Name: Terapia test in un modello di coltura cellulare 3D basati su sferoide per testa e collo a cellule squamose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Scopri come generare sferoidi tridimensionali da cellule tumorali primarie per testare terapie nel carcinoma squamoso di testa e collo. Questo metodo consente di valutare la risposta a radioterapia e chemioterapia in vitro.

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Questo progetto è stato finanziato da un contributo dell'Università di Monaco di Baviera (n. FöFoLe progetto: 789-781).

Tutti gli studi indicati in questo manoscritto, vale a dire l'uso degli esemplari del tumore umano, sono protetti sotto e nel consenso con decisioni precedenti da Università di medicina di Mainz/Università di Monaco di Baviera, centro medico etico. I pazienti hanno dato il consenso informato secondo le linee guida legali nazionali, accettando di uso scientifico degli eccessi di materiale biologico che è stato ottenuto nel corso del loro trattamento. Ricerca è stata eseguita nel rispetto di tutte le linee guida istituzionali, nazionali ed internazionali per il benessere umano.
1. prendere una biopsia del tumore dalla testa e Carcinoma di cellule Squamous Heck
<ol><li>Eseguire generale (propofol e/o sevoflurane, agente di rilassamento muscolare) o infiltrazione locale (2% ultracaine, adrenalina) / superficie (xylocaine) anestesia in sala operatoria o otorinolaringoiatria sedia esame. Visualizzare la massa tumorale in orale cavità/faringe/laringe/altre parti del tratto digerente e respiratorio superiore con strumenti di funzionamento standard e, se necessario, sotto il microscopio.</li>
	<li>Prendere una biopsia del tumore fresco dalla periferia della lesione cancerogena con strumenti contundenti o taglienti. Evitare il centro della lesione dovuto necrosi abbondante in questa zona. Mettere il tessuto ottenuto in un contenitore sterile con soluzione salina isotonica.</li>
	<li>Dopo la biopsia, eseguire l'emostasi come necessario, ad es., con un dispositivo di coagulazione monopolare o bipolare oltre all'uso di sostanze vasocostrittori.</li>
	<li>Portare la biopsia del tumore può essere utilizzato per esperimenti di coltura cellulare direttamente al tratto di laboratorio adiacente. Invia altre le biopsie del tumore per il patologo come al solito per escludere il cancro.</li>
	<li>Assicurarsi che un tecnico di laboratorio è pronto a trattare il campione direttamente.</li>
</ol>2. trattamento del campione di tumore
<ol><li>Posizionare l'esemplare del tumore su una superficie adatta e sterile e tagliare accuratamente con un bisturi monouso sterile in pezzi il meno possibile. Attenzione: Assicurarsi che lo stato di malattie infettive ed ematica è ben documentato e il tecnico è in attenzione delle istituzioni standard protocolli per impedire ad aghi bastone o lesioni di taglio con potenzialmente materiale paziente di rischio biologico e la protocolli da seguire dopo possibili lesioni.</li>
	<li>Dopo una separazione meccanica sufficiente del tessuto primario, mettere il tessuto in un flaconcino contenente collagenasi I / II e incubare per 1h a 37 ° C. Passare al setaccio attraverso un colino di cella di 70 µm falcon e lavare la sospensione con soluzione salina bilanciata Hanks' (HBSS).</li>
	<li>
Dopo la riuscita separazione e lavaggio successivo, posizionare la sospensione contenente 1-2 × 106 cellule in un matracci di cultura di cellule (75 cm2) T75 a crescere a sub-confluency 5% CO2 e temperatura di 37 ° C. Questo passaggio potrebbe richiedere fino a 10 giorni.
	<ol>
<li>Utilizzare speciali dei cheratinociti terreno di coltura costituito da quanto segue: 125 mL di Dulbecco modificato medio eagles (DMEM), 250 mL di Keratinocyte completato medio (medio integrato composto da 500 mL di Medium di SF del Keratinocyte, 15 mg di ipofisi bovina estrarre (BPE), 2,5 mL di penicillina/streptomicina, 150 ng umano ricombinante fattore crescita epiteliale (EGF), 516 µ l di 300 mM CaCl2, stock mix per essere preparati in anticipo), 125 mL di miscela nutriente di F12, 10 mg di BPE (0,75 mL), 75 ng EGF umano ricombinante (2 µ l) , 3,75 mL 200 mm L-alanil-L-Glutamin-Dipeptide (tabella materiali).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. le cellule di semina in piastre per colture cellulari ultra-bassa adesione
<ol><li>Confermare la crescita delle cellule tumorali al microscopio. Contare le celle in cultura (primaria o colture cellulari) e seme 5.000 cellule primarie del tumore o 1.000-2.000 cellule della linea cellulare intermedio / altra linea cellulare a 200-300 µ l di media (punto 3.2.) in un piatto ultra-bassa adesione concavo, rotondo bottoms (96-well).</li>
	<li>
1% della coltura le cellule al 5% CO2 a 37 ° C e in mezzo a parti uguali DMEM e delle vie respiratorie delle cellule epiteliali (BEGM), 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina/streptomicina, piruvato di sodio 1%, 1% non essenziali aminoacidi, L-Glutammina (punto 2.3.). Se vengono utilizzate linee cellulari, media sulla base di DMEM è sufficiente.
	<ol>
<li>Eseguire modifiche di supporto ogni altro giorno. Prestare attenzione a non aspirare la sferoide con la pipetta durante i cambi di mezzi. Fino a quando il livello di crescita della coltura sferoidi come descritto al punto 3.3 è raggiunto (circa 7-10 giorni).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confermare la formazione spontanea della sferoide al microscopio cercando di conglomerati di cella tridimensionale, a forma di sferoide. Escludere i pozzetti con irregolare e/o formazione di sferoide multipla da ulteriori indagini. Nota: Sferoidi dovrebbero essere visibile ad occhio nudo, troppo, facilitare l'ulteriore elaborazione e modifiche di supporto come descritto di seguito.</li>
</ol>4. esporre sferoidi alla terapia multimodale del tumore Standard o sperimentali
<ol><li>Scegliere un regime di terapia desiderata. Progettazione di gruppi di controllo sufficientemente grande che consentono confronti dei trattamenti di sferoidi non trattate o sferoidi che ricevono solo i regimi di terapia parziale, ad es. radiazione da solo. La dimensione dei gruppi di controllo dipende dalla progettazione del gruppo sperimentale e non può essere definita universalmente.</li>
	<li>Scambiare i mezzi di comunicazione ai media con additivi, significato media con chemioterapici e/o anticorpi monoclonali alle concentrazioni desiderate. Aggiungere cisplatino alle concentrazioni di 2.5/5/10 µM o 5-fluoruracil (5FU) a 30 µM. Nota: Per esperimenti di throughput elevato o grande gruppo dimensioni/grande numero di gruppi, uno può utilizzare un robot di pipettaggio automatizzato come stiamo stabilendo ulteriormente negli esperimenti.</li>
	<li>In alternativa, irradiare le piastre per colture cellulari con sferoidi a 2 Gy usando un impianto di irradiazione adatto. Attenzione: Rispettare protocolli dell'istituzione per quanto riguarda la prevenzione dell'esposizione di radiazioni nocive dei dipendenti. Funziona solo con i tecnici designati e addestrati secondo le linee guida di protezione di radiazione. Se lo si desidera, aggiungere chemioterapici come descritto sotto 4.2. in seguito.</li>
	<li>Incubare le cellule per 24 h in condizioni di coltura precedentemente descritti (37 ° C, punto 3.2).</li>
	<li>Dopo l'incubazione, continuare la coltura delle cellule per almeno 6 giorni con le modifiche di supporto ogni altro giorno.</li>
</ol>5. valutazione della sferoide formato ed il limite di proliferazione cellulare per test lettura
<ol><li>Misurare la dimensione di sferoide in termini di superficie dopo documentazione fotografica digitale il giorno 6 (giorno 10, giorno 16) con un software di grafica (parametro 1).</li>
	<li>Dopo centrifugazione a 520 x g per 2,5 min della piastra, eliminare il surnatante. Lavare le cellule con sufficiente quantità di 1X PBS e centrifugare che la piastra nuovamente come descritto, seguita da rimuovendo il surnatante (PBS).</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di soluzione di distacco enzimatica cellulare ad ogni flacone per consentire le sferoidi a dissolversi. Incubare la piastra per 8 min a 37 ° C.</li>
	<li>Verifica per la dissoluzione del successo di sferoide sotto il microscopio. Aggiungere 100 µ l di DMEM. Centrifugare la piastra a 520 x g per 2,5 minuti rimuovere il surnatante e sospendere le cellule in 100 μl di DMEM.</li>
	<li>Eseguire un'analisi di proliferazione colorimetrico disponibile nel commercio, nell'analisi di esempio WST-8 su ciascun flaconcino secondo istruzioni25 del produttore. Leggere il saggio in un lettore di test (ELISA) enzima-collegata dell'immunosorbente (parametro 2).</li>
</ol>

<ol><li>Hunter, K. D., Parkinson, E. K., Harrison, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+early+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Profiling early head and neck cancer.</a> Nat Rev Cancer. 5 (2), 127-135 (2005).</li>
<li>Jerjes, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+tobacco+and+alcohol+and+their+reduction%2Fcessation+on+mortality+in+oral+cancer+patients%3A+short+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck+Oncol%22%5BJournal%5D)">The effect of tobacco and alcohol and their reduction/cessation on mortality in oral cancer patients: short communication.</a> Head Neck Oncol. 4, 6(2012).</li>
<li>Chen, H. H. W., Kuo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+radiotherapy+in+cancer+treatment%3A+Promises+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Improving radiotherapy in cancer treatment: Promises and challenges.</a> Oncotarget. 8 (37), 62742-62758 (2017).</li>
<li>Boeckx, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-epidermal+growth+factor+receptor+therapy+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+focus+on+potential+molecular+mechanisms+of+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">Anti-epidermal growth factor receptor therapy in head and neck squamous cell carcinoma: focus on potential molecular mechanisms of drug resistance.</a> Oncologist. 18 (7), 850-864 (2013).</li>
<li>Brand, T. M., Iida, M., Wheeler, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+resistance+to+the+EGFR+monoclonal+antibody+cetuximab%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of resistance to the EGFR monoclonal antibody cetuximab.</a> Cancer Biol Ther. 11 (9), 777-792 (2011).</li>
<li>Seidl, D., Schild, S. E., Wollenberg, B., Hakim, S. G., Rades, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+Factors+in+Patients+Irradiated+for+Recurrent+Head-and-Neck+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prognostic Factors in Patients Irradiated for Recurrent Head-and-Neck Cancer.</a> Anticancer Res. 36 (12), 6547-6550 (2016).</li>
<li>Shirai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Outcomes+of+Definitive+and+Postoperative+Radiotherapy+for+Stage+I-IVB+Hypopharyngeal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical Outcomes of Definitive and Postoperative Radiotherapy for Stage I-IVB Hypopharyngeal Cancer.</a> Anticancer Res. 36 (12), 6571-6578 (2016).</li>
<li>Theile, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+drug+transporters%27+significance+for+multidrug+resistance+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Evaluation of drug transporters' significance for multidrug resistance in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Head Neck. 33 (7), 959-968 (2011).</li>
<li>Slade, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+bone+marrow%2C+disseminated+tumour+cells+and+blood-circulating+tumour+cells+in+breast+cancer+patients+after+primary+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Comparison of bone marrow, disseminated tumour cells and blood-circulating tumour cells in breast cancer patients after primary treatment.</a> Brit J Cancer. 100 (1), 160-166 (2009).</li>
<li>Mockelmann, N., Laban, S., Pantel, K., Knecht, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+in+head+and+neck+cancer%3A+clinical+impact+in+diagnosis+and+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Arch+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells in head and neck cancer: clinical impact in diagnosis and follow-up.</a> Eur Arch Otorhinolaryngol. 271 (1), 15-21 (2014).</li>
<li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).</li>
<li>Ledgerwood, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+degree+of+intratumor+mutational+heterogeneity+varies+by+primary+tumor+sub-site%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The degree of intratumor mutational heterogeneity varies by primary tumor sub-site.</a> Oncotarget. 7 (19), 27185-27198 (2016).</li>
<li>Loyo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+learned+from+next-generation+sequencing+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Lessons learned from next-generation sequencing in head and neck cancer.</a> Head Neck. 35 (3), 454-463 (2013).</li>
<li>Morris, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Landscape+of+Recurrent+and+Metastatic+Head+and+Neck+Cancers%3A+Insights+From+a+Precision+Oncology+Sequencing+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Oncol%22%5BJournal%5D)">The Molecular Landscape of Recurrent and Metastatic Head and Neck Cancers: Insights From a Precision Oncology Sequencing Platform.</a> JAMA Oncol. , (2016).</li>
<li>Bauml, J. M., Cohen, R. B., Aggarwal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+for+head+and+neck+cancer%3A+latest+developments+and+clinical+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Adv+Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy for head and neck cancer: latest developments and clinical potential.</a> Ther Adv Med Oncol. 8 (3), 168-175 (2016).</li>
<li>Mack, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+non-enzymatic+in+vitro+retrieval+of+tumour+cells+from+surgical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid and non-enzymatic in vitro retrieval of tumour cells from surgical specimens.</a> PLoS One. 8 (1), e55540(2013).</li>
<li>Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-based+three-dimensional+tumor+models+for+cancer+research+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery.</a> Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 939-954 (2016).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li>
<li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening%3A+the+multicellular+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model.</a> J Biomol Screen. 9 (4), 273-285 (2004).</li>
<li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li>
<li>Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spherical+cancer+models+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Spherical cancer models in tumor biology.</a> Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).</li>
<li>Cancer Genome Atlas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+characterization+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic characterization of head and neck squamous cell carcinomas.</a> Nature. 517 (7536), 576-582 (2015).</li>
<li>Duarte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+head+and+neck+squamous+carcinoma+cancer+stem-like+cells+in+a+syngeneic+mouse+model+and+analysis+of+hypoxia+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Isolation of head and neck squamous carcinoma cancer stem-like cells in a syngeneic mouse model and analysis of hypoxia effect.</a> Oncol Rep. 28 (3), 1057-1062 (2012).</li>
<li>Reid, P. A., Wilson, P., Li, Y., Marcu, L. G., Bezak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+cancer+stem+cells%3A+Review+of+their+radiobiology+and+role+in+head+and+neck+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Neck%22%5BJournal%5D)">Current understanding of cancer stem cells: Review of their radiobiology and role in head and neck cancers.</a> Head Neck. 39 (9), 1920-1932 (2017).</li>
<li>Cossu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Insight+into+Inhibitor+of+Apoptosis+Proteins+Recognition+by+a+Potent+Divalent+Smac-Mimetic%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Structural Insight into Inhibitor of Apoptosis Proteins Recognition by a Potent Divalent Smac-Mimetic.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49527(2012).</li>
<li>Hagemann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+3D+Cell+Cultures+Enable+Personalized+Therapy+Testing+and+Drug+Discovery+in+Head+and+Neck+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based 3D Cell Cultures Enable Personalized Therapy Testing and Drug Discovery in Head and Neck Cancer.</a> Anticancer Res. 37 (5), 2201-2210 (2017).</li>
<li>Worp, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+animal+models+of+disease+reliably+inform+human+studies%3F%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Can animal models of disease reliably inform human studies?</a> PLoS Med. 7 (3), e1000245(2010).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li>
<li>Chitcholtan, K., Asselin, E., Parent, S., Sykes, P. H., Evans, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+growth+properties+of+endometrial+cancer+in+three+dimensional+%283D%29+culture+and+2D+cell+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer.</a> Exp Cell Res. 319 (1), 75-87 (2013).</li>
<li>Longati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+pancreatic+carcinoma+spheroids+induce+a+matrix-rich%2C+chemoresistant+phenotype+offering+a+better+model+for+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">3D pancreatic carcinoma spheroids induce a matrix-rich, chemoresistant phenotype offering a better model for drug testing.</a> BMC Cancer. 13, 95(2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Siamo stati in grado di stabilire un protocollo per generare sferoidi riproducibile da sospensioni cellulari, per entrambe le linee cellulari e, in esperimenti preliminari, cellule primarie del tumore umano. Abbiamo valutato due metodi precedentemente descritti e identificati l'ULA-metodo, un metodo dove sono utilizzati piatti di coltura con superfici ultra-bassa aderenza, per essere quello più sicuro e affidabile per la generazione di sferoidi tridimensionale uniforme. Combinando i due metodi distinti per lettura di dos...

Carcinoma di cellule squamous di testa e del collo (HNSCC) è il sesto più comune cancro in tutto il mondo con un'incidenza aumentante della patogenesi associata a infezione mucosa papillomavirus umano (HPV), accanto a una maggioranza dei casi causati dall'alcol e nicotina eccessiva consumo di 1,2. Mentre più piccoli tumori e fasi pre-invasive sono di solito ben curabile con l'asportazione chirurgica, di solito combinata con la dissezione di linfonodo cervicale, trattamento per stadio avanzato e ricorrenti HNSCC rimane impegnativo a causa dell'invasione del tumore aggressivo con la diffusione metastatica e resistenza alla radiazione e chemioterapia protocolli3,4,5,6,7,8. Gli studi recenti suggeriscono un'alta variabilità del fenotipo cellulare e sub-caratterizzazione di circolazione e le cellule del tumore diffuso è appena iniziata9,10. La precedente convinzione di un tumore solido, uniforme massa ha dovuto essere rivisto alla luce di recenti studi in passato anni11,12,13,14. Approcci attuali per la caratterizzazione del tumore e l'identificazione di mutazioni chiave potrebbero identificare numerosi geni che sembrano essere associati con resistenza di terapia ma rimangono un approccio costo elevato. Inoltre, conoscenza del genotipo non consente necessariamente una previsione affidabile del fenotipo e la sua risposta al trattamento.
Ci sono stati pochi progressi nel miglioramento della sopravvivenza globale e libera da malattia per malattia in stadio avanzato e ricorrente. Per nicotina - così come carcinoma virus-collegato, le opzioni correnti di trattamento oltre ambulatorio racchiudono aggressivo radiazione e chemioterapia platino-basata. Ci sono state conseguenze per i tassi di risposta diversa fra carcinoma HPV-negativi e positivo; Tuttavia, questo non ha ancora portare a un cambiamento in generale le linee guida di terapia. Resistenza nei confronti di radiazione e la chemioterapia è un fenomeno diffuso in tutte le fasi del tumore ed esiste per chemioterapia platino-basata anche per quanto riguarda la terapia mirata (Anti-EGFR; ricevitore di fattore di crescita epidermico) e recentemente emergenti checkpoint inibizione15. Chemioterapia e radioterapia inefficace hanno un costo elevato di morbosità significativa paziente in termini di disfagia, mucosite, secchezza delle fauci e rischio di diminuzione della funzione renale o cardiaca, tra gli altri. Prima risposta di terapia di predizione della decisione di un concetto di terapia generale per ogni singolo paziente sembra essere l'obiettivo cruciale, impedire il trattamento inutile concetti, effetti collaterali e costi.
Abbiamo cercato di stabilire un modello per testare SUSCETTIBILITA trattamento del singolo paziente attuale chemio-radioterapia standard che poteva essere integrata nell'algoritmo di trattamento oncologico regolari e qualità controllata da un punto di tecniche in piedi. L'obiettivo lontano era quello di utilizzare il modello senza utilizzare linee cellulari pesantemente alterato e invecchiato, come scarsamente rappresentano le cellule di tumore umano effettivo senza loro variabilità ed eterogeneità come la conosciamo ora, mentre l'istituzione del protocollo è stato fatto in varie linee cellulari. Per essere indipendente solo da linee cellulari disponibili in commercio, abbiamo generato recentemente con successo una linea di cella intermedio chiamata "PiCa" da cellule primarie di HNSCC da esemplari del tumore umano con markers cellulari conservato il suoi passaggi superficiale e limitate 16. linea cellulare questo PiCa dovrebbe servire come preparazione per lo sviluppo del modello sulla strada per poi successivamente seguendo studi con cellule tumorali umane fresche da biopsie del tumore. È stato dimostrato che cellule nella cellula tridimensionale culture reagiscono in modo diverso e più in vivo-come per la somministrazione di farmaci di cancro rispetto a quelli che crescono in strati monomolecolari17,18,19,20 ,21, principalmente a causa della conservazione dei migratori e proprietà Sub-differenziazione di alcune cellule sottoinsiemi22,23,24. Qui, descriviamo il protocollo di un modello tridimensionale, basato su sferoide da linee cellulari intermedi e modi e cellule di carcinoma di cellule squamous umano primario come integrano tale modello nel trattamento del cancro del collo e della testa chirurgo e oncologo ( Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)</td><td>Biochrom, Berlino, Germania</td><td>F 0425</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco Life Technologies, Paisley, Regno Unito</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina</td><td>Biochrom, Berlino, Germania</td><td>A2212</td><td></td></tr><tr><td>piruvato di sodio</td><td>Biochrom, Berlino, Germania</td><td>L0473</td><td></td></tr><tr><td>aminoacidi</td> <td>non essenzialiBiochrom, Berlino, Germania</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Biochrom, Berlino, Germania</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche Life Sciences, Basilea, Svizzera</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma di coltura e analisi 3D GravityPLUS</td><td>InSphero, Schlieren, Svizzera</td><td>PB-CS 06-001</td><td></td></tr><tr><td>Piastra GravityTRAP</td><td>InSphero, Schlieren, Svizzera</td><td>PB-CS-01-001</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura con attacco ultrabasso (ULA)</td><td>Corning, Corning, NY, USA</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>terreno di coltura delle cellule epiteliali delle vie aeree</td><td>Promocell, Heidelberg, Germania</td><td>C-21060</td><td></td></tr><tr><td>amfotericina B</td><td>Biochrom, Berlino, Germania</td><td>A 2612</td><td></td></tr><tr><td>miscela di integratori per la crescita delle cellule epiteliali delle vie aeree</td><td>Promocell, Heidelberg, Germania</td><td>C39165</td><td></td></tr><tr><td>Test WST-8</td><td>Promocell, Heidelberg, Germania</td><td>PC PK-CA705-CK04</td><td></td></tr><tr><td>Cheratinocita SFMedium + L-Glutammina 500mL</td><td>Invitrogen</td><td>#17005-034</td><td></td></tr><tr><td>Estratto ipofisario bovino (BPE), 25mg</td><td>Invitrogen</td><td>#37000015</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epiteliale umano ricombinante 2.5 &; g</td><td>Invitrogen</td><td>#37000015</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Alto glucosio</td><td>Invitrogen</td><td>#21068-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina 10000U/mL Penicillina/ 10000&micro; g/mL Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>#15140-122</td><td></td></tr><tr><td>F12 Miscela di nutrienti</td><td>Invitrogen</td><td>#21765-029</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (200 mM L-Alanil-L-Glutammina-Dipeptide in NaCl)</td><td>Invitrogen</td><td>#35050087</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Ca, Mg)</td><td>Life Technologies</td><td>#14025-092</td><td>(senza rosso fenolo)</td></tr><tr><td>1x TrypLE Expres Enzyme</td><td>Invitrogen</td><td>#12604-013</td>(<td>senza rosso fenolo)</td></tr><tr><td>Accutase (soluzione enzimatica per il distacco di cellule)</td><td>Tecnologie innovative per celle</td><td>Cat# AT104</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtro cellulare Falcon</td><td>BD Biosciences, USA</td><td>#352350</td><td></td></tr></tbody></table>

terapia test in un modello di coltura cellulare 3d basati su sferoide per testa e collo a cellule squamose

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Opzioni correnti di trattamento per avanzati e ricorrente di testa e collo carcinoma di cellule squamous (HNSCC) racchiudono radiazione e approcci chemio-radioterapia con o senza la chirurgia. Mentre i regimi di chemioterapia platino-basata attualmente rappresentano il gold standard in termini di efficacia e sono indicati nella maggior parte dei casi, i nuovi regimi di chemioterapia, vale a dire l'immunoterapia stanno emergendo. Tuttavia, i tassi di risposta e meccanismi di resistenza di terapia per entrambi il regime chemio sono difficili da prevedere e rimangono insufficientemente capiti. Ampie variazioni dei meccanismi di resistenza di chemio e radiazioni sono noti fino ad oggi. Questo studio descrive lo sviluppo di un test standardizzato, ad alta produttività in vitro per valutare la risposta di linea HNSCC cellulare ai vari regimi di terapia e, auspicabilmente, su cellule primarie da singoli pazienti come un futuro strumento per tumore personalizzato terapia. Il dosaggio è stato progettato per essere integrato nell'algoritmo standard di qualità controllata per pazienti HNSCC presso il nostro centro di cura terziario; Tuttavia, questo sarà oggetto di futuri studi. Fattibilità tecnica sembra essere molto promettente per cellule primarie da biopsie del tumore dai pazienti reali. I campioni sono poi trasferiti in laboratorio. Le biopsie sono separate meccanicamente seguita da digestione enzimatica. Le cellule vengono poi coltivate in flaconi di coltura cellulare ultra-bassa adesione che promuovono la formazione riproducibile, standardizzata e spontanea dei conglomerati di cella tridimensionale, a forma di sferoide. Sferoidi sono pronti per essere esposti a protocolli di chemio-radioterapia e protocolli di immunoterapia come necessario. La dimensione di vitalità e sferoide di cella finale sono indicatori di suscettibilità di terapia e di conseguenza potrebbe essere disegnato in considerazione in futuro, per valutare la risposta probabile terapia dei pazienti. Questo modello potrebbe essere uno strumento prezioso, costo-efficiente verso una terapia personalizzata per il cancro del collo e della testa.

Siamo stati in grado di generare riproducibile sferoidi dalle sospensioni unicellulare, in primo luogo da linee cellulari differenti compreso la proprietaria linea cellulare di PiCa, più tardi dalle cellule di cancro umano primario derivato da biopsie del tumore fresco come descritto in Hagemann et al. . 26. abbiamo valutato due metodi consolidati per la generazione di sferoide; i due sono l'impiccagione cosiddetto drop (HD) metodo e il metodo di ultra-bas...

Descriviamo l'evoluzione di un modello tridimensionale, basato su sferoide in vitro che permette di testare l'attuale standard di regimi di terapia sperimentale per testa e collo carcinoma di cellule squamous su linee cellulari, che mira a valutare la terapia suscettibilità e resistenza su cellule primarie dagli esemplari umani in futuro.

Terapia test in un modello di coltura cellulare 3D basati su sferoide per testa e collo a cellule squamose

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

L'obiettivo generale di questo metodo in vitro è quello di generare gli sferoidi tridimensionali in coltura cellulare che consentono di testare gli attuali regimi terapeutici standard o sperimentali per il carcinoma a cellule squamose della testa e del collo. Questo metodo ci aiuta a comprendere la crescita tumorale tridimensionale delle cellule tumorali della testa e del collo quando esposte a radiazioni o trattamento con radiazioni chemioterapiche. Resta da dire che la gestione delle cellule tumorali primarie è difficile e non sempre porta a una formazione di sferoidi tridimensionali affidabile.A dimostrare la procedura sarà Sabina Schwenk-Zieger, un tecnico del nostro laboratorio. Durante l'utilizzo di cellule primarie da un campione tumorale, posizionare il campione su una superficie adatta e sterile e tagliarlo accuratamente con un bisturi sterile monouso in pezzi molto piccoli. Dopo un'adeguata separazione meccanica del tessuto primario, trasferirlo in una fiala contenente collagenasi 1 e 2 e incubarlo per un'ora a 37 gradi Celsius.Quindi, setacciare la miscela attraverso un colino a celle Falcon da 70 micrometri e lavare la sospensione con HBSS. Dopo la separazione e il succ

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Vi presentiamo una semplice piattaforma di agarosio overlay a crescere 3D sferoidi multicellulari neuroendocrini utilizzando linee cellulari tumorali. Questo metodo fornisce un modo molto comodo per esaminare l'effetto di farmaci terapeutici sulle cellule tumorali neuroendocrine. Si potrebbe anche aiutarci a definire umani sferoidi tumorali neuroendocrine per la terapia del cancro.

Neuroendocrini umani cella linee tumorali come un modello tridimensionale per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e terapia dei tumori neuroendocrini

Gli sferoidi sono un tipo di modello di coltura cellulare 3D utilizzato per rappresentare in modo più accurato l'ambiente di una cellula rispetto ai modelli monostrato di coltura cellulare 2D. Nel protocollo di esempio, vedremo gli scienziati generare sferoidi da una linea cellulare di cancro del colon-retto e applicare l'imaging di cellule vive per monitorare la crescita degli sferoidi.

Generazione di sferoidi da linee cellulari: un metodo di coltura cellulare tridimensionale (3D)

L'invasione dei tessuti normali circostanti è una caratteristica distintiva dei tumori maligni. Forniamo qui un semplice saggio semi-automatico su micropiastra dell'invasione in una biomatrice 3D naturale che è stata esemplificata con una serie di modelli di tumori umani avanzati.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Attraverso un'ampia varietà di indicazioni di malattia, modelli più fisiologicamente rilevanti sono in corso programmi di scoperta della droga sviluppata e implementata in. Il nuovo modello di sistema descritto qui di seguito viene illustrato come tridimensionale del tumore sferoidi possono essere coltivate e proiettati in un sistema basato su piastra 1536 pozzetti ad alta produttività per la ricerca di nuovi farmaci oncologici.

Generazione di sferoidi tumore tridimensionale High-Throughput per lo Screening di stupefacenti

Questo protocollo è progettato per valutare la citotossicità T-cellula (auto T-cellula) reindirizzata immunoterapia contro le cellule cancerose strutturate 3D (sferoidi) in tempo reale.

Un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto

Qui, presentiamo diversi semplici metodi per valutare la vitalità e la morte negli sferoidi delle cellule tumorali 3D, che imitano i gradienti fisico-chimici dei tumori in vivo molto meglio della cultura 2D. Il modello sferoide, quindi, consente di valutare l'efficacia del farmaco controilcancro con una migliore traduzione in condizioni in vivo.

Valutare la vitalità cellulare e la morte nelle colture di sferoidi 3D delle cellule tumorali

Qui, descriviamo un assaggio di invasione facile da usare per il glioblastoma. Questo test è adatto per cellule staminali del glioblastoma. Viene descritta anche una macro Fiji per una facile quantificazione dell'invasione, della migrazione e della proliferazione.

Un modello spheroid 3D per Glioblastoma

Mancano modelli completi in vitro che ricapitolino fedelmente la malattia umana pertinente. Il presente studio presenta la creazione e la coltura tridimensionale (3D) di sferoidi tumorali, uno strumento affidabile in vitro per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare umano.

Un modello sferoide tridimensionale per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare

Il presente protocollo descrive la generazione di modelli di coltura tumorale 3D da cellule tumorali primarie e la valutazione della loro sensibilità ai farmaci utilizzando saggi di vitalità cellulare ed esami microscopici.

Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci

Presentiamo un protocollo per la coltivazione di sferoidi ad alta riproducibilità e la loro caratterizzazione fenotipica utilizzando l'acquisizione di immagini e la proteomica.

Analisi fenotipica semi-automatizzata di colture cellulari sferoidi 3D funzionali

Questo articolo dimostra un metodo standardizzato per la costruzione di sferoidi tumorali tridimensionali. Viene inoltre descritta una strategia per l'osservazione degli sferoidi e l'analisi di apprendimento profondo basata su immagini utilizzando un sistema di imaging automatizzato.

Generazione di sferoidi tumorali 3D per studi di valutazione dei farmaci

Scopri come generare sferoidi tridimensionali da cellule tumorali primarie per testare terapie nel carcinoma squamoso di testa e collo. Questo metodo consente di valutare la risposta a radioterapia e chemioterapia in vitro.

Terapia test in un modello di coltura cellulare 3D basati su sferoide per testa e collo a cellule squamose

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