Mosaico Transgenesi Zebrafish per la valutazione sequenze Enhancer

Dimostriamo il nostro approccio alla ricerca di potenziali elementi enhancer regolati da geni evolutivamente e valutando la loro funzione attraverso transgenesi mosaico zebrafish.

Ciao, sono Erica Kgi del laboratorio di Shannon Fisher presso il Dipartimento di Biologia Cellulare e dello Sviluppo dell'Università della Pennsylvania. Sono Chris Weber, anche lui del Fisher Lab. E io sono Shannon Fisher.

Oggi vi mostreremo una procedura per analizzare la funzione degli elementi enhancer utilizzando la transgenesi del pesce zebra. Utilizziamo questa procedura per studiare le regolazioni trascrizionali di geni importanti nello sviluppo scheletrico. Quindi iniziamo.

Per identificare le sequenze non codificanti che circondano i geni candidati, utilizziamo l'algoritmo fast cons, che è accessibile come traccia sul browser del genoma uc SC. Siamo principalmente interessati ai geni espressi durante lo sviluppo scheletrico, ma lo stesso approccio può essere utilizzato per studiare qualsiasi gene espresso nello sviluppo precoce. Nell'esempio mostrato qui, abbiamo identificato sequenze conservate.

Nell'intervallo che circonda il gene paraurti umano, esaminiamo l'intero intervallo con i geni adiacenti e determiniamo un cutoff di punteggio logaritmico specifico di dimensioni basse corrispondente a circa il 5% superiore della sequenza non codificante. Dopo aver selezionato le sequenze, progettare i primer utilizzando il primer tre per amplificare ogni sequenza dalla genomica umana, i primer del DNA dovrebbero essere selezionati per amplificare la regione conservata più 30 o più coppie di basi su entrambi i lati. Amplificare la regione di interesse con polimerasi di alta qualità utilizzando DNA genomico umano, utilizzare procedure standard di biologia molecolare di laboratorio per clonare il prodotto amplificato in un vettore di espressione.

Il vettore utilizzato in questo protocollo è PG wc FOS GFPA gateway. Vettore di destinazione. A seguito della creazione del vettore è stato detto di trasporre.

L'enzima necessario per la trasposizione viene prima trascritto in vitro utilizzando il kit di macchine M message M di Ambion e il plasmide PGB 600 prima delle iniezioni sperimentali. Testare l'efficacia di ogni lotto di trasposizioni iniettandolo con un potenziatore noto come i calzini di topo. 10 potenziatore.

Per prepararsi alle iniezioni, estrarre gli aghi utilizzati per la microiniezione da un vetro capillare a filamento di 1,2 millimetri di diametro su un estrattore per micropipette Sutter P 97. Utilizzare un programma che produca una punta forte con una conicità affilata per penetrare i corion intatti con una lama di rasoio pulita e un vetrino micrometrico. Rompere le punte a mano sotto uno stereomicroscopio fino a un diametro esterno di circa 15 micrometri.

Gli aghi possono essere conservati per un giorno in un piatto coperto. Mantenere la popolazione di pesci zebra su un ciclo regolare di luce-buio con 14 ore di luce in condizioni standard il giorno prima di eseguire le micro iniezioni. Prepara i pesci per gli accoppiamenti a tempo in piccole vasche di riproduzione.

Posizionare tre femmine o due maschi per vasca in file parallele la mattina delle micro iniezioni, poco dopo l'inizio del ciclo di luce. Combina maschi e femmine in acqua trattata con sistema pulito per la produzione di uova. Controllare frequentemente il pesce e raccogliere le uova entro pochi minuti dalla produzione per ottenere lotti ben sincronizzati.

Mantenere la produzione di uova per due o tre ore continuando a combinare gruppi di pesci freschi per tutta la mattinata con una pipetta di vetro di cinque pollici e un quarto dotata di bulbo in lattice. Smistare gli embrioni raccolti in piastre di Petri da 60 x 15 millimetri, parzialmente riempite con mezzo embrionale in gruppi di 50 embrioni. Segnate il tempo raccolto sul coperchio di ogni piatto.

Per ogni covata di embrioni raccolti, conservare una capsula di 50 embrioni per il controllo non iniettato tra i prelievi di ovociti. Preparare soluzioni iniettabili fresche mescolando i seguenti ingredienti in un tubo per micro-fuge e conservare in ghiaccio. Posizionare gli aghi per iniezione nei piatti di supporto e riempire con 1,5-2 microlitri di soluzione iniettabile.

Pipettando gocce da 500 nanolitri sull'estremità larga di ciascun ago. Il liquido verrà attirato verso la punta attraverso un'azione capillare. Preparare almeno due aghi per ogni soluzione iniettabile.

Caricare l'ago riempito nel portaago portatile di una pompa pico pneumatica o di un iniettore di pressione simile. Configurato e collegato a un serbatoio di azoto secondo le istruzioni del produttore. Calibrare i volumi di iniezione misurando il diametro delle goccioline espulse nell'olio minerale su un vetrino micrometrico, in genere un tempo di iniezione di 120 millisecondi.

Con una pressione di 20 PS, produrrò una gocciolina di circa un nanolitro utilizzando uno stereomicroscopio con un ingrandimento da sei a 10x. Tenere l'embrione in posizione con un paio di pinze sottili e spingere l'ago per iniezione con una pressione costante attraverso il corion nel tuorlo di un embrione allo stadio di una cellula o all'inizio di due cellule, posizionare la punta dell'ago nel tuorlo appena sotto i blastomeri, espellere circa un litro di soluzione per iniezione e ritirare l'ago per ogni costrutto che iniettiamo più o uguale a 200 embrioni dopo che l'iniezione è completata. Ordina gli embrioni rimuovendo gli ovuli non fecondati, gli embrioni danneggiati e le iniezioni fallite o gli embrioni senza rosso fenolo nei bestemmiatori.

Quindi incubiamo gli embrioni e il terreno embrionale a 28,5 gradi Celsius fino al momento appropriato per le osservazioni. Ora vi mostreremo alcuni risultati rappresentativi degli elementi enhancer che producono modelli tessuto-specifici di espressione della GFP nell'embrione di zebrafish. Studiamo i geni espressi nelle ossa o nella cartilagine durante.

Ecco un esempio di un elemento potenziatore a monte del gene acan che regola l'espressione nella cartilagine cranica facciale a tre giorni dopo la fecondazione. Ecco un altro potenziatore, questa volta dal gene bumper che regola l'espressione nelle cellule ossee. A cinque giorni dei molti enhancer che abbiamo identificato, troviamo poca correlazione tra la posizione relativa al gene e la regolazione dell'espressione.

Quando si scelgono le sequenze da testare, è importante ricordare che un enhancer può essere centinaia di kilobasi a monte o a valle di un gene o in uno degli introni come si vede in questo embrione. Una parte sostanziale delle sequenze non sembra regolare l'espressione tessuto-specifica. Questi spesso mostrano una fluorescenza molto scarsa o possono avere alcune cellule sparse in due siti comuni per l'espressione ectopica, l'epidermide e il muscolo scheletrico.

Vi abbiamo appena mostrato come identificare potenziali elementi potenziatori attraverso la conservazione della sequenza e testare la loro funzione attraverso la transgenesi a mosaico nel pesce zebra. Quando si esegue questa procedura, è importante esaminare la qualità del DNA e dell'RNA per le iniezioni. Inoltre, assicurati di esaminare attentamente tutti i tuoi embrioni iniettati, soprattutto se ti aspetti solo un'espressione in un piccolo gruppo di vendite.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.