Immunostaining lotto per la grande rivelazione di proteine ​​nel cervello della scimmia Whole

Questa procedura inizia al ricevimento di un cervello perfuso, esternalizzato e crioprotetto al 4% di PFA, che è stato inviato agli associati di Neuroscienze per l'incorporamento utilizzando punti di riferimento di allineamento incorporati nella matrice circostante. Il cervello può essere sezionato sul piano coronale per produrre sezioni seriali allo spessore desiderato, che rappresenteranno l'intera estensione posteriore anteriore del cervello utilizzando cestelli e contenitori specializzati. L'elaborazione immunologica in batch può essere eseguita per determinare il modello di espressione spaziale di una proteina in tutto il cervello.

Ciao, sono la dottoressa Shaheen Zur del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Optometria dell'Università di Montreal. Ciao, sono il Dr.Mark Burke, anche lui del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Optometria dell'Università di Montreal. Ciao, sono Dr.Mo Petto, direttore del Laboratorio di Neuroscienze Visive presso la Scuola di Optometria dell'Università di Montreal.

Oggi vi mostreremo una procedura per l'immunocolorazione in batch per il rilevamento di proteine su larga scala in un intero cervello di scimmia. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i modelli di espressione delle proteine bersaglio in tutto il cervello e per confrontare e contrastare l'espressione di tali proteine all'interno dello stesso cervello. Quindi iniziamo.

Prima dell'elaborazione istologica, ottenere un cervello di primate, che è stato preservato tramite perfusione sistemica e post-fissazione e crioprotetto utilizzando soluzioni di saccarosio graduate. In questa fase, il cervello viene inviato ai soci di neuroscienze per essere incorporato e sezionato liberamente utilizzando la loro tecnologia proprietaria. Al ritorno, si osserverà che sette punti di riferimento di allineamento sono posizionati nella matrice di inclusione in modo che le sezioni possano essere orientate correttamente e riallineate dopo che l'elaborazione istologica è completa.

Durante l'esecuzione del sezionamento, vengono scattate immagini digitali che possono essere successivamente utilizzate per la ricostruzione 3D di mappe anatomiche. I neuroscienziati associano i processi del nostro tessuto per produrre sezioni coronali fluttuanti di 50 micrometri di spessore su tutto il cervello. Una volta completato, possiamo iniziare l'elaborazione istologica delle sezioni.

Quando iniziamo l'elaborazione istologica, in genere abbiamo circa 140 sezioni da gestire per anticorpo o colorazione. Qui dimostreremo la tecnica con un campione più piccolo di sezioni trattate con l'anticorpo SMI 32, che è un anticorpo monoclonale contro le proteine dei neurofilamenti non fosforilate. Durante tutta la procedura, vengono utilizzati piatti e cestelli di colorazione specializzati, che consentono di elaborare un gran numero di sezioni flottanti libere contemporaneamente ed efficientemente.

Ciò garantisce che la macchia risultante sia coerente in tutte le sezioni. Il primo passo consiste nell'incubare le sezioni in una soluzione a base di PBS contenente TRITTON X 100 e siero di cavallo normale per 60 minuti. Ciò ridurrà il legame aspecifico delle molecole di anticorpi che si traduce nella colorazione di fondo.

Successivamente, le sezioni vengono incubate durante la notte. In una soluzione anticorpale SMI 32 a base di PBS, integrata con tritton X 100 e siero di cavallo normale il giorno successivo, le sezioni vengono lavate per tre periodi di 10 minuti in soluzione di lavaggio e poi incubate per due ore a temperatura ambiente. In una soluzione di anticorpi secondari Muse biotinilati a base di PBS contenente Triton X 100 e siero di cavallo normale.

Dopo una serie di tre lavaggi aggiuntivi di 10 minuti, le sezioni vengono poste in una soluzione di complesso di perossidasi di rafano coniugato con biotina avadon per un'ora a temperatura ambiente. Infine, dopo un'altra serie di lavaggi, le sezioni vengono poste in una reazione D amminobenzina per 10 minuti, che produce una macchia marrone all'interno dei neuroni immunoreattivi. La reazione viene quindi interrotta rimuovendo il cestello di colorazione e immergendo le sezioni in PBS.

Dopo due o tre, i risciacqui di cinque minuti nelle sezioni PBS sono pronti per essere montati singolarmente su vetrini per iniziare il processo di montaggio utilizzando una grande piastra di Petri e pennelli molto morbidi. Le sezioni vengono sollevate dal contenitore tampone PBS e montate singolarmente su vetrini rivestiti di gelatina. I campioni vengono quindi lasciati asciugare all'aria per una notte in una cappa aspirante il giorno successivo.

Le sezioni vengono risciacquate immergendole in acqua deionizzata per lavare via eventuali cristalli di sale che possono essere rimasti dal processo di montaggio. I vetrini vengono quindi disidratati in fasi graduate di etanolo, puliti in xilene e il coperchio scivolato con un mezzo di montaggio per montatura. In questa fase, i vetrini devono essere conservati per circa una settimana o 10 giorni in posizione orizzontale per consentire l'indurimento del mezzo di montaggio.

Successivamente, i vetrini possono essere conservati in una scatola per vetrini o sottoposti a imaging tramite microscopia. Questo metodo produce un profilo di espressione completo di una proteina bersaglio di interesse in un intero cervello di scimmia. Qui mostriamo sezioni coronali rappresentative che forniscono un'istantanea dell'espressione di FMRP, new n e SMI 32.

Nello stesso cervello di scimmia. Ti abbiamo appena mostrato come completare l'immunocolorazione batch per una proteina bersaglio di interesse in tutto il cervello. Quando si esegue questa procedura, è importante assicurarsi che tutte le sezioni siano sottoposte a una leggera agitazione mentre vengono incubate in varie soluzioni e che rimangano sempre completamente immerse.

Inoltre, prenditi il tuo tempo durante il montaggio del vetro delle dissezioni e rimuovi il maggior numero possibile di rughe e pieghe senza danneggiare l'integrità del tessuto. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.