Assotomia laser a due fotoni: un metodo per ferire gli assoni negli embrioni di zebrafish e osservare il recupero assonale

- Metti gli embrioni di interesse nella fenil tiourea, PTU, la soluzione di Ringer per inibire la formazione di pigmenti, che inizia a 24 ore dopo la fecondazione. Ciò rende più visibile l'anatomia in via di sviluppo, necessaria per questa procedura. Trasferire un embrione anestetizzato con tricaina in una camera di imaging. Posiziona un vetrino sopra e osservalo al microscopio. Concentrati sull'assone da ferire, che è visibile sotto un laser a 488 nanometri perché esprime transgeneticamente la GFP.

Scatta un'immagine precedente del sito. Quindi, osserva l'assone con un laser a 910 nanometri che provoca la fluorescenza del rosso GFP. Aumenta l'intensità di questo laser per ferire l'area bersaglio senza intaccare il tessuto circostante. Questo processo è chiamato assotomia. Scatta una nuova immagine con il primo laser per confermare l'assotomia, che appare come detriti sparsi. Nel seguente protocollo, eseguiremo un'assotomia degli assoni sensoriali periferici in embrioni di zebrafish utilizzando un laser a due fotoni.

- Se un cannocchiale a due fotoni costruito su misura non è disponibile nel vostro laboratorio, il microscopio confocale a due fotoni Zeiss 510 può essere utilizzato anche per recidere gli assoni. Iniziamo posizionando l'embrione montato sul palco e mettendolo a fuoco utilizzando un obiettivo d'acqua 25x. Successivamente, accendi i due laser a fotoni e argon in un'impostazione multitraccia in modo che sia possibile passare dall'uno all'altro.

Sebbene entrambi i laser siano utilizzati per rilevare la GFP, l'emissione di due fotoni viene visualizzata in rosso e l'emissione laser ad argon in verde per differenziare le due. Usa il laser ad argon per identificare un assone da ferire. Nelle impostazioni Z contrassegnare la prima e l'ultima sezione ottica, scattare un'immagine confocale e creare una proiezione massima dello stack Z.

Spegnere il laser ad argon e accendere il laser a due fotoni. Eseguire la scansione a un'intensità di circa il 9% di trasmissione per assicurarsi che l'assone sia ancora a fuoco. Fare clic sul pulsante Stop in modo che lo strumento Ritaglia sia disponibile. Utilizzare Ritaglia per ingrandire l'area di interesse. Di solito ingrandiamo a circa 70x. Scegli la regione dell'assone da ferire e metti a fuoco questa regione. Lo zoom può essere controllato nella scheda Modalità.

Successivamente, nella scheda Canali, modificare l'intensità dei due fotoni da circa il 9% di trasmissione al 15% al 30% di trasmissione. Per attivare le nuove impostazioni, fare clic sul pulsante Fast XY e quindi fare clic su Interrompi subito dopo per evitare danni eccessivi. L'assone dovrebbe essere visto come detriti sparsi se la procedura ha funzionato. Infine, per assicurarsi che l'assone sia stato effettivamente danneggiato, è possibile tornare al laser ad argon a 488 nanometri. Prendi un'altra immagine confocale e crea una proiezione massima delle pile Z.