Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da fibroblasti umani Riprogrammare con il Stemgent Lentivirus umani TF Set

Ciao, mi chiamo Brad Hamilton. Sono uno scienziato del dipartimento di ricerca e sviluppo di STEM Gen. Oggi vi mostreremo un procedimento per riprogrammare i fibroblasti umani mediante fattori di riprogrammazione veicolati da lentivirus.

Questa procedura può essere utilizzata sia per generare cellule IPS che per studiare il processo di riprogrammazione. Le cellule IPS sono simili alle cellule ES per morfologia, proliferazione e capacità di differenziarsi in tutti i tipi di tessuti del corpo. Le cellule IPS umane presentano un vantaggio distintivo rispetto alle cellule ES poiché manifestano le proprietà fondamentali delle cellule ES senza il dilemma etico legato alla distruzione di un embrione per ottenere le cellule.

La generazione di cellule iPS specifiche per il paziente aggira un importante ostacolo terapeutico nella medicina rigenerativa personalizzata, eliminando il rischio di rigetto immunitario delle cellule trapiantate non autologhe. Cominciamo dunque. In diversi punti di questo protocollo, si sostituisce il mezzo di coltura delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) in via di sviluppo con mezzo condizionato con metionina.

La preparazione di questo mezzo richiede sei giorni. Pertanto, iniziare almeno una settimana prima di iniziare il proprio esperimento. Per iniziare, seminare ogni pozzetto di una piastra a sei.

Piastra a pozzetti con due volte 10 alla quinta cellule ditritrice cf uno in due millilitri di mezzo di crescita per meth. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, sostituire il mezzo con coltura cellulare per cellule E-S-I-P-S umane.

Incubare il mezzo durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Raccogliere il sopranatante e sostituirlo con mezzo fresco ogni 24 ore per quattro giorni. Filtrare il sopranatante attraverso un filtro da 0,22 micrometri.

Integrare il sopranatante raccolto con 15 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita dei fibroblasti basico (BFGF). Si otterranno circa 16 millilitri di mezzo condizionato con met, da conservare ogni giorno separatamente a quattro gradi SIUs. Il mezzo condizionato con met può essere conservato da una a due settimane a quattro gradi Celsius oppure per diversi mesi a meno 20 gradi Celsius.

Ora che hai verificato che il mezzo condizionato con metionina sarà pronto quando ne avrai bisogno, parliamo della preparazione delle cellule. Il primo passaggio nella generazione di iPSC consiste nell'utilizzare virus lentivirali per trasdurre cellule di fibroblasti della pelle del pene umano, o cellule BJ, con quattro fattori di trascrizione caratteristici delle cellule staminali. Per prepararsi alla trasduzione, semina le cellule BJ a una densità di uno per dieci alla quinta cellule per pozzetto di una piastra a sei pozzetti e coltivale.

Le cellule in due millilitri di mezzo di crescita, incubate durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica nello stesso giorno. Iniziare a preparare le piastre con alimentatori di metionina aggiungendo due millilitri di gelatina allo 0,1% diluita in acqua in una piastra a sei pozzetti e incubando durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. La gelatina riveste i pozzetti e funge da matrice per le cellule.

Ora le cellule BJ sono pronte per la trasduzione lentivirale per preparare il virus per la trasduzione. Aggiungere due millilitri di mezzo fresco con sei microgrammi per millilitro di polibrene e quattro lentivirus, ciascuno esprimente uno dei fattori di trascrizione umani T4, SO2 nanog e lin28, in modo che ciascuno abbia la stessa multiplicità di infezione o MOI.

Questi lentivirus sono tutti inclusi nel set di lentivirus dei fattori di riprogrammazione umani. Per eseguire la trasduzione, sostituire semplicemente il mezzo di crescita delle cellule BJ con il mezzo contenente il virus. Agitare delicatamente la piastra in modo che il mezzo ricopra uniformemente il fondo.

Incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica nello stesso giorno. Rimuovere una provetta di cellule cf one meth feeder dall'azoto liquido e scongelare. Rimuovere la soluzione di gelatina dalle piastre meth feeder, che ora sono rivestite di gelatina ciascuna.

Aggiungere 0,2 volte 10 alla quinta cellule in due millilitri di mezzo di crescita per MES. Incubare le cellule MES durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, staccare le cellule BJ con tripsina 0,05% EDTA e centrifugare a 200 g per cinque minuti.

Dopo la centrifugazione, aspirare il soprannatante e risospendere le cellule nel mezzo di crescita. Rimuovere il mezzo dalla piastra del feeder di metionina e aggiungere due millilitri per pozzetto della sospensione cellulare BJ. La concentrazione delle cellule BJ deve essere di circa cinque volte 10 alla quarta cellule per pozzetto.

Incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. 24 ore dopo il ripristino delle cellule BJ sulla piastra con metionina come nutriente, sostituire il mezzo con E-S-I-P-S umano, ovvero mezzo di coltura per cellule staminali embrionali o cellule staminali pluripotenti indotte. Continuare a cambiare il mezzo ogni 24 ore per sette giorni.

Al settimo giorno, sostituire il mezzo di coltura delle cellule ES con due millilitri di mezzo condizionato da meth. Le cellule feeder di meth hanno fornito i fattori solubili necessari per la crescita delle cellule IPS. Tuttavia, ora è necessario aggiungere ulteriori quantità di questi fattori per mantenere la coltura in buone condizioni.

Il mezzo condizionato da meth contiene tutti i fattori solubili secreti dalle cellule feeder meth incubate durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Osservando al microscopio, selezionare una colonia cellulare. Distinguibile per un aspetto compatto a cupola in una piastra fresca a 24 pozzetti che è stata precedentemente preparata 24 ore prima con cellule feeder ccf one meth, isolare la colonia selezionata nella coltura umana E-S-I-P-S.

Mezzo integrato con 10 micromolari della molecola staminale Y 2 7 6 3 2, un inibitore della chinasi dipendente. Cambiare il mezzo di coltura senza aggiungere la molecola staminale Y 2 7 6 3 2 ogni 24 ore per i primi sette giorni.

Dopo sette giorni, sostituire il mezzo con mezzo condizionato. Continuare a passaggi cellulari in questo mezzo fino a quando le cellule non mostrano una morfologia tipica delle cellule staminali embrionali umane. Cercare colonie piccole, compatte, a forma di cupola, con bordi ben definiti.

Le colonie devono essere uniformi e presentare un elevato rapporto tra nucleo e citoplasma. A questo punto, sono state sviluppate colonie con la morfologia delle cellule staminali embrionali (ES), ma esprimono anche geni caratteristici delle cellule ES? Per verificarlo, colorare le colonie per rilevare marcatori di pluripotenza come TRA 180 1 TRA one 60 SSEA four s, SE, a three T four sox, two nanog e SSEA one. Per iniziare, lavare delicatamente le cellule tre volte con PBS.

Successivamente, fissare le cellule con 500 microlitri di paraformaldeide al 4% o altro fissativo per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo 20 minuti, lavare le cellule con PBS per 3 volte per rimuovere l'eccesso di fissativo. Successivamente, bloccare il legame non specifico incubando le cellule in 500 microlitri di buffer di blocco per pozzetto per un'ora a temperatura ambiente. Al termine del passaggio di blocco, aggiungere 250 microlitri di anticorpo primario diluito 1:100 nel buffer di blocco in ciascun pozzetto.

Incubare bene le cellule con l'anticorpo primario tutta la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Lavare le cellule tre volte con PBS per rimuovere l'anticorpo primario non legato. Incubare le cellule con 250 microlitri di anticorpo secondario diluito uno a 300 in buffer di blocco per un'ora a temperatura ambiente, proteggendo dalla luce per evitare il fotoblecamento dopo l'incubazione con l'anticorpo secondario.

Lavare le cellule tre volte con PBS fino al terzo lavaggio. Aggiungere DPI a una microgrammo per millilitro per colorare i nuclei. Infine, analizzare l'espressione genica delle cellule IPS.

Al microscopio, la morfologia ha rivelato quattro cellule di fibroblasti cutanei umani co-trasdotte con T4, SOX2, Nanog e Lin28, in cui sono state osservate modifiche morfologiche già dal quarto giorno successivo alla trasduzione e in cui gli aggregati cellulari sono diventati più compatti al diciassettesimo giorno. Per caratterizzare ulteriormente le colonie di cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) isolate, abbiamo ricercato la presenza di marcatori comuni della pluripotenza espressi nelle cellule staminali embrionali (ES). Le colonie hanno mostrato una forte attività di fosfatasi alcalina.

Inoltre, è stata eseguita un'immunochimica o ICC su colonie di cellule IPS utilizzando un pannello di anticorpi specifici per marcatori di pluripotenza, inclusi i marcatori di superficie TA 180, TRA-1-60, SSEA-4 e SSEA-3, nonché i marcatori nucleari T4, SOX2 e Nanog. Le colonie di IPS isolate sono risultate positive per tutti i marcatori. I risultati dell'ICC mostrano che le cellule IPS esprimevano in modo appropriato il profilo di espressione dei marcatori di pluripotenza, dimostrando che queste cellule IPS assomigliano strettamente alle cellule staminali embrionali umane indifferenziate.

Abbiamo appena mostrato come generare cellule iPS riprogrammando fibroblasti umani con il set di lentivirus dei geni staminali. Quando si esegue questa procedura, è importante prendere in considerazione diversi fattori.

Innanzitutto, il rapporto tra virus attivo e bersaglio potrebbe necessitare di essere modificato durante il passaggio primario di trasduzione per ottenere un'efficienza ottimale di trasduzione. In secondo luogo, le condizioni di crescita delle cellule bersaglio possono avere un impatto. Le cellule sane e proliferative sono più suscettibili al riprogrammamento.

Terzo, quando si modifica il protocollo per diversi numeri di cellule, si raccomanda di regolare proporzionalmente il numero di cellule bersaglio rispetto alla superficie della piastra di coltura. Infine, si dovrebbe prendere in considerazione l'uso di inibitori della chinasi ROCK, come Y 2 7 6 3 2, per favorire un riprogrammazione efficace, poiché studi recenti ne hanno dimostrato l'utilità nel migliorare la sopravvivenza delle colonie di cellule staminali umane. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.