Drosophila Quantifizierung der neuromuskulären Junction (NMJ): Eine Methode zur Bewertung der synaptischen Morphologie und Funktion

Overview

Die Neuromuskuläre Schnittstelle Drosophila (NMJ) wird als Modell verwendet, um die Morphologie und Funktion von Synapsen zu studieren. Dieses Video beschreibt wichtige Funktionen, die Forscher quantifizieren, um das NMJ zu charakterisieren. Das Beispielprotokoll zeigt eine Software, die in der Lage ist, die Quantifizierung automatisch durchzuführen.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Castells-Nobau et al.,Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology, J. Vis. Exp. (2017).

1. Anforderungen vor der Bildverarbeitung

1. Führen Sie Drosophila offene Buchvorbereitungen der dritten instar wandernden Larven (L3), wie zuvor beschrieben.
2. Co-Immunolabel Drosophila NMJ Terminals mit einer Kombination von zwei Markern: Dlg-1 oder Hrp zusammen mit Brp für die Analyse mit "Drosophila NMJ Morphometrics", und Syt oder Csp zusammen mit Brp für die Analyse mit "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   HINWEIS: Antikörper derselben Art können durch Voretikettierung mit einem Antikörper-Konjugationskit wie den Zenon Alexa Labeling Kits kombiniert werden.
3. Bild NMJ-Terminals mit einem Mikroskop der Wahl, z.B. Fluoreszenz (mit oder ohne ApoTome) oder konfokale Mikroskopie.
   1. Erfassen Sie einen 2-Kanal-Bildstapel des NMJ-Terminals.
      1. Stellen Sie die Mikroskopeinstellungen so ein, dass Kanal 1 die NMJ-Klemme mit Dlg-1 (oder Hrp, Syt, Csp) und Kanal 2 des NMJ-Terminals mit Brp immunlabeliert erfasst.
      2. Optional können Sie Einkanalbilder (von Synapsen, die mit einem einzigen Antikörper immunomarkiert sind) mit den Makros analysieren. Bild NMJs immunolabeled einzigartig mit Dlg-1 oder Hrp für die Analyse mit "Drosophila NMJ Morphometrics", oder Syt oder Csp für "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
         HINWEIS: Es ist nicht möglich, Synapsen immunstainiert nur mit Anti-Brp zu analysieren.
   2. Exportieren Sie die erhaltenen Bilder als einzelne .tiff Dateien. Invertieren Sie die Kanalreihenfolge, bevor Sie die Makros ausführen, wenn sie nicht wie angegeben erfasst werden.

2. Software-Anforderungen und Installation

1. Laden Sie die Makros herunter: "Drosophila NMJ Morphometrics" und "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" von der folgenden Website: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
2. Bewegen Sie den Cursor in den Ordner "Macros update 1", und klicken Sie auf die angezeigte Option "Ansicht". Eine Liste mit dem Inhalt dieses Ordners wird angezeigt. Der Ordner enthält die Makros "Drosophila NMJ Morphometrics" und "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
   HINWEIS: Beide Makros sind kompatibel mit Fidschi-Versionen 1.4, die ebenfalls im selben Ordner bereitgestellt werden. Die Makros werden möglicherweise nicht auf neueren Versionen ausgeführt. Bitte nutzen Sie die mitgelieferte Version 1.4. Es ist unproblematisch, diese Version zu starten, auch auf Computern mit einer neueren Fidschi-Version verfügbar.
3. Klicken Sie auf "Alle herunterladen". Der Ordnerinhalt wird als .zip Datei auf den Computer heruntergeladen. Entpacken Sie die heruntergeladene Datei.
4. Kopieren Sie die Dateien Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm und Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm in Fiji.app/plugins/ Verzeichnis. Beim Neustart des Programms werden die Makros am unteren Rand des Dropdown-Menüs Plugins angezeigt.

3. Führen Sie Submakro "Convert to Stack" aus, um Z-Projektionen und Hyperstacks der NMJ-Bilder zu erstellen

1. Starten Sie die grafische Oberfläche, indem Sie Plugins in der Symbolleiste auswählen und im Dropdown-Menü"Drosophila NMJ Morphometrics" auswählen.
2. Definieren Sie die Einstellung "Unique File String" in der grafischen Oberfläche des Makros.
   HINWEIS: Die Mikroskop-Software verwendet eine Identifikationssignatur, um Flugzeuge und Kanäle beim Speichern von Stapeln als einzelne ".tiff-Dateien zu organisieren. Die eingegebene eindeutige Dateizeichenfolgeneinstellung muss die Signatur angeben, die von der Software der ersten Ebene des ersten Kanals zugewiesen wurde (wichtig: niedrigste Ebene und Kanalnummer muss angegeben werden).
3. Wählen Sie nur das Submakro "Konvertieren in Stapel" und klicken Sie auf "OK" und wählen Sie den Ordner aus, in dem sich die Bilder befinden. Wenn ein Hauptverzeichnis mit mehreren Unterordnern ausgewählt ist, werden alle einzelnen .tiff Dateien innerhalb des Hauptverzeichnisses und des Unterordners verarbeitet, die den eindeutigen Dateizeichenfolgenkriterien entsprechen.
   1. Wenn der Z-Stack nur einen Kanal enthält, wählen Sie das Feld "Nur Kanal 1".
4. Beachten Sie, dass zwei neue Dateien pro NMJ-Bild angezeigt werden, die standardmäßig als stack_image_name und flatstack_image_name bezeichnet werden. Speichern Sie nur diese Stacks und Flatstackfürs zur weiteren Analyse. Die .tiff Dateiserie kann an dieser Stelle gelöscht werden, wodurch die erforderlichen Speicherkapazitäten minimiert und potenzielle Fehlerquellen vermieden werden.

4. Führen Sie Submakro "ROI definieren" aus, um das NMJ-Terminal von Interesse zu definieren

1. Starten Sie die grafische Oberfläche von "Drosophila NMJ Morphometrics".
2. Wählen Sie nur das Kontrollkästchen "ROI definieren" und drücken Sie "OK" und wählen Sie das Hauptverzeichnis, in dem die Bilder mit dem Titel flatstack_name gespeichert werden, und drücken Sie "Auswählen". Das Submakro "ROI definieren" durchsucht automatisch alle Unterordner innerhalb des ausgewählten Hauptverzeichnisses.
3. Wählen Sie beim Öffnen der ersten Projektion das Werkzeug "Freihandauswahl" in der Symbolleiste aus.
4. Zeichnen Sie mit der Maus eine Auswahl, die ausschließlich das komplette NMJ-Terminal enthält, und klicken Sie im Fenster "Terminal definieren" auf "OK". Das Makro wird mit der nächsten Projektion fortgesetzt.
5. Richten Sie den nächsten ROI ab, und wiederholen Sie ihn, bis alle ROIs definiert sind. Die ROI-Bilddatei mit dem Namen "roi_image_name" wird im selben Verzeichnis wie die zuvor generierten Stapel- und Projektionsbilder für jedes der verarbeiteten Bilder gespeichert. Die Ausgabe dieses Submakros ist ein binäres Bild des ROI in Weiß auf schwarzem Hintergrund.

5. Führen Sie Submakro "Analyze" aus, um NMJ-Terminalfunktionen zu quantifizieren

1. Gehen Sie zur Symbolleiste, wählen Sie "Plugins" und verwenden Sie:
   "Drosophila_NMJ_Morphometrics" bei der Analyse von Synapsen, die mit Anti-Dlg-1 oder Anti-Hrp (Kanal 1) immunmarkiert sind, zusammen mit Anti-Brp (Kanal 2) oder"Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" bei der Analyse von Synapsen, die mit Anti-Syt oder Anti-Csp (Kanal 1) immunomarkiert sind, zusammen mit Brp (Kanal 2).
   1. Wenn ein KanalBildstapel analysiert werden soll (der Strukturkanal Dlg-1 oder HRP für "Drosophila_NMJ_Morphometrics", oder Syt oder Csp für "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics"), wählen Sie das Feld "Nur Kanal 1".
2. Passen Sie den Maßstab an, der den zu analysierenden Bildern entspricht.
   1. Entspricht ein Pixel im Bild 2,5 'm', geben Sie Scale-Pixel = 1 an, Scale-Distance in 'm = 2.5. Falls beide Einstellungen bei 0 belassen werden, werden der NMJ-Bereich, der Umfang, die Länge und die längste Verzweigungslänge in der Anzahl der Pixel ausgedrückt.
3. Passen Sie bei Bedarf die Standardanalyseeinstellungen des Makros an. Führen Sie Anpassungen nur durch, wenn das Submakro "Analyze" zuvor mit unbefriedigenden Ergebnissen ausgeführt wurde (siehe Ende dieses Abschnitts und Abschnitt 6 für Anweisungen zur Optimierung der Einstellungen).
4. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen "Analysieren" und "Warten" und drücken Sie "OK".
   1. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Warten", wenn Sie das Submakro "Analyze" auf 2 Kanalbildern ausführen. Andernfalls können Fehler bei der aktiven Zonenzählung aufgrund begrenzter Computerkapazitäten auftreten.
5. Wenn ein neues Fenster "Wählen Sie ein Verzeichnis" öffnet, wählen Sie das Verzeichnis aus, in dem sich die Bilder befinden, und drücken Sie "select". Das Makro analysiert alle im Hauptverzeichnis gespeicherten Bilder und ggf. nachfolgende Ordner (mit den drei Dateien aus der Ausführung der vorherigen Submakros: stack_image_name, flatstack_image_name und roi_image_name). Das Makro verarbeitet jedes Bild einzeln und nacheinander. Dies kann mehrere Minuten pro Image-Stack dauern (abhängig von der Computerkapazität).
6. Beachten Sie nach dem Ausführen des Makros, dass im übergeordneten Ordner eine neue Bilddatei mit dem Namen res_image_name für jede analysierte Synapse erstellt wird. Die quantitativen Messungen werden als "Ergebnisse.txt" Datei gespeichert.
7. Überprüfen Sie alle Ergebnisbilder, um Bilder mit Segmentierungsfehlern zu erkennen und auszuschließen. Mögliche Segmentierungsfehler werden in Tabelle 1beschrieben, zusammen mit Ratschlägen zum Anpassen von Einstellungen, um diese Fehler zu umgehen. Ergebnisbilder mit solchen Segmentierungsfehlern werden als Beispiele in Abbildung 1dargestellt.
   HINWEIS: Beim Ausführen des Makros mit den in der Benutzeroberfläche beobachteten Standardeinstellungen war eine Genauigkeit von ca. 95 % bei der Makrobewertung im Vergleich zur manuellen Auswertung zu verzeichnen.

6. Passen Sie die Makroeinstellungen an die Bilder an

1. Wenn mehr als 5 % der Bilder Segmentierungsfehler anzeigen, untersuchen Sie die verschiedenen Algorithmen, um die am besten geeigneten Makroeinstellungen für die Bilder zu definieren/auszuwählen.
2. Anpassen des Wertes für den Walzkugelradius
   HINWEIS: Die Funktion rolling ball radius subtrahiert den Hintergrund des Bildes. Diese Funktion ist von entscheidender Bedeutung, wenn Sie mit Bildern arbeiten, die auf Fluoreszenzmikroskopen aufgenommen wurden und/oder wenn Bilder ein hohes Hintergrundrauschen haben. Die Subtraktion des Hintergrunds wird den automatischen Schwellenwertschritten des Makros helfen, eine angemessene Segmentierung der NMJ-Klemmen zu erzeugen.
   1. Wählen Sie drei NMJ-stack_image_name Bilder aus, die vom Submakro "Konvertieren in Stapel" generiert werden. Wählen Sie Bilder aus, die für das Bild-Dataset repräsentativ sind.
   2. Wählen Sie in der Symbolleiste Bild | Farbe | Split-Kanäle. Es werden zwei Bildstapel erstellt, von denen einer Kanal 1 und der andere Kanal 2 darstellt und sie speichert.
   3. Öffnen Sie den Bildstapel, der zu Kanal 1 gehört, geöffnet, entsprechend Dlg-1, Hrp, Syt oder Csp Immunolabeling.
   4. Führen Sie den Filter "Hintergrund subtrahieren" aus, indem Sie in der Symbolleiste "Prozess" auswählen, gefolgt von "Hintergrund subtrahieren..." im Dropdown-Menü.
   5. Klicken Sie auf das Vorschau-Kontrollkästchen im Pop-up-Fenster und passen Sie den Rollenkugelradius auf den Wert an, der für die Bilder am besten geeignet ist. Die Einstellung "Rolling Ball Radius" sollte an Werte angepasst werden, die den Kontrast zwischen Synapse und Hintergrund erhöhen (siehe Abbildung 2A').
      1. Siehe Abbildung 2 für ein Beispiel. In Panel A zeigen Teile der Synapse die gleichen Graustufen wie der Hintergrund, während in Abbildung 2 Panel A' ein "Rolling Ball Radius" von 500 zu einem starken Kontrast zwischen der Synapse und dem Hintergrund führt.
   6. Erstellen Sie eine Z-Projektion, indem Sie in der Symbolleiste Bild | Stack| Z-Projektion, wählen Sie Projektionstyp = Max Intensität und speichern Sie das resultierende Bild. Wenn der entsprechende Wert für den rollenden Kugelradius definiert ist, führen Sie den Algorithmus "Hintergrund subtrahieren" auf den verbleibenden repräsentativen Bildern mit demselben Rollenkugelradiuswert aus. Erstellen Sie die Z-Projektionen und speichern Sie sie (in jedem Verzeichnis).
      HINWEIS: Der Wert für den rollenden Kugelradius für 8-Bit- oder RGB-Bilder sollte mindestens so groß sein wie der Radius des größten Objekts im Bild, das nicht Teil des Hintergrunds ist. Bei 16-Bit- und 32-Bit-Bildern sollte der Radius umgekehrt proportional zum Pixelwertbereich sein.
3. Bestimmen der verschiedenen Autoschwellenwerte, die verwendet werden
   1. Öffnen Sie die im vorherigen Schritt (6.2.6) gespeicherten Z-Projektionen, und wählen Sie Bild | Anpassen | AutoThreshold | Probieren Sie alles aus.
   2. Als binäre Schwellen Ergebnis Bild erscheint mit allen verschiedenen Auto-Schwellenwert-Algorithmen, bestimmen Sie den am besten geeigneten Algorithmus für die Bilder.
      1. Wenn Sie das Makro später ausführen, ändern Sie den Schwellenwert in den Makroeinstellungen entsprechend.
      2. Verwenden Sie restriktivere Schwellenwerte wie "RenyiEntrophy" oder "Moments" als NMJ-Umrissschwelle und freizügigere Schwellenwerte wie "Li", um das NMJ-Skelett zu bestimmen, und "Huang", um aktive Zonen zu bestimmen. Wenn Bilder sehr scharf mit wenig bis gar keinem Hintergrund sind, verwenden Sie "Huang" als NMJ-Umrissschwelle. Andernfalls fehlen möglicherweise Teile der Synapse nach der Bildsegmentierung.
      3. Siehe Abbildung 2B für ein Beispiel. Eine angemessene Segmentierung der Synapse wird mit automatischen Schwellenwerten erreicht, die durch grüne Felder hervorgehoben werden. Einige Beispiele für nicht geeignete Schwellenwerte werden durch rote Kästchen hervorgehoben (Synapsen bei hoher Vergrößerung überprüfen). In letzterem fehlen entweder Teile der Synapse oder Teile des Hintergrunds sind enthalten.
4. Bestimmen Sie die maximale Größe der kleinen Partikel
   HINWEIS: Diese Funktion schließt alle Partikel aus, die durch den NMJ-Umrissschwelle und den Skelettschwellenwert erkannt werden, die kleiner als der definierte Wert in der Einstellung "Kleine Partikel" sind. Dieser Wert ist in Pixel definiert. Diese Funktion dient als Rauschfilter und ist sehr nützlich, wenn in den erhaltenen Bildern hohe Raten von ungleichmäßigem Hintergrund (z. B. Kristalle/Staub) vorhanden sind.
   1. Öffnen Sie die in Schritt 6.2.6 gespeicherten Z-Projektionen. und legen Sie die Skalierung fest, um die Anzahl der Pixel über analysieren | Set Scale. Wenden Sie die folgenden Einstellungen an: Abstand in Pixel = 1, bekannter Abstand = 1, Pixelseitenverhältnis = 1, Längeneinheit = Pixel und drücken Sie "Ok". Klicken Sie in der Symbolleiste auf das Werkzeug "Ovale Auswahl".
   2. Zeichnen Sie mit der Maus eine Auswahl, die einzelne Partikel, die in der Immunfärbung vorhanden sind, aber nicht zum NMJ gehören, eng umgibt. Drücken Sie Strg+m für einen Windows-Benutzer oder cmd+m für Mac-Benutzer. Ein Ergebnisfenster wird geöffnet, das den Bereich der Partikel angibt, die in der Anzahl der Pixel ausgewählt wurden.
   3. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt mehrmals mit mehreren Artefakten in den Bildern, um den größten kontaminierenden Partikel-/Artefaktbereich zu bestimmen. Dies ist der Wert, der in der Einstellung festgelegt werden soll, wenn das Makro später ausgeführt wird. Wenn das Makro ausgeführt wird, legen Sie die "Kleine Partikelgröße" als kleinste beobachtete Partikelgröße auf einen Rand von 25 % fest.
   4. Siehe Abbildung 2D für ein Beispiel. Der größte erkannte Kristall hat eine Fläche von 112 Pixeln. Die Einstellung "Kleine Partikelgröße" sollte bei der Verarbeitung dieses Bildes mit dem Makro auf 125 - 150 gesetzt werden.
5. Bestimmen der minimalen Bouton-Größe
   HINWEIS: Diese Funktion schließt alle Boutons aus, die durch den NMJ-Umrissschwellenwert erkannt werden und kleiner als der definierte Wert sind. Dieser Wert ist in Pixel definiert.
   1. Führen Sie die gleichen Schritte wie in Abschnitt 6.4 beschrieben, aber zeichnen Sie in diesem Fall eine Auswahl um die kleinsten Boutons, die im NMJ-Terminal vorhanden sind. Wählen Sie die kleinste Fläche, die dem kleinsten Bouton der gemessenen entspricht. Dies ist der Wert, der in der Einstellung für die minimale Bouton-Größe festgelegt werden soll, wenn das Makro später ausgeführt wird.
6. Definieren des Wertes "Maxima-Rauschtoleranz"
   1. Um den Wert "Suche maxima Rauschtoleranz" für das Makro zu definieren, öffnen Sie den Kanal 2 Z-Stack, der in Abschnitt 6.2.2 gespeichert ist.
   2. Gehen Sie zur Registerkarte Plugins im Popup-Menü, wählen Sie | Maximum(3D), und wenn die maximum_image_name erscheint (was einige Minuten dauern kann), schließen Sie den ursprünglichen Bildstapel.
   3. Wählen Sie die Maximum..._image_name (den neu erhaltenen Image-Stack) und wählen Sie Plugins | Prozess-| Minimum (3D), wenn das neue Bild Minimum of Maximum..._image_name Apears schließen die Maximum... _image_name Stapel.
   4. Wählen Sie in der Symbolleiste | Finden Sie maxima.... Ein neues Fenster "Find maxima..." wird geöffnet. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen "Vorschaupunktauswahl..." und füllen Sie das Feld "Rauschtoleranz" mit der Standardmakroeinstellung 50. Die Maxima-Punkte werden im Bild als kleine Kreuze angezeigt.
      1. Erhöhen Sie den Wert "Rauschtoleranz", wenn Sie einen Überschuss an kommentierten aktiven Zonen beobachten, d. h. Kreuze, die sich nicht über aktive Zonen befinden, die nicht im Fokus auf der ausgewählten Stapelebene stehen, oder falsche aktive Zonen, die im Hintergrund erkannt werden.
         1. Wenn hingegen die Nichtbeachtung unvollständig kommentierter Aktivzonen, d. h. nicht erkannte aktive Zonen, den Wert "Maxima-Rauschtoleranz" verringert. Versuchen Sie nach diesem Verfahren immer wieder verschiedene Werte, bis die Kreuze aktive Zonen entsprechend im Fokus beschriften. Füllen Sie die "Suche maxima Rauschtoleranz" mit diesem Wert.
         2. Siehe Abbildung 2C für ein Beispiel. Es werden zu viele aktive Zonen erkannt. In Abbildung 2C' werden nur die aktiven Zonen im Fokus erkannt, wenn der Wert "Maxima-Rauschtoleranz" erhöht wird.
   5. Führen Sie das Submakro "Analyze" für die repräsentativen Bilder aus, die in Schritt 5.1 ausgewählt wurden, wobei die Einstellungen in allen vorherigen Schritten definiert sind.
7. Brp-puncta untere und obere Schwelle einstellen
   1. Beachten Sie, dass eine neue Datei angezeigt wird, nachdem das Makro gemäß Schritt 6.6 ausgeführt wurde, 2_active_zone_stack_image_name. In diesem Bildstapel werden die aktiven Zonen, die von der Funktion "Maxima suchen" erkannt werden, durch weiße Punkte in jeder Ebene angezeigt.
   2. Öffnen Sie diese Datei, indem Sie sie ziehen und in die Symbolleiste ablegen, und wählen Sie Bild | Stack-| Z-Projekt | Projektionstyp = Summenslices. Eine Projektion der 2_active_zone_stack_image_name wird erhalten.
   3. Bild | auswählen Anpassen | Schwelle. Ein neues Fenster "Schwellenwert" wird geöffnet. Schieben Sie den oberen Balken, um einen Schwellenwert auszuwählen, bei dem alle gewünschten brenn-/Brp-positiven Flecken rot visualisiert sind.
      HINWEIS: Wenn der Schwellenwert zu niedrig eingestellt ist, wird ein Überschuss an aktiven Zonen gezählt. Wenn zu hoch eingestellt, wird ein Bruchteil der aktiven Zonen verpasst.
      1. Siehe Abbildung 2E für ein Beispiel. Wenn der Schwellenwert auf 400 festgelegt ist, sind die meisten aktiven Zonen (symbolisiert als 1 Pixel-Brennpunkte) nicht in der Segmentierung enthalten, da sie nicht rot hervorgehoben sind (Abbildung 2E). Wenn der Schwellenwert auf einen Wert von 50 festgelegt ist, werden alle aktiven Zonen rot hervorgehoben (Abbildung 2E').
   4. Definieren Sie diesen Wert als Mindestschwellenwert. Belassen Sie "Obere Punktzeichenschwelle" auf dem Maximalwert.
   5. Führen Sie das Submakro "Analyze" für die repräsentativen Bilder mit den in allen vorherigen Schritten dieses Abschnitts definierten Einstellungen erneut aus. Bewerten Sie die resultierenden Bilddateien kritisch und stellen Sie sicher, dass die Segmentierung ordnungsgemäß durchgeführt wird. Ist dies nicht der Fall, ändern Sie die Einstellungen an die Art der Segmentierungsfehler an (Abbildung 1, Tabelle 1).

Representative Results

Abbildung 1: Beispiele für unangemessene Makrosegmentierungsergebnisse. Ergebnisbilder nach dem Ausführen von "Drosophila NMJ Morphometrics" oder "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics". Teile der synaptischen Klemme sind nicht in der gelben Umrisslinie enthalten (A). Teile des Hintergrunds sind in der synaptischen Klemme durch die gelbe Umrisslinie enthalten (B). Blaue Skelettlinie erstreckt sich über die synaptische Klemme (C - D). Es werden zu viele aktive Zonen erkannt (E - E'). Einige Aktive Zonen bleiben durch die Analyse unentdeckt (G - G'). Aktive Zonen werden außerhalb der Synapse (F) erkannt. Falsche Bouton-Segmentierung (Nur anwendbar bei Derdrosophila NMJ Bouton Morphometrics), Werden Boutons übersehen (H) oder zu viele Boutons werden durch die Segmentierung erkannt (I). Partikel wie Kristalle oder Staub, die Teil des Hintergrunds sind, sind in der Segmentierung enthalten (J). Informationen zum Ändern von Einstellungen zur Vermeidung dieser Fehler finden Sie in Tabelle 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beispiele für Makroeinstellungsanpassungen und deren Folgen für die Bildsegmentierung. (A) Subtrahieren Sie die Hintergrundvorschau einer Immun-1-Synapse mit Immunbezeichnung, die auf einem Fluoreszenzmikroskop mit ApoTome abgebildet ist, wenn "Rolling ball radius" auf 20 (A) oder 500 (A') gesetzt ist. (B) Geben Sie Bilder aus, die nach dem Ausführen von Image | Anpassen | Auto-Threshold-| Probieren Sie alle Abbildungen aus, die Bildsegmentierungen veranschaulichen, die von den 16 verschiedenen Algorithmen mit automatischer Schwelle erhalten wurden. (C) Vorschau "Find Maxima" bei der Einrichtung von "Lärmtoleranz" bei 50 (C) und 500 (C'); Aktive Zonen, die durch die Segmentierung erkannt werden, werden durch ein kleines Kreuz gekennzeichnet. (D) Messung der "kleinen Partikel", die im Bildhintergrund eines synapsischen Immunolabels mit Anti-Hrp erscheinen, abgebildet auf einem konfokalen Mikroskop. (E) Projektion "Summenscheiben" aus dem 2_active_zone_stack_ima-ge_name. Der Schwellenwert wird auf 400 (E) und auf 50 (E') festgelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Segmentierung	Beobachtete Fehler	Beispiel	Erforderliche Anpassungen
NMJ-Bereich und Umfang (Dargestellt durch gelbe Umriss im Ergebnisbild)	Teile der synaptischen Klemme sind entweder nicht enthalten im gelben Umriss oder Teilen des Hintergrunds sind in der synaptischen Klemme enthalten, die gelb umrissen ist.	Abbildung 2A-B	Passen Sie den Wert 'Rolling Ball Radius' an. Siehe Abschnitt 6.1.	Passen Sie 'NMJ-Umrissschwelle' an. Siehe Abschnitt 6.2.
NMJ-Längenbezogene Parameter (Dargestellt durch blaue Skelettlinie im Ergebnisbild)	Blaue Skelettlinie erstreckt sich entweder über oder ist nicht entlang des gesamten synaptischen Terminals vorhanden.	Abbildung 2C-D	Passen Sie den Wert 'Rolling Ball Radius' an. Siehe Abschnitt 6.1.	Passen Sie 'NMJ-Umrissschwelle' an. Siehe Abschnitt 6.2.
Brp-positive puncta (Dargestellt durch Punkte im Ergebnisbild)	Es werden zu viele aktive Zonen erkannt.	Abbildung 2E-E'	Verringern Sie den Wert "Suche maxima Rauschtoleranz". Siehe Abschnitt 6.5.
Brp-positive puncta (Dargestellt durch Punkte im Ergebnisbild)	Aktive Zonen werden bei der Analyse übersehen.	Abbildung 2G-G'	Erhöhen Sie den Wert "Suche maxima Rauschtoleranz". Siehe Abschnitt 6.5.	Verringern Sie 'Brp-puncta untere Schwelle'. Siehe Abschnitt 6.6.
Brp-positive puncta (Dargestellt durch Punkte im Ergebnisbild)	Aktive Zonenartefakte werden erkannt außerhalb des synaptischen Terminals.	Abbildung 2F	Passen Sie Abschnitt 6.2 "Aktive Zone" an.	Erhöhen Sie 'Brp-puncta untere Schwelle'. Siehe Abschnitt 6.6.
Kleine Partikel	Partikel wie Kristalle oder Staub, die Teil des Hintergrunds scheinen in die Segmentierung.	Abbildung 2J	Wählen Sie das Feld 'Kleine Partikel entfernen'. Siehe Abschnitt 6.3.	Bestimmen Sie die maximale Größe kleiner Partikel. Siehe Abschnitt 6.3.
Bouton-Segmentierung	Falsche Bouton-Segmentierung (Gilt nur für Drosophila NMJ Bouton Morphometrics; Drosophila NMJ Morphometrics nicht zur Bouton-Segmentierung verwenden).	Abbildung 2H-I	Passen Sie 'NMJ-Umrissschwelle' an. Siehe Abschnitt 6.1.	Bestimmen Sie die "minimale Bouton-Größe". Siehe Abschnitt 6.4.

Tabelle 1: Leitfaden zur Fehlerbehebung für die verschiedenen Arten von Fehlern in der Bildsegmentierung, die von den Makros erstellt werden können. In dieser Tabelle werden verschiedene Arten von Bildsegmentierungsfehlern beschrieben, die von den Makros erzeugt werden. Diese können leicht in den Ergebnisbildern erkannt werden. Beispiele für jeden Fehlertyp sind in Abbildung 1dargestellt. Im Abschnitt "Anpassungen" der Tabelle werden die Einstellungen hervorgehoben, die angepasst werden müssen, und der Benutzer wird auf den kritischen Teilschritt von Abschnitt 6 verwiesen, in dem beschrieben wird, wie diese Einstellungen angepasst werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunostaining			Dilution
Mouse anti-discs large 1	Developmental Studies Hybridoma Bank	AFFN-DLG1-4D6	1/25 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Rabbit anti-horseradish peroxidase	Jackson IR	323-005-021	1/500
Rabbit anti-Synaptotagmin	Gift from Hugo Bellen		Jan-00
Mouse anti-Cysteine string protein	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCSP-1(ab49)	1/10 (conjungated using the Zenon Alexa Fluor 528 Labeling Kit)
Mouse anti-Bruchpilot	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Jan-50
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488	Life technologies	A11029	1/200
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568	Life technologies	A11011	1/500
Zenon Alexa Fluor 568 Mouse IgG1 Labeling Kit	ThermoFisher	Z25006
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFisher	P36930
Equipment
Confocal microscope or fluorescence microscope	Leica SP5
Zeiss Axio imager
Computer	Mac or Pc
Software
FIJI