L'elaborazione del Pino Loblolly PtGen2 cDNA Microarray

Questo video è stato prodotto dai ricercatori della Warnell School of Forestry and Natural Resources dell'Università della Georgia. Lo scopo di questo video di formazione è quello di descrivere in dettaglio come elaborare il nostro LOB lolly pine pt, gen two CDNA, microarray, prestando particolare attenzione al lavaggio e alla manipolazione dell'array, sia prima che dopo l'ibridazione. In generale, i nostri protocolli seguono quelli sviluppati presso l'Institute for Genomic Research Tiger e il Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility, VMSR, dove vengono stampati i nostri array.

Abbiamo riscontrato che è necessaria un'elaborazione più rigorosa del PT Gen 2 per fornire la massima coerenza rispetto all'uniformità della qualità del segnale e ai bassi sfondi. Il primo passo è un prelavaggio. Lo facciamo perché il nostro tampone smacchiatore contiene un contenuto di sale molto elevato e questo prelavaggio è necessario per rimuovere quel sale.

I vetrini vengono posti in un supporto per vetrini da microscopio e immersi vigorosamente da 15 a 20 volte in una soluzione SDS allo 0,2% che è stata preriscaldata a 43 gradi. Dopo che i vetrini sono stati lavati nella soluzione SDS, vengono rimossi con cura con una pinza in un barattolo Copeland contenente un tampone di pre-ibridazione. Questo buffer contiene cinque XSSC 0,1% SDS e 1% BSA ed è anche riscaldato a 43 gradi.

Il barattolo Copeland viene ricoperto di profumo e posto in un'incubatrice a 43 gradi per un'ora. Dopo la pre-ibridazione, i vetrini vengono rimossi su un supporto per vetrini da microscopio e processati successivamente attraverso cinque cambi di acqua deionizzata immergendosi da 15 a 20 volte ad ogni cambio. Infine, i vetrini vengono posti in isopropanolo e immersi cinque o sei volte prima di essere centrifugati a secco in una centrifuga chip M mate.

Dopo la centrifugazione, i vetrini vengono soffiati con aria compressa fatta passare attraverso un filtro da 0,2 micron. I vetrini vengono quindi ricoperti con listelli di sollevamento, anch'essi puliti con aria compressa, e utilizziamo una piccola punta di pipetta per regolare il cursore di sollevamento nella posizione corretta. Sulla diapositiva.

Dopo che gli scivolamenti del sollevatore sono stati posizionati, ma prima che venga aggiunto il tampone di ibridazione, aggiungiamo 20 microlitri di 100 millimolari dihi, tre atoli ai pozzetti di umidità situati alle estremità della camera. A questo punto è possibile aggiungere i CDNA di destinazione, che sono stati risospesi nel buffer di ibridazione. Il puntale della pipetta viene posizionato sul bordo del cursore di sollevamento e il vetrino e la soluzione vengono pipettati lentamente.

Abbiamo scoperto che l'utilizzo dell'effetto capillare per caricare gli array fornisce la massima consistenza e riduce notevolmente l'incorporazione di bolle indesiderate. Dopo che il materiale target è stato aggiunto all'array, la camera di ibridazione viene assemblata e ricoperta con un foglio di alluminio. La camera di ibridazione viene quindi posta in un bagno d'acqua agitante per l'incubazione notturna, in genere da 14 a 16 ore.

Il bagnomaria è regolato a 48 gradi e lo shaker è regolato a 50 giri/min. È importante notare anche che dal punto di aggiunta della soluzione di ibridazione attraverso tutti i lavaggi post-ibridazione, le procedure vengono eseguite in condizioni di scarsa illuminazione per prevenire la fotoossidazione. Il giorno seguente, i vetrini vengono rimossi dalla camera di ibridazione e posti in un barattolo Copeland contenente la soluzione di lavaggio numero uno, che è stato preriscaldato a 53 gradi.

I vetrini vengono lasciati rimanere nel barattolo Copeland per circa un minuto fino a quando i vetrini del sollevatore non cadono, a quel punto i vetrini vengono rimossi delicatamente con una pinza e posti in un supporto per vetrini da microscopio per procedere con i lavaggi. I vetrini vengono quindi immersi energicamente circa 15-20 volte in un secondo contenitore, contenente anche la soluzione di lavaggio numero uno a 53 gradi. Il contenitore viene quindi ricoperto di profumo e posto in uno shaker d'aria dell'incubatore impostato a 53 gradi e cento giri/min.

Dopo 10 minuti di incubazione e soluzione di lavaggio, numero uno, i vetrini vengono immersi vigorosamente da 15 a 20 volte in un contenitore con la soluzione di lavaggio numero due, che si trova a temperatura ambiente nel contenitore. Questo è stato coperto con pellicola para e posto di nuovo su un agitatore a temperatura ambiente per un'incubazione di 10 minuti. Infine, i vetrini vengono rimossi dalla soluzione di lavaggio numero due e immersi energicamente da 15 a 20 volte in un contenitore con la soluzione di lavaggio numero tre.

I vetrini vengono quindi rimossi in un secondo contenitore di soluzione di lavaggio numero tre, coperti con perfil e nuovamente posti sullo shaker per 10 minuti. Dopo il lavaggio finale, centrifughiamo i vetrini fino a completa asciugatura. Per fare ciò, posizioniamo un tappo Falcon da 15 mil in un tubo conico da 50 mil e posizioniamo il codice a barre degli array con il lato rivolto verso il basso nel tubo conico.

I tubi vengono quindi fatti girare in una testa a secchio oscillante a 1500 giri/min a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, i vetrini vengono rimossi in una seconda serie di provette coniche da 50 mil, che sono state ricoperte con un foglio di alluminio. Le provette vengono quindi spurgate con azoto gassoso, che viene filtrato attraverso un filtro da 0,22 micron e un tappo per il trasporto o per lo stoccaggio fino alla scansione.

Raccogliamo i dati di scansione su un array di scansione PerkinElmer 5.000. L'immagine dell'array viene grigliata e i dati di scansione grezzi vengono elaborati e l'analisi iniziale dei dati viene eseguita con la suite di software di imaging di bio discovery. Successivamente, i dati sull'intensità del segnale spot vengono normalizzati mentre l'analisi statistica viene eseguita con gli strumenti di array BRB, un pacchetto statistico di microarray robusto e disponibile gratuitamente che può essere scaricato dal National Cancer Institute.

Altre analisi statistiche e ricerche sui modelli di espressione genica vengono eseguite con i PPA Jeep PPA per i modelli di espressione genica e la suite di analisi. Un altro pacchetto di analisi basato sul web disponibile gratuitamente. Grazie per aver guardato il nostro video su come elaborare il microarray di lob lolly pine PT Gen two.

Le seguenti persone sono state responsabili del contenuto e della produzione di questo video di formazione.