Riavviare diretta di una forchetta di replica in stallo da un Head-On polimerasi RNA

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare il destino della zona di Repli e della RNA polimerasi o RNAP a seguito di una collisione frontale. Ciò si ottiene assemblando prima il complesso di trascrizione sul DNA biotinilato e immobilizzandolo su compresse e perline di Stripp, che si tradurrà nell'arresto del complesso di allungamento dell'RNAP. Il secondo passo della procedura consiste nel legare il DNA biforcato pre-necessario al complesso di allungamento dell'RNAP per formare una forcella di replicazione a valle dell'RNAP frontale.

Il terzo passo della procedura consiste nell'assemblare la zona di repli e avviare la sintesi del filamento principale alla forcella di replicazione. La fase finale della procedura consiste nell'isolare il DNA dalle sfere magnetiche e purificare il DNA su una colonna di pulizia PCR. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano che il roso si blocca in caso di collisione con il complesso di trascrizione frontale attraverso un agro gel alcalino di prodotti di DNA purificati radiomarcati.

Ciao, sono Richard Pomerance del Laboratorio di Mike O'Donnell alla Rockefeller University. Oggi mostrerò la tua procedura come eseguire una collisione del ribosoma con una testa su RNA polimerasi in fase solida. Utilizzo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare come il processo di replicazione sia influenzato dai complessi di trascrizione lungo il DNA.

Quindi iniziamo. Per iniziare questa miscela di protocollo, l'oloenzima RNAP con un modello di DNA biotinilato da 3,6 KB contenente il promotore T seven A one in 100 microlitri di tampone a incuba la miscela per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione di 10 minuti, aggiungere i ribonucleotidi adenosina, trifosfato, citidina fosfato e allele di Aden uridina, che limiteranno la sintesi dell'RNA a 20 nucleotidi.

Incubare la soluzione per altri 10 minuti a 37 gradi Celsius per immobilizzare il complesso di allungamento delle scimmie RN bloccato su perline. Aggiungere la soluzione alle perle magnetiche rivestite di streptavidina. Lasciare incubare la miscela per 10 minuti a temperatura ambiente.

Purificare il complesso di allungamento dell'RNAP immobilizzato lavando le perle con 0,9 millilitri di tampone ad alto contenuto di sale. Per rimuovere i complessi R-N-A-P-D-N-A non specifici dopo ogni lavaggio, rimuovere il surnatante mediante separazione magnetica. Questo lavaggio deve essere ripetuto cinque volte.

Dopo il lavaggio finale, la forcella di replicazione a valle può essere assemblata per formare una forcella di replicazione a valle della testa RNAP Resus, sospendere la striscia magnetica a perline evidenti attaccate al complesso di allungamento RNAP fermato in 100 microlitri di tampone quattro di New England Biolabs. Quindi, aggiungi 10 unità di fosfatasi alcalina di gamberetti o SAP one e incuba il campione per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Lavare le perle tre volte con 0,9 millilitri di tampone A.Quindi risospendere le perle in 50 microlitri di tampone di reazione di legatura rapida T quattro.

Aggiungere due microlitri di T 4 ligasi rapida e DNA biforcuto pre-bisogno, incubare la soluzione per 10 minuti a temperatura ambiente. Infine, lavare le perle altre tre volte con 0,9 millilitri di esamero della miscela di tampone A, l'elicasi di DNAB con lo streptococco magnetico A e le perle che sono attaccate al complesso di allungamento RNAP arrestato e alla forcella di replicazione a valle. Preparare la soluzione in 150 microlitri di tampone A e incubarla per 30 secondi a 23 gradi Celsius.

Dopo la breve 32a incubazione a 23 gradi Celsius. Alla polimerasi tre beta clamp, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P alfa P 32 marcato DGTP e alfa P 32 marcato DATP per un volume di 200 microlitri. Incubare il campione per cinque minuti a 37 gradi Celsius.

Avvia la replicazione aggiungendo la proteina legante il DNA a filamento singolo DCTP e DTTP. Aggiungere anche alfa P 32, etichettato DTTP e DCTP a un volume finale di 250 microlitri. Dopo 10 minuti, terminare le reazioni aggiungendo 12 microlitri di EDTA 0,5 molari.

Quindi, fai bollire le perle strp din per rilasciare il DNA dalle perline. Rimuovere eventuali residui di DNA trattando le perle con proteinasi K per 30 minuti a 50 gradi Celsius. Far bollire nuovamente le perle e rimuovere il surnatante mediante separazione magnetica.

Purificare il surnatante combinato contenente il DNA utilizzando il kit di pulizia Kyogen PCR. Infine, analizzare i prodotti di DNA radiomarcato purificato in un gel di aros alcalino La collisione della zona con una testa su RNAP di solito si traduce in due prodotti di 2,5 KB e 3,6 KB di lunghezza. Il prodotto da 2,5 KB rappresenta la lunghezza del DNA dalla forchetta all'RNAP bloccato.

Ciò è dovuto allo stallo di repli in caso di collisione con l'RNAP. Il prodotto da 3,6 KB rappresenta il DNA a lunghezza intera e deriva dall'occupazione incompleta del promotore da parte dell'RNAP o dalla lettura parziale dell'RNAP frontale. Un buon risultato dimostra che viene prodotto circa il 50% di DNA a lunghezza intera.

Tuttavia, in alcuni casi, si verifica una minore occupazione del promotore da parte dell'RNAP e si osserva una percentuale più elevata di DNA a lunghezza intera. Questo perché una popolazione maggiore di zone repli non incontra una testa sulla replicazione dell'RNAP in assenza di un RNAP interrotto si traduce solo nel DNA a lunghezza intera, ti abbiamo appena mostrato come eseguire la replicazione e la fase solida in presenza di un complesso di allungamento della RNA polimerasi fermato legato al DNA. Quando si esegue questa procedura, è importante lavare il complesso di trascrizione interrotto con sale alto per rimuovere l'eccesso di RNA polimerasi, che si lega in modo non specifico al DNA e inibisce la replicazione.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.