Name: Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-23T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Scopri come generare cellule staminali pluripotenti indotte umane senza transgeni utilizzando il virus Sendai. Questo metodo efficiente riprogramma i fibroblasti somatici per applicazioni in medicina rigenerativa.

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Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Lee per le discussioni importanti sul manoscritto. Il lavoro in laboratorio Lee è stato sostenuto da sovvenzioni dal Robertson Investigator Award of Foundation di New York Stem Cell e dal Maryland Stem Cell Research Fund (TEDCO).

1. Preparazione di cellule e dei media (1 ° giorno) <ol><li> Cultura ed espandere fibroblasti umani con i media DMEM contenente 10% FBS. </li><li> Piastre fibroblasti umani (Figura 1) su una piastra da 24 pozzetti alla densità appropriata per pozzetto il giorno prima trasduzione. NOTA: Le seguenti diluizioni seriali sono raccomandati (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K e 6.25K), perché diversi tipi di cellule hanno diverse capacità di attacco. </li><li> Incubare le cellule per un giorno a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore, assicurando le cellule hanno pienamente aderito ed esteso. </li></ol> 2. Eseguire trasduzione (Day 2) <ol><li> Il giorno di trasduzione, controllare la densità cellulare e scelto pozzetti densità più efficienti (Figura 2). E &#39;meglio scegliere tre diverse densità: alta (80 ~ 90%), medio (50 ~ 70%) e bassa (20 ~ 40%). </li><li> Almeno 1 ora prima di trasduzione, aspirare il fibroblsupporti AST dalle cellule e modificare nuovi 300 ml di mezzo fibroblasti. </li><li> Rimuovere un set di 4 diversi tubi di virus Sendai dal -80 ° C di stoccaggio. Scongelare ogni provetta allo stesso tempo in un bagno d&#39;acqua a 37 ° per alcuni secondi, e poi le valvole fuori dal bagno di acqua. Dopo di che, scongelare a temperatura ambiente; provette da centrifuga a 6000 xg per 10 sec e disporli sul ghiaccio fino all&#39;uso. Non ricongelare e scongelare il virus dal momento che i titoli non manterrà. </li><li> Aggiungere i volumi di ciascuna delle quattro tubi virus Sendai (OCT-4, Klf-4, c-Myc e Sox-2) indicati al tubo micro-centrifuga. Assicurarsi che la soluzione viene mescolata ben pipettando delicatamente. Ad esempio, se 50K cellule / pozzetto di una 24-pozzetti lookwell per trasduzione: (Titer sulla base del certificato di analisi di Life Technologies, può essere diverso da lotto a lotto) Tubo hOct-4 = 6,0 x 10 7 CIU, 3 MOI = 5 ml Tubo hSox-2 = 6,5 x 10 7 CIU, 3 MOI = 4.6 μ; L Tubo hKlf-4 = 6,3 x 10 7 CIU, 3 MOI = 4.8 ml Tubo hc-Myc = 7.8 x 10 7 CIU, 3 MOI = 3,8 microlitri Totale = 18.2 ml di quattro fattori virali miscela / uno così (50K celle) della piastra da 24 pozzetti </li><li> A seconda densità cellulari; aggiungere 2X, 1X, 0.5X e volume della miscela virus nel pozzo. Agitare delicatamente la piastra anteriore alla parte posteriore, a sinistra ea destra (2X: 36.4 ml di miscela di virus, 1X: 18,2 microlitri e 0.5X: 9.1 ml). </li><li> Mettere le cellule a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore e incubare una notte. </li></ol> 3. Sostituzione della Cultura Media (Day 3 &amp; Day 5) <ol><li> 24 ore dopo la trasduzione, sostituire il mezzo con 500 microlitri media fibroblasti fresco. </li><li> Il giorno 5, cambiare il Piano con i media fibroblasti fresca. </li></ol> 4. Preparare piatti MEF per il Co-cultura (Giorno 8) <ol><li> Preparare cellule MEF in 60 millimetri capsule di Petri con il 10% FBS conteneva DMEM uno day prima passaging fibroblasti trasdotte sul feeder cellule MEF. Nota: Stiamo usando 5 x 10 5 del MEF in ogni piatto 60 millimetri. </li></ol> 5. Avvio co-coltura con cellule trasdotte Feeder MEF (Giorno 9) <ol><li> Prima di placcatura cellule trasdotte, aspirare il 10% FBS conteneva DMEM supporto dai piatti alimentatore MEF e aggiungere fresco del 10% FBS conteneva DMEM. </li><li> Rimuovere il terreno dai fibroblasti trasdotti che sono 24 pozzetti e lavare le cellule una volta con D-PBS. Aggiungere 200 ml di 0,25% tripsina / EDTA nelle cellule di fibroblasti inthe 24-pozzetti. Dopo meno di 5 minuti di incubazione con tripsina / EDTA, quando le cellule iniziano a staccarsi dalla piastra, raccogliere le cellule con mezzo di coltura in tubo da 15 ml. Poi si centrifuga a 6000 g per 4 min. NOTA: Pooling 2X, 1X, e il virus 0.5X è raccomandato fibroblasti trasdotte. </li><li> Rimuovere il mezzo surnatante e lavare per risospendereil pellet cellulare con 4-5 ml di terreno fresco fibroblasti di neutralizzazione da tripsina. Poi centrifugare a 135 g per 4 min. </li><li> Cellule Piastra come densità diluizione seriale e iniziare a co-coltura di fibroblasti con i media sul MEF: come 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 e 1/128 a 60 mm piatto. A seconda del tasso di morte delle cellule durante la prima settimana di trasduzione, non si può avere bisogno di diluire a 1/2 o 1/128 densità. Mettere da parte cellule rimanenti per estrarre l&#39;RNA totale come controllo positivo per Transgene RT-PCR. </li><li> Porre 60 millimetri piatti 37 ° C, 5% CO 2 incubatore durante la notte. </li></ol> 6. Feed Cellule Staminali embrionali umane a medio e Controllo delle Cellule (Giornata 10) <ol><li> Il giorno dopo, cambiare i media fibroblasti ai media ES umana con 10 pM Y-27632. Dopo di che, cambiare medio giornaliero con terreno ES umana: 800 ml DMEM/F12 + 200 ml Knockout siero sostituzione + 10 ml di L-Glutammina + 10 ml di 10 mM MEM aminoacidi non essenziali minimi+ 1 ml di 2-mercaptoetanolo + 10 ng / ml di fattore base di crescita dei fibroblasti. </li><li> Fare un cambiamento dei media ogni giorno con mezzi freschi umane ES. Dopo una settimana, controllare i piatti una volta ogni 2 ~ 3 giorni sotto un microscopio per la formazione di grumi di cellule ES colonia-like. A seconda del tipo di cellula, la cultura vorrà più o meno tempo prima colonie si trovano. </li></ol> 7. Picking staminali pluripotenti indotte colonie di cellule ed espandere la Cells (giorno 20 ~) <ol><li> Tre settimane dopo la trasduzione, le colonie dovrebbero apparire cresciuto correttamente per la raccolta. </li><li> Il giorno prima di prendere le colonie, preparare alimentatore MEF a 24 pozzetti. NOTA: Stiamo usando 12,5 x 10 5 del MEF in una piastra da 24 pozzetti. </li><li> Il giorno dopo, cambiare mezzo di piatti MEF dai media fibroblasti a supporto ES umana con 10 pM Y-27632. Scegliere manualmente una colonia in ogni tempo sotto il microscopio alla raccolta-cappuccio e macchie più piccole pipettando e trasferirlisulla nuova preparati MEF dishes.Try di scegliere diversi cloni. </li><li> Passaggio ed espandere l&#39;ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti di una piastra inizialmente 6 bene. Poi da un 6-pozzetti a 60 mm piatti prima di ulteriore moltiplicazione. </li></ol> 8. Caratterizzazione di iPSCs umano (dopo 10 passaggi) <ol><li> Immunofluorescenza <ol><li> Piatto iPSCs umani in lamiera e della cultura 24 pozzetti durante 4-5 giorni con cambio giornaliero dei media. </li><li> Per avviare test immunofluorescenza, lavare la piastra con D-PBS volta. Poi fissare le cellule immediatamente nello 0,4% paraformaldeide per 30 min. Dopo che lavare tre volte in D-PBS per 5 min. </li><li> Trattare cellule fissate con 0.1% Triton X-100 in PBS soluzione per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare la soluzione permeablization (0,1% triton X-100 soluzione), poi aggiungere BSA soluzione bloccante 0,5% per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Eseguire una rilevazione di Nanog, Oct-4, SSE (antig embrionale stadio-specificait) e TRA-1-81 (tumore rifiuto antigene) utilizzando un anticorpo anti-umano in soluzione BSA allo 0,5% (controllare la tabella materiale per tasso di diluizione di anticorpi). Incubare anticorpo primario per 2 ore a temperatura ambiente. Quindi lavare tre volte in D-PBS per 5 minuti ciascuno. </li><li> Verificare usando la microscopia a fluorescenza dopo 1 ora di incubazione con Alexa Fluor 488 di capra anti-topo IgG come 2 ° anticorpi, che vengono diluiti in soluzione 1:2.000 BSA 0,5% a temperatura ambiente. Colorare tutti i nuclei di ogni MEF cellule feeder e hiPSCs con DAPI. </li></ol></li><li> RT-PCR di Transgene Conferma <ol><li> Estrarre mRNA totale di pellet cella utilizzando reagenti di estrazione di RNA. </li><li> Fare una trascrizione inversa su aliquote (1 mg) di RNA totale e il cDNA risultante per l&#39;amplificazione PCR da trascrittasi inversa. </li><li> Preparare le miscele PCR per contenere 2 ml di cDNA, 10 ml di 2X PCR master mix, 2 ml di 2 pmol di primer(Avanti: 1 ml e reverse: 1 ml) e 6 ml di DW. Per rilevare l&#39;espressione genica, apportare la RT-PCR con i primer elencati nella Tabella 1. </li><li> Eseguire la RT-PCR con gene GAPDH come controllo per l&#39;efficienza delle reazioni di amplificazione. Visualizzare e analizzare prodotto di PCR dell&#39;1% elettroforesi su agarosio-gel. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322, 949-953 (2008).</li>
<li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgene-free+induced+pluripotent+mouse+stem+cells+by+the+piggyBac+transposon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.</a> Nature Methods. 6, 363-369 (2009).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Yoshioka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Generation+of+Human+iPSCs+by+a+Synthetic+Self-Replicative+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA.</a> Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Fluri, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation%2C+expansion+and+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+continuous+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Derivation, expansion and differentiation of induced pluripotent stem cells in continuous suspension cultures.</a> Nature Methods. 9, 509-516 (2012).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+without+Myc+from+mouse+and+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.</a> Nature Biotechnology. 26, 101-106 (2008).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22P+Jpn+Acad+B-Phys%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> P Jpn Acad B-Phys. 85, 348-362 Forthcoming.</li>
<li>Silva, S. S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+and+epigenetic+fluidity+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riprogrammazione delle cellule somatiche umane per hiPSCs detiene promesse senza precedenti nella biologia di base, medicina personale, e il trapianto 12. In precedenza, le generazioni IPSC umane necessarie virus a DNA che ha il rischio di integrazione nel genoma dell&#39;ospite, che può creare mutazioni genetiche indesiderabili che limitano ulteriori applicazioni cliniche quali sviluppo di farmaci e terapie di trapianto 13. Con questa ragione, molti studi sono stati riportati per generare-vettore ...

Le cellule umane staminali embrionali (hESC) hanno la capacità di auto-rinnovarsi in vitro e hanno pluripotenza, che potrebbe essere potenzialmente utile per la modellazione della malattia, per lo screening di stupefacenti, e di sviluppare le terapie a base di cellule per il trattamento di malattie e lesioni dei tessuti. Tuttavia, hESCs hanno una limitazione per la terapia di sostituzione cellulare a causa delle barriere immunologiche, oncologiche ed etiche, e di studiare i geni correlati alla malattia, hESCs malattie specifiche possono essere isolati attraverso pre-impianto diagnosi genetica preimpianto (PGD) si avvicina, ma è ancora tecnicamente impegnativo e le donazioni di embrioni sono piuttosto rari. Questi problemi sono legati al progresso della biologia delle cellule staminali, che ha portato allo sviluppo di cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs). IPSCs umani sono geneticamente riprogrammate da cellule somatiche adulte umane e porto le caratteristiche di cellule simil-staminali pluripotenti simili a hESCs, che li rende una fonte utile per la medicina rigenerativa, come dscoperta tappeto, modelli di malattia e la terapia cellulare in paziente-specifici 1,2 maniera. Fino ad ora, ci sono diversi metodi per generare iPSCs umani, inclusi virus-mediata (retrovirus e adenovirus) 3, non virus mediata (sistema BAC e vettori di transfezione) 4 trasduzioni gene, e di sistema di consegna di proteine ​​5-7. Sebbene una consegna di geni del virus-mediata può garantire un certo livello di efficienza, vettori virali potevano lasciare impronta genetica, perché integrano nei cromosomi ospite per esprimere geni riprogrammazione in modo incontrollato. Anche quando integrazione virale di fattori di trascrizione può attivare o inattivare geni ospite 8, può causare un&#39;aberrazione genetica inattesa e il rischio di tumorigenesi 5,9. D&#39;altra parte, l&#39;introduzione diretta di proteine ​​o RNA in cellule somatiche sono stati segnalati, ma hanno alcuni svantaggi, come intensità di lavoro, trasf ripetutaezione, e basso livello di riprogrammazione 7,10. Anche episomale e non integranti adenovirus, virus adeno-associati, e vettori plasmidici sono ancora relativamente meno efficienti 11. Per queste ragioni, è plausibile scegliere non-integrazione metodi di riprogrammazione con elevata efficacia della generazione iPSC e un minor numero di anomalie genetiche. In questo studio, usiamo una riprogrammazione basata Sendai-virus. Questo metodo è noto per essere non integrata nel genoma dell&#39;ospite e produce costantemente iPSCs umani senza integrazioni transgene.

<table><tbody><tr><td>Kit di riprogrammazione CytoTune-iPS</td><td>Invitrogen</td><td>A1378002</td><td></td></tr><tr><td>CF-6, MEF, resistente alla neomicina, trattato con mitomicina C.</td><td>Stelo globale</td><td>GSC-6105M</td><td>5 x 105/6 cm o 12,5 x 105/piastra a 24 pozzetti</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 0,25% Tripsina con EDTA 4Na 1X</td><td>Invitrogen</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medio</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti, fondo piatto con coperchio</td><td>BD</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td>10 &#956; M (Stock: 10 mM)</td></tr><tr><td>fattore di crescita dei fibroblasti basici</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>PHG0263</td><td>10 ng (Stock: 100 ug)</td></tr><tr><td>Siero sostitutivo knock-out</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s Medium Eagle modificato (D-MEM, DMEM) (1X), liquido (ad alto contenuto di glucosio)</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>SH30071,03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina-200 mM (100X), liquido</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td>1/100</td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali, 100X</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td></td> 11140050 <td>1/100</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo (1.000X), </td><td>liquido GIBCO</td><td>21985023</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Hausser Emocitometri a contrasto di fase</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1% Soluzione di</td><td>gelatina Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>DSHB</td><td>MC-813-70</td><td>1/200</td></tr><tr><td>anti-Tra-1-81</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>4745S</td><td>1/200</td></tr><tr><td>anticorpo monoclonale di topo Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Nanog R</td><td>& D</td><td>AF1997</td><td>1/1.000</td></tr><tr><td>Alexa Flouor 488 capra anti-topo</td><td>Invitrogen</td><td>948492</td><td>1/2.000</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&#039; s Soluzione salina tamponata con fosfato), 1X senza calcio & magnesio</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa QuantiTect</td><td>QIAGEN</td><td>205313</td><td></td></tr><tr><td>PCR Master Mix [2X]</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>cappa di prelievo</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td></td></tr><tr><td>cannocchiale di dissezione&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr></tbody></table>

efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con sendai-virus

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Alcuni anni fa, la creazione di cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs) ha inaugurato una nuova era nel campo della biomedicina. Possibili usi di iPSCs umani comprendono la modellazione patogenesi delle malattie genetiche umane, la terapia cellulare autologa dopo la correzione genica e screening di farmaci personalizzati, fornendo una fonte di cellule rilevanti e sintomi specifici del paziente. Tuttavia, ci sono diversi ostacoli da superare, come eliminare l&#39;espressione del transgene fattore riprogrammazione restante dopo la produzione iPSCs umani. Ancora più importante, l&#39;espressione del transgene residuo in iPSCs umane indifferenziate potrebbe ostacolare differenziazioni corretta e fuorviare l&#39;interpretazione della malattia in questione in fenotipi vitro. Con questo motivo, privo di integrazione e / o iPSCs umani privi di transgene sono state sviluppate utilizzando diversi metodi, quali adenovirus, il sistema piggyBac, minicircle vettore, vettori episomale, la consegna diretta delle proteine ​​e sintetizzato mRNA. Tuttavia, l&#39;efficienza di reprograllo utilizzando metodi libero-integrazione è piuttosto basso nella maggior parte dei casi. Qui, vi presentiamo un metodo per isolare iPSCs umani utilizzando Sendai-virus (virus RNA) sistema di riprogrammazione based. Questo metodo di riprogrammazione mostra i risultati coerenti e di alta efficienza in modo economicamente efficiente.

Fibroblasti solito infette non mostrano cambiamenti morfologici in diversi giorni dopo la trasduzione del virus Sendai, ma cinque giorni dopo, cominciano ad avere forme diverse (Figura 1). Come descritto in un pannello di destra della figura 1, le cellule non hanno tipica morfologia fibroblasto più. Hanno una forma rotonda e più grande nucleo di citoplasma. Anche quando trasduzione viene eseguita nel 80% di confluenza cellulare, sembra che siano meno confluenti nel pozzo dopo cominciano...

Qui vi presentiamo il nostro metodo stabilito per riprogrammare cellule somatiche umane in libera-transgene iPSCs umane con virus di Sendai, che mostra esito coerente e una maggiore efficienza.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di generare cellule staminali pluripotenti indotte umane con il virus Sendai. Ciò si ottiene preparando e placcando prima le cellule dei fibroblasti da trasdurre. Il passo successivo della procedura è infettare le cellule con il virus Sendai.Quindi le cellule dei fibroblasti infette vengono trasferite su cellule alimentatrici di fibroblasti embrionali di topo fresche. Il passaggio finale consiste nel selezionare manualmente il riprogrammato. Ora le cellule staminali pluripotenti, in ultima analisi la riprogrammazione delle cellule dei fibroblasti in I PSCs, senza l'uso di geni trans, può essere dimostrata attraverso l'immunomarcatura e la R-T-P-C-R.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente è che migliora l'efficienza della riprogrammazione senza rimanere transing e in modo economicamente vantaggioso Per questo protocollo, avere fibroblasti umani pronti coltivati in DMEM. Con FBS trasferire queste cellule su piastre a 24 pozzetti per la piastra dell'esperimento, le celle in sei diluizioni seriali per determinare la migliore densità per l'attacco delle cellule. Ogni fila della piastra a 24 pozzetti può osp

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Dimostriamo il protocollo per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule somatiche umane utilizzando lentivirus-mediata consegna dei fattori umani Oct4, Sox2, Nanog, e Lin28. Pluripotenza è stata confermata dalla morfologia e la presenza di staminali embrionali (ES) cellulo-specifici marcatori.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da fibroblasti umani Riprogrammare con il Stemgent Lentivirus umani TF Set

Vi presentiamo un protocollo efficace per la riprogrammazione di cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) che utilizzano vettori retrovirali codificanti Oct3 / 4, Sox2, Klf4 e c-myc (OSKM) e l'individuazione di hiPSC correttamente riprogrammata mediante colorazione dal vivo con Tra- 1-81 anticorpo.

Selezione e isolamento di colonie di cellule pluripotenti indotte umane staminali riprogrammato da fibroblasti adulti

Un metodo per generare umani cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) tramite retrovirus-mediata espressione ectopica di Oct4, Sox2, Klf4 e MYC è descritto. Un modo pratico per identificare umani IPSC colonie sulla base di GFP è anche discusso.

Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

Qui mostriamo un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs umani da 3-4 ml di sangue periferico utilizzando un singolo vettore lentivirale riprogrammazione. La riprogrammazione delle cellule del sangue prontamente disponibili promette di accelerare l'utilizzo della tecnologia iPSC rendendola accessibile ad una comunità di ricerca più ampio.

Generazione di cellule pluripotenti indotte umane staminali da sangue periferico mediante il STEMCCA lentivirale Vector

Descriviamo un protocollo per la derivazione di cellule staminali pluripotenti umane indotte prive di fattori riprogrammate e caratterizzate su base lentivirale e la conversione in condizioni cliniche putative.

Derivazione e caratterizzazione di un free-Transgene umana indotta pluripotenti staminali Cell Line e Conversione in definite condizioni clinico-grade

Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) rappresentano una fonte di tessuti paziente-specifici per le applicazioni cliniche e di ricerca di base. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per riprogrammare le cellule umane mononucleari di sangue periferico (PBMNCs) ottenute da buffy coats congelati in iPSCs-virali gratuito utilizzando non integrano plasmidi episomiale.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da congelata Buffy cappotti con non-integrazione episomiale Plasmidi

Questo protocollo descrive come generare cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da cellule T periferiche umane in condizioni di feeder-free utilizzando una combinazione di vettori virali matrigel e Sendai contenenti fattori di riprogrammazione.

Generazione di pluripotenti indotte cellule staminali da umani periferici T Cellule con Sendai virus in condizioni di libera-Feeder

L'obiettivo di questo protocollo è mostrare il protocollo per la riprogrammazione dei linfociti infiltranti il tumore del melanoma in cellule staminali pluripotenti indotte.

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da melanoma umano Linfociti infiltranti il ​​tumore

Proponiamo un protocollo per la riprogrammazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Placcando le cellule del sangue trasdotte su piastre rivestite di matrice con centrifugazione, le iPSC vengono indotte con successo da cellule galleggianti. Questa tecnica suggerisce un protocollo di riprogrammazione semplice ed efficace per cellule come PBMC e CBMC.

Pluripotenti indotte generazione di cellule staminali da cellule del sangue Utilizzando Sendai Virus e centrifugazione

Questo protocollo descrive un metodo dettagliato per la generazione efficiente di iPSC prive di integrazione da cellule del sangue periferico adulto umano. Con l'uso di quattro vettori episomiali basati su oriP/EBNA per esprimere i fattori di riprogrammazione, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 e SOX2, è possibile ottenere migliaia di colonie di iPSC da 1 mL di sangue periferico.

Generazione di integrazione-liberi cellule staminali pluripotenti indotte dalle cellule mononucleari di sangue periferico umano Utilizzando episomiale Vettori

Il protocollo presenta la riprogrammazione delle cellule mononucleari del sangue periferiche per indurre le cellule staminali neurali mediante l'infezione da virus Sendai, la differenziazione degli iNSC in neuroni dopaminergici, il trapianto di precursori DA nei precursori unilateralmente Modelli murini del morbo di Parkinson e valutazione della sicurezza e dell'efficacia dei precursori DA derivati da iNSC per il trattamento con LA PD.

Generazione di cellule staminali neurali indotte da cellule mononucleari periferiche e differenziazione verso i precursori dei neuroni dopaminergici per gli studi di trapianto

Scopri come generare cellule staminali pluripotenti indotte umane senza transgeni utilizzando il virus Sendai. Questo metodo efficiente riprogramma i fibroblasti somatici per applicazioni in medicina rigenerativa.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

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