Name: Riavviare diretta di una forchetta di replica in stallo da un Head-On polimerasi RNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Scopri il riavvio della replicazione dopo collisione con RNA polimerasi in direzione head-on. Questo metodo utilizza DNA biotinilato e perline magnetiche per studiare il ruolo di Mfd nel ripristino della forcella di replicazione.

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Siamo particolarmente grati a Seth Darst per fornire proteine ​​RNAP e MFD e vettori di espressione. Siamo anche ringraziare Sergei Borukhov per la fornitura di Greb e Dan Zhang per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Institutes of Health (MOD) e da un Marie-Josee e Henry Kravis Fellowship presso l&#39;Università Rockefeller (RTP).

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content-nw/full/327/5965/590/F3">Pomerantz e O'Donnell, Science 327, 590-592 (2010)</a> . 1. Assemblaggio di un complesso RNAP fermato allungamento è stato eseguito come segue: 500 nM concentrazione finale di E. RNAP coli σ 70 Egli è stato mescolato con concentrazione del 5 nM finale di un modello di DNA biotinilato 3,6 kb che contiene il T7A1 promotore in 100 ml di tampone A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% glicerolo) per 10 minuti a 37 ° C. 100 mM di Apu e 40 mM ognuno di GTP, ATP e CTP sono stati aggiunti per altri 10 minuti a 37 ° C. 2. Immobilizzazione del complesso RNAP fermato allungamento su perline streptavidina è stata effettuata come segue: 200 ml di streptavidina sfere magnetiche patinata (Invitrogen) sono stati aggiunti alla reazione sopra per 10 minuti a temperatura ambiente. 3. Purificazione del complesso immobilizzato RNAP fermato allungamento è stato effettuato come segue: Le perle (da sopra) sono state lavate 5 volte con 0,9 ml di tampone A contenente 0,75 M di NaCl, 200 mg / ml di eparina, e 20 mg / ml ssDNA (Il surnatante è stato rimosso dopo ogni fase di lavaggio, di separazione magnetica.) Successivamente, la perline sono stati lavati 2 volte con 0,9 ml di tampone A. 4. Formazione di una forchetta replica a valle rispetto alla testa-on RNAP è stata eseguita come segue: Le perle (da sopra) sono stati risospesi in 100 ml di New England Biolabs buffer di 4 e 10 unità di Sap I (New England Biolabs) è stato aggiunto per 10 minuti a 37 ° C. Le perle sono stati lavati 3 volte con 0,9 ml di tampone A e poi risospeso in 50 ml di tampone T4 rapida reazione Legatura (New England Biolabs). 2 l di rapida ligasi T4 (New England Biolabs) è stato aggiunto insieme con 6 nM concentrazione finale di pre-ricotto DNA biforcuta (RP10, RP22, RP25) per 10 minuti a temperatura ambiente. Le perle sono stati lavati 3 volte con 0,9 ml di tampone A. 5. Assemblea dei replisoma e inizio della sintesi filone che porta al bivio replica è stata effettuata come segue: 448 pmol di DnaB (come esamero) è stata incubata con la 150 microlitri perle di tampone A (20 glicerolo mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10%) per 30 s in 23 ° C. 4,9 pmol di Pol III * (Pol III HE meno β), 15 pmol di β, 2 mM ATP, e 60 mM ciascuno dei dGTP e dATP sono state aggiunte ad un volume di 200 l ed incubati per altri 5 minuti a 37 ° C. La replica è stata aperta in seguito l'aggiunta di 10 mcg SSB e 24 mM ognuno di dATP e dTTP con [α-32 P] dTTP e [α-32 P] dCTP (attività specifica, 3.000-5.000 cpm / pmol) ad un volume finale di 250 microlitri. Reazioni sono state terminato dopo 10 minuti su l'aggiunta di 12 ml di 500 mM EDTA. 6. Purificazione e concentrazione del radio-prodotti contrassegnati DNA è stata eseguita come segue: Le perle (da sopra) sono stati bolliti dopo la reazione è stata interrotta al fine di rimuovere il DNA dalle perline. Qualsiasi residuo di DNA che rimangono aderenti al perline è stato rimosso trattando le perle con proteinasi K in un volume di 10 ul per 30 minuti a 50 ° C. Le perle sono state poi bollito e il surnatante è stato rimosso dalla separazione magnetica. Il supernatante combinato contenente il DNA è stato purificato utilizzando il kit di pulizia Qiagen PCR. Purificato radio-marcato DNA dei prodotti sono stati poi analizzati in un gel alcalino di agarosio. Replica * in assenza di uno scontro RNAP fermato complesso allungamento è stata eseguita come sopra, però, σ 70 è stato omesso. Rappresentante dei risultati: Collisione del replisoma con una testa-on RNAP risultati di solito in due prodotti di 2,5 kb e 3,6 kb di lunghezza. Da 2,5 kb prodotto rappresenta la lunghezza del DNA dalla forcella al RNAP fermato ei risultati replisoma stallo sulla collisione con il RNAP. Il prodotto 3,6 kb rappresentare tutta la lunghezza del DNA e dei risultati sia da occupazione incompleta del promotore da parte RNAP o parziale replisoma lettura tramite del capo-on RNAP. Un buon risultato o accurata dimostra che circa il 50% full-length del DNA viene prodotto. Tuttavia, in alcuni casi meno occupazione del promotore da RNAP verifica e una più alta percentuale di full-length del DNA si osserva quanto una popolazione maggiore di replisomes non incontrano uno scontro RNAP. Replica in assenza di un RNAP fermato in un solo full-length del DNA (3,6 kb). <img src="/files/ftp_upload/1919/1919fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura. 1 Il replisoma è impedita da una testa-on RNAP. (A) di setup sperimentale. A E. coli RNAP complesso allungamento fermato è stato montato su un DNA biotinilato contenente il promotore T7A1 come descritto in precedenza (9). In breve, un complesso allungamento fermato è stato formato da 20 bps a valle del promotore incubando oloenzima RNAP con il DNA biotinilato per 10 minuti seguita dall'aggiunta di Apu, GTP, ATP e CTP per altri 10 min. Perline streptavidina sono stati aggiunti per altri 10 minuti poi le perle sono state lavate cinque volte ciascuna con 0,9 ml di tampone contenente 0.75M NaCl, 200 mg / ml di eparina, e 100 nM a singolo filamento di DNA per rimuovere instabile RNAP-DNA complessi e NTP in eccesso . Il DNA è stato poi digerito con Sapi, lavato, e legato ad una pre-ricotto DNA biforcuta. Le perle sono stati lavati di nuovo prima del montaggio del replisoma. Il promotore si trova a 2,5 kb dalla forcella ed è orientato alla trascrizione diretta verso la forcella. (B) DnaB è stata aggiunta poi la replisoma è stato assemblato e replica è stato avviato sia in presenza (corsia 2) o assenza (corsia 1) di un a testa alta RNAP.

<ol><li>Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+and+resolving+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription.</a> DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).</li>
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</ol>

Lavare il complesso allungamento fermato legato ai talloni con sale alto è fondamentale al fine di rimuovere qualsiasi instabili o non specificamente molecole RNAP legato. RNAP ha un&#39;affinità molto elevata per le strutture di tipo iniettore-stampo di DNA. Quindi, è necessario rimuovere tale non specifici RNAP-DNA complessi al fine di eseguire la replica dal primer-template. Concentrando la radio prodotti contrassegnati con la purificazione del DNA Qiagen PCR kit è critica anche al fine di ottenere un elevato rapporto segnale sufficientemente radioattive che possono essere osservati nel gel.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads M-270</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0569S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Quick Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

riavviare diretta di una forchetta di replica in stallo da un head-on polimerasi rna

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

Gli studi in vivo suggeriscono che le forcelle replica vengono arrestati a causa di incontri con testa alta complessi trascrizione. Eppure, il destino del replisoma e RNA polimerasi (RNAP) a seguito di una collisione frontale è sconosciuta. Qui, troviamo che la E. coli bancarelle replisoma su collisione con uno scontro complesso di trascrizione, ma invece di crollare, la forcella di replicazione resta altamente stabile e riprende alla fine allungamento dopo lo spostamento del RNAP dal DNA. Troviamo anche che la trascrizione di riparazione fattore di accoppiamento, DM, promuove riavviare diretta della forcella a seguito della collisione, facilitando lo spostamento del RNAP. Questi risultati dimostrano la stabilità intrinseca dell&#39;apparato replica e un ruolo nuovo per la trascrizione accoppiati percorso riparazione nella promozione di replica passato un blocco RNAP.

Il destino del replisoma a seguito di una collisione con un testa-a RNA polimerasi (RNAP) è sconosciuta. Troviamo che le bancarelle replisoma su collisione con uno scontro RNAP, ma riprende allungamento dopo lo spostamento del RNAP dal DNA. MFD promuove riavviare la replica, facilitando lo spostamento del RNAP dopo la collisione.

Riavviare diretta di una forchetta di replica in stallo da un Head-On polimerasi RNA

Gli studi in vivo suggeriscono che le forche di replicazione vengano bloccate a causa di collisioni frontali con i complessi di trascrizione. Tuttavia, il destino del replisoma e dell'RNA...

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare il destino della zona di Repli e della RNA polimerasi o RNAP in seguito a una collisione frontale. Questo viene ottenuto innanzitutto assemblando il complesso di trascrizione su DNA biotinilato e immobilizzandolo su tablet e perle Stripp, il che porterà alla formazione di un complesso allungato di RNAP arrestato. Il secondo passaggio della procedura consiste nel legare un DNA forcellato preformato al complesso allungato di RNAP per formare una forcella di replicazione a valle della RNAP in collisione frontale.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'assemblare la zona di riplica e avviare la sintesi del filamento guida alla forcella di replicazione. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'isolare il DNA dalle perle magnetiche e purificare il DNA su una colonna di ripulitura PCR. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano l'arresto del roso in seguito alla collisione con il complesso di trascrizione head-on, mediante un gel agarosio alcalino dei prodotti di DNA radioetichettati purificati.Ciao, sono Richard Pomerance del laboratorio di Mike O'Donnell presso la Rockefeller University. Oggi vi mostrerò il procedimento per effettuare una collisione tra un ribosoma e una RNA polimerasi in fase solida. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare come il processo di replicazione sia influenzato dai complessi di trascrizione lungo il DNA.Iniziamo. Per iniziare questo protocollo, mescolare l'enzima RNA polimerasi oloenzima con un template di DNA biotinilato di 3,6 KB contenente il promotore T7A1 in 100 microlitri di buffer A; incubare la miscela per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione di 10 minuti, aggiungere i ribonucleotidi adenosina trifosfato, citidina monofosfato e uridina adenilica, che limiteranno la sintesi dell'RNA a 20 nucleotidi.Incubare la soluzione per ulteriori 10 minuti a 37 gradi Celsius per immobilizzare il complesso di allungamento dell'RN ape arrestato sulle perle. Aggiungere la soluzione a perle magnetiche rivestite con streptavidina. Lasciare incubare la miscela per 10 minuti a temperatura ambiente.Purificare il complesso di allungamento dell'RNAP immobilizzato e arrestato lavando le perle con 0,9 millilitri di tampone ad alto contenuto salino. Per rimuovere i complessi R-N-A-P-D-N-A non specifici dopo ogni lavaggio, rimuovere il sopranatante mediante separazione magnetica. Questo lavaggio deve essere ripetuto cinque volte.Quindi, le perle devono essere lavate altre due volte con 0,9 millilitri di buffer A. Dopo l'ultimo lavaggio, il forcone di replicazione a valle può essere assemblato per formare un forcone di replicazione a valle del complesso RNAP in avanzamento frontale; sospendere la striscia magnetica con le perle associate al complesso di elongazione RNAP arrestato in 100 microlitri di buffer quattro di New England Biolabs. Successivamente, aggiungere 10 unità di fosfatasi alcalina di gambero (SAP) e incubare il campione per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Lavare le perle tre volte con 0,9 millilitri di buffer A. Quindi, risospendere le perle in 50 microlitri di buffer per reazione di ligasi T4 rapida.Aggiungere due microlitri di ligasi T4 rapida e DNA forcellato preformato, incubare la soluzione per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, lavare le perle altre tre volte con 0,9 millilitri di tampone A, quindi aggiungere esamero e DNA elicasi al complesso di allungamento dell'RNAP arrestato e alla forca di replicazione a valle, legati alle perle di streptavidina magnetica. Preparare la soluzione in 150 microlitri di tampone A e incubarla per 30 secondi a 23 gradi Celsius.Dopo una breve incubazione di 32 secondi a 23 gradi Celsius. Alla polimerasi tre beta clamp, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P alfa P 32 marcato dGTP e alfa P 32 marcato dATP fino a un volume di 200 microlitri. Incubare il campione per cinque minuti a 37 gradi Celsius.Avviare la replicazione aggiungendo la proteina legante il DNA a filamento singolo, DCTP e DTTP. Aggiungere inoltre DTTP e DCTP marcati con P 32-alfa, portando il volume finale a 250 microlitri. Dopo 10 minuti, arrestare le reazioni aggiungendo 12 microlitri di EDTA 0,5 M.Successivamente, far bollire le perline din per rilasciare il DNA dalle perline. Rimuovere qualsiasi residuo di DNA trattando le perline con proteinasi K per 30 minuti a 50 gradi Celsius. Far bollire nuovamente le perline e rimuovere il soprannatante mediante separazione magnetica.Purificare il surnatante combinato contenente il DNA utilizzando il kit di purificazione PCR Kyogen. Infine, analizzare i prodotti di DNA marcati radioattivamente purificati in un gel alcalino aros. La collisione della zona con una RNAP frontale produce solitamente due prodotti di lunghezza pari a 2,5 KB e 3,6 KB. Il prodotto di 2,5 KB rappresenta la lunghezza del DNA dalla forcella fino alla RNAP arrestata.Ciò è dovuto all'arresto della replicazione in seguito alla collisione con la RNAP. Il prodotto di 3,6 KB rappresenta il DNA di lunghezza intera ed è il risultato di un'occupazione incompleta del promotore da parte della RNAP o di un parziale superamento della replicazione in senso opposto alla RNAP. Un buon risultato dimostra che viene prodotto circa il 50% di DNA di lunghezza intera.Tuttavia, in alcuni casi si verifica una minore occupazione del promotore da parte della RNAP e si osserva una percentuale maggiore di DNA di lunghezza completa. Questo accade perché una popolazione maggiore di zone di replicazione non incontra una RNAP in collisione frontalmente; in assenza di una RNAP arrestata, si ottiene esclusivamente DNA di lunghezza completa. Abbiamo appena mostrato come eseguire la replicazione in fase solida in presenza di un complesso di allungamento della RNA polimerasi arrestato legato al DNA. Durante questa procedura, è importante lavare il complesso di trascrizione arrestato con una soluzione ad alta forza ionica per rimuovere l'eccesso di RNA polimerasi, che si lega in modo non specifico al DNA e inibisce la replicazione.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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