5 = [OD 650 X vol.] / 0,25. Successivamente, calcolare la pmol di nucleotidi / pmol rapporto colorante per ogni reazione. Reazioni ottimale generare 6000pmol&gt; di cDNA (per 60ul),&gt; 200pmol di Cy-Dye (per 60ul), e un rapporto di nucleotidi / colorante che è &lt;30. </li></ol> Parte 5: Presentazione Pre-Wash <ol><li> Array PtGen2 è stampato su Corning diapositive UltraGaps (amino-silano rivestito) e cDNA sono UV-reticolato. Macchie di stampa sono chiaramente visibili a causa del contenuto di sale del buffer. </li><li> Utilizzare una penna a punta di diamante per segnare la diapositiva per le aree superiore e inferiore dell&#39;area di stampa (opzionale). </li><li> Mettere circa 250mL pre-riscaldato a 43 ° C soluzione allo 0,2% SDS nel lavare i piatti vetrino da microscopio (3 &quot;x 4&quot;). </li><li> Collocare i vetrini per essere pre-ibridato nel rack diapositive e immergersi nella soluzione di SDS 15-20 volte molto energicamente per rimuovere i sali nelle diapositive. </li><li> Prendere con cautela rimuovere le diapositive dal rack e metterli in una vaschetta Coplin contenente Pre-ibridazione Buffer (5X SSC, 0,1% SDS, 1% BSA) che è stato pre-riscaldato a 43 ° C. Incubare a 43 ° C per almeno un&#39;ora. </li></ol> Parte 6: Pre-ibridazione <ol><li> Impostare fino a cinque piatti scivolare lavaggio, ognuno dei quali contiene millipure dH 2 O, e una vaschetta Coplin piena molecolare grado isopropanolo. Porre i vetrini in un rack di diapositive e di processo in modo sequenziale attraverso cinque piatti da inzuppare 20 volte ciascuno. </li><li> Rimuovere diapositive due alla volta dal lavaggio con acqua quinto e tuffo 5-6 volte al posto isopropanolo e immediatamente nelle diapositive in microcentrifuga diapositive (da banco Chipmate, 2 posizioni) e spin 1 minuto ad asciugare. </li><li> Vetrini puliti con aria compressa filtrata attraverso una cartuccia filtrante 0,22 mM e metterli con il codice a barre rivolto verso l&#39;alto in un Genomic Hybridization Camera Solutions. </li><li> LifterSlips Clean ™ con aria filtrata e posizionarli nelle diapositive con le strisce bianche verso il basso. Utilizzare una punta di giallo pipetta per allineare scivolare delicatamente il sollevatore sul vetrino (lavaggio LifterSlips ™ prima in etanolo al 70% è facoltativo. Abbiamo trovato non sia necessario.) </li></ol> Parte 7: ibridazione Deve essere effettuata alla luce scura o bassa. <ol><li> Per ogni diapositiva di essere ibridato, calcolare la quantità di Cy-5-3 e Cy cDNA marcato per dare 50-75pmol di ciascun target. Combinare tali importi in un unico tubo e asciutto in un essiccatore a vuoto con l&#39;impostazione di calore a 37-45 ° C. Evitare di asciugare completamente! </li><li> Risospendere le sonde secco in tampone di ibridazione da 60 ml (fatto fresco quel giorno) e mescolare brevemente nel vortex. </li><li> Incubare il cDNA risospeso per 5 minuti in un bagno di 95 ° C e poi microcentrifuga veloce per 30 secondi. </li><li> Carico l&#39;intero volume della sonda risospeso lentamente pipettamento a slide-LifterSlip ™ incrocio nella parte inferiore (fine codice a barre) della diapositiva. La slitta si caricherà attraverso l&#39;azione capillare. (Alcuni preferiscono pipetta alla diapositiva e poi delicatamente la sovrapposizione LifterSlip ™ questo è un metodo di colpo perché se si ottiene bolle non è possibile spostare l&#39;™ LifterSlip dopo il posizionamento che può portare a posto artefatti sbavature) </li><li> 20 ul luogo di DTT 100mM in ogni umidità ben posizionato alle estremità della camera. </li><li> Posizionare la parte superiore sulla camera e stringere le viti della camma. Coprire la camera con un foglio di alluminio e immergere in un bagno d&#39;acqua ° 48 C per 12-18 ore con agitazione a 50-60 giri al minuto. </li></ol> Parte 8: Post-ibridazione lava Tutti i lavaggi devono essere effettuati nel buio o in luce scarsa. Diapositive non dovrebbe mai essere permesso per asciugare fino alla fase finale. <ol><li> Impostare una vaschetta Coplin piena di soluzione di lavaggio # 1 @ 53 ° C, e quattro piatti di far scorrere il lavaggio pieno di 250 ml di ciascuna delle seguenti: 1) Wcenere Soluzione # 1 @ 53 ° C, 2) la soluzione di lavaggio # 2 @ temperatura ambiente, 3 e 4) due piatti contenenti soluzione di lavaggio # 3 @ temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere con attenzione le diapositive dalla camere di ibridazione e metterli due per volta nel vaso Coplin. Lasciare agire per 30 secondi, quindi sollevare il sfilare lentamente e la polizza di sollevatore rimarrà nel barattolo. Collocare i vetrini nel rack diapositive e subito immergere in soluzione di lavaggio # 1 (1X SSC, 0,2% SDS, preriscaldamento a 43 ° C). Ripetere fino a quando tutti LifterSlips vengono rimossi e tutte le diapositive da lavare sono nella soluzione di lavaggio # 1 piatto. Tuffo a rack su e giù per 10 volte con vigore. </li><li> Piatto posto a 53 ° C in aria shaker con agitazione a 50-100 rpm per 10 minuti. </li><li> Trasferimento rack per la soluzione di lavaggio # 2 (0,1 X. SSC, 0,2% SDS), tuffo 10 volte, e incubare a temperatura ambiente, agitando lento per 10 minuti. </li><li> Tuffo a rack 15 volte nella soluzione di lavaggio primo # 3 (0,1 X. SSC) per rimuovere eventuali residui SDS riporto dalla soluzione di lavaggio # 2. Cremagliera posto nella soluzione di lavaggio # 3 secondo piatto, immergersi per 10 volte, e poi lenta agitazione per 10 minuti. </li><li> Collocare i vetrini in 50mL tubi Falcon innevate e spin @ 1.500 giri in centrifuga dotato di un rotore oscillante. Rimuovere diapositive alla luce contenitore impermeabile, usiamo un altro tubo Falcon coperto con un foglio di alluminio e eliminare l&#39;aria dal tubo con gas di azoto, il tappo (che riduce l&#39;ossidazione dei coloranti Cy, specialmente Cy-5 in estate, quando i livelli di ozono sono più alti ). Le diapositive possono essere conservati per un paio d&#39;ore prima della scansione nei tubi di azoto eliminato, tuttavia, i risultati migliori si ottengono quando il segnale di scansione viene effettuata immediatamente dopo il lavaggio. </li></ol> Parte 9: Raccolta dati e analisi statistica <ol><li> Dati delle immagini di scansione è raccolto su un ScanArray PerkinElmer. Usiamo una impostazione di scansione 10 micron ed equilibrio Cy3 e Cy5 segnali utilizzando il metodo di regolazione linea secondo le istruzioni del produttore. </li><li> TIF sono griglia e dati del segnale grezzi raccolti e filtrati con ImaGene versione 7.5 (BioDiscovery, Inc., El Segundo, CA) </li><li> Normalizzazione dei dati e la valutazione per determinare statisticamente validi specie espressi in modo differenziale si fa con BRB Array strumenti Ver. 3.7. </li><li> Analisi di modelli per facilitare la determinazione di geni espressi coordinatamente è fatto con il software analisi di espressione genica Pattern (GEPAS) Ver. 3.1. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1182/Figure1_WWLorenz-1.png" alt="Figura 1" /> Figura 1. Esempio di PtGen2 serie elaborati utilizzando questa l. protoco <img src="/files/ftp_upload/1182/Figure2_WWLorenz.png" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esempio di PtGen2 serie trattati mediante ibridazione standard e protocolli di lavaggio.

<ol><li>Lorenz, W. W., Sun, F., Liang, C., Kolychev, D., Wang, H., Zhao, X., Cordonnier-Pratt, M. M., Pratt, L. H., Dean, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+stress-responsive+genes+in+loblolly+pine+%28Pinus+taeda%29+roots+identified+by+analyses+of+expressed+sequence+tag+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Tree+Physiol%22%5BJournal%5D)">Water stress-responsive genes in loblolly pine (Pinus taeda) roots identified by analyses of expressed sequence tag libraries.</a> Tree Physiol. 26, 1-16 (2006).</li>
<li>Lorenz, W. W., Dean, J. F. D. unpublished data. , Forthcoming.</li>
<li>Hegde, P., Qi, R., Abernathy, K., Gay, C., Dharap, S., Gaspard, R., Hughes, J. E., Snesrud, E., Lee, N., Quackenbush, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA microarray analysis.</a> Biotechniques. 29, 548-562 (2000).</li>
<li>Alba, R., Fei, Z., Payton, P., Liu, Y., Moore, S. L., Debbie, P., Cohn, J., D'Ascenzo, M., Gordon, J. S., Rose, J. K. C., Martin, G., Tanksley, S. D., Bouzayen, M., Molly, M., Jahn, M. M., Giovannoni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESTs%2C+cDNA+microarrays%2C+and+gene+expression+profiling%3A+tools+for+dissecting+plant+physiology+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">ESTs, cDNA microarrays, and gene expression profiling: tools for dissecting plant physiology and development.</a> The Plant Journal. 39, 697-714 (2004).</li>
<li>Lorenz, W. W., Simões, M., Miguel, C., Dean, J. F. D. Analysis of Gene Expression changes in Pinus species using a Loblolly pine cDNA microarray. IUFRO-CTIA 2008 Joint Conference. August 25-29, Quebec City, Quebec, , (2008).</li>
<li>Simões, M., Lorenz, W. W., Alba, A., Gonçalves, S., Dean, J., Miguel, C. Global gene expression analysis during P. pinaster embryo development. 7th Plant Genomics European Meeting. September 24-27, Albena, Bulgaria, , (2008).</li>
</ol>

PtGen2 è sviluppata di recente, cDNA microarray personalizzati che è stato progettato per essere utilizzato principalmente dalla comunità di ricerca loblolly pino. I risultati preliminari generato finora hanno mostrato l&#39;array di essere un valido strumento nella valutazione degli eventi trascrizionale che si verificano in risposta a stress idrico, così come nel monitoraggio dei cambiamenti che si verificano durante lo sviluppo embrionale in pino marittimo, Pinus pinaster 5,6 Abbiamo inoltre recen...

<table><tbody><tr><td>Buffer di pre-ibridazione</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>5X SSC, 0,1% SDS, 1% BSA</td></tr><tr><td>Buffer di ibridazione</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>30% formammide, 5X SSC, 5X Denhardt&amp;rsquo;s, RNA PolyA al 1% (Invitrogen, POLYA.GF), SDS allo 0,1%</td></tr><tr><td>Soluzione Lavaggio n. 1</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>1X SSC, 0,2% SDS, preriscaldare a 43&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Soluzione di Lavaggio n. 2</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>0,1X SSC, 0,2% SDS</td></tr><tr><td>Soluzione di Lavaggio n. 3</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>0,1X SSC</td></tr><tr><td>Alcol isopropilico</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34959-2,5 L</td><td></td></tr><tr><td>Tubi conici da 50 mL</td><td>Altro</td><td>Falcon BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubi conici da 15 mL</td><td>Altro</td><td>Falcon BD</td><td>352196</td><td>Utilizzare questo o un tappo simile posizionato alla base di ogni tubo conico da 50 mL durante la centrifugazione</td></tr><tr><td>Vaso Coplin</td><td></td><td>Wheaton</td><td>900520</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colorazione &amp;e supporto </td><td>Altro</td><td>Wheaton</td><td>900200</td><td></td></tr><tr><td>Albumina da siero bovino (BSA)</td><td>Altro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9418</td><td></td></tr><tr><td>RNA poliA</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>POLYA.GF</td><td></td></tr><tr><td>Etichettatura indiretta del cDNA con SuperScriptTM </td><td>Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L1014-02</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNasi</td><td>Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>Sistema</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colorante Cy-5</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>PA25001</td><td></td></tr><tr><td>Colorante Cy-3</td><td>Reagente</td><td>GE Healthcare</td><td>PA23001</td><td></td></tr><tr><td>LifterSlips&amp;#8482;</td><td>Altro</td><td>Erie Scientific</td><td>25X601</td><td></td></tr><tr><td>HybChambers</td><td>Attrezzature</td><td>GeneMachines</td><td>JHYB200003</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;elaborazione del pino loblolly ptgen2 cdna microarray

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 è una caratteristica del DNA microarray 26.496 contenente amplificato EST pino loblolly. La serie è prodotta nel nostro laboratorio per l&#39;utilizzo da parte di ricercatori studiando l&#39;espressione genica in specie di pino ed altre conifere. PtGen2 è stato sviluppato come risultato degli sforzi gene nostra scoperta in pino loblolly, ed è composto da sequenze identificate principalmente dai tessuti radice, ma anche da ago e staminali. 1,2 PtGen2 è stato testato da ibridare differenti Cy-dye etichettati cDNA bersaglio di conifere , utilizzando sia amplificato e non amplificati modalità di etichettatura indiretti, e anche testato con una serie di condizioni di ibridazione e di lavaggio. Questo video si concentra sulla gestione e l&#39;elaborazione di diapositive prima e dopo la pre-ibridazione, così come dopo ibridazione, con alcune modifiche alle procedure sviluppate in precedenza. 3,4 inclusi anche, in forma di testo unico, sono i protocolli utilizzati per la generazione, l&#39;etichettatura e la pulizia di s cDNA bersaglio, così come informazioni sul software utilizzato per l&#39;elaborazione dei dati a valle. PtGen2 è stampato con un buffer di stampa proprietario che contiene alte concentrazioni di sale che possono essere difficili da rimuovere completamente. I vetrini vengono lavati prima di una soluzione calda SDS prima di pre-ibridazione. Dopo la pre-ibridazione, le diapositive vengono lavati con vigore in diversi cambiamenti di acqua per completare la rimozione dei sali rimanenti. LifterSlips ™ sono quindi puliti e posizionati sul diapositive e cDNA marcato è attentamente caricati sul microarray per mezzo di un&#39;azione capillare che prevede anche la distribuzione del campione lungo la diapositiva e riduce la possibilità di incorporazione bolla. Ibridazione degli obiettivi alla matrice avviene a 48 ° C in condizioni di elevata umidità. Dopo l&#39;ibridazione, una serie di lavaggi standard sono fatto a 53 ° C e temperatura ambiente per tempi prolungati. Elaborazione PtGen2 diapositive utilizzando questa tecnica riduce sale e SDS-derivati ​​artefatti spesso visto quando l&#39;array è un&#39;elaborazione meno rigorosamente. Ibridazione obiettivi derivanti da diverse fonti diverse conifere RNA, questo protocollo di elaborazione prodotto un minor numero di artefatti, sfondo ridotto, e ha fornito una migliore coerenza tra i diversi gruppi sperimentali di array.

Il cDNA microarray PtGen2 stato sviluppato per studi di espressione genica in pino loblolly,<em&gt; P. taeda</em&gt;, E altre specie di conifere. Qui mostriamo pre-e post-ibridazione manipolazione e il lavaggio delle tecniche che possono essere utilizzati con questo array per produrre una maggiore coerenza, manufatti ridotti e inferiori sfondi.

L&#39;elaborazione del Pino Loblolly PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 è un microarray di cDNA con 26.496 feature contenente EST di pino tasso amplificati. L'array è prodotto presso il nostro laboratorio per l'uso da parte di ricercatori...

Questo video è stato prodotto da ricercatori della Warnell School of Forestry and Natural Resources dell'Università della Georgia. Lo scopo di questo video formativo è illustrare nel dettaglio come processare la nostra microarray di cDNA da pino lolly LOB, genotipo due, prestando particolare attenzione alle fasi di lavaggio e manipolazione della matrice, sia prima che dopo l'ibridazione. In generale, i nostri protocolli seguono quelli sviluppati presso l'Institute for Genomic Research Tiger e la Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility, VMSR, dove vengono stampate le nostre matrici.Abbiamo constatato che è necessario un trattamento più rigoroso del PT Gen due per ottenere il massimo livello di coerenza rispetto all'uniformità della qualità del segnale e a fondi bassi. Il primo passaggio è un prelavaggio. Eseguiamo questo passaggio perché il nostro buffer di spotting contiene una concentrazione molto elevata di sale e questo prelavaggio è necessario per rimuovere tale sale.I vetrini vengono posizionati in un portavetrini per microscopio e immersi vigorosamente da 15 a 20 volte in una soluzione di SDS 0,2% preriscaldata a 43 gradi. Dopo il lavaggio nella soluzione di SDS, vengo

processing-the-loblolly-pine-ptgen2-cdna-microarray

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

A causa della natura transitoria del pre-mRNA, può essere difficile da isolare e...

Un rapido ad alta velocità Metodo per ribonucleoproteine ​​Mapping (RNP) su Human pre-mRNA

Tessuti vegetali, tra cui floema e xilema di pino loblolly...

Un metodo migliorato di isolamento dell&#39;RNA da Pino Loblolly ( P. taeda L.) e altre specie di conifere

Una ricerca fondamentale in biologia cellulare è quello di definire i meccanismi che sono alla base l'identità degli organelli che rendono le cellule eucariotiche. Qui vi proponiamo un metodo per identificare i geni responsabili per l'integrità morfologica e funzionale degli organelli vegetali usando la microscopia a fluorescenza e di nuova generazione strumenti di sequenziamento.

Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l&#39;identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity

Questo manoscritto descrive l'uso della tecnologia all'avanguardia fornita dai DNA-microarrays. I microarray forniscono una panoramica dei cambiamenti trascrittomici nei batteri che si verificano in una condizione specifica. Inoltre, sottolineiamo la facilità con cui è possibile analizzare grandi quantità di dati utilizzando comodi pacchetti software sviluppati internamente.

A Pipeline veloce e affidabile per lo studio batterica trascrittoma un&#39;analisi caso: serina-dipendente regolazione genica in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

La tecnologia Microarray consente la misurazione quantitativa e la profilazione dell'espressione genica dei trascritti su base genomica. Pertanto, questo protocollo fornisce una procedura tecnica ottimizzata in un array bovino a due colori su misura utilizzando embrioni bovini del giorno 7 per dimostrare la fattibilità dell'utilizzo di una bassa quantità di RNA totale.

Trascrittoma Profiling di In-Vivo Embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori

Questo articolo descrive l'applicazione di metabolomica non mirati, trascrittomica e l'analisi statistica multivariata per le trascrizioni di bacche di uva e metaboliti al fine di ottenere una visione nel concetto terroir, vale a dire, l'impatto dell'ambiente sulla caratteristiche qualitative di bacche.

Il concetto Terroir interpretato attraverso uva a bacca Metabolomica e Trascrittomica

Questo articolo descrive la procedura per l'identificazione e la caratterizzazione di una famiglia di geni a grapevine applicato alla famiglia di Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitina ligasi.

Flusso di lavoro globale per l'identificazione del genoma e la Meta-analisi di espressione della famiglia genica ATL E3 ubiquitina ligasi a Grapevine

Qui presentiamo un protocollo che è stato progettato per analizzare l'associazione genoma del fattore di trascrizione del oligodendrocyte 2 (Olig2) in cellule del precursore del oligodendrocyte cervello acutamente purificato (OPCs) eseguendo immunoprecipitazione della cromatina basso-cella (ChIP) , libreria preparazione, high throughput sequenziamento e analisi bioinformatica dei dati.

Identificare i siti di fattore di trascrizione Olig2 associazione genomico in acutamente purificato PDGFRα + cellule di immunoprecipitazione della cromatina Low-cella ordinamento dell'analisi

Questo studio presenta un protocollo multioma spaziale Trekker–CUT&amp;Tag che combina il codice a barre spaziale diretto di una sezione tissutale con l'analisi multioma a singola cellula. Questo approccio consente contemporaneamente la profilazione spaziale dell'espressione genica a singola cellula e la modifica dell'istone H3K27ac, offrendo intuizioni meccanicistiche sulla regolazione genica nel contesto della microanatomia tissutale.

Profilazione multiomica integrata a singola singola e risolta spazialmente del trascricroma e dei bersagli epigenomici nelle sezioni di tessuto congelato

Per studiare i processi di sviluppo delle ascospore in Gibberella zeae, una procedura per la raccolta in condizioni di sterilità è girato in modo da generare il massimo livello di informazioni per la descrizione del protocollo. Ciò dovrebbe facilitare la riproducibilità dell'esperimento, un aspetto cruciale quando è piena genoma test profilo di espressione attuazione.

Gibberella zeae ascospore di produzione e di raccolta di esperimenti di microarray.

Scopri le tecniche di lavaggio e gestione del microarray PtGen2 per studi di espressione genica nel pino loblolly. Questo metodo standardizzato migliora la consistenza del segnale e riduce il rumore di fondo.

L'elaborazione del Pino Loblolly PtGen2 cDNA Microarray

Esplora altri video