Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con un fattore quattro trascrizione, Doxiciclina inducibile lentivirali sistema di trasduzione

Ciao, mi chiamo Brad Hamilton. Lavoro nel dipartimento di ricerca e sviluppo di STEM Gen. Oggi vi mostreremo un procedimento per generare cellule staminali pluripotenti indotte a partire da fibroblasti embrionali murini.

Questa procedura può essere utilizzata sia per generare cellule staminali pluripotenti indotte che per studiare il processo di riprogrammazione. Cominciamo dunque. Iniziare seminando fibroblasti embrionali di topo, o cellule meth, in una piastra da 15 centimetri rivestita con gelatina, a una densità di quattro volte 10 alla quinta cellule per piastra.

Ora aggiungere 30 millilitri di mezzo di crescita per metilcoltura e incubare le cellule per due giorni a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a quando non raggiungono una confluenza di circa l'80%. Al termine, aspirare il mezzo e aggiungere 30 millilitri di mezzo di crescita supplementato con lentivirus concentrato.

Muovere delicatamente la piastra per assicurare una distribuzione uniforme del mezzo. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica con la trasduzione virale completata. Passiamo ora alla riprogrammazione indotta da doxiciclina.

Per iniziare il riprogrammazione, 20-24 ore dopo la trasduzione, trattare le cellule trasdotte con tripsina e centrifugare a 200 ×g per cinque minuti. Successivamente, aspirare con attenzione il mezzo dal pellet cellulare e risospendere le cellule nel mezzo di crescita. Una volta risospese, seminare le cellule mes trasdotte a una concentrazione appropriata rispetto alla dimensione della piastra per colture cellulari in uso.

Qui stiamo utilizzando 2,5 × 10⁵ cellule per piastra da 10 cm per esperimenti di efficienza di riprogrammazione e isolamento di colonie IPS, e 2 × 10⁴ cellule per pozzetto in piastre a 4 pozzetti per esperimenti di immunoistochimica. Per monitorare l'efficienza di trasduzione, incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. A questo stadio, le cellule possono essere congelate in azoto liquido per analisi future, se necessario.

Il giorno successivo, aspirare il mezzo e sostituirlo con del mezzo di crescita fresco integrato con doxiciclina a una concentrazione finale di due microgrammi per millilitro. Includiamo un controllo negativo contenente mezzo senza doxiciclina. Infine, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Abbiamo avviato il processo di riprogrammazione. In generale, le colonie di cellule staminali pluripotenti saranno abbastanza grandi da poter essere isolate dopo 16-22 giorni.

Prima di dimostrare tale procedura, dobbiamo innanzitutto verificare l'efficienza di trasduzione utilizzando la chimica per determinare l'efficienza di trasduzione. Il test di immunochemica viene eseguito sulle cellule ripiastrellate in piastre a quattro pozzetti a 48 ore dall'induzione con doxiciclina. Tutti i volumi indicati in questo protocollo devono essere adattati in base alle dimensioni della piastra per colture cellulari; iniziare lavando delicatamente le cellule.

Una volta con PBS privo di ioni magnesio o calcio, fissare le cellule con 500 microlitri di paraformaldeide al 4% in PBS per 15 minuti. A temperatura ambiente, lavare delicatamente le cellule due volte con PBS. Successivamente, permeabilizzare le cellule aggiungendo 500 microlitri di Tween 20 allo 0,2% freddo in PBS e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.

Dopo aver lavato le cellule altre due volte, aggiungere 200 microlitri di buffer bloccante per un'ora a temperatura ambiente per bloccare il legame non specifico degli anticorpi. Aggiungere ora 200 microlitri dell'anticorpo primario desiderato.

Qui stiamo utilizzando i marcatori di pluripotenza T 4K LF four, SOX two e cmic. Incubare le cellule tutta la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Dopo aver lavato delicatamente le cellule due volte con PBS, incubarle con 200 microlitri di anticorpo secondario per un'ora a temperatura ambiente, proteggendo le piastre dalla luce.

Qui stiamo utilizzando gli opportuni anticorpi secondari coniugati con fluorocromi per la visualizzazione, mediante un microscopio a fluorescenza invertito dopo l'incubazione. Lavare le cellule altre due volte, quindi aggiungere DPI e incubare nuovamente per 10 minuti per visualizzare i nuclei. Infine, dopo un ultimo lavaggio, aggiungere il mezzo di montaggio antifa aqua prima di acquisire le immagini delle cellule con il microscopio a fluorescenza invertito per determinare l'efficienza di trasduzione.

Iniziare l'isolamento e l'ampliamento delle cellule staminali pluripotenti. Dopo aver avviato il processo di riprogrammazione, monitorare le colture ogni giorno e sostituire il mezzo appropriato ogni 48 ore. Utilizziamo un mezzo supplementato con doxiciclina per coltivare le cellule per i primi 12 giorni, per poi successivamente rimuovere la doxiciclina dal mezzo.

Le colonie di cellule staminali pluripotenti indotte o IPS selezionate manualmente per l'espansione sono sensibili alla doxiciclina. Le cellule indipendenti devono essere monitorate quotidianamente per rilevare cambiamenti morfologici indicativi del processo di riprogrammazione. Ogni esperimento sarà diverso, ma le colonie sono generalmente abbastanza grandi da poter essere isolate tra i 16 e i 22 giorni successivi all'induzione DS, il giorno precedente l'inizio del processo di isolamento e riprogrammazione delle colonie mediante tripsina.

Preparare una piastra a 24 pozzetti seminando uno strato di cellule di supporto irradiate con raggi gamma a una densità di cinque volte 10 alla quarta cellule per pozzetto. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, selezionare manualmente ciascuna colonia di IPS e trattarla con tripsina per dissociare gli aggregati cellulari, quindi reimpiantare le cellule IPS in mezzo per cellule staminali embrionali murine nei singoli pozzetti della piastra a 24 pozzetti preparata in precedenza e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Cambiare il mezzo ogni 24 ore. Monitorare quotidianamente le colonie IPS per la crescita e la fluorescenza GFP. Abbiamo incubato le nostre colture per sei giorni prima dell'allestimento in piastre a quattro pozzetti per l'analisi della pluripotenza.

Stabilire quali pozzetti della piastra a 24 pozzetti esprimono uniformemente GFP: i pozzetti con una buona espressione di GFP possono essere triplicati, dissociati e passati in un rapporto da uno a otto in piastre a quattro pozzetti precedentemente preparate con strati di cellule di supporto irradiate con raggi gamma. Queste piastre possono quindi essere utilizzate per l'analisi mediante ICC della pluripotenza, al fine di avviare l'analisi della pluripotenza. Lavare delicatamente le cellule due volte con PBS privo di ioni magnesio o calcio.

Aggiungere 0,5 millilitri per pozzetto di PBS freddo ghiacciato contenente lo 0,2% di BSA e incubare le cellule per 10 minuti. Dopo altri tre lavaggi in PBS, bloccare il legame non specifico con 200 microlitri di buffer di blocco per un'ora a temperatura ambiente. Aggiungere ora 200 microlitri dell'anticorpo primario desiderato.

Qui abbiamo utilizzato SSEA uno, nanog e OCT quattro per incubare le cellule tutta la notte a quattro gradi Celsius. Dopo aver lavato delicatamente le cellule due volte, incubarle con 200 microlitri di anticorpo secondario per un'ora a temperatura ambiente, mantenendole al riparo dalla luce. In questo caso stiamo utilizzando gli anticorpi secondari appropriati coniugati con fluoro force per la visualizzazione, utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito; dopo altri due lavaggi, aggiungere DPI e incubare le cellule per 10 minuti.

Ora, dopo un ultimo lavaggio, aggiungere antifa aqua mount prima di acquisire le immagini delle cellule mediante microscopio a fluorescenza invertito. Le colonie di IPS possono anche essere analizzate per l'attività della fosfatasi alcalina utilizzando kit disponibili in commercio. L'insieme di lentivirus per topo con fattori di trascrizione induttibili stem gent docs può essere utilizzato per riprogrammare le MES in cellule IPS dopo la trasduzione dell'espressione nei MES dei fattori di trascrizione.

T quattro, SOX due, KLF quattro e seic possono essere rilevati nelle cellule trattate con doxiciclina, ma si osserva poca o nessuna espressione nelle cellule non trattate. I cambiamenti morfologici procederanno nel tempo fino a generare colonie più grandi, simili a cellule staminali embrionali, con margini ben definiti e crescita tridimensionale. Quando il docs viene rimosso, si verifica un evidente ripristino della morfologia cellulare in alcune colonie simili a cellule staminali embrionali.

Tuttavia, molte delle colonie hanno mantenuto la loro morfologia di IPS. Queste colonie di IPS, una volta isolate e sottoposte a passaggio, mostrano un'espressione tipica dei marcatori di pluripotenza come la fosfatasi alcalina, nano T quattro e SSEA uno.

Il tipo di cellule meth utilizzato in questo esperimento esprimeva GFP dal locus endogeno nag. Quando queste cellule vengono riprogrammate allo stato di pluripotenza, l'espressione di GFP può quindi essere utilizzata come indicatore preliminare di un riprogrammazione avvenuta con successo. Abbiamo appena mostrato come indurre la riprogrammazione di fibroblasti embrionali murini per generare cellule staminali pluripotenti mediante un sistema antivirale inducibile da doxiciclina basato su quattro fattori di trascrizione.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che nella progettazione di esperimenti di riprogrammazione, diverse variabili devono essere considerate per ottimizzare l'efficienza del processo. In primo luogo, è possibile modificare il rapporto tra virus attivi e cellule durante il passaggio di infezione primaria per aumentare o ridurre l'efficienza di trasduzione, influenzando così il numero di virus integrati nella popolazione cellulare bersaglio. In secondo luogo, modificando il tempo di esposizione delle cellule ai docs è possibile influire sul numero di colonie IPS generate.

In terzo luogo, la capacità proliferativa delle cellule bersaglio può influenzare il riprogrammamento, poiché le cellule attivamente in crescita e divisione sono più ricettive al riprogrammamento. Infine, quando si modifica il protocollo per diversi numeri di cellule o per piastre di coltura tissutale di dimensioni diverse, si raccomanda di regolare proporzionalmente il numero di cellule bersaglio rispetto alla superficie della piastra di coltura. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.