Name: Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Scopri come generare cellule staminali pluripotenti indotte umane senza transgeni utilizzando il virus Sendai. Questo metodo efficiente riprogramma i fibroblasti somatici per applicazioni in medicina rigenerativa.

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Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Lee per le discussioni importanti sul manoscritto. Il lavoro in laboratorio Lee è stato sostenuto da sovvenzioni dal Robertson Investigator Award of Foundation di New York Stem Cell e dal Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).

1. Preparazione di cellule e dei media (1 ° giorno) <ol><li> Cultura ed espandere fibroblasti umani con i media DMEM contenente 10% FBS. </li><li> Piastre fibroblasti umani (Figura 1) su una piastra da 24 pozzetti alla densità appropriata per pozzetto il giorno prima trasduzione. NOTA: Le seguenti diluizioni seriali sono raccomandati (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K e 6.25K), perché diversi tipi di cellule hanno diverse capacità di attacco. </li><li> Incubare le cellule per un giorno a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore, assicurando le cellule hanno pienamente aderito ed esteso. </li></ol> 2. Eseguire trasduzione (Day 2) <ol><li> Il giorno di trasduzione, controllare la densità cellulare e scelto pozzetti densità più efficienti (Figura 2). E &#39;meglio scegliere tre diverse densità: alta (80 ~ 90%), medio (50 ~ 70%) e bassa (20 ~ 40%). </li><li> Almeno 1 ora prima di trasduzione, aspirare il fibroblsupporti AST dalle cellule e modificare nuovi 300 ml di mezzo fibroblasti. </li><li> Rimuovere un set di 4 diversi tubi di virus Sendai dal -80 ° C di stoccaggio. Scongelare ogni provetta allo stesso tempo in un bagno d&#39;acqua a 37 ° per alcuni secondi, e poi le valvole fuori dal bagno di acqua. Dopo di che, scongelare a temperatura ambiente; provette da centrifuga a 6000 xg per 10 sec e disporli sul ghiaccio fino all&#39;uso. Non ricongelare e scongelare il virus dal momento che i titoli non manterrà. </li><li> Aggiungere i volumi di ciascuna delle quattro tubi virus Sendai (OCT-4, Klf-4, c-Myc e Sox-2) indicati al tubo micro-centrifuga. Assicurarsi che la soluzione viene mescolata ben pipettando delicatamente. Ad esempio, se 50K cellule / pozzetto di una 24-pozzetti lookwell per trasduzione: (Titer sulla base del certificato di analisi di Life Technologies, può essere diverso da lotto a lotto) Tubo hOct-4 = 6,0 x 10 7 CIU, 3 MOI = 5 ml Tubo hSox-2 = 6,5 x 10 7 CIU, 3 MOI = 4.6 μ; L Tubo hKlf-4 = 6,3 x 10 7 CIU, 3 MOI = 4.8 ml Tubo hc-Myc = 7.8 x 10 7 CIU, 3 MOI = 3,8 microlitri Totale = 18.2 ml di quattro fattori virali miscela / uno così (50K celle) della piastra da 24 pozzetti </li><li> A seconda densità cellulari; aggiungere 2X, 1X, 0.5X e volume della miscela virus nel pozzo. Agitare delicatamente la piastra anteriore alla parte posteriore, a sinistra ea destra (2X: 36.4 ml di miscela di virus, 1X: 18,2 microlitri e 0.5X: 9.1 ml). </li><li> Mettere le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore e incubare una notte. </li></ol> 3. Sostituzione della Cultura Media (Day 3 &amp; Day 5) <ol><li> 24 ore dopo la trasduzione, sostituire il mezzo con 500 microlitri media fibroblasti fresco. </li><li> Il giorno 5, cambiare il Piano con i media fibroblasti fresca. </li></ol> 4. Preparare piatti MEF per il Co-cultura (Giorno 8) <ol><li> Preparare cellule MEF in 60 millimetri capsule di Petri con il 10% FBS conteneva DMEM uno day prima passaging fibroblasti trasdotte sul feeder cellule MEF. Nota: Stiamo usando 5 x 10 5 del MEF in ogni piatto 60 millimetri. </li></ol> 5. Avvio co-coltura con cellule trasdotte Feeder MEF (Giorno 9) <ol><li> Prima di placcatura cellule trasdotte, aspirare il 10% FBS conteneva DMEM supporto dai piatti alimentatore MEF e aggiungere fresco del 10% FBS conteneva DMEM. </li><li> Rimuovere il terreno dai fibroblasti trasdotti che sono 24 pozzetti e lavare le cellule una volta con D-PBS. Aggiungere 200 ml di 0,25% tripsina / EDTA nelle cellule di fibroblasti inthe 24-pozzetti. Dopo meno di 5 minuti di incubazione con tripsina / EDTA, quando le cellule iniziano a staccarsi dalla piastra, raccogliere le cellule con mezzo di coltura in tubo da 15 ml. Poi si centrifuga a 6000 g per 4 min. NOTA: Pooling 2X, 1X, e il virus 0.5X è raccomandato fibroblasti trasdotte. </li><li> Rimuovere il mezzo surnatante e lavare per risospendereil pellet cellulare con 4-5 ml di terreno fresco fibroblasti di neutralizzazione da tripsina. Poi centrifugare a 135 g per 4 min. </li><li> Cellule Piastra come densità diluizione seriale e iniziare a co-coltura di fibroblasti con i media sul MEF: come 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 e 1/128 a 60 mm piatto. A seconda del tasso di morte delle cellule durante la prima settimana di trasduzione, non si può avere bisogno di diluire a 1/2 o 1/128 densità. Mettere da parte cellule rimanenti per estrarre l&#39;RNA totale come controllo positivo per Transgene RT-PCR. </li><li> Porre 60 millimetri piatti 37 ° C, 5% CO 2 incubatore durante la notte. </li></ol> 6. Feed Cellule Staminali embrionali umane a medio e Controllo delle Cellule (Giornata 10) <ol><li> Il giorno dopo, cambiare i media fibroblasti ai media ES umana con 10 pM Y-27632. Dopo di che, cambiare medio giornaliero con terreno ES umana: 800 ml DMEM/F12 + 200 ml Knockout siero sostituzione + 10 ml di L-Glutammina + 10 ml di 10 mM MEM aminoacidi non essenziali minimi+ 1 ml di 2-mercaptoetanolo + 10 ng / ml di fattore base di crescita dei fibroblasti. </li><li> Fare un cambiamento dei media ogni giorno con mezzi freschi umane ES. Dopo una settimana, controllare i piatti una volta ogni 2 ~ 3 giorni sotto un microscopio per la formazione di grumi di cellule ES colonia-like. A seconda del tipo di cellula, la cultura vorrà più o meno tempo prima colonie si trovano. </li></ol> 7. Picking staminali pluripotenti indotte colonie di cellule ed espandere la Cells (giorno 20 ~) <ol><li> Tre settimane dopo la trasduzione, le colonie dovrebbero apparire cresciuto correttamente per la raccolta. </li><li> Il giorno prima di prendere le colonie, preparare alimentatore MEF a 24 pozzetti. NOTA: Stiamo usando 12,5 x 10 5 del MEF in una piastra da 24 pozzetti. </li><li> Il giorno dopo, cambiare mezzo di piatti MEF dai media fibroblasti a supporto ES umana con 10 pM Y-27632. Scegliere manualmente una colonia in ogni tempo sotto il microscopio alla raccolta-cappuccio e macchie più piccole pipettando e trasferirlisulla nuova preparati MEF dishes.Try di scegliere diversi cloni. </li><li> Passaggio ed espandere l&#39;ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti di una piastra inizialmente 6 bene. Poi da un 6-pozzetti a 60 mm piatti prima di ulteriore moltiplicazione. </li></ol> 8. Caratterizzazione di iPSCs umano (dopo 10 passaggi) <ol><li> Immunofluorescenza <ol><li> Piatto iPSCs umani in lamiera e della cultura 24 pozzetti durante 4-5 giorni con cambio giornaliero dei media. </li><li> Per avviare test immunofluorescenza, lavare la piastra con D-PBS volta. Poi fissare le cellule immediatamente nello 0,4% paraformaldeide per 30 min. Dopo che lavare tre volte in D-PBS per 5 min. </li><li> Trattare cellule fissate con 0.1% Triton X-100 in PBS soluzione per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare la soluzione permeablization (0,1% triton X-100 soluzione), poi aggiungere BSA soluzione bloccante 0,5% per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Eseguire una rilevazione di Nanog, Oct-4, SSE (antig embrionale stadio-specificait) e TRA-1-81 (tumore rifiuto antigene) utilizzando un anticorpo anti-umano in soluzione BSA allo 0,5% (controllare la tabella materiale per tasso di diluizione di anticorpi). Incubare anticorpo primario per 2 ore a temperatura ambiente. Quindi lavare tre volte in D-PBS per 5 minuti ciascuno. </li><li> Verificare usando la microscopia a fluorescenza dopo 1 ora di incubazione con Alexa Fluor 488 di capra anti-topo IgG come 2 ° anticorpi, che vengono diluiti in soluzione 1:2.000 BSA 0,5% a temperatura ambiente. Colorare tutti i nuclei di ogni MEF cellule feeder e hiPSCs con DAPI. </li></ol></li><li> RT-PCR di Transgene Conferma <ol><li> Estrarre mRNA totale di pellet cella utilizzando reagenti di estrazione di RNA. </li><li> Fare una trascrizione inversa su aliquote (1 mg) di RNA totale e il cDNA risultante per l&#39;amplificazione PCR da trascrittasi inversa. </li><li> Preparare le miscele PCR per contenere 2 ml di cDNA, 10 ml di 2X PCR master mix, 2 ml di 2 pmol di primer(Avanti: 1 ml e reverse: 1 ml) e 6 ml di DW. Per rilevare l&#39;espressione genica, apportare la RT-PCR con i primer elencati nella Tabella 1. </li><li> Eseguire la RT-PCR con gene GAPDH come controllo per l&#39;efficienza delle reazioni di amplificazione. Visualizzare e analizzare prodotto di PCR dell&#39;1% elettroforesi su agarosio-gel. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322, 949-953 (2008).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+induced+pluripotent+mouse+stem+cells+by+the+piggyBac+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.</a> Nature Methods. 6, 363-369 (2009).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Yoshioka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Human+iPSCs+by+a+Synthetic+Self-Replicative+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA.</a> Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Fluri, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation%2C+expansion+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+continuous+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures.</a> Nature Methods. 9, 509-516 (2012).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22P+Jpn+Acad+B-Phys%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.</li>
<li>Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+and+epigenetic+fluidity+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riprogrammazione delle cellule somatiche umane per hiPSCs detiene promesse senza precedenti nella biologia di base, medicina personale, e il trapianto 12. In precedenza, le generazioni IPSC umane necessarie virus a DNA che ha il rischio di integrazione nel genoma dell&#39;ospite, che può creare mutazioni genetiche indesiderabili che limitano ulteriori applicazioni cliniche quali sviluppo di farmaci e terapie di trapianto 13. Con questa ragione, molti studi sono stati riportati per generare-vettore ...

Le cellule umane staminali embrionali (hESC) hanno la capacità di auto-rinnovarsi in vitro e hanno pluripotenza, che potrebbe essere potenzialmente utile per la modellazione della malattia, per lo screening di stupefacenti, e di sviluppare le terapie a base di cellule per il trattamento di malattie e lesioni dei tessuti. Tuttavia, hESCs hanno una limitazione per la terapia di sostituzione cellulare a causa delle barriere immunologiche, oncologiche ed etiche, e di studiare i geni correlati alla malattia, hESCs malattie specifiche possono essere isolati attraverso pre-impianto diagnosi genetica preimpianto (PGD) si avvicina, ma è ancora tecnicamente impegnativo e le donazioni di embrioni sono piuttosto rari. Questi problemi sono legati al progresso della biologia delle cellule staminali, che ha portato allo sviluppo di cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs). IPSCs umani sono geneticamente riprogrammate da cellule somatiche adulte umane e porto le caratteristiche di cellule simil-staminali pluripotenti simili a hESCs, che li rende una fonte utile per la medicina rigenerativa, come dscoperta tappeto, modelli di malattia e la terapia cellulare in paziente-specifici 1,2 maniera. Fino ad ora, ci sono diversi metodi per generare iPSCs umani, inclusi virus-mediata (retrovirus e adenovirus) 3, non virus mediata (sistema BAC e vettori di transfezione) 4 trasduzioni gene, e di sistema di consegna di proteine ​​5-7. Sebbene una consegna di geni del virus-mediata può garantire un certo livello di efficienza, vettori virali potevano lasciare impronta genetica, perché integrano nei cromosomi ospite per esprimere geni riprogrammazione in modo incontrollato. Anche quando integrazione virale di fattori di trascrizione può attivare o inattivare geni ospite 8, può causare un&#39;aberrazione genetica inattesa e il rischio di tumorigenesi 5,9. D&#39;altra parte, l&#39;introduzione diretta di proteine ​​o RNA in cellule somatiche sono stati segnalati, ma hanno alcuni svantaggi, come intensità di lavoro, trasf ripetutaezione, e basso livello di riprogrammazione 7,10. Anche episomale e non integranti adenovirus, virus adeno-associati, e vettori plasmidici sono ancora relativamente meno efficienti 11. Per queste ragioni, è plausibile scegliere non-integrazione metodi di riprogrammazione con elevata efficacia della generazione iPSC e un minor numero di anomalie genetiche. In questo studio, usiamo una riprogrammazione basata Sendai-virus. Questo metodo è noto per essere non integrata nel genoma dell&#39;ospite e produce costantemente iPSCs umani senza integrazioni transgene.

<table><tbody><tr><td>Kit di riprogrammazione CytoTune-iPS</td><td>Invitrogen</td><td>A1378002</td><td></td></tr><tr><td>CF-6, MEF, resistente alla neomicina, trattato con mitomicina C.</td><td>Stelo globale</td><td>GSC-6105M</td><td>5 x 105/6 cm o 12,5 x 105/piastra a 24 pozzetti</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 0,25% Tripsina con EDTA 4Na 1X</td><td>Invitrogen</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medio</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti, fondo piatto con coperchio</td><td>BD</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td>10 &#956; M (Stock: 10 mM)</td></tr><tr><td>fattore di crescita dei fibroblasti basici</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>PHG0263</td><td>10 ng (Stock: 100 ug)</td></tr><tr><td>Siero sostitutivo knock-out</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s Medium Eagle modificato (D-MEM, DMEM) (1X), liquido (ad alto contenuto di glucosio)</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>SH30071,03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina-200 mM (100X), liquido</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td>1/100</td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali, 100X</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td></td> 11140050 <td>1/100</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo (1.000X), </td><td>liquido GIBCO</td><td>21985023</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Hausser Emocitometri a contrasto di fase</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1% Soluzione di</td><td>gelatina Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>DSHB</td><td>MC-813-70</td><td>1/200</td></tr><tr><td>anti-Tra-1-81</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>4745S</td><td>1/200</td></tr><tr><td>anticorpo monoclonale di topo Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Nanog R</td><td>& D</td><td>AF1997</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Alexa Flouor 488 capra anti-topo</td><td>Invitrogen</td><td>948492</td><td>1/2.000</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&#039; s Soluzione salina tamponata con fosfato), 1X senza calcio & magnesio</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa QuantiTect</td><td>QIAGEN</td><td>205313</td><td></td></tr><tr><td>PCR Master Mix [2X]</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>cappa di prelievo</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td></td></tr><tr><td>cannocchiale di dissezione&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr></tbody></table>

efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con sendai-virus

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Alcuni anni fa, la creazione di cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs) ha inaugurato una nuova era nel campo della biomedicina. Possibili usi di iPSCs umani comprendono la modellazione patogenesi delle malattie genetiche umane, la terapia cellulare autologa dopo la correzione genica e screening di farmaci personalizzati, fornendo una fonte di cellule rilevanti e sintomi specifici del paziente. Tuttavia, ci sono diversi ostacoli da superare, come eliminare l&#39;espressione del transgene fattore riprogrammazione restante dopo la produzione iPSCs umani. Ancora più importante, l&#39;espressione del transgene residuo in iPSCs umane indifferenziate potrebbe ostacolare differenziazioni corretta e fuorviare l&#39;interpretazione della malattia in questione in fenotipi vitro. Con questo motivo, privo di integrazione e / o iPSCs umani privi di transgene sono state sviluppate utilizzando diversi metodi, quali adenovirus, il sistema piggyBac, minicircle vettore, vettori episomale, la consegna diretta delle proteine ​​e sintetizzato mRNA. Tuttavia, l&#39;efficienza di reprograllo utilizzando metodi libero-integrazione è piuttosto basso nella maggior parte dei casi. Qui, vi presentiamo un metodo per isolare iPSCs umani utilizzando Sendai-virus (virus RNA) sistema di riprogrammazione based. Questo metodo di riprogrammazione mostra i risultati coerenti e di alta efficienza in modo economicamente efficiente.

Fibroblasti solito infette non mostrano cambiamenti morfologici in diversi giorni dopo la trasduzione del virus Sendai, ma cinque giorni dopo, cominciano ad avere forme diverse (Figura 1). Come descritto in un pannello di destra della figura 1, le cellule non hanno tipica morfologia fibroblasto più. Hanno una forma rotonda e più grande nucleo di citoplasma. Anche quando trasduzione viene eseguita nel 80% di confluenza cellulare, sembra che siano meno confluenti nel pozzo dopo cominciano...

Qui vi presentiamo il nostro metodo stabilito per riprogrammare cellule somatiche umane in libera-transgene iPSCs umane con virus di Sendai, che mostra esito coerente e una maggiore efficienza.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare cellule staminali pluripotenti indotte umane con il virus Sendai. Ciò si ottiene preparando e placcando prima le cellule dei fibroblasti da trasdurre. Il passo successivo della procedura è infettare le cellule con il virus Sendai.Quindi le cellule dei fibroblasti infette vengono trasferite su cellule alimentatrici di fibroblasti embrionali di topo fresche. Il passaggio finale consiste nel selezionare manualmente il riprogrammato. Ora le cellule staminali pluripotenti, in ultima analisi la riprogrammazione delle cellule dei fibroblasti in I PSCs, senza l'uso di geni trans, può essere dimostrata attraverso l'immunomarcatura e la R-T-P-C-R.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente è che migliora l'efficienza della riprogrammazione senza rimanere transing e in modo economicamente vantaggioso Per questo protocollo, avere fibroblasti umani pronti coltivati in DMEM. Con FBS trasferire queste cellule su piastre a 24 pozzetti per la piastra dell'esperimento, le celle in sei diluizioni seriali per determinare la migliore densità per l'attacco delle cellule. Ogni fila della piastra a 24 pozzetti può ospitare una serie di celle di diluizione.In questo modo è possibile testare quattro tipi di cellule su una piastra, incubare la diluizione per 24 ore. Il giorno successivo selezionare i pozzi a tre livelli di confluenza per la trasduzione. Uno ad un alto livello di confluenza dell'80-90%, uno a circa il 60% di confluenza e il terzo a circa il 30% di confluenza un'ora o più prima della trasduzione.Sostituire il terreno con 300 microlitri di terreno di coltura fresco per fibroblasti per il disgelo di trasduzione. Una serie di provette per il virus Sendai a 37 gradi Celsius per alcuni secondi, e poi finire. Scongelarli a temperatura ambiente.Centrifugare i virus scongelati a 6.000 G per 10 secondi e conservarli con ghiaccio in una provetta per microcentrifuga. Realizzare una miscela dei virus calcolata in base al numero di cellule da trasdurre. I dettagli del calcolo sono disponibili nel protocollo di testo.Mescolare bene i virus con un pipettaggio delicato. Ora alle cellule più dense, aggiungi due volumi di virus. Aggiungi un volume di virus alle cellule a media densità e aggiungi mezzo volume di virus alla selezione meno densa.Agitare la piastra e lasciarla incubare per una notte affinché la reazione avvenga il giorno successivo. Sostituire il terreno con 500 microlitri di terreno fresco per fibroblasti. Ripetere l'operazione due giorni dopo, tre giorni dopo la seconda modifica del terreno apportata alle cellule trasdotte.Preparare le cellule di metanfetamina in piastre da 60 millimetri con DMEM contenente il 10% di piastra FBS 500.000 cellule per piastra e incubarle durante la notte. Il giorno successivo, sostituire il terreno sulle cellule di metanfetamina con terreno fresco e quindi procedere con l'impostazione della co-coltura. Per prima cosa, rimuovere il terreno dai fibroblasti trasdotti e lavarli una volta con DPBS.Successivamente, aggiungere 200 microlitri di tripsina EDTA allo 0,25% a ciascun pozzetto trasdotto di cellule entro cinque minuti. Raggruppare tutte le cellule staccanti in un'unica provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare le celle a 1.350 g per quattro minuti.Quindi rimuovere il surnatante e lavare le celle pellettate con circa cinque millilitri di terreno fresco per neutralizzare la spilla. Ora raccogli le celle con un'altra centrifuga di quattro minuti a 1, 350 G.Piastra successiva. La maggior parte delle cellule sono sei diluizioni seriali in metanfetamina.La prima e l'ultima diluizione potrebbero non essere necessarie a seconda del tasso di mortalità delle cellule. Conservare alcune cellule per un'estrazione dell'RNA e incubare le piastre durante la notte. Il giorno successivo, sostituire il terreno con un terreno ES umano integrato con 10 micromolari di inibitore della chinasi RO Y 2 7 6 3 2.Per migliorare la sopravvivenza cellulare nei giorni successivi, cambiare il terreno in un normale terreno di ES umano non integrato. Dopo una settimana di coltivazione, inizia a controllare le piastre ogni pochi giorni per la formazione di grumi cellulari simili a colonie ES. Una volta che compaiono, monitora la crescita.Tre settimane dopo la trasduzione, le colonie di grumi di cellule ES dovrebbero essere pronte per l'espansione. Hanno preparato celle di alimentazione della metanfetamina in piastre da 24 pozzetti proprio come sono state preparate per piastre da 60 millimetri. Prima di prelevare qualsiasi colonia, cambiare il terreno sulle cellule di metanfetamina in terreno ES con 10 microlitri di Y 2 7, 6, 3, 2.Scegli una colonia alla volta dai piatti. Trasferisci la colonia in una provetta da 15 millilitri con la soluzione lì. Rompi la colonia usando il pipettatore.Poi copri un me. Beh, con la colonia distrutta. Alla fine carica ogni pozzo con una colonia spezzettata e carica il maggior numero possibile di pozzi.Mantenere le celle con cambi giornalieri di terreno ed espanderle in piastre a sei pozzetti e poi in piastre da 60 millimetri. Tipicamente, i fibroblasti infettati dal virus Sendai non mostrano alcun cambiamento morfologico fino a dopo cinque giorni. Quindi le cellule assumono una forma rotonda con un nucleo più grande e un citoplasma più piccolo.Questo protocollo su piccola scala include diversi parametri che possono essere ottimizzati, come la densità dei fibroblasti, il titolo del virus e la densità di placcatura al mese. Anche la trasduzione di cellule con diversa cofluenza mostrate in diversi colori può essere ottimizzata. Dopo una settimana di co-coltura con cellule alimentatrici di metanfetamine, i fibroblasti parzialmente riprogrammati hanno una forma a forma di slike sciolto e sono facilmente raccolti invece di essere raccolti utilizzando la tripsina.Completamente riprogrammate, le PSC I sono chiaramente identificabili da celle parzialmente riprogrammate. Le cellule completamente riprogrammate sono strettamente impacchettate e le colonie possono avere confini chiari. Le cellule parzialmente riprogrammate formano grappoli sciolti che si staccano facilmente.Dopo aver espanso i cloni IPSC per diverse settimane, la colorazione per i marcatori delle cellule staminali è giustificata rispetto alle cellule H nove. Gli IPC sono positivi a diversi anticorpi attesi, tra cui SSEA four, OCT four, TRA 81 e nano G, a sostegno della loro qualità pluripotente. L'uso del transgene R-T-P-C-R non è stata notata nei cloni IPSC umani.Dopo 10 primer per OCT esogeno quattro, SOX due, klf quattro e Cmic sono stati utilizzati con campioni di controllo positivi che hanno mostrato forti livelli di espressione transgenica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come riprogrammare le cellule somatiche per indurre le cellule staminali poli potenti e come selezionarle, riprogrammare completamente le cellule delle altre cellule.

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