Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Ematociti concentrati Drosophila disperdere sulla totalità dello sviluppo dell'embrione. Questo protocollo dimostra come montare e immagine queste migrazioni uso di embrioni con ematociti concentrati fluorescente.

Questo video mostra una procedura per il montaggio di embrioni di drosofila per l'imaging degli emociti. I loro macrofagi embrionali. Gli embrioni vengono deposti dalle mosche su piastre di agar di succo di mela in una gabbia per la deposizione durante la notte.

Il giorno successivo la piastra agricola viene rimossa e gli embrioni vengono lavati dalla piastra agricola in un colino cellulare dopo ulteriori lavaggi per rimuovere i detriti. Il filtro cellulare contenente gli embrioni viene immerso nella candeggina per rivestire gli embrioni. Dopo aver lavato via la candeggina, gli embrioni vengono trasferiti in una goccia d'acqua.

La goccia d'acqua viene quindi aspirata e gli embrioni vengono ricoperti di olio di carbonio hello. Gli embrioni opportunamente messi in scena con i citi visibili vengono trasferiti in un Petri per membrana tra due vetrini coprioggetti apposti e accuratamente allineati in olio. Un terzo vetrino coprioggetti viene quindi posizionato sugli embrioni e incollato in posizione con lo smalto per unghie.

La motilità degli emociti all'interno dell'embrione può ora essere visualizzata al microscopio attraverso il vetrino coprioggetti più in alto. Ciao, sono Jennifer Zaed del laboratorio Brian Strm presso la divisione noleggio di Seoul e di biofisica molecolare presso il Kings College di Londra. E io sono Ian Evans del Wood Lab del Dipartimento di Biologia e Biochimica dell'Università di Bath.

Oggi vi mostreremo una procedura per montare il bryo di Joseph all'immagine dal vivo, il sito emo, i macrofagi embrionali di questo organismo. Utilizziamo questa procedura per studiare la dispersione dello sviluppo e la risposta del vento a queste importanti cellule immunitarie e al meccanismo citoscheletrico che utilizzano per eseguire questi processi. Quindi iniziamo.

Iniziare questa procedura ottenendo linee OAL TRO appropriate contenenti quattro driver gal specifici per gli emociti e reporter fluorescenti geneticamente codificati sotto controllo UAS. Qui, serpent gal four viene utilizzato per guidare l'espressione di un marcatore nucleare rosso fluorescente da UAS Red Stinger. Per una discussione della gamma di costrutti GAL a quattro driver e UAS raccomandati, si prega di consultare il protocollo scritto allegato per collocare 20 drosofile di ciascun sesso in una gabbia di deposizione.

La gabbia di deposizione è composta da una piastra di succo di mela da 55 millilitri montata sul fondo di un tubo di plastica con una garza che copre l'altra estremità per consentire il flusso d'aria. In alternativa, è possibile utilizzare un semplice peaker in plastica con fori. Perforando la base, lasciare che le mosche si acclimatino alla gabbia di deposizione per almeno due giorni dopo che le mosche si sono acclimatate, passare a una nuova griglia per succo di mela preriscaldata e lasciare che le mosche depongano durante la notte a 25 gradi Celsius.

Per informazioni sulla raccolta di embrioni più discretamente stagizzati, consultare il protocollo scritto allegato. Una volta che le mosche hanno incubato per il tempo appropriato per la deposizione, utilizzare un flacone di lavaggio per applicare circa tre millilitri di acqua sulla piastra. Quindi, utilizzando un pennello a punta morbida, rimuovere gli embrioni dal succo di mela, gli embrioni rimossi possono essere facilmente visti ad occhio nudo tenendo un colino cellulare su un bicchiere.

Versare l'acqua del succo di mela nel colino cellulare per raccogliere gli embrioni. Quindi aggiungere altra acqua al succo di mela. Aate. Ripetere il processo di filtraggio fino a quando non è stato raccolto il numero desiderato di embrioni.

Successivamente, utilizzando un flacone, lavare gli embrioni nel colino cellulare utilizzando circa 10 millilitri di acqua. Una volta che gli embrioni sono stati lavati, posizionare il colino cellulare nel coperchio dell'aerato di succo di mela. Aggiungi candeggina pulita quanto basta per sospendere gli embrioni nel colino cellulare per ricoprire gli embrioni.

Trasferire il colino cellulare e il coperchio della capsula di Petri in un microscopio da dissezione per seguire la decorazione degli embrioni. In condizioni di illuminazione a campo chiaro, la decorazione è completa quando le appendici dorsali si sono dissolte, il che dovrebbe avvenire entro due minuti. Al termine della decorazione, rimuovere nuovamente il colino contenente gli embrioni dalla candeggina, tenendo il colino sopra un bicchiere.

Usa un flacone di lavaggio per lavare via delicatamente ma accuratamente i residui di candeggina. Applicare fazzoletti di laboratorio di colore blu sul lato inferiore del colino cellulare per asciugare l'acqua rimanente. Se il colore blu cambia in bianco o rosa è presente candeggina residua, continuare il lavaggio assicurandosi che tutte le tracce di candeggina siano state rimosse prima di procedere al passaggio successivo.

La rimozione dell'acqua in eccesso dal filtro cellulare rende più facile raccogliere gli embrioni con un pennello nella fase successiva. Una volta rimossa tutta la candeggina dagli embrioni, metti una goccia d'acqua nel coperchio di una capsula di Petri con un pennello fine. Raccogli tutti gli embrioni rivestiti dal colino e rimettili in sospensione nella gocciolina.

Quindi, applica una salvietta chimica all'esterno del colino cellulare per asciugare gli embrioni. Una volta che gli embrioni sono stati essiccati, aggiungere una goccia di olio di carbonio halo, 700 per coprire tutti gli embrioni. Quindi posizionare una seconda piccola goccia di olio adiacente alla gocciolina contenente gli embrioni.

Ispezionare gli embrioni con un microscopio da dissezione fluorescente. Identificare embrioni adeguatamente stadiati del genotipo desiderato per visualizzare la migrazione laterale dei citi. Sulla linea mediana ventrale.

Scegli gli embrioni di stadio da 13 a 14. In questo esempio, i citi sono identificati dai nuclei fluorescenti e sono visibili nella testa e lungo il cordone nervoso ventrale e il vaso dorsale in via di sviluppo per visualizzare la motilità dell'emo dopo la dispersione sull'embrione, scegliere gli embrioni di stadio 15. In questa fase, l'emos si sarà disperso su tutto l'embrione.

Tuttavia, tre linee parallele di emos dovrebbero essere visibili sul lato ventrale dell'embrione dopo la migrazione laterale dalla linea mediana. Una volta selezionati gli embrioni, utilizzare un paio di pinze da orologiaio curve numero cinque per raccogliere gli embrioni selezionati. Facendo attenzione a non forare le membrane del flaconcino.

Quindi posizionare gli embrioni nella seconda goccia di olio sul lato inferiore di una capsula di Petri perm lumax da 50 millimetri. Mettere due piccole gocce di olio Halo Caron 700 a circa un centimetro di distanza l'una dall'altra. Applicare un vetrino coprioggetti su ogni goccia in condizioni di illuminazione a campo chiaro su un microscopio da dissezione.

Trasferisci con cura fino a 15 embrioni utilizzando una pinza curva. Allineare gli embrioni con il lato ventrale rivolto verso l'alto e parallelamente al bordo del coperchio. Scivola una volta che gli embrioni sono allineati a una piccola goccia di olio e gli permette di diffondersi per formare uno strato omogeneo tra i due vetrini.

Dopo che l'olio si è diffuso, l'operazione potrebbe richiedere alcuni minuti. Controlla che gli embrioni siano ancora ventrali. Con il lato rivolto verso l'alto se gli embrioni sono leggermente arrotolati.

Riposizionarli nuovamente con la pinza. Infine usando la pinzetta numero tre. Posizionare un terzo vetrino coprioggetti sugli embrioni.

Collegamento tra i due vetrini di copertura precedentemente aderenti. Incolla questo vetrino coprioggetti sulla copertina. Scivolare i supporti con lo smalto.

Gli embrioni sono ora pronti per l'imaging. Questo embrione di Red Stinger è stato montato con il lato ventrale rivolto verso l'alto e le immagini time-lapse sono state acquisite su un microscopio a dissezione fluorescente Leica M 2 0 5. I citi sono visualizzati dai loro nuclei etichettati in rosso.

Il film inizia allo stadio 12-13 dello sviluppo, quando i cititi lasciano la testa e migrano lungo la linea mediana ventrale. Dopo circa un'ora, i citi iniziano a migrare fuori dalla linea mediana per disperdersi in posizioni laterali lungo la superficie ventrale. Per il resto dello sviluppo.

Gli emociti sono molto attivi e migrano in tutto l'embrione. Dobbiamo mostrarti come monitorare l'embrione di Joseph per seguire il movimento o il lato emo dal vivo in vivo. Quando si esegue questa procedura, è importante maneggiare gli embrioni con cura, soprattutto sulla capsula della permanente di Petro, per evitare di danneggiarli una volta che gli embrioni sono nell'olio, sono relativamente resistenti alla disidratazione, ma bisogna fare attenzione a non sbiancare gli embrioni troppo a lungo quando si rimuove il corion.

Infine, montando diversi embrioni, ti darai la migliore possibilità possibile di ottenere un embrione con l'orientamento perfetto per l'imaging dal vivo. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.