Iniezione intrathoracica per lo studio del cuore di zebrafish adulto

Questo metodo si basa sull'iniezione di 0,5 − 3 μL di soluzione nel torace di zebrafish adulto. La procedura trasporta efficacemente proteine e composti chimici nella vicinanza del cuore del pesce zebra senza danneggiare l'organo. L'approccio è adatto per testare gli effetti di fattori esogeni su vari tessuti del cuore.

Nella ricerca cardiaca sul pesce zebra adulto, i trattamenti farmacologici vengono solitamente eseguiti in modo sistemico. Con l'iniezione intratoracica, si può fornire localmente soluzione al cuore senza causare danni al miocardio. Questo metodo consente la consegna di piccoli volumi di farmaci, proteine o altre molecole in soluzione proprio intorno al cuore di un zebrafish adulto.

Per iniziare questa procedura, utilizzare un estrattore di ago per estrarre capillari di vetro borosilicato adattati alla microiniezione. Conservare i capillari tirati in una piastra di Petri di nove centimetri con rotaie di argilla modellante o nastro adesivo. Usando forbici comuni, taglia un pezzo di spugna e intasa una silhouette simile a un pesce nel suo mezzo.

Successivamente, preparare piccole aliquote delle soluzioni di iniezione con le proteine testate o altri composti. Regolare la loro concentrazione a seconda del saggio diluire la sostanza in soluzione salina bilanciata 1x Hanks integrata con 10% rosso fenolo. Per ottenere la concentrazione di lavoro degli anestetici, aggiungere da due a tre millilitri di soluzione di stock di tricaina ad un bicchiere contenente 100 millilitri di acqua di pesce.

Per prima cosa, accendi il microscopio stereo con la luce dall'alto e regola l'ingrandimento su 16x. Immergere la spugna con acqua di pesce e posizionarla su una piastra di Petri di nove centimetri al microscopio. Regolare la messa a fuoco e, al microscopio stereo, utilizzare le forbici per iridectomia per tagliare l'estremità di un microcapillare a circa sette millimetri dalla base, come descritto nella figura 1A del protocollo di testo.

Inserire il microcapillare tagliato nel supporto dell'ago dell'apparato del microiniettore. Utilizzando le punte microloader, caricare una soluzione di controllo per impostare la pressione di iniezione per ottenere il flusso appropriato, quindi svuotare l'ago. Successivamente, caricare il volume selezionato della soluzione di iniezione nella punta del capillare, assicurandosi che non ci siano bolle d'aria.

Usa una rete per catturare un pesce adulto e trasferirlo nella soluzione anestetica. Dopo uno o due minuti, quando il pesce smette di nuotare e il movimento dell'opercolo è ridotto, toccare il pesce con un cucchiaio di plastica per assicurarsi che non reagisca ad alcun contatto. Successivamente, trasferire rapidamente e accuratamente il pesce nella scanalatura della spugna bagnata, con il lato ventrale verso l'alto.

La testa del pesce dovrebbe puntare lontano dalla mano dominante dell'operatore. Al microscopio stereo, osservare attentamente il movimento del cuore pulsante sotto la pelle del pesce. Determinare visivamente il punto di iniezione sopra il cuore pulsante e al centro del triangolo, definito dalle placche cartilaginee ventrali.

Inserire la punta del capillare con un angolo compreso tra 30 e 45 gradi rispetto all'asse del corpo. Penetrare delicatamente nella pelle con la punta del microcapillare nel pericardio. Una volta che l'ago si trova all'interno del pericardio, premere il pedale del dispositivo del microiniettore per completare l'iniezione.

Dopo l'iniezione, ritirare delicatamente il capillare dal torace e trasferire immediatamente il pesce in un serbatoio con acqua di sistema per il recupero. Monitorare il pesce fino al recupero totale dall'anestesia. Per analizzare gli effetti dell'iniezione, raccogliere il cuore nel momento desiderato e prepararlo per ulteriori analisi.

In questo studio, composti esogeni e proteine vengono consegnati nella cavità pericardica al fine di studiare i loro effetti sul cuore nel pesce zebra adulto. Per convalidare questo metodo, due esperimenti di prova vengono eseguiti iniettando coloranti colorati e fluorescenti in pesci eutanasiati. In entrambi i test, l'analisi a montaggio intero rivela l'etichettatura di tutto il cuore, incluso il ventricolo, l'atrio e il bulbus arteriosus.

Questi risultati rivelano un'efficiente diffusione delle soluzioni di iniezione sulla superficie cardiaca. Per confrontare l'idoneità dell'iniezione intratoracica rispetto all'iniezione intraperitoneale per studi cardiaci, una quantità simile di DAPI viene iniettata utilizzando entrambi i metodi. I cuori vengono quindi fissati dopo cinque minuti o 120 minuti.

Nessuna cellule dapi-positive si osserva nei cuori dopo l'iniezione intraperitoneale in entrambi i punti di tempo. Al contrario, le iniezioni intratoraciche si traducono nella presenza di nuclei etichettati DAPI nel miocardio. Questi risultati dimostrano che l'iniezione intratoracica migliora l'erogazione del composto al cuore, rispetto all'iniezione intraperitoneale.

Per testare l'idoneità di questo metodo per gli studi di rigenerazione cardiaca, i ventricoli vengono crioingiunti e quindi le iniezioni vengono eseguite a tre e sette giorni dopo il crioinjury. Sia il miocardio che il tessuto ferito contengono numerose cellule dapi-positive, indicando un'efficiente penetrazione di questo colorante nel cuore intatto e nel tessuto fibrotico. Inoltre, la falloidina iniettata AF649 è anche incorporata dai cardiomiociti della zona peri-lesione e da alcuni fibroblasti reclutati dell'area ferita.

Questo esperimento rivela che i farmaci possono attraversare l'epicardio e penetrare nel miocardio sottostante. Dopo aver testato l'efficienza delle iniezioni intratoraciche utilizzando coloranti, vengono analizzati gli effetti delle proteine iniettate sul cuore. Per questo, vengono studiati gli effetti della citochina esogena su vari processi.

Gli aspetti biologici della proliferazione cardiomiocitaria, della deposizione della matrice extracellulare, del reclutamento delle cellule immunitarie e dell'espressione genica cardioprotettiva sono attivati dall'iniezione intratoracica di citochina. Questi risultati dimostrano che l'iniezione intratoracica fornisce una strategia adatta per la consegna mirata di proteine per studiare i loro effetti su tessuti cardiaci distinti in una varietà di test. L'inserimento dell'ago nel pericardio è un passaggio chiave per un'iniezione riuscita.

La forma dell'ago, l'angolo di penetrazione e i siti di puntura sono tutti fattori che influenzano l'inserimento dell'ago. Dopo o prima dell'iniezione intratoracica, si può eseguire crioinjury al fine di analizzare l'effetto delle molecole iniettate sulla rigenerazione cardiaca. L'iniezione intratoracica è stata utilizzata nei pesci zebra per studiare la precondizione cardiaca.

Una proteina chiamata CNTF è stata iniettata e ha dimostrato di migliorare i programmi citoprotettivi e pro-rigenerativi nel cuore.