Elettrosaldabili cellula visualizzate con microscopia a fluorescenza
1 luglio 2010
In questo video si dimostra efficiente elettrofusione di cellule In vitro Per mezzo di metodo rispetto modificati utilizzando elettroporazione e la rilevazione successiva visualizzazione fuso cellule con microscopia a fluorescenza.
L'elettrofusione comporta l'applicazione di brevi impulsi elettrici ad alta tensione alle celle in un contesto stretto. In questo video, dimostriamo l'elettrofusione di cellule in vitro mediante Adherence.Method modificato. Gli esperimenti sono stati eseguiti su cellule di melanoma di topo, BF una.
Per l'esperimento, segui questi passaggi. Coltiva le cellule in due fiasche di coltura separate all'80% di confluenza. Separatamente, aggiungere 2,1 microlitri di ciascuna soluzione madre.
10 millimolari C-M-F-D-A o CMRA rispettivamente a tre millilitri di tampone Krebs Hess in una provetta da centrifuga. Sciacquare due volte le celle con il tampone Krebs Hess e quindi inserire le soluzioni di carico nei palloni Le soluzioni di carico contengono rispettivamente circa sette micromolari C-M-F-D-A o CMRA.
Incubare le cellule per 30 minuti in atmosfera controllata. Durante questa prima incubazione, le regioni passano liberamente attraverso le membrane cellulari nel citosol dove vengono trasformate in prodotti di reazione permeabili IMP di membrana. Dopo questa prima incubazione, sciacquare e incubare le cellule con terreno di coltura per altre due ore.
Le cellule vengono osservate utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di una telecamera CCD raffreddata nel software di acquisizione. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 548 nanometri e scegliere un'immagine di fluorescenza di minaccia del filtro passa banda appropriata delle celle caricate con CMRA per le celle caricate con C-M-F-D-A. Imposta la lunghezza d'onda di eccitazione a 492 nanometri e scegli un filtro passa-banda per gli occhi di tripsina dell'immagine a fluorescenza verde, conta le cellule in entrambi i palloni e mescola insieme le cellule rosse e verdi in un rapporto uno a uno, regola la concentrazione delle cellule a 5 milioni di cellule per millilitro.
Posizionare una goccia di 20 microlitri di sospensione cellulare al centro di ogni pozzetto. In una piastra a 24 pozzetti, incubare le cellule in atmosfera controllata per 20 minuti per consentire alle cellule di attaccarsi leggermente alla superficie del pozzetto in un monostrato e stabilire contatti cellulari tra di loro. Posizionare il pozzetto multiplo con le cellule sul tavolino del microscopio.
Posizionare gli elettrodi sul fondo del pozzetto e collegarli al generatore di impulsi Per ottenere un'elettrofusione ottimale e mantenere la vitalità delle celle, è necessario utilizzare parametri adeguati di impulsi elettrici. Questi parametri dipendono dalla linea cellulare e dovrebbero essere determinati in esperimenti preliminari. Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule con un millilitro di tampone fosfato di potassio ISO omu a 350 microlitri di tampone fosfato di potassio Miller per indurre il rigonfiamento cellulare.
Lasciare le cellule nel tampone iperosmale per due minuti prima di applicare gli impulsi elettrici. Gli impulsi elettrici devono essere applicati quando le celle sono vicine al loro volume massimo. Questo prima che inizino il volume normativo.
Diminuzione nel nostro esperimento. È stato applicato un treno di otto impulsi rettangolari con una durata di 100 microsecondi a un hertz. Dopo l'erogazione dell'impulso.
Lasciare le cellule indisturbate per 10 minuti dopo 10 minuti. Resa di diffusione determinata mediante contrasto facciale e microscopio a fluorescenza. E acquisire tre immagini, contrasto del volto, fluorescenza rossa e verde in cinque campi visivi scelti casualmente.
In ciascuno, crea immagini a tre canali da ciascuna tripletta di immagini nel software J dell'immagine al fine di migliorare la qualità visiva delle immagini per pre-elaborare le fasi possono essere applicate alle immagini originali, allo sfondo, alla sottrazione e ai miglioramenti del contrasto con i set di parametri predefiniti. Infine, le immagini a tre canali sono composte utilizzando il plug-in J per immagini da RGB a grigio. In tale immagine, il citoplasma a riposo può essere visto insieme alle membrane cellulari.
Quindi poche cellule possono essere facilmente determinate nel conteggio dell'immagine a tre canali tutti e tre i tipi di cellule, rossa, verde e doppiamente fluorescente. Determinare la percentuale di celle a doppia fluorescenza dividendo il numero di celle a doppia fluorescenza per un numero di tutte le celle in ciascuna immagine. La resa di fusione è quindi definita come la percentuale di celle a doppia fluorescenza moltiplicata per due.
Poiché metà delle celle di visualizzazione non vengono rilevate quando vengono visualizzate celle dello stesso colore.
Panoramica
Questo video dimostra l'elettrofusione efficiente delle cellule in vitro utilizzando un metodo di adesione modificato combinato con l'elettroporazione. Il processo include il rilevamento delle cellule fuse attraverso la microscopia a fluorescenza.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Tecniche di fusione cellulare
- Metodi di elettroporazione
- Applicazioni della microscopia a fluorescenza
Sfondo
- L'elettrofusione è una tecnica che applica impulsi elettrici per facilitare la fusione cellulare.
- Il metodo può migliorare l'efficienza della creazione di cellule ibride.
- La microscopia a fluorescenza permette la visualizzazione delle cellule fuse.
- Comprendere la fusione cellulare è cruciale per varie applicazioni biologiche.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo affidabile per l'elettrofusione delle cellule.
- Visualizzare e quantificare l'efficienza della fusione cellulare.
- Fornire un protocollo che può essere replicato in altri laboratori.
Metodi utilizzati
- Le cellule di melanoma del topo sono state coltivate e preparate per la fusione.
- Sono stati utilizzati coloranti fluorescenti per marcare le cellule prima della fusione.
- Sono stati applicati impulsi elettrici per indurre la fusione cellulare.
- La microscopia a fluorescenza è stata impiegata per analizzare i risultati della fusione.
Risultati principali
- La fusione delle cellule è stata realizzata con successo come indicato dalla fluorescenza.
- La percentuale di cellule doppiamente fluorescenti è stata calcolata per determinare il rendimento della fusione.
- Sono stati identificati parametri ottimali degli impulsi elettrici per la vitalità cellulare.
- La qualità visiva delle immagini è stata migliorata attraverso tecniche di elaborazione delle immagini.
Conclusioni
- Il metodo di adesione modificato è efficace per l'elettrofusione cellulare.
- La microscopia a fluorescenza è uno strumento prezioso per valutare l'efficienza della fusione.
- Questo protocollo può essere adattato per vari tipi di cellule nella ricerca.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Cell electrofusion visualized by fluorescence microscopy provides a non-viral, non-chemical platform for generating hybrid cells, supporting early-stage biopharma research. Quantitative visualization of fusion events enables robust assessment of cell manipulation techniques, directly impacting target validation and assay development. This approach strengthens predictive confidence in cell-based workflows and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell fusion mechanisms relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Supports functional validation of cell manipulation strategies for hybrid cell generation.
- Facilitates biological de-risking by quantifying fusion efficiency and specificity.
- Provides measurable outputs for portfolio triage and target confidence.
Screening & Assay Development
- Establishes validated cell systems for downstream screening of fusion-dependent phenotypes.
- Delivers standardized, reproducible quantification of fusion yield via dual fluorescence.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound evaluation targeting cell fusion processes.
- Supports reliable benchmarking of fusion protocols across cell types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational workflows by enabling generation of hybrid cells for preclinical modeling.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of cell-based therapies.
- Reduces mechanistic ambiguity in cell manipulation strategies for therapeutic development.
- Supports risk-adjusted advancement of cell fusion-based therapeutic concepts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust cell fusion quantification and visualization, supporting both early validation and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative fusion yield measurement supports hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Dual fluorescence readouts enable reproducible assay development and benchmarking.
- Analytics: Image-based quantification provides objective, comparable outputs for condition assessment.
- Translational Research: Hybrid cell generation supports preclinical modeling and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable across cell types and research programs, enhancing platform value.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell fusion workflows.
- Operational Value: Standardizes fusion quantification and supports reproducibility across teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and improves capital efficiency in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescence microscopy, and image analysis.
- Needs access to pulse generators, fluorescence microscopes, and image processing software.
- Demands cross-team standardization of labeling, imaging, and quantification protocols.
- Adaptation across cell lines may require optimization of pulse parameters and labeling conditions.
- Fusion efficiency and viability are cell line-dependent and must be empirically determined.
