Congelamento dei nematodi: un metodo per esporre i tessuti interni dei vermi per la colorazione

- Trasferire C. elegans lavato in liquido su un vetrino precedentemente rivestito con polilisina, un composto che aiuterà le cuticole dei vermi ad aderire alla superficie del vetro. Premere delicatamente un altro vetrino verso il basso con un bordo che sporge dal vetrino inferiore. Per immobilizzare i vermi senza danni, comprimere gli animali evitando qualsiasi movimento laterale. Quindi, posizionare i vetrini con vermi a sandwich su un blocco di metallo all'interno di un contenitore da laboratorio isolato riempito con un agente congelante, come azoto liquido o ghiaccio secco.

Il metallo è un efficace conduttore di temperatura che garantisce che la superficie del blocco sia sufficientemente fredda da congelare rapidamente le cuticole del verme su entrambe le superfici di vetro. Una volta congelati, separare rapidamente i vetrini per separare o aprire le cuticole del verme. Procedere con la fissazione e la colorazione dei tessuti poiché la rottura della cuticola a bassa permeabilità consente ai fissativi chimici e agli anticorpi coloranti di accedere ai tessuti interni del verme. Nel seguente protocollo, vedremo una dimostrazione dettagliata della tecnica di freeze-cracking e fissazione dei tessuti.

- Per prima cosa, prepara una diapositiva per riparare i vermi. Pipettare 30 microlitri di poli-L-lisina su un vetrino, quindi posizionare un secondo vetrino sull'altro e strofinarli insieme per distribuire uniformemente la soluzione su entrambi. Ora, staccate i due vetrini e lasciateli asciugare all'aria per 30 minuti.

Quindi, posiziona un blocco di metallo piatto in un contenitore riempito con azoto liquido. Lavare le piastre con la soluzione M9 e trasferire circa 10 microlitri di M9 contenente i vermi. In alternativa, scegli i vermi e aggiungi M9 alla diapositiva.

Una volta che i vermi sono stati trasferiti, far cadere delicatamente un vetrino coprioggetti trasversalmente su di essi in modo che il vetrino coprioggetti sporga da un bordo. Quindi, premere delicatamente il vetrino coprioggetti senza effettuare movimenti laterali.

A questo punto, trasferire immediatamente il vetrino sul blocco metallico in azoto liquido e lasciarlo congelare. Dopo cinque minuti, rimuovere il vetrino coprioggetti utilizzando il bordo sporgente. Fallo rapidamente per ottenere la corretta fessura della cuticola.

Quindi, immergere il vetrino in un barattolo di vetro Coplin riempito di metanolo a meno 20 gradi Celsius. Dopo cinque minuti, trasferire il vetrino in un barattolo di vetro Coplin pieno di acetone per altri cinque minuti alla stessa temperatura. I vetrini possono essere colorati direttamente o conservati a meno 20 gradi Celsius.