Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da fibroblasti umani Riprogrammare con il Stemgent Lentivirus umani TF Set

Ciao, mi chiamo Brad Hamilton. Sono uno scienziato del dipartimento di ricerca e sviluppo di STEM Gen. Oggi vi mostreremo una procedura su come riprogrammare i fibroblasti umani utilizzando fattori di riprogrammazione veicolati da lentivirali.

Questa procedura può essere utilizzata sia per generare celle IPS che per studiare il processo di riprogrammazione. Le cellule IPS sono simili alle cellule ES per morfologia, proliferazione e capacità di differenziazione, e a tutti i tipi di tessuto del corpo. Le cellule IPS umane hanno un netto vantaggio rispetto alle cellule ES in quanto mostrano le proprietà chiave delle cellule ES senza il dilemma etico di distruggere un embrione per ottenere le cellule.

La generazione di cellule IPS paziente-specifiche elude un importante ostacolo alle terapie di medicina rigenerativa personalizzate, eliminando il potenziale di rigetto immunitario delle cellule trapiantate non autologhe. Quindi iniziamo. In diversi punti di questo protocollo, si sostituisce il terreno delle cellule staminali pluripotenti indotte o IPSC in via di sviluppo con il terreno condizionato con metanfetamina.

La preparazione di questo mezzo richiede sei giorni. Quindi inizia almeno una settimana prima di iniziare il tuo esperimento. Per iniziare semina ogni pozzo di un sei.

Piastra a pozzetto con due volte 10 al quinto cf una cellula di alimentazione della metanfetamina in due millilitri di crescita della metanfetamina. Incubare per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, cambiare il terreno con la coltura cellulare umana E-S-I-P-S.

Incubare per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Raccogliere il surnatante e sostituirlo con un terreno fresco ogni 24 ore per quattro giorni. Filtrare il surnatante attraverso un filtro da 0,22 micrometri.

Integrare il surnatante raccolto con 15 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita base dei fibroblasti BFGF. Ti ritroverai con circa 16 millilitri di metanfetamina condizionato con il surnatante raccolto separatamente a quattro gradi SIU. Il terreno condizionato con metanfetamina può essere conservato per una o due settimane a quattro gradi Celsius o per diversi mesi a meno 20 gradi Celsius.

Ora che hai la certezza che il tuo terreno condizionato con metanfetamina sarà pronto quando ne avrai bisogno, parliamo della preparazione delle cellule. Il primo compito nella generazione dell'IPSC è quello di utilizzare i lentivirus per trasdurre, le cellule dei fibroblasti del prepuzio umano o le cellule BJ con quattro trascrizioni caratteristiche delle cellule staminali. Per prepararsi alla trasduzione, seminare le cellule BJ a una densità di una volta 10 per le quinte cellule per pozzetto di una piastra a sei pozzetti e coltura.

Le cellule in due millilitri di crescita, medie durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica lo stesso giorno. Iniziate a preparare le piastre di alimentazione della metanfetamina aggiungendo due millilitri di gelatina allo 0,1% diluita in acqua a una piastra a sei pozzetti e incubando per una notte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. La gelatina ricopre i pozzetti e funge da matrice per loro.

Ora le cellule BJ sono pronte per la trasduzione lentivirale per preparare il virus alla trasduzione. Integrare due millilitri di terreno fresco con sei microgrammi per millilitro di poli cervello e quattro lentivirus, ciascuno dei quali esprime uno dei fattori di trascrizione umani. T quattro, SO due nanog e lin 28, tali che ciascuno si trovi alla stessa molteplicità di infezione o MOI.

Questi lentivirus sono tutti inclusi nel set di lentivirus del fattore di riprogrammazione umana. Per eseguire la trasduzione, è sufficiente sostituire il terreno di crescita delle cellule BJ con il terreno contenente il virus. Scuotere delicatamente la piastra in modo che il mezzo ricopra uniformemente il fondo.

Incubare per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica lo stesso giorno. Rimuovere una fiala di cellule di alimentazione di metanfetamina dall'azoto liquido e scongelare. Rimuovere la soluzione di gelatina dalle piastre di alimentazione della metanfetamina, che ora sono ricoperte di gelatina su ciascuna.

Beh, aggiungi 0,2 volte 10 alla quinta cellula in due millilitri di crescita di metanfetamina. Medio. Incubare il MES per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, staccare le cellule BJ con lo 0,05% di tripsina EDTA e centrifugare a 200 Gs per cinque minuti.

Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere le cellule nel terreno di crescita. Rimuovere il terreno dalla piastra di alimentazione della metanfetamina e aggiungere due millilitri per pozzetto della sospensione di cellule BJ. La concentrazione di cellule BJ dovrebbe essere di circa cinque volte 10 per quarta cellula per pozzetto.

Incubare per una notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. 24 ore dopo la ritirata, le cellule BJ sulla piastra di alimentazione della metanfetamina sostituiscono il terreno con E-S-I-P-S umano, cioè staminali embrionali o colture di cellule staminali pluripotenti indotte. Medio. Continuare a cambiare il mezzo ogni 24 ore per sette giorni.

Il settimo giorno, sostituire il terreno di coltura cellulare ES con due millilitri di terreno condizionato con metanfetamina. Le cellule alimentatrici di metanfetamina hanno fornito i fattori solubili necessari per far crescere le cellule IPS. Ma ora dobbiamo aggiungere altri di questi fattori per mantenere sana la cultura.

Il terreno condizionato con metanfetamina contiene tutti i fattori solubili secreti dalle cellule alimentatrici di metanfetamina, incubano durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Guardando attraverso l'oscilloscopio, selezionare una colonia di cellule. Distinto da una piccola cupola compatta come l'aspetto in una piastra fresca a 24 pozzetti che hai preceduto 24 ore prima con ccf una cellule di alimentazione di metanfetamina ritira la colonia selezionata in coltura umana E-S-I-P-S.

Terreno integrato con 10 molecole di stelo micromolare Y 2 7 6 3 2. Un inibitore della chinasi dipendente. Cambiare il terreno di coltura senza integrare con la molecola staminale Y 2 7 6 3 2 ogni 24 ore per i primi sette giorni.

Dopo sette giorni cambia terreno in metanfetamina. Da condizione a mezzo continuano a far passare le cellule fino a quando non mostrano la tipica morfologia delle cellule ES umane. Cerca colonie piccole e compatte a cupola che abbiano un bordo affilato.

Le colonie dovrebbero essere uniformi e avere un alto rapporto tra nucleo e citoplasma. A questo punto, avete sviluppato colonie che hanno la morfologia delle cellule ES, ma esprimono anche geni caratteristici delle cellule ES? Per scoprirlo, colorare le colonie per i marcatori di pluripotenza come TRA 180, 1, TRA, uno, 60, SSEA, quattro s, SE, un tre, T, quattro, sox, due nanog e SSEA uno. Per iniziare, lavare delicatamente le cellule tre volte con PBS.

Successivamente, fissare le cellule con 500 microlitri di paraforma al 4%, aldeide o altro fissativo per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo 20 minuti, lavare le cellule con PB S3 più volte per rimuovere il fissativo in eccesso. Successivamente, bloccare il legame aspecifico incubando le cellule in 500 microlitri di tampone bloccante per pozzetto per un'ora a temperatura ambiente Dopo la fase di blocco, aggiungere 250 microlitri di anticorpo primario diluito da uno a 100 in tampone bloccante a ciascuna.

Incubare bene le cellule in anticorpi primari durante la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Lavare le cellule tre volte con PBS per rimuovere l'anticorpo primario non legato. Incubare le cellule con 250 microlitri di anticorpo secondario diluito da uno a 300 e tampone bloccante per un'ora a temperatura ambiente, tenendosi al riparo dalla luce per evitare il fotosbiancamento dopo l'incubazione con l'anticorpo secondario.

Lavare le celle tre volte con PBS fino al terzo lavaggio. Aggiungere DPI a un microgrammo per millilitro per colorare i nuclei. Infine, analizza l'espressione genica delle tue cellule IPS.

Al microscopio si ottengono morfologie umane, quattro cellule fibroblastiche cutanee in cui cot trasdotte con T, quattro SOX, due nanog e lin 28 cambiamenti morfologici già al quarto giorno dopo la trasduzione e il gruppo di cellule è diventato più compatto al giorno 17, espressione dei marcatori di potenza del liurgo. Per caratterizzare ulteriormente le colonie cellulari IPS isolate, abbiamo cercato la presenza di marcatori di pluripotenza comuni espressi nelle cellule ES. Le colonie hanno mostrato una forte attività fosfatasi alcalina.

Inoltre, l'immunochimica o ICC è stata eseguita sulle colonie cellulari IPS con un pannello di anticorpi specifici per marcatori di pluripotenza, tra cui marcatori di superficie TA 180 1, TRA one 60, SSEA four e SS EEA three, nonché marcatori nucleari, T four, SOX two e Nanog. Le colonie di IPS isolate sono risultate positive per tutti i marcatori. I risultati dell'ICC mostrano che le cellule IPS hanno mostrato il modello di espressione del marcatore di pluripotenza appropriato, dimostrando che queste cellule IPS assomigliano molto alle cellule E es umane indifferenziate.

Vi abbiamo appena mostrato come generare cellule IPS riprogrammando i fibroblasti umani con i geni staminali. Set di lentivirus del fattore di riprogrammazione umano. Quando si esegue questa procedura, è importante tenere conto di diversi fattori.

In primo luogo, potrebbe essere necessario modificare il rapporto virus/bersaglio attivo durante la fase di trasduzione primaria per ottenere un'efficienza di trasduzione ottimale. In secondo luogo, la condizione di crescita delle cellule bersaglio può avere un impatto. Le cellule sane e proliferative sono più suscettibili alla riprogrammazione.

In terzo luogo, quando si modifica il protocollo per numeri di cellule diverse, si raccomanda di regolare il numero di cellule target proporzionalmente alla superficie della piastra di coltura. Infine, l'applicazione di inibitori delle rocce come Y 2 7 6 3 2 dovrebbe essere presa in considerazione per garantire il successo della riprogrammazione, poiché studi recenti hanno dimostrato la sua utilità nel migliorare la sopravvivenza delle colonie di yes umane. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.