Immunostaining lotto per la grande rivelazione di proteine nel cervello della scimmia Whole
27 luglio 2009
Su larga scala immunolocalizzazione di proteine bersaglio attraverso tutto il cervello dei primati è possibile utilizzando tessuti romanzo di inclusione e di sezionamento metodi combinati con l'impiego di attrezzature creativo per la colorazione in batch di più liberamente fluttuanti sezioni in un dato momento.
Questa procedura inizia al ricevimento di un cervello perfuso con PFA al 4%, esternalizzato e protetto criogenicamente, inviato agli associati in neuroscienze per l'inclusione, utilizzando punti di allineamento incorporati nella matrice circostante. Il cervello può essere sezionato nel piano coronale per produrre sezioni seriali di uno spessore desiderato, che rappresenteranno l'intera estensione antero-posteriore del cervello mediante l'uso di appositi cestelli e contenitori. È possibile eseguire un'immunoprocedura in batch per determinare il profilo di espressione spaziale di una proteina in tutto il cervello.
Ciao, sono la dottoressa Shaheen Zur del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Ottometria dell'Università di Montreal. Ciao, sono il dottor Mark Burke, anch'io del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Ottometria dell'Università di Montreal. Salve, sono il dottor Mo Petto, direttore del Laboratorio di Neuroscienze Visive della Scuola di Ottometria, Università di Montreal.
Oggi vi mostreremo un procedimento per la colorazione immunoistochimica in batch per il rilevamento su larga scala di proteine in un intero cervello di scimmia. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare i modelli di espressione di proteine bersaglio in tutto il cervello e per confrontare e analizzare l'espressione di tali proteine all'interno dello stesso cervello. Cominciamo dunque.
Prima dell'elaborazione istologica, ottenere un cervello di primate che sia stato conservato mediante perfusione sistemica e fissazione post-operatoria, e protetto dal congelamento utilizzando soluzioni di saccarosio a gradiente. A questo stadio, il cervello viene inviato a neuroscience associates per essere inclusi e sezionato gratuitamente mediante la loro tecnologia proprietaria. Al ritorno, si osserverà che sette punti di riferimento di allineamento sono stati posizionati nella matrice di inclusione in modo che le sezioni possano essere orientate correttamente e riallineate dopo il completamento dell'elaborazione istologica.
Durante il sezionamento, vengono acquisite immagini digitali che potranno essere utilizzate successivamente per la ricostruzione tridimensionale di mappe anatomiche. Gli associati neuroscienziati elaborano il nostro tessuto per ottenere sezioni coronali seriali libere di 50 micrometri di spessore su tutto il cervello. Una volta completato questo passaggio, possiamo iniziare l'elaborazione istologica delle sezioni.
Quando iniziamo l'elaborazione istologica, di solito abbiamo circa 140 sezioni da trattare per ogni anticorpo o colorazione. Qui dimostreremo la tecnica utilizzando un campione più piccolo di sezioni trattate con l'anticorpo SMI 32, un anticorpo monoclonale diretto contro le proteine dei neurofilamenti non fosforilate. Durante tutta la procedura, si utilizzano piatti e cestelli specializzati per colorazione, che permettono di processare contemporaneamente ed in modo efficiente un elevato numero di sezioni in sospensione libera.
Questo garantisce che la colorazione risultante sia uniforme in tutte le sezioni. Il primo passaggio consiste nell'incubare le sezioni in una soluzione a base di PBS contenente TRITON X-100 e siero equino normale per 60 minuti. Questo ridurrà il legame non specifico delle molecole anticorpali, che causa una colorazione di fondo.
Successivamente, le sezioni vengono incubate durante la notte. In una soluzione di anticorpo SMI 32 in PBS, integrata con Triton X-100 e siero equino normale, il giorno seguente le sezioni vengono lavate per tre periodi di 10 minuti ciascuno in soluzione di lavaggio e quindi incubate per due ore a temperatura ambiente in una soluzione di anticorpo secondario biotinilato anti-Muse in PBS contenente Triton X-100 e siero equino normale.
Dopo un'ulteriore serie di tre lavaggi di 10 minuti ciascuno, i campioni vengono posti in una soluzione del complesso di avido-biotina con perossidasi di rafano per un'ora a temperatura ambiente. Infine, dopo un'altra serie di lavaggi, i campioni vengono immersi in una reazione con D-ammino benzidina per 10 minuti, che produce una colorazione bruna nelle cellule neuronali immunoreattive. La reazione viene quindi interrotta rimuovendo il cestello di colorazione e immergendo i campioni in PBS.
Dopo due o tre risciacqui di cinque minuti in PBS, le sezioni sono pronte per essere montate singolarmente su vetrini di vetro per iniziare il processo di montaggio, utilizzando una grande piastra di Petri e pennelli molto morbidi. Le sezioni vengono sollevate dal contenitore con tampone PBS e montate singolarmente su vetrini di vetro rivestiti con gelatina. I campioni vengono quindi lasciati asciugare all'aria tutta la notte in una cappa aspirante il giorno successivo.
Le sezioni vengono risciacquate immergendole in acqua deionizzata per rimuovere eventuali cristalli di sale residui dal processo di montaggio. I vetrini vengono quindi disidratati mediante gradazioni di etanolo, puliti in xilene e coperti con un'immersione di mezzo di montaggio per montaggio. A questo punto, i vetrini devono essere conservati per circa una settimana fino a 10 giorni in posizione orizzontale per permettere al mezzo di montaggio di indurirsi.
Dopo questa fase, i vetrini possono essere conservati in una scatola per vetrini oppure sottoposti a imaging mediante microscopia. Questo metodo produce un profilo completo di espressione di una proteina bersaglio di interesse in tutto il cervello di scimmia. Qui mostriamo sezioni coronali rappresentative che forniscono un'istantanea dell'espressione di FMRP, nuova n e SMI 32.
Nello stesso cervello di scimmia. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire la colorazione immunoistochimica in batch per una proteina bersaglio di interesse su tutto il cervello. Durante questa procedura, è fondamentale garantire che tutti i campioni siano sottoposti a un'agitazione delicata mentre vengono incubati nelle diverse soluzioni e che rimangano completamente immersi in ogni momento.
Inoltre, prenditi il tempo necessario durante il montaggio su vetrino delle dissezioni ed elimina il maggior numero possibile di grinze e pieghe senza compromettere l'integrità del tessuto. Quindi è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
In questo articolo viene descritto un approccio innovativo per la rilevazione immunologica su larga scala di proteine bersaglio nell'intero cervello di primati. Vengono evidenziati metodi innovativi di inclusione e sezionamento dei tessuti, insieme a tecniche di colorazione in batch per molteplici sezioni in sospensione libera.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunorilevamento
- Imaging cerebrale
Sfondo
- L'immunorilevamento è fondamentale per lo studio dell'espressione proteica nel cervello.
- I metodi tradizionali possono essere limitati per quanto riguarda portata ed efficienza.
- I progressi nelle tecniche di elaborazione dei tessuti possono potenziare le capacità di ricerca.
- L'elaborazione in batch consente un'analisi completa della distribuzione delle proteine.
Scopo dello studio
- Sviluppare metodi per l'immunodetection su larga scala nei cervelli di primati.
- Migliorare l'efficienza dell'analisi dell'espressione proteica.
- Facilitare lo studio dei modelli di espressione spaziale nell'intero cervello.
Metodi Utilizzati
- Perfusione con PFA al 4% per la conservazione del cervello.
- Inclusione utilizzando punti di riferimento di allineamento in una matrice circostante.
- Taglio al piano coronale per sezioni seriali.
- Elaborazione immunologica in batch per l'analisi dell'espressione spaziale delle proteine.
Risultati principali
- Incorporazione e sezionamento riusciti di tessuto cerebrale di primate.
- Dimostrata capacità di analizzare i modelli di espressione proteica.
- Tecniche innovative migliorano l'efficienza dell'immunorilevamento.
- Potenziale per applicazioni più ampie nella ricerca neuroscientifica.
Conclusioni
- I metodi sviluppati migliorano in modo significativo l'immunorilevamento su larga scala.
- Queste tecniche possono approfondire la nostra comprensione dell'espressione proteica cerebrale.
- La ricerca futura potrà basarsi su questi metodi per diverse applicazioni.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La mappatura su larga scala dell'espressione proteica nei cervelli di primati supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta di farmaci in neuroscienze. La colorazione immunologica in batch consente una valutazione riproducibile e quantitativa della distribuzione spaziale delle proteine in tutto il cervello, migliorando la fiducia predittiva nell'interazione con l'obiettivo e nella modulazione del percorso. Questo approccio affronta una lacuna fondamentale nella ricerca traslazionale fornendo dati di sistema pertinenti alla malattia per l'identificazione dei composti promettenti e l'allineamento dei modelli preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mappando l'espressione delle proteine bersaglio in tutto il cervello del primate.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante una colorazione uniforme di sezioni seriali per una valutazione coerente dell'interazione con il bersaglio.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio fornendo dati spazialmente risolti sull'espressione proteica per decisioni di avanzamento o interruzione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi mediante l'elaborazione in batch di sezioni libere.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità dei saggi attraverso la sincronizzazione dell'immunomarcatura di ampi set di sezioni.
- Valore strategico: Evidenzia la prontezza per lo screening e il riutilizzo della piattaforma per la valutazione affidabile di composti nelle fasi di scoperta.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Discute la rilevanza clinica attraverso l'allineamento dei profili di espressione proteica con modelli di disturbi neurologici.
- Valore operativo: Descrive la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica mediante l'uso di protocolli standardizzati di immunomarcatura.
- Valore predittivo: Affronta decisioni di avanzamento corrette per il rischio, consentendo la misurazione quantitativa dei livelli proteici e delle popolazioni neuronali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio alla ricerca preclinica, consentendo l'analisi dell'espressione proteica con risoluzione spaziale in sistemi rilevanti per la malattia.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la mappatura proteica su tutto il cervello.
- Screening: Descrive la prontezza e la riproducibilità del saggio attraverso la colorazione immunologica in serie di sezioni consecutive.
- Analisi: Mette in evidenza risultati quantitativi come i livelli proteici e il conteggio delle popolazioni neuronali per l'analisi comparativa tra condizioni diverse.
- Ricerca Translazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica allineando i modelli di espressione con studi sui biomarcatori.
- Riutilizzo Aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile per il rilevamento su larga scala di proteine su multipli bersagli e studi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi terapeutici, riduzione dell'ambiguità meccanicistica negli studi sull'espressione proteica.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità dei protocolli di immunomarcatura per set di sezioni di grandi dimensioni.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosecuzione o interruzione del progetto, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate grazie alla riduzione precoce del rischio associato alla proteina bersaglio.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate su profili di espressione a livello dell'intero cervello.
Considerazioni sull'implementazione
- Esperienza scientifica obbligatoria in istologia, immunohistochemia e neuroanatomia.
- Necessità di strumentazione e infrastrutture analitiche, inclusi piatti per colorazione specializzati, cestelli e sistemi di microscopia.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi diversi per l'allineamento delle sezioni, la coerenza della colorazione e l'interpretazione dei dati.
- Considerazioni relative all'adattamento tra diversi sistemi modello, in particolare per il trattamento del cervello di primate rispetto a quello di roditore.
- Limitazioni pratiche, inclusa la complessità nella manipolazione delle sezioni e la precisione richiesta per il montaggio di sezioni seriali su larga scala.
