Elettrosaldabili cellula visualizzate con microscopia a fluorescenza
1 luglio 2010
In questo video si dimostra efficiente elettrofusione di cellule In vitro Per mezzo di metodo rispetto modificati utilizzando elettroporazione e la rilevazione successiva visualizzazione fuso cellule con microscopia a fluorescenza.
L'elettrofusione prevede l'applicazione di brevi impulsi elettrici ad alta tensione a cellule in stretto contatto. In questo video, dimostriamo l'elettrofusione di cellule in vitro mediante il metodo di adesione modificato. Gli esperimenti sono stati condotti su cellule di melanoma murino, BF uno.
Per l'esperimento, seguire questi passaggi. Coltivare le cellule in due flaconi da coltura separati fino al 80% di confluenza. Aggiungere separatamente 2,1 microlitri di ciascuna soluzione madre.
10 millimolari di C-M-F-D-A o CMRA rispettivamente in tre millilitri di tampone Krebs Hess in un tubo da centrifuga. Lavare le cellule due volte con tampone Krebs Hess e quindi aggiungere le soluzioni di carico nei flaconi. Le soluzioni di carico contengono circa sette micromolari di C-M-F-D-A o CMRA rispettivamente.
Incubare le cellule per 30 minuti in un'atmosfera controllata. Durante questa prima incubazione, le regioni passano liberamente attraverso le membrane cellulari nel citosol, dove vengono trasformate in prodotti di reazione permeabili alla membrana IMP. Al termine di questa prima incubazione, risciacquare e quindi incubare le cellule con mezzo di coltura per altre due ore.
Le cellule vengono osservate utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di una telecamera CCD raffreddata nel software di acquisizione. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 548 nanometri e scegliere un filtro passa-banda appropriato per l'immagine di fluorescenza rossa delle cellule caricate con CMRA per le cellule caricate con C-M-F-D-A. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 492 nanometri e selezionare un filtro passa-banda per l'immagine di fluorescenza verde degli occhi di tripsina, quindi contare le cellule in entrambi i fiaschi e mescolare insieme le cellule rosse e verdi in un rapporto uno a uno, regolando la concentrazione cellulare a 5 milioni di cellule per millilitro.
Posizionare una goccia di 20 microlitri di sospensione cellulare al centro di ogni pozzetto. In una piastra a 24 pozzetti, incubare le cellule in atmosfera controllata per 20 minuti, in modo che si attacchino leggermente alla superficie del pozzetto in un monostrato e stabiliscano contatti cellulari tra loro. Posizionare la piastra con le cellule sul portacampioni del microscopio.
Posizionare gli elettrodi nella parte inferiore del pozzetto e collegarli al generatore di impulsi. Per ottenere un'elettrofusione ottimale e mantenere la vitalità cellulare, è necessario utilizzare parametri adeguati degli impulsi elettrici. Tali parametri dipendono dalla linea cellulare e devono essere determinati in esperimenti preliminari. Rimuovere il mezzo di coltura e lavare le cellule con un millilitro di tampone fosfato di potassio ISO omu, utilizzando 350 microlitri di tampone fosfato di potassio hypos Miller per indurre il rigonfiamento cellulare.
Lasciare le cellule nel tampone iperosmolare per due minuti prima di applicare gli impulsi elettrici. Gli impulsi elettrici devono essere applicati quando le cellule sono vicine al loro volume massimo, cioè prima che inizi la regolazione del volume.
Diminuzione nel nostro esperimento. È stata applicata una serie di otto impulsi rettangolari della durata di 100 microsecondi a un hertz. Dopo la somministrazione dell'impulso.
Lasciare le cellule indisturbate per 10 minuti dopo 10 minuti. Determinare il rendimento della diffusione mediante microscopia a contrasto di fase e microscopia a fluorescenza. Acquisire tre immagini, a contrasto di fase e in fluorescenza rossa e verde, in cinque campi visivi scelti casualmente.
In ciascuna, creeremo tre immagini a canali da ogni tripletta di immagini nel software ImageJ, al fine di migliorare la qualità visiva delle immagini prima di applicare passaggi di pre-elaborazione alle immagini originali, come la sottrazione del fondo e il miglioramento del contrasto mediante set di parametri predefiniti. Infine, le immagini a tre canali vengono composte utilizzando il plugin RGB a scala di grigi di ImageJ. In un'immagine di questo tipo, è possibile osservare il citoplasma in riposo insieme alle membrane cellulari.
Pertanto, poche cellule possono essere facilmente identificate nel conteggio dell'immagine a tre canali, che include tutti e tre i tipi di cellule: rosse, verdi e doppio fluorescenti. Determinare la percentuale di cellule doppio fluorescenti dividendo il numero di cellule doppio fluorescenti per il numero totale di cellule in ciascuna immagine. Il rendimento della fusione è quindi definito come la percentuale di cellule doppio fluorescenti moltiplicata per due.
Dato che metà delle cellule di vista non vengono rilevate quando si osservano cellule dello stesso colore.
Panoramica
Questo video dimostra l'elettrofusione efficiente di cellule in vitro mediante un metodo di adesione modificato combinato con elettroporazione. Il processo include la rilevazione delle cellule fuse mediante microscopia a fluorescenza.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Tecniche di fusione cellulare
- Metodi di elettroporazione
- Applicazioni della microscopia a fluorescenza
Sfondo
- L'elettrofusione è una tecnica che applica impulsi elettrici per facilitare la fusione cellulare.
- Il metodo può aumentare l'efficienza nella creazione di cellule ibride.
- La microscopia a fluorescenza permette la visualizzazione delle cellule fuse.
- Comprendere la fusione cellulare è fondamentale per numerose applicazioni biologiche.
Scopo dello studio
- Dimostrare un metodo affidabile per l'elettrofusione delle cellule.
- Visualizzare e quantificare l'efficienza della fusione cellulare.
- Fornire un protocollo che possa essere replicato in altri laboratori.
Metodi Utilizzati
- Le cellule di melanoma murino sono state coltivate e preparate per la fusione.
- I coloranti fluorescenti sono stati utilizzati per etichettare le cellule prima della fusione.
- Impulsi elettrici sono stati applicati per indurre la fusione cellulare.
- La microscopia a fluorescenza è stata impiegata per analizzare i risultati della fusione.
Risultati principali
- La fusione delle cellule è stata ottenuta con successo, come indicato dalla fluorescenza.
- La percentuale di cellule doppio-fluorescenti è stata calcolata per determinare la resa della fusione.
- Sono stati identificati i parametri ottimali dell'impulso elettrico per la vitalità cellulare.
- La qualità visiva delle immagini è stata migliorata mediante tecniche di elaborazione delle immagini.
Conclusioni
- Il metodo di adesione modificato è efficace per l'elettrofusione cellulare.
- La microscopia a fluorescenza è uno strumento prezioso per valutare l'efficienza della fusione.
- Questo protocollo può essere adattato per diversi tipi cellulari nella ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La fusione cellulare elettroindotta visualizzata mediante microscopia a fluorescenza fornisce una piattaforma non virale e non chimica per la generazione di cellule ibride, sostenendo la ricerca preclinica nel settore biofarmaceutico. La visualizzazione quantitativa degli eventi di fusione consente una valutazione accurata delle tecniche di manipolazione cellulare, influenzando direttamente la validazione degli obiettivi terapeutici e lo sviluppo di saggi. Questo approccio rafforza l'affidabilità predittiva dei flussi di lavoro basati su cellule e orienta decisioni di portafoglio corrette in base al rischio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi diretta dei meccanismi di fusione cellulare rilevanti per la verifica di ipotesi terapeutiche.
- Consente la validazione funzionale di strategie di manipolazione cellulare per la generazione di cellule ibride.
- Facilita la riduzione del rischio biologico quantificando l'efficienza e la specificità della fusione.
- Fornisce parametri misurabili per la selezione del portafoglio e la valutazione della fiducia sul bersaglio.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Stabilisce sistemi cellulari validati per lo screening successivo di fenotipi dipendenti dalla fusione.
- Fornisce una quantificazione standardizzata e riproducibile del rendimento di fusione mediante doppia fluorescenza.
- Consente la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma per la valutazione di composti mirati ai processi di fusione cellulare.
- Permette un confronto affidabile dei protocolli di fusione tra diversi tipi cellulari.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea ai flussi di lavoro traslazionali consentendo la generazione di cellule ibride per la modellizzazione preclinica.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica delle terapie cellulari.
- Riduce l'ambiguità meccanicistica nelle strategie di manipolazione cellulare per lo sviluppo terapeutico.
- Supporta l'avanzamento basato sulla valutazione del rischio di concetti terapeutici fondati sulla fusione cellulare.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica consentendo una quantificazione e una visualizzazione robuste della fusione cellulare, sostenendo sia la validazione iniziale sia la ricerca traslazionale.
- Biologia della scoperta: La misurazione quantitativa del rendimento di fusione supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi molecolari.
- Screening: Letture a doppia fluorescenza consentono lo sviluppo e il confronto riproducibile dei saggi.
- Analisi: La quantificazione basata su immagini fornisce risultati oggettivi e confrontabili per la valutazione delle condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: La generazione di cellule ibride supporta la modellizzazione preclinica e l'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Il flusso di lavoro è adattabile a diversi tipi cellulari e programmi di ricerca, aumentando il valore della piattaforma.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nei flussi di lavoro di fusione cellulare.
- Valore operativo: Standardizza la quantificazione della fusione e favorisce la riproducibilità tra diversi gruppi di lavoro.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione e migliora l'efficienza nell'uso del capitale nei programmi della fase iniziale.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione delle strategie terapeutiche cellulari basata sull'adeguamento al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in colture cellulari, microscopia a fluorescenza e analisi delle immagini.
- Necessita dell'accesso a generatori di impulsi, microscopi a fluorescenza e software per l'elaborazione delle immagini.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di marcatura, acquisizione delle immagini e quantificazione.
- L'adattamento a diverse linee cellulari potrebbe richiedere l'ottimizzazione dei parametri degli impulsi e delle condizioni di marcatura.
- L'efficienza di fusione e la vitalità cellulare dipendono dalla linea cellulare e devono essere determinate empiricamente.
