Terapia test in un modello di coltura cellulare 3D basati su sferoide per testa e collo a cellule squamose

L'obiettivo generale di questo metodo in vitro è quello di generare gli sferoidi tridimensionali in coltura cellulare che consentono di testare gli attuali regimi terapeutici standard o sperimentali per il carcinoma a cellule squamose della testa e del collo. Questo metodo ci aiuta a comprendere la crescita tumorale tridimensionale delle cellule tumorali della testa e del collo quando esposte a radiazioni o trattamento con radiazioni chemioterapiche. Resta da dire che la gestione delle cellule tumorali primarie è difficile e non sempre porta a una formazione di sferoidi tridimensionali affidabile.

A dimostrare la procedura sarà Sabina Schwenk-Zieger, un tecnico del nostro laboratorio. Durante l'utilizzo di cellule primarie da un campione tumorale, posizionare il campione su una superficie adatta e sterile e tagliarlo accuratamente con un bisturi sterile monouso in pezzi molto piccoli. Dopo un'adeguata separazione meccanica del tessuto primario, trasferirlo in una fiala contenente collagenasi 1 e 2 e incubarlo per un'ora a 37 gradi Celsius.

Quindi, setacciare la miscela attraverso un colino a celle Falcon da 70 micrometri e lavare la sospensione con HBSS. Dopo la separazione e il successivo lavaggio, trasferire la sospensione contenente da uno a due milioni di cellule in un pallone di coltura cellulare T75 per farla crescere fino alla subconfluenza a 37 gradi Celsius per un massimo di dieci giorni. Al microscopio, confermare la crescita delle cellule tumorali.

Contare le cellule in coltura. Utilizzando una piastra a 96 pozzetti a bassissima adesione con fondo rotondo concavo, seminare nei pozzetti 5.000 cellule tumorali primarie o da 1.000 a 2.000 cellule di linea cellulare intermedia, in 200-300 microlitri di terreno. Successivamente, coltiva le cellule a 37 gradi Celsius.

Esegui modifiche ai supporti a giorni alterni. Prestare attenzione a non aspirare lo sferoide con la pipetta durante il cambio del fluido. Coltivare gli sferoidi fino a quando non si osservano i conglomerati cellulari tridimensionali a forma di sferoide.

Tenete presente di escludere i pozzetti con formazione irregolare o multipla di sferoidi da ulteriori indagini. Successivamente, cambiare il terreno in terreno con chemioterapie e/o anticorpi monoclonali alle concentrazioni desiderate. Aggiungere cisplatino alle concentrazioni di 2,5, cinque o 10 micromolari o 5-fluorouracile a 30 micromolari.

In questa procedura, misurare la dimensione dello sferoide dopo la documentazione fotografica digitale il sesto giorno, il giorno 10 e il giorno 16 con un software grafico. Dopo la centrifugazione della piastra a 520 g per 2,5 minuti, rimuovere il surnatante. Successivamente, lavare le celle con 1x PBS e centrifugare nuovamente la piastra, quindi rimuovere il surnatante.

Successivamente, aggiungere 100 microlitri di soluzione enzimatica per il distacco di cellule in ogni fiala per consentire agli sferoidi di dissolversi. Successivamente, incubare la piastra per otto minuti a 37 gradi Celsius. Verificare la corretta dissoluzione degli sferoidi al microscopio.

Aggiungere 100 microlitri di DMEM. Quindi, centrifugare la piastra a 520 g per 2,5 minuti. Quindi rimuovere il surnatante e sospendere le cellule in 100 microlitri di DMEM.

Successivamente, se necessario, eseguire un saggio di proliferazione colorimetrica disponibile in commercio e leggere il test in un lettore ELISA. Tutte le linee cellulari potrebbero generare sferoidi affidabili con differenze nelle dimensioni e nel tempo di lettura. Le cellule primarie hanno formato sferoidi riproducibili in piastre di attacco ultra-basse.

La colorazione con Ki-67 rivela che la periferia della coltura mostra tassi di proliferazione molto più elevati rispetto alle cellule centrali, imitando la distribuzione dei nutrienti nei tumori della mucosa solida che spesso mostrano nuclei necrotici. Qui, l'effetto di diverse chemioterapie e radiazioni sulla dimensione degli sferoidi. Le radiazioni con due gray prima del trattamento con cisplatino, portano a una significativa diminuzione delle dimensioni degli sferoidi rispetto al solo cisplatino.

Con l'ulteriore istituzione della generazione di sferoidi da cellule umane primarie, questo è il modo in cui il concetto di test terapeutico potrebbe essere implementato. Gli sferoidi verrebbero generati dopo la biopsia tumorale e quindi testati per le caratteristiche molecolari e la suscettibilità alla terapia. Siamo stati in grado di stabilire un protocollo per generare sferoidi riproducibili da sospensioni cellulari sia per linee cellulari che per cellule tumorali umane primarie.

Questo test multimodale è sufficientemente sensibile da identificare piccole differenze tra i gruppi. In futuro, il test potrebbe essere utilizzato per valutare in primo luogo la risposta individuale ai protocolli terapeutici standard e sperimentali. In secondo luogo, caratterizzare ulteriormente le cellule tumorali da campioni freschi.

E terzo, correlare la risposta della terapia ai modelli molecolari. L'uso di cellule primarie e la generazione di sferoidi consentirebbero la conservazione del maggior numero possibile di caratteristiche della crescita tumorale in vivo in combinazione con un test efficiente in termini di costi per lo studio della risposta alla terapia individuale.