Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con un fattore quattro trascrizione, Doxiciclina inducibile lentivirali sistema di trasduzione

Ciao, mi chiamo Brad Hamilton. Lavoro nel reparto di ricerca e sviluppo di STEM Gen. Oggi vi mostreremo una procedura su come generare cellule staminali pluripotenti indotte da fibroblasti embrionali di topo.

Questa procedura può essere utilizzata sia per generare cellule staminali pluripotenti indotte che per studiare il processo di riprogrammazione. Quindi iniziamo. Inizia seminando fibroblasti embrionali di topo, o cellule di metanfetamina, su un piatto rivestito di gelatina di 15 centimetri a una densità di quattro volte 10 delle quinte cellule per piatto.

Ora aggiungi 30 millilitri di terreno di coltura della metanfetamina e incuba le cellule per due giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a quando non sono confluenti all'80%. Al termine, l'incubazione aspira il terreno e aggiunge 30 millilitri di crescita. Terreno integrato con lentivirus concentrato.

Scuotere delicatamente il piatto per garantire una distribuzione uniforme del mezzo. Incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con trasduzione virale completa. Passiamo alla riprogrammazione indotta dalla doxiciclina.

Per iniziare la riprogrammazione da 20 a 24 ore dopo la trasduzione, la tripsina è la tripsina trasdotta e centrifugarle a 200 Gs per cinque minuti. Quindi, aspirare con cura il terreno dal pellet cellulare e risospendere le cellule nel terreno di crescita. Una volta sospeso il seme, il mes trasdotto a una concentrazione appropriata per le dimensioni del piatto di coltura cellulare che si sta utilizzando.

Qui stiamo usando 2,5 volte 10 alla quinta cellula per piatto da 10 centimetri per esperimenti di riprogrammazione dell'efficienza e isolamento di colonie IPS e due volte 10 alla quarta cellula per pozzetto in piastre a quattro pozzetti per esperimenti di immunochimica. Per monitorare l'efficienza di trasduzione, incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. In questa fase, le cellule possono essere congelate in azoto liquido per analisi future, se necessario.

Il giorno successivo, aspirare il terreno e sostituirlo con un terreno di coltura fresco che è stato integrato con doxiciclina fino a una concentrazione finale di due microgrammi per millilitro. Includiamo un controllo negativo contenente terreno senza doxiciclina. Infine, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.

Abbiamo avviato il processo di riprogrammazione. Generalmente. Le colonie di cellule staminali pluripotenti saranno abbastanza grandi per l'isolamento dopo 16-22 giorni.

Prima di dimostrare questa procedura, dobbiamo prima verificare l'efficienza di trasduzione utilizzando la chimica per determinare l'efficienza di trasduzione. I test immunochimici vengono eseguiti sulle cellule ripiastrate in piastre a quattro pozzetti 48 ore dopo l'induzione della doxiciclina. Tutti i volumi elencati in questo protocollo devono essere regolati in base alle dimensioni della piastra di coltura cellulare: iniziare lavando delicatamente le cellule.

Una volta con PBS non contenente ioni magnesio o calcio, fissare le cellule con 500 microlitri di aldeide paraforma al 4% in PBS per 15 minuti. A temperatura ambiente, lavare nuovamente le celle delicatamente due volte con PBS. Successivamente, permeare le cellule aggiungendo 500 microlitri di ghiaccio freddo allo 0,2%Tween 20 in PBS incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver lavato le celle altre due volte. Aggiungere 200 microlitri di tampone bloccante per un'ora a temperatura ambiente per bloccare il legame degli anticorpi non specifici. Ora aggiungi 200 microlitri dell'anticorpo primario desiderato.

Qui stiamo usando i marcatori di pluripotenza T 4K LF quattro, SOX due e cmic. Incubare le cellule per una notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Dopo aver lavato delicatamente le cellule due volte con PBS, incubarle con 200 microlitri di anticorpo secondario per un'ora a temperatura ambiente, proteggendo le piastre dalla luce.

Qui stiamo utilizzando gli anticorpi secondari appropriati coniugati con fluoro quattro per la visualizzazione, utilizzando un microscopio fluorescente invertito dopo l'incubazione. Lavare le cellule altre due volte, quindi aggiungere DPI e incubare nuovamente per 10 minuti per visualizzare i nuclei. Infine, dopo un ultimo lavaggio, aggiungere la montatura antifa aqua prima di eseguire l'imaging delle cellule con il microscopio a fluorescenza invertita per determinare l'efficienza di trasduzione.

Iniziare l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali pluripotenti. Dopo aver avviato il processo di riprogrammazione, monitorare le colture ogni giorno e sostituire il terreno appropriato ogni 48 ore. Utilizziamo il terreno integrato con doxiciclina per coltivare le cellule per i primi 12 giorni e poi successivamente rimuoviamo la doxiciclina dal terreno fino a quello.

Le cellule staminali pluripotenti indotte o colonie di IPS prelevate manualmente per l'espansione sono la doxiciclina. Le cellule indipendenti devono essere monitorate quotidianamente per verificare la presenza di cambiamenti morfologici indicativi del processo di riprogrammazione. Ogni esperimento sarà diverso, ma le colonie sono generalmente abbastanza grandi per l'isolamento tra 16 e 22 giorni dopo l'induzione della DS, il giorno prima di iniziare il processo di isolamento e le colonie riprogrammate con tripsina.

Preparare una piastra a 24 pozzetti seminando con uno strato di alimentazione irradiato con raggi gamma di mets a una densità di cinque volte 10 per la quarta cella per pozzetto. Incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo prelevare manualmente ogni colonia di IPS e tripizzarla per dissociare gli aggregati cellulari, repl le cellule IPS nel mezzo di cellule staminali embrionali di topo nei singoli pozzetti della piastra a 24 pozzetti preceduta incubano le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Cambio del supporto ogni 24 ore. Monitora quotidianamente le colonie di IPS per la crescita e la fluorescenza GFP. Abbiamo incubato le nostre colture per sei giorni prima di confezionarle in piastre a quattro pozzetti per l'analisi della pluripotenza.

Determinare quali pozzetti della piastra a 24 ruote esprimono uniformemente i pozzetti GFP che hanno una buona espressione di GFP possono essere inciampati, inizzati e fatti passare da uno a otto in piastre a quattro pozzetti che sono state precedute da strati di alimentazione irradiati con raggi gamma di mes. Queste piastre possono quindi essere utilizzate per l'analisi ICC per la pluripotenza per iniziare l'analisi della pluripotenza. Lavare delicatamente le cellule due volte con PBS non contenente ioni magnesio o calcio.

Aggiungere 0,5 millilitri per pozzetto di ghiaccio freddo allo 0,2% tra 20 in PBS e incubare le cellule per 10 minuti. Dopo altri tre lavaggi in blocco PBS, legatura aspecifica con 200 microlitri di tampone bloccante per un'ora a temperatura ambiente. Ora aggiungi 200 microlitri dell'anticorpo primario desiderato.

Qui abbiamo usato SSEA one nanog e OCT four incubare le cellule durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato delicatamente le cellule due volte, incubarle con 200 microlitri di anticorpi secondari per un'ora a temperatura ambiente, tenendole al riparo dalla luce. Qui stiamo usando gli anticorpi secondari appropriati coniugati con forza fluoro per la visualizzazione, utilizzando un microscopio fluorescente invertito dopo altri due lavaggi, aggiungendo DPI e incubando le cellule per 10 minuti.

Ora, dopo un lavaggio finale, aggiungere la montatura antifa aqua prima di eseguire l'imaging delle cellule con il microscopio a fluorescenza invertito. Le colonie di IPS possono anche essere analizzate per l'attività della fosfatasi alcalina utilizzando i kit disponibili in commercio. Il set di lentivirus TF inducibile di topo stem gent docs può essere utilizzato per riprogrammare i mes in cellule IPS dopo la trasduzione dell'espressione MES dei fattori di trascrizione.

T quattro, SOX due, KLF quattro e seic possono essere rilevati nelle cellule trattate con doxiciclina, ma l'espressione minima o nulla può essere rilevata nelle cellule non trattate. I cambiamenti morfologici progrediranno nel tempo per generare colonie più grandi, più simili a cellule ES, con bordi di colonia definiti e crescita tridimensionale. Quando i docs vengono rimossi, c'è una notevole inversione della morfologia cellulare per alcune colonie simili a cellule ES.

Tuttavia, molte delle colonie hanno mantenuto la loro morfologia IPS. Queste colonie IPS quando vengono raccolte e fatte passare. Espressione tipica del marcatore di pluripotenza della fosfatasi alcalina, nano T four e SSEA one.

Il tipo di cellule metanfetamine utilizzate in questo esperimento esprimeva GFP dal locus endogeno del nag. Quando viene riprogrammata allo stato di pluripotenza, l'espressione di GFP può quindi essere utilizzata come indicatore preliminare per il successo della riprogrammazione. Vi abbiamo appena mostrato come indurre la riprogrammazione dei fibroblasti embrionali di topo per indurre cellule staminali pluripotenti utilizzando un sistema antivirale inducibile dalla doxiciclina a quattro fattori di trascrizione.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che quando si progettano esperimenti di riprogrammazione, è necessario considerare diverse variabili per ottimizzare l'efficienza della riprogrammazione. In primo luogo, è possibile modificare il rapporto tra virus attivo e cellule bersaglio durante la fase primaria dell'infezione per aumentare o diminuire l'efficienza di trasduzione, influenzando così il numero di virus integrati nella popolazione cellulare bersaglio. In secondo luogo, la regolazione del periodo di tempo in cui le cellule sono esposte ai documenti può influenzare il numero di colonie IPS generate.

In terzo luogo, la capacità proliferativa delle cellule bersaglio può influire sulla riprogrammazione poiché le cellule che crescono e si dividono attivamente sono più suscettibili alla riprogrammazione. Infine, quando si modifica il protocollo per diversi numeri di cellule o piastre di coltura tissutale di diverse dimensioni, si raccomanda di regolare il numero di cellule target proporzionalmente alla superficie del piatto di coltura. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.