Name: Elettrosaldabili cellula visualizzate con microscopia a fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: Impara l'elettrofusione cellulare in vitro con il metodo di adesione modificato su cellule di melanoma murine. Questa tecnica consente di visualizzare e quantificare l'efficienza della fusione mediante microscopia a fluorescenza.

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Questo lavoro è stato sostenuto dall&#39;Agenzia di ricerca sloveno (progetto J2-9764 e programma P2-0249). Questo video rappresenta materiale supplementare per il &quot;Elettroporazione basato Tecnologie e Trattamenti&quot; laboratorio scientifico e corso post-laurea, organizzato dalla Facoltà di Ingegneria Elettrica presso l&#39;Università di Lubiana, Slovenia.

I. Caricamento delle celle con celle inseguitori CMFDA e CMRA <ol><li> Gli esperimenti sono stati condotti su cellule precedentemente preparato delle linee cellulari di melanoma mouse (B16-F1). Le cellule sono coltivate in due separate 25 cm 2 fiasche cultura (TPP, ZDA) al 70-80% confluenza nel terreno di coltura DMEM (Dulbecco modificato medio di Eagle) supplementato con 10% siero fetale bovino, 0,15 mg / ml L-glutamina, 16 mg / ml di gentamicina (tutti da Sigma-Aldrich, Germania), 200 unità / ml crystacillin (Pliva, Croazia), e incubate nel 5% CO 2 a 37 ° C. </li><li> Preparare due soluzioni da 10 mM stock di inseguitori Cell (Invitrogen, USA) con l'aggiunta di 10,76 microlitri e 9 microlitri (per il verde CMFDA e per Orange CMRA, rispettivamente) di DMSO (Sigma-Aldrich, Germania) a 50 mg del colorante in originale Invitrogen flaconcino. La soluzione madre può essere conservato in frigorifero a 4 ° C per pochi mesi. Prima di iniziare gli esperimenti, riscaldare la soluzione fino a quando i cristalli di DMSO sciogliere. </li><li> Preparare bicarbonato senza Krebs-tampone HEPES (130 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 11,7 mm D-glucosio, 1,3 mM CaCl 2, 10 HEPES mM, pH 7,4). In due tubi da 15 ml Eppendorf separatamente mix 2,1 ml di ciascuna soluzione madre (10 mM CMFDA o CMRA, rispettivamente) in 3 ml di bicarbonato senza Krebs-tampone HEPES. Questo produce una "soluzione di carico" che contiene circa 7 mM CMFDA (o CMRA). </li><li> Lavare le cellule due volte con il bicarbonato senza Krebs-tampone HEPES e quindi inserire il caricamento soluzioni nelle beute. Incubare le cellule per 30 minuti in 5% CO 2 a 37 ° C. Durante questo reagenti incubazione prima passare liberamente attraverso le membrane delle cellule, ma una volta all'interno della cellula, i reagenti si trasformano in cellule impermeant prodotti di reazione fluorescente. </li><li> Dopo la prima incubazione, lavare e incubare cellule con terreno di coltura per altre due ore in 5% CO 2 a 37 ° C. </li><li> Trypsinize cellule in entrambi i flaconi (caricato con CMFDA e CMRA) e mescolare globuli rossi e verdi insieme in un rapporto di 1:1 in un tubo da centrifuga da 50 ml (TPP, ZDA). Regolare la concentrazione cellulare di 5 x 10 6 cellule / ml per diluizione con mezzo di DMEM o mediante concentrazione con centrifuga. Inserire una goccia 20 ml di sospensione di cellule in ciascun pozzetto della piastra 24 pozzetti (TPP, ZDA). Incubare cellule nel 5% CO 2 a 37 ° C per 20 minuti per consentire loro di attaccare un po 'alla superficie del pozzo e stabilire contatti cell. </li></ol> II. Elettrofusione <ol><li> Preparare isoosomolar tampone fosfato di potassio (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mM MgCl2, 250 mM saccarosio) e hypoosmolar tampone fosfato di potassio (10 mM KH2PO4, 10 mM K 2 HPO 4, 1mM MgCl2, 75 mM saccarosio) . </li><li> Posizionare il pozzetti con le cellule al microscopio sul palco, la posizione degli elettrodi sul fondo del pozzo e collegarli al generatore di impulsi. </li><li> Lavare le cellule con 1 ml di isoosomolar tampone fosfato di potassio. Aggiungere 350 ml di hypoosmolar tampone fosfato di potassio al fine di indurre rigonfiamento delle cellule. Il buffer dovrebbe coprire gli elettrodi. </li><li> Lasciare le cellule nel buffer hypoosmolar per 2 minuti prima di applicare gli impulsi elettrici. Durante questo periodo afflusso di molecole d'acqua all'interno delle cellule a causa di squilibrio osmotico tra l'interno e l'esterno delle cellule causano un aumento del volume cellulare. Impulsi elettrici devono essere applicate quando le cellule sono vicini al loro volume massimo, prima di iniziare a regolamentare diminuire il volume. </li><li> Per raggiungere elettrofusione ottimale e mantenere la vitalità cellulare, i parametri ottimali di impulsi elettrici devono essere utilizzati. Questi dipendono da linee cellulari utilizzate [1]. In questo esperimento un treno di 8 impulsi rettangolari (ciascuno con durata di 100 ms a 1 Hz) viene applicato a ciascun campione, utilizzando un dispositivo elettroporazione (nel nostro caso Cliniporator, IGEA, Italia). Gli impulsi vengono consegnati a due parallele Pt / Ir elettrodi a filo da 0,8 mm di diametro e 5 mm di distanza tra loro, creando un campo elettrico di circa 1200 V / cm tra gli elettrodi in ogni bene, tranne per il controllo dei pozzi. </li><li> Lasciare le cellule indisturbato per 10 minuti dopo la consegna degli impulsi. Determinare il rendimento di fusione mediante microscopia a fluorescenza e contrasto di fase. </li></ol> III. Acquisizione di immagini e la determinazione del rendimento fusione <ol><li> Le cellule sono osservati utilizzando un microscopio a fluorescenza (nel nostro caso Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Germania) equipaggiato con un obiettivo (x20) ed una camera CCD raffreddata (VISICAM 1280, Visitron, Germania). Le immagini vengono acquisite in MetaMorph 7.1.1 (Molecular Devices, USA), ma altri software di acquisizione simili possono anche essere utilizzati. CMFDA è eccitato con un monocromatore (policroma IV, Visitron, Germania) a 492 nm e CMRA a 548 nm. La fluorescenza della CMFDA e CMRA viene eseguita utilizzando due filtri di emissione, uno centrato a 535 nm (HQ535/30m, per CMFDA) e l'altra centrata a 510 nm (D605/55m, per CMRA, sia Chroma, USA). L'uso di specchi dicroici (Q515LP) hanno impedito la cross talk canale. </li><li> Acquisire tre immagini (contrasto di fase, fluorescenza rossa e verde) per cinque campi scelti a caso in ciascun pozzetto. Creare tre immagini per ogni canale tripletta immagine. In tale immagine citoplasma fluorescenti possono essere visti insieme con le membrane cellulari. Cellule fuse può quindi essere facilmente determinato [Figura 1]. </li><li> Contare tutti e tre i tipi di cellule (rosso, verde e fluorescente doppiamente) in ogni immagine a tre canali. Determinare la percentuale di cellule doppiamente fluorescenti dividendo il numero di cellule doppiamente fluorescenti con il numero di tutte le cellule in ogni immagine. Resa fusione è definita come la percentuale di cellule doppiamente fluorescenti moltiplicato per 2 in quanto la metà delle cellule fuse non vengono rilevati (quando le cellule del fusibile stesso colore). </li></ol> Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/1991/1991fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Tre immagine microscopia canale di B16F1 cellule dopo elettrofusione:. Contrasto di fase, CMRA fluorescenza (eccitazione a 548 nm) e CMFDA fluorescenza (eccitazione a 492 nm), ingrandimento obiettivo 20x

<ol><li>Čemazar, M., Jarm, T., Miklavčič, D., Maček-Lebar, A., Ihan, A., Kopitar, N. A., Serša, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+electric-field+intensity+on+electropermeabilization+and+electrosensitivity+of+various+tumor-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Electro.+Magnetobiol%22%5BJournal%5D)">Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro.</a> Electro. Magnetobiol. 17, 263-272 (1998).</li>
<li>Trontelj, K., Reberšek, M., Kandušer, M., čurin šerbec, V., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+bulk+cell+electrofusion+in+vitro+for+production+of+human-mouse+heterohybridoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of bulk cell electrofusion in vitro for production of human-mouse heterohybridoma cells.</a> Bioelectrochemistry. 74, 124-129 (2008).</li>
<li>Rols, M. -P., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+electrically+induced+permeabilization+and+fusion+of+Chinese+hamster+ovary+cells+by+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Modulation of electrically induced permeabilization and fusion of Chinese hamster ovary cells by osmotic pressure.</a> Biochemistry. 29, 4561-4567 (1990).</li>
<li>Neil, G., Zimmermann, U. Electrofusion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeil%2C+G+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 220, 174-196 Forthcoming.</li>
<li>Abidor, I. G., Li, L. -H., Hui, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+cell+pellets%3A+II.+Osmotic+properties%2C+electroporation%2C+and+related+phenomena%3A+Membrane+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Studies of cell pellets: II. Osmotic properties, electroporation, and related phenomena: Membrane interactions.</a> Biophysical journal. 67, 427-435 (1994).</li>
<li>Jaroszeski, M. J., Gilbert, R., Fallon, P. G., Heller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+facilitated+cell-cell+electrofusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanically facilitated cell-cell electrofusion.</a> Biophys J. 67 (4), 1574-1581 (1994).</li>
<li>Ramos, C., Bonefant, D., Teissié, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hybridization+by+electrofusion+on+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell hybridization by electrofusion on filters.</a> Analytical biochemistry. 302, 213-219 (2002).</li>
<li>Cao, Y., Yang, J., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+high-throughput+cell+electrofusion+in+a+microelectrode-array+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Study of high-throughput cell electrofusion in a microelectrode-array chip.</a> Microfluid Nanofluid. 5, 669-675 (2008).</li>
<li>Ušaj, M., Trontelj, M., Kandušer, M., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+dynamics+and+viability+of+cells+exposed+to+hypotonic+treatment+and+electroporation+for+electrofusion+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Radiol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cell size dynamics and viability of cells exposed to hypotonic treatment and electroporation for electrofusion optimization.</a> Radiol. Oncol. 43, 108-119 (2009).</li>
<li>Teissié, J., Ramos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+electric+field+pulse+induced+long-lived+permeabilization+and+fusogenicity+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Correlation between electric field pulse induced long-lived permeabilization and fusogenicity in cell membranes.</a> Biophys. J. 74, 1889-1898 (1998).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La capacità delle membrane cellulari di fondere in modo non specifico, ad esempio, da campi elettrici esterni, è importante per la biotecnologia, la medicina e la ricerca in biologia. Tale fusione non specifico permette la produzione di cellule ibride di grande valore e dei loro prodotti, come gli anticorpi monoclonali, e fornisce informazioni sui meccanismi fondamentali di fusione [2]. Elettrofusione è un metodo potenzialmente molto efficace in quanto può essere regolata correttamente a diversi tipi di cellule. Elettrofusione si ottiene quando le cellule in stretto contatto fisico sono messi a loro stato fusogenic (soggetto ad fusione) per mezzo di impulsi elettrici ad alta tensione. L&#39;efficienza di elettrofusione dipende da vari parametri che influiscono sulle due parti del processo di elettrofusione. La prima parte del processo di elettrofusione è il raggiungimento del contatto fisico tra le cellule, che possono essere ottenuti con metodi diversi [3-8]. Metodo di aderenza (cellule in crescita a confluenza) possono essere utilizzate in modo efficiente a causa di contatti cellule spontaneamente stabilimenti situati in zone di grandi dimensioni tra le cellule, tuttavia, che produce le cellule fuse molto grande con molti nuclei. Stiamo usando il metodo di aderenza modificato, dove celle più piccole (da 2 a 5 nuclei), che hanno maggiori probabilità di sopravvivere e proliferare, sono ottenuti (Figura 1). Il contatto tra le cellule anche beneficiare di rigonfiamento osmotico delle cellule, a causa di un trattamento osmotico utilizzati per l&#39;esperimento [9]. Seconda parte del processo di elettrofusione è il raggiungimento dello stato fusogenic delle membrane cellulari. Stato Fusogenic correla bene con lo stato electropermeabilized della membrana (cellule non sono specificamente permeabilizzate alle molecole che normalmente non può passare attraverso la membrana intatta) ed è regolato dagli stessi parametri degli impulsi elettrici (ampiezza, lunghezza, numero e frequenza) [10] . I valori dei parametri elettrici necessari per l&#39;elettroporazione ottimale [1] e elettrofusione differiscono tra cellule diverse e dipendono dalle dimensioni delle cellule e le loro proprietà biologiche. Parametri elettrici devono quindi essere ottimizzati per diverse linee cellulari, che vengono utilizzati come partner di fusione, per ottenere la fusione.

<table><tbody><tr><td>CMRA</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>C34551</td><td>Colorante fluorescente citosolico</td></tr><tr><td>CMFDA</td><td>Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td>Colorante fluorescente citosolico</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM </td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5671</td><td>Mezzo Dulbecco&amp;rsquo;s modificato di Eagle&amp;rsquo;s</td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>crystacillina</td><td>Reagente</td><td>Pliva</td><td>625110</td><td>antibiotico</td></tr><tr><td>gentamicina</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>antibiotico</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A124873 927</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4248</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reagente</td><td>Fluka</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reagente</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>A154336 908</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>saccarosio</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>Generatore di impulsi elettrici</td><td>Strumento</td><td>IGEA</td><td></td><td>Cliniporator VITAE</td></tr><tr><td>Piastra multiwell</td><td>Strumento</td><td>Techno Plastic Products</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 50 ml</td><td>Strumento</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga da 15 ml</td><td>Strumento</td><td>Techno Plastic Products</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Flacone da coltura da 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Strumento</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi</td><td>Strumento</td><td>Prodotto su misura</td><td></td><td>Pt/Ir</td></tr></tbody></table>

elettrosaldabili cellula visualizzate con microscopia a fluorescenza

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Elettrofusione di cellule è un metodo sicuro e non virale e non chimici che possono essere utilizzati per la preparazione di cellule ibride per la terapia umana. Elettrofusione consiste nell&#39;applicazione di brevi impulsi elettrici ad alta tensione per le cellule che sono in stretto contatto. Applicazione di breve, ad alta tensione impulsi elettrici provoca destabilizzazione della membrana plasmatica delle cellule. Membrane destabilizzato sono più permeabili di diverse molecole e anche incline alla fusione con le membrane vicine destabilizzato. Elettrofusione è quindi un metodo conveniente per raggiungere un non-specifico fusione di cellule molto diverse<em&gt; In vitro</em&gt;. Al fine di ottenere la fusione, le membrane cellulari, destabilizzato dal campo elettrico, deve essere in stretto contatto per consentire una fusione dei loro doppi strati lipidici e di conseguenza il loro citoplasma. In questo video, si dimostra efficiente elettrofusione di cellule<em&gt; In vitro</em&gt; Per mezzo del metodo di aderenza modificato. In questo modo, le cellule sono permesso di allegare solo leggermente la superficie del bene, in modo che media possono essere scambiati e le cellule conservano la loro forma sferica. Visualizzazione fusione è valutata la pre-etichettatura del citoplasma delle cellule con coloranti diversi di cellule fluorescenti inseguitore, la metà delle celle sono etichettate con arancia CMRA e l&#39;altra metà con verde CMFDA. Resa fusione è determinato dal numero di cellule doppiamente fluorescenti diviso con il numero di tutte le cellule moltiplicato per due.

In questo video si dimostra efficiente elettrofusione di cellule<em&gt; In vitro</em&gt; Per mezzo di metodo rispetto modificati utilizzando elettroporazione e la rilevazione successiva visualizzazione fuso cellule con microscopia a fluorescenza.

Elettrosaldabili cellula visualizzate con microscopia a fluorescenza

L'electrofusione cellulare è un metodo sicuro, non virale e non chimico che può essere utilizzato per la preparazione di cellule ibride per la terapia umana. L'electrofusione comporta...

L'elettrofusione prevede l'applicazione di brevi impulsi elettrici ad alta tensione a cellule in stretto contatto. In questo video, dimostriamo l'elettrofusione di cellule in vitro mediante il metodo di adesione modificato. Gli esperimenti sono stati condotti su cellule di melanoma murino, BF uno.Per l'esperimento, seguire questi passaggi. Coltivare le cellule in due flaconi da coltura separati fino al 80% di confluenza. Aggiungere separatamente 2,1 microlitri di ciascuna soluzione madre.10 millimolari di C-M-F-D-A o CMRA rispettivamente in tre millilitri di tampone Krebs Hess in un tubo da centrifuga. Lavare le cellule due volte con tampone Krebs Hess e quindi aggiungere le soluzioni di carico nei flaconi. Le soluzioni di carico contengono circa sette micromolari di C-M-F-D-A o CMRA rispettivamente.Incubare le cellule per 30 minuti in un'atmosfera controllata. Durante questa prima incubazione, le regioni passano liberamente attraverso le membrane cellulari nel citosol, dove vengono trasformate in prodotti di reazione permeabili alla membrana IMP. Al termine di questa prima incubazione, risciacquare e quindi incubare le cellule con mezzo di coltura per altre due ore.Le cellule vengono osservate utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di una telecamera CCD raffreddata nel software di acquisizione. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 548 nanometri e scegliere un filtro passa-banda appropriato per l'immagine di fluorescenza rossa delle cellule caricate con CMRA per le cellule caricate con C-M-F-D-A. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 492 nanometri e selezionare un filtro passa-banda per l'immagine di fluorescenza verde degli occhi di tripsina, quindi contare le cellule in entrambi i fiaschi e mescolare insieme le cellule rosse e verdi in un rapporto uno a uno, regolando la concentrazione cellulare a 5 milioni di cellule per millilitro.Posizionare una goccia di 20 microlitri di sospensione cellulare al centro di ogni pozzetto. In una piastra a 24 pozzetti, incubare le cellule in atmosfera controllata per 20 minuti, in modo che si attacchino leggermente alla superficie del pozzetto in un monostrato e stabiliscano contatti cellulari tra loro. Posizionare la piastra con le cellule sul portacampioni del microscopio.Posizionare gli elettrodi nella parte inferiore del pozzetto e collegarli al generatore di impulsi. Per ottenere un'elettrofusione ottimale e mantenere la vitalità cellulare, è necessario utilizzare parametri adeguati degli impulsi elettrici. Tali parametri dipendono dalla linea cellulare e devono essere determinati in esperimenti preliminari. Rimuovere il mezzo di coltura e lavare le cellule con un millilitro di tampone fosfato di potassio ISO omu, utilizzando 350 microlitri di tampone fosfato di potassio hypos Miller per indurre il rigonfiamento cellulare.Lasciare le cellule nel tampone iperosmolare per due minuti prima di applicare gli impulsi elettrici. Gli impulsi elettrici devono essere applicati quando le cellule sono vicine al loro volume massimo, cioè prima che inizi la regolazione del volume.Diminuzione nel nostro esperimento. È stata applicata una serie di otto impulsi rettangolari della durata di 100 microsecondi a un hertz. Dopo la somministrazione dell'impulso.Lasciare le cellule indisturbate per 10 minuti dopo 10 minuti. Determinare il rendimento della diffusione mediante microscopia a contrasto di fase e microscopia a fluorescenza. Acquisire tre immagini, a contrasto di fase e in fluorescenza rossa e verde, in cinque campi visivi scelti casualmente.In ciascuna, creeremo tre immagini a canali da ogni tripletta di immagini nel software ImageJ, al fine di migliorare la qualità visiva delle immagini prima di applicare passaggi di pre-elaborazione alle immagini originali, come la sottrazione del fondo e il miglioramento del contrasto mediante set di parametri predefiniti. Infine, le immagini a tre canali vengono composte utilizzando il plugin RGB a scala di grigi di ImageJ. In un'immagine di questo tipo, è possibile osservare il citoplasma in riposo insieme alle membrane cellulari.Pertanto, poche cellule possono essere facilmente identificate nel conteggio dell'immagine a tre canali, che include tutti e tre i tipi di cellule: rosse, verdi e doppio fluorescenti. Determinare la percentuale di cellule doppio fluorescenti dividendo il numero di cellule doppio fluorescenti per il numero totale di cellule in ciascuna immagine. Il rendimento della fusione è quindi definito come la percentuale di cellule doppio fluorescenti moltiplicata per due.Dato che metà delle cellule di vista non vengono rilevate quando si osservano cellule dello stesso colore.

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