Assotomia laser a due fotoni: un metodo per ferire gli assoni negli embrioni di zebrafish e osservare il recupero assonale

- Metti gli embrioni di interesse nella fenil tiourea, PTU, la soluzione di Ringer per inibire la formazione di pigmenti, che inizia a 24 ore dopo la fecondazione. Ciò rende più visibile l'anatomia in via di sviluppo, necessaria per questa procedura. Trasferire un embrione anestetizzato con tricaina in una camera di imaging. Posiziona un vetrino sopra e osservalo al microscopio. Concentrati sull'assone da ferire, che è visibile sotto un laser a 488 nanometri perché esprime transgeneticamente la GFP.

Scatta un'immagine precedente del sito. Quindi, osserva l'assone con un laser a 910 nanometri che provoca la fluorescenza del rosso GFP. Aumenta l'intensità di questo laser per ferire l'area bersaglio senza intaccare il tessuto circostante. Questo processo è chiamato assotomia. Scatta una nuova immagine con il primo laser per confermare l'assotomia, che appare come detriti sparsi. Nel seguente protocollo, eseguiremo un'assotomia degli assoni sensoriali periferici in embrioni di zebrafish utilizzando un laser a due fotoni.

- Se un cannocchiale a due fotoni costruito su misura non è disponibile nel vostro laboratorio, il microscopio confocale a due fotoni Zeiss 510 può essere utilizzato a