Studiare Piscine vescicole sinaptiche con fotoconversione di coloranti Styryl

Questo video mostra la procedura per la conversione delle foto dello Styro Dye FM 1 43. Per studiare i pool di vescicole sinaptiche in drosophila melanogaster, le prime larve di drosophila vengono sezionate per esporre i muscoli ventrali che costituiscono la giunzione neuromuscolare o la preparazione NMJ. I preparati vengono incubati in tampone contenente FM D mostrato qui nella membrana cellulare con marcatura grigia.

Vengono quindi stimolati elettricamente o chimicamente per indurre la fusione fisica della membrana della vescicola internalizzata in seguito. L'esocitosi stimolata verrà colorata con FM D.Il colorante FM extracellulare viene quindi lavato, rimuovendolo dalla membrana plasmatica, e il tessuto viene fissato sotto illuminazione continua ad alta intensità. Il colorante è completamente sbiancato e il colore nero appare a causa dell'ammino Ben e della precipitazione.

Questo precipitato può quindi essere visualizzato per trasmissione em. Ciao, sono Philippe o Paso del laboratorio di Sylvia Olli presso l'Istituto Europeo di Neuroscienze di Gaon, in Germania. Oggi vi mostreremo una procedura per la fotoconversione FM inria giunzione neuromuscolare.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il riciclo vescicale sinaptico. Ok, allora iniziamo a lavorare al microscopio da dissezione. Inizia appuntando una larva di drosophila con il lato dorsale rivolto verso l'alto in un piatto rivestito di protezione.

Coprilo con soluzione salina di drosophila usando un ago da siringa e trova le forbici da dissezione che sezionano longitudinalmente il lato dorsale. Quindi rimuovere gli organi interni. Quindi, allunga la preparazione e di nuovo, fissala al piatto sigar.

Diversi muscoli ventrali possono quindi essere utilizzati per proteggere i coloranti FM utilizzati in questa procedura dallo sbiancamento. Questa procedura deve essere eseguita in condizioni di scarsa illuminazione. Coprire la preparazione di drosophila pizzicata con soluzione salina contenente 90 millimolari di cloruro di potassio e 10 micromolari FM.1 43 die per stimolare chimicamente i nervi.

Incubare per un minuto a temperatura ambiente dopo la stimolazione. Togliere la soluzione stimolante e immergere il piatto con la drosofila appuntata. Preparazione in un becher riempito con 100 millilitri di soluzione fisiologica di drosophila due volte per rimuovere la matrice extracellulare FM 1 43 lavorando sotto una cappa di sicurezza chimica.

Fissare il preparato della giunzione neuromuscolare in glutaraldeide al 2,5% in soluzione salina tamponata con fosfato o PBS per 45 minuti a temperatura ambiente. Lavare una volta il preparato con PBS, quindi rimuoverlo dal portasigari e immergerlo in 100 millimolari di cloruro di ammonio per 15 minuti. Per estinguere i gruppi aldeidici liberi del rimanente fissativo aldeidico gluteo.

Utilizzando il normale PBS, lavare la soluzione di cloruro di ammonio, posizionare la preparazione della giunzione neuromuscolare in un nuovo portasigari e immergerla in 1,5 milligrammi filtrati per millilitro. Diammina benzina o DAB in PBS e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Posizionare il campione sotto un microscopio a fluorescenza dotato di una sorgente luminosa con lampada al mercurio con un alloggiamento della lampada contenente uno specchio posteriore utilizzando un obiettivo a secco a ingrandimento relativamente basso.

Trova il campione. Quindi, utilizzando un normale cubo con filtro a fluorescenza verde di eccitazione blu, mettere a fuoco il segnale fluorescente. Le giunzioni neuromuscolari appaiono come punti luminosi sui muscoli.

Quindi, utilizzando lo stesso set di filtri a fluorescenza, illuminare il campione alla massima intensità fino a quando l'FM D non è completamente sbiancato. Utilizzando un obiettivo 20x, dovrebbero essere sufficienti da 30 a 45 minuti. Tuttavia, il tempo per la conversione delle foto varia a seconda dell'intensità dell'illuminazione, della forza di penetrazione del DAB nella preparazione e della lente dell'obiettivo utilizzata.

Dopo l'illuminazione, esaminare il campione sotto la luce di trasmissione. Se la conversione della foto è avvenuta, si dovrebbe vedere un precipitato marrone scuro. Torna al cannocchiale di dissezione, quindi usa le forbici per tagliare il punto convertito con foto dalla larva.

Tornare all'oscilloscopio di dissezione. Quindi usa le forbici per tagliare il punto convertito con foto dalle larve. Posizionare ora il campione in una provetta per micro-fuga contenente PBS lavorando sotto una cappa di sicurezza chimica e indossando dispositivi di sicurezza adeguati, inclusi guanti e protezione per gli occhi.

Preparare 300 microlitri di tetrossido di osmio all'1% per campione. A questo punto, posizionare il campione in un pallone di vetro con coperchio di plastica e aggiungere la soluzione di tetrossido di osmio preparata per postfissare la preparazione. Durante l'incubazione del campione, preparare soluzioni separate contenenti 30, 50, 70, 90 95 e 100% di etanolo.

Lavare il campione quattro o cinque volte con PBS per cinque minuti ciascuna. Dopo ogni lavaggio, utilizzare un PE di plastica sulla pipetta per trasferire il campione in un nuovo pallone. Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire il campione in un pallone di vetro pulito.

Successivamente, disidratare il campione inserendolo nella serie di soluzioni di etanolo. Inizia incubando in un millilitro di etanolo al 30%. Quindi, dopo cinque minuti, rimuovere l'etanolo utilizzando una pipetta da pascolo e sostituirlo con un millilitro di etanolo al 50%.

Proseguire con la disidratazione, incubando la preparazione della giunzione neuromuscolare nelle soluzioni al 70, 90 e poi al 95%. Il campione sarà quindi incubato in una soluzione di etanolo al 95% più volte rispetto a quello incubato in etanolo al 100% tre volte dopo la disidratazione. Aggiungere due millilitri di resina EIN uno a uno all'etanolo e posizionare il campione su un incubatore rotatore.

Da due a quattro ore a temperatura ambiente dopo la rotazione al 100% e posizionare il campione in un pallone aperto per consentire all'etanolo rimanente di evaporare per quattro-sei ore. Versare l'EIN fresco in uno stampo. Aggiungere i preparati e incubare a 60 gradi Celsius per 36 ore.

Quando le preparazioni EIN incorporate sono pronte, utilizzare un ultra microtomo per preparare sezioni sottili da 50 a 80 nanometri utilizzando un coltello di diamante. I campioni vengono tagliati in sezioni sottili. Le sezioni scorrono sul bagno d'acqua del coltello e possono essere successivamente prelevate su normali griglie EM.

I preparati sono ora pronti per l'imaging utilizzando le procedure EM convenzionali. Le giunzioni neuromuscolari isolate di Drosophila Melan gaster sono state stimolate utilizzando membrane ad alto contenuto di potassio e internalizzate. Sono stati colorati usando FM 1 43 come mostrato qui.

La fluorescenza di un terminale nervoso può essere osservata utilizzando un microscopio a epifluorescenza convenzionale. Sotto l'illuminazione continua, il colorante viene completamente sbiancato e quando l'illuminazione continua, appare un colore nero a causa della precipitazione di benzina di dinosauro. Questo terminale nervoso contiene vescicole sinaptiche, ma nessuna di esse è fotoconvertita.

Ciò potrebbe essere causato da una scarsa illuminazione o da una scarsa penetrazione dell'amminobenzina DIA nel tessuto. Al contrario, un'illuminazione eccessiva si traduce in un terminale complessivamente scuro in cui non sono distinguibili vescicole o organelli con la quantità appropriata di illuminazione che si può vedere con la conversione delle foto. Questa micrografia mostra un bhuton sinaptico in cui si vede una pozza di vescicole scure che indicano la conversione di foto FM.

Ti abbiamo appena mostrato come fotoconvertire le vescicole sinaptiche etichettate con fem die. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di calibrare sempre attentamente i tempi di illuminazione per la fase di conversione. Quindi questo è tutto.

Grazie per l'attenzione. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.