Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare cellule staminali pluripotenti indotte umane con il virus Sendai. Ciò si ottiene preparando e placcando prima le cellule dei fibroblasti da trasdurre. Il passo successivo della procedura è infettare le cellule con il virus Sendai.

Quindi le cellule dei fibroblasti infette vengono trasferite su cellule alimentatrici di fibroblasti embrionali di topo fresche. Il passaggio finale consiste nel selezionare manualmente il riprogrammato. Ora le cellule staminali pluripotenti, in ultima analisi la riprogrammazione delle cellule dei fibroblasti in I PSCs, senza l'uso di geni trans, può essere dimostrata attraverso l'immunomarcatura e la R-T-P-C-R.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente è che migliora l'efficienza della riprogrammazione senza rimanere transing e in modo economicamente vantaggioso Per questo protocollo, avere fibroblasti umani pronti coltivati in DMEM. Con FBS trasferire queste cellule su piastre a 24 pozzetti per la piastra dell'esperimento, le celle in sei diluizioni seriali per determinare la migliore densità per l'attacco delle cellule. Ogni fila della piastra a 24 pozzetti può ospitare una serie di celle di diluizione.

In questo modo è possibile testare quattro tipi di cellule su una piastra, incubare la diluizione per 24 ore. Il giorno successivo selezionare i pozzi a tre livelli di confluenza per la trasduzione. Uno ad un alto livello di confluenza dell'80-90%, uno a circa il 60% di confluenza e il terzo a circa il 30% di confluenza un'ora o più prima della trasduzione.

Sostituire il terreno con 300 microlitri di terreno di coltura fresco per fibroblasti per il disgelo di trasduzione. Una serie di provette per il virus Sendai a 37 gradi Celsius per alcuni secondi, e poi finire. Scongelarli a temperatura ambiente.

Centrifugare i virus scongelati a 6.000 G per 10 secondi e conservarli con ghiaccio in una provetta per microcentrifuga. Realizzare una miscela dei virus calcolata in base al numero di cellule da trasdurre. I dettagli del calcolo sono disponibili nel protocollo di testo.

Mescolare bene i virus con un pipettaggio delicato. Ora alle cellule più dense, aggiungi due volumi di virus. Aggiungi un volume di virus alle cellule a media densità e aggiungi mezzo volume di virus alla selezione meno densa.

Agitare la piastra e lasciarla incubare per una notte affinché la reazione avvenga il giorno successivo. Sostituire il terreno con 500 microlitri di terreno fresco per fibroblasti. Ripetere l'operazione due giorni dopo, tre giorni dopo la seconda modifica del terreno apportata alle cellule trasdotte.

Preparare le cellule di metanfetamina in piastre da 60 millimetri con DMEM contenente il 10% di piastra FBS 500.000 cellule per piastra e incubarle durante la notte. Il giorno successivo, sostituire il terreno sulle cellule di metanfetamina con terreno fresco e quindi procedere con l'impostazione della co-coltura. Per prima cosa, rimuovere il terreno dai fibroblasti trasdotti e lavarli una volta con DPBS.

Successivamente, aggiungere 200 microlitri di tripsina EDTA allo 0,25% a ciascun pozzetto trasdotto di cellule entro cinque minuti. Raggruppare tutte le cellule staccanti in un'unica provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare le celle a 1.350 g per quattro minuti.

Quindi rimuovere il surnatante e lavare le celle pellettate con circa cinque millilitri di terreno fresco per neutralizzare la spilla. Ora raccogli le celle con un'altra centrifuga di quattro minuti a 1, 350 G.Piastra successiva. La maggior parte delle cellule sono sei diluizioni seriali in metanfetamina.

La prima e l'ultima diluizione potrebbero non essere necessarie a seconda del tasso di mortalità delle cellule. Conservare alcune cellule per un'estrazione dell'RNA e incubare le piastre durante la notte. Il giorno successivo, sostituire il terreno con un terreno ES umano integrato con 10 micromolari di inibitore della chinasi RO Y 2 7 6 3 2.

Per migliorare la sopravvivenza cellulare nei giorni successivi, cambiare il terreno in un normale terreno di ES umano non integrato. Dopo una settimana di coltivazione, inizia a controllare le piastre ogni pochi giorni per la formazione di grumi cellulari simili a colonie ES. Una volta che compaiono, monitora la crescita.

Tre settimane dopo la trasduzione, le colonie di grumi di cellule ES dovrebbero essere pronte per l'espansione. Hanno preparato celle di alimentazione della metanfetamina in piastre da 24 pozzetti proprio come sono state preparate per piastre da 60 millimetri. Prima di prelevare qualsiasi colonia, cambiare il terreno sulle cellule di metanfetamina in terreno ES con 10 microlitri di Y 2 7, 6, 3, 2.

Scegli una colonia alla volta dai piatti. Trasferisci la colonia in una provetta da 15 millilitri con la soluzione lì. Rompi la colonia usando il pipettatore.

Poi copri un me. Beh, con la colonia distrutta. Alla fine carica ogni pozzo con una colonia spezzettata e carica il maggior numero possibile di pozzi.

Mantenere le celle con cambi giornalieri di terreno ed espanderle in piastre a sei pozzetti e poi in piastre da 60 millimetri. Tipicamente, i fibroblasti infettati dal virus Sendai non mostrano alcun cambiamento morfologico fino a dopo cinque giorni. Quindi le cellule assumono una forma rotonda con un nucleo più grande e un citoplasma più piccolo.

Questo protocollo su piccola scala include diversi parametri che possono essere ottimizzati, come la densità dei fibroblasti, il titolo del virus e la densità di placcatura al mese. Anche la trasduzione di cellule con diversa cofluenza mostrate in diversi colori può essere ottimizzata. Dopo una settimana di co-coltura con cellule alimentatrici di metanfetamine, i fibroblasti parzialmente riprogrammati hanno una forma a forma di slike sciolto e sono facilmente raccolti invece di essere raccolti utilizzando la tripsina.

Completamente riprogrammate, le PSC I sono chiaramente identificabili da celle parzialmente riprogrammate. Le cellule completamente riprogrammate sono strettamente impacchettate e le colonie possono avere confini chiari. Le cellule parzialmente riprogrammate formano grappoli sciolti che si staccano facilmente.

Dopo aver espanso i cloni IPSC per diverse settimane, la colorazione per i marcatori delle cellule staminali è giustificata rispetto alle cellule H nove. Gli IPC sono positivi a diversi anticorpi attesi, tra cui SSEA four, OCT four, TRA 81 e nano G, a sostegno della loro qualità pluripotente. L'uso del transgene R-T-P-C-R non è stata notata nei cloni IPSC umani.

Dopo 10 primer per OCT esogeno quattro, SOX due, klf quattro e Cmic sono stati utilizzati con campioni di controllo positivi che hanno mostrato forti livelli di espressione transgenica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come riprogrammare le cellule somatiche per indurre le cellule staminali poli potenti e come selezionarle, riprogrammare completamente le cellule delle altre cellule.